Summary
Durch das Schrumpfen von Zahnzement während der Aushärtung wird die Grundplatte verdrängt. Dieses Protokoll minimiert das Problem, indem es ein erstes Fundament des Zahnzements schafft, das Platz für die Zementierung der Grundplatte lässt. Wochen später kann die Bodenplatte mit wenig neuem Zement auf diesem Gerüst zementiert werden, wodurch die Schwindung reduziert wird.
Abstract
Neurowissenschaftler verwenden Miniaturmikroskope (Miniskope), um die neuronale Aktivität in frei agierenden Tieren zu beobachten. Das Miniscope-Team der University of California, Los Angeles (UCLA) stellt Forschern offene Ressourcen zur Verfügung, mit denen sie Miniskope selbst bauen können. Das V3 UCLA Miniscope ist eines der beliebtesten Open-Source-Miniskope, die derzeit im Einsatz sind. Es ermöglicht die Bildgebung der Fluoreszenztransienten, die von genetisch veränderten Neuronen emittiert werden, durch eine Objektivlinse, die in den oberflächlichen Kortex implantiert wird (ein Ein-Linsen-System), oder in tiefen Hirnbereichen durch eine Kombination aus einer Relaislinse, die in das tiefe Gehirn implantiert wird, und einer Objektivlinse, die im Miniskop vorverankert ist, um das weitergeleitete Bild zu beobachten (ein Zwei-Linsen-System). Selbst unter optimalen Bedingungen (wenn Neuronen Fluoreszenzindikatoren exprimieren und die Relaislinse ordnungsgemäß implantiert wurde) kann eine Volumenänderung des Zahnzements zwischen der Grundplatte und ihrer Befestigung am Schädel bei der Zementhärtung zu einer Fehlausrichtung mit einem veränderten Abstand zwischen Objektiv und Relaislinse führen, was zu einer schlechten Bildqualität führt. Eine Grundplatte ist eine Platte, die hilft, das Miniskop auf dem Schädel zu befestigen und den Arbeitsabstand zwischen dem Objektiv und dem Relaisobjektiv zu fixieren. So verändern Änderungen des Volumens des Zahnzements um die Grundplatte herum den Abstand zwischen den Linsen. Das vorliegende Protokoll zielt darauf ab, das Problem der Fehlausrichtung, das durch Volumenänderungen im Zahnzement verursacht wird, zu minimieren. Das Protokoll reduziert die Fehlausrichtung, indem es während der Implantation der Relaislinse ein erstes Fundament aus Zahnzement bildet. Die Rekonvaleszenzzeit nach der Implantation reicht aus, damit das Fundament aus Zahnzement die Grundplatte vollständig aushärten kann, so dass die Grundplatte mit möglichst wenig neuem Zement auf diesem Gerüst zementiert werden kann. Im vorliegenden Artikel beschreiben wir Strategien für die Baseplattierung bei Mäusen, um die Abbildung der neuronalen Aktivität mit einer im Miniskop verankerten Objektivlinse zu ermöglichen.
Introduction
Fluoreszierende Aktivitätsreporter sind ideal für die Bildgebung der neuronalen Aktivität, da sie empfindlich sind und große Dynamikbereiche 1,2,3 haben. Daher wird in immer mehr Experimenten die Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um die neuronale Aktivitätdirekt zu beobachten 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16. Das erste miniaturisierte Ein-Photonen-Fluoreszenzmikroskop (Miniskop) wurde 2011 von Mark Schnitzer et al.5 entwickelt. Dieses Miniskop ermöglicht es den Forschern, die Fluoreszenzdynamik von Kleinhirnzellen in sich frei verhaltenden Tieren5 zu überwachen (d.h. ohne physische Fesselung, Kopfstütze, Sedierung oder Anästhesie der Tiere). Derzeit kann die Technik angewendet werden, um oberflächliche Hirnareale wie den Cortex 6,8,15,16 zu überwachen; subkortikale Bereiche wie der dorsale Hippocampus 8,11,13,14 und Striatum 6,17; und tiefe Hirnareale wie der ventrale Hippocampus 14, die Amygdala 10,18 und der Hypothalamus 8,12.
In den letzten Jahren wurden mehrere Open-Source-Miniskope entwickelt4,5,6,7,11,13,17,19. Das Miniskop kann von Forschern kostengünstig zusammengebaut werden, wenn sie die Schritt-für-Schritt-Richtlinien des Miniscope-Teams der University of California, Los Angeles (UCLA) befolgen4,7,11,13. Weil die optische Überwachung der neuronalen Aktivität durch die Grenzen der Lichtdurchlässigkeit eingeschränkt ist7 Zu und von der interessierenden neuronalen Population wurde ein Miniskop entwickelt, bei dem eine GRIN-Linse (oder Objektivlinse) mit objektivem Gradientenbrechungsindex (oder Objektiv) an der Unterseite des Miniskops vorverankert werden muss, um das Sichtfeld zu vergrößern, das von einer Relais-GRIN-Linse (oder Relaislinse) weitergeleitet wird6,7,8,10,16,17. Diese Relaislinse wird in die Zielhirnregion implantiert, so dass die Fluoreszenzaktivität der Zielhirnregion auf die Oberfläche der Relaislinse übertragen wird6,7,8,10,16,17. Ungefähr 1/4 einer vollen sinusförmigen Lichtperiode wandert durch das GRIN-Objektiv (~ 0,25 Tonhöhe) (Abbildung 1A1), was zu einem vergrößerten Fluoreszenzbild führt6,7. Das Objektiv ist nicht immer an der Unterseite des Miniskops befestigt und die Implantation der Relaislinse ist nicht immer notwendig6,7,11,13,15. Konkret gibt es zwei Konfigurationen: eine mit einem festen Objektiv im Miniskop und eine Relaislinse, die in das Gehirn implantiert wird8,10,12,14,16 (Abbildung 1B1) und eine weitere mit nur einem abnehmbaren Objektiv6,7,11,13,15 (Abbildung 1B2). In dem Design, das auf der Kombination aus festem Objektiv und implantierter Relaislinse basiert, werden die Fluoreszenzsignale aus dem Gehirn auf die Oberseite der Relaislinse gebracht (Abbildung 1A1)7,8,10,12,14,16. Anschließend kann die Objektivlinse das Gesichtsfeld von der Oberseite der Relaislinse (Abbildung 1A2). Auf der anderen Seite ist das Design der abnehmbaren GRIN-Objektivlinse flexibler, was bedeutet, dass die Präimplantation einer Relaislinse in das Gehirn nicht zwingend erforderlich ist (Abbildung 1B2)6,7,11,13,15. Bei der Verwendung eines Miniskops, das auf einem abnehmbaren Objektivdesign basiert, müssen die Forscher immer noch eine Linse in die Zielregion des Gehirns implantieren, aber sie können entweder eine Objektivlinse implantieren6,7,11,13,15 oder eine Relaislinse im Gehirn6,7. Die Wahl eines Objektivs oder einer Relaislinse für die Implantation bestimmt die Miniskop-Konfiguration, die der Forscher verwenden muss. Zum Beispiel basiert das V3 UCLA Miniscope auf einem abnehmbaren GRIN-Objektivdesign. Die Forscher können entweder eine Objektivlinse direkt in die interessierende Hirnregion implantieren und das "leere" Miniskop auf das Objektiv montieren6,7,11,13,15 (ein Ein-Linsen-System; Abbildung 1B2) oder um eine Relaislinse in das Gehirn zu implantieren und ein Miniskop zu montieren, das mit einer Objektivlinse vorverankert ist6,7 (ein System mit zwei Linsen; Abbildung 1B1). Das Miniskop arbeitet dann als Fluoreszenzkamera, um Livestream-Bilder der neuronalen Fluoreszenz aufzunehmen, die von einem genetisch kodierten Kalziumindikator erzeugt wird1,2,3. Nachdem das Miniskop an einen Computer angeschlossen wurde, können diese Fluoreszenzbilder auf den Computer übertragen und als Videoclips gespeichert werden. Forscher können die neuronale Aktivität untersuchen, indem sie die relativen Veränderungen der Fluoreszenz mit einigen Analysepaketen analysieren20,21 Oder schreiben Sie ihre Codes für zukünftige Analysen.
Das V3 UCLA Miniscope bietet Anwendern die Flexibilität, zu entscheiden, ob die neuronale Aktivität mit einem Ein- oder Zweilinsensystem abgebildet werden soll7. Die Wahl des Aufzeichnungssystems richtet sich nach der Tiefe und Größe des Zielhirnbereichs. Kurz gesagt, ein Ein-Linsen-System kann nur einen Bereich abbilden, der oberflächlich (weniger als ca. ca. 2,5 mm tief) und relativ groß (größer als ca. 1,8 x 1,8 mm2) ist, da die Hersteller nur eine bestimmte Größe des Objektivs herstellen. Im Gegensatz dazu kann ein Zwei-Linsen-System auf jedes Zielgebiet des Gehirns angewendet werden. Der Zahnzement zum Verkleben der Grundplatte neigt jedoch dazu, bei einem veränderten Abstand zwischen Objektiv und Relaislinse zu einer Fehlausrichtung zu führen, was zu einer schlechten Bildqualität führt. Wenn das Zwei-Linsen-System verwendet wird, müssen zwei Arbeitsabstände genau ausgerichtet werden, um die optimale Abbildungsqualität zu erzielen (Abbildung 1A). Diese beiden kritischen Arbeitsabstände befinden sich zwischen den Neuronen und der unteren Oberfläche der Relaislinse sowie zwischen der Oberseite der Relaislinse und der Unterseite der Objektivlinse (Abbildung 1A1). Jede Fehlausrichtung oder falsche Platzierung des Objektivs außerhalb des Arbeitsabstands führt zu einem Abbildungsfehler (Abbildung 1C2). Im Gegensatz dazu benötigt das Ein-Linsen-System nur einen präzisen Arbeitsabstand. Die Größe des Objektivs begrenzt jedoch seine Anwendung für die Überwachung von tiefen Hirnregionen (das Objektiv, das zum Miniskop passt, ist ungefähr 1,8 ~ 2,0 mm 6,11,13,15). Daher ist die Implantation einer Objektivlinse für die Beobachtung der Oberfläche und relativ großer Hirnregionen, wie z.B. des Cortex6,15 und der dorsalen Cornu ammonis 1 (CA1) bei Mäusen11,13 begrenzt. Darüber hinaus muss ein großer Bereich des Kortex abgesaugt werden, um das dorsale CA111,13 anzugreifen. Aufgrund der Einschränkung der Ein-Linsen-Konfiguration, die die Bildgebung tiefer Hirnregionen verhindert, bieten kommerzielle Miniskop-Systeme nur ein kombiniertes Objektiv-/Relaisobjektiv-Design (Zwei-Linsen-Design). Auf der anderen Seite kann das V3 UCLA Miniskop entweder in ein Ein- oder Zwei-Linsen-System umgewandelt werden, da das Objektiv abnehmbar ist 6,11,13,15. Mit anderen Worten, V3 UCLA Miniskop-Benutzer können die abnehmbare Linse nutzen, indem sie sie in das Gehirn implantieren (wodurch ein Ein-Linsen-System entsteht), wenn sie Experimente mit oberflächlichen Gehirnbeobachtungen (weniger als 2,5 mm Tiefe) durchführen oder indem sie sie im Miniskop vorverankern und eine Relaislinse in das Gehirn implantieren (wodurch ein Zwei-Linsen-System entsteht). bei der Durchführung von Experimenten mit Tiefenhirnbeobachtungen. Das Zwei-Linsen-System kann auch für die oberflächliche Beobachtung des Gehirns verwendet werden, aber der Forscher muss die genauen Arbeitsabstände zwischen der Objektivlinse und der Relaislinse kennen. Der Hauptvorteil des Ein-Linsen-Systems besteht darin, dass die Wahrscheinlichkeit, dass die Arbeitsabstände verfehlt werden, geringer ist als bei einem Zwei-Linsen-System, da zwei Arbeitsabstände genau ausgerichtet werden müssen, um eine optimale Abbildungsqualität im Zwei-Linsen-System zu erzielen (Abbildung 1A). Daher empfehlen wir die Verwendung eines Ein-Linsen-Systems für oberflächliche Gehirnbeobachtungen. Wenn das Experiment jedoch eine Bildgebung im Bereich des tiefen Gehirns erfordert, muss der Forscher lernen, eine Fehlausrichtung der beiden Linsen zu vermeiden.
Das Basisprotokoll für die Zwei-Linsen-Konfiguration von Miniskopen für Experimente umfasst die Linsenimplantation und die Baseplattierung 8,10,16,17. Baseplating ist das Aufkleben einer Grundplatte auf den Kopf eines Tieres, so dass das Miniskop schließlich auf dem Tier montiert werden kann und die Fluoreszenzsignale von Neuronen auf Video aufzeichnen kann (Abbildung 1B). Bei diesem Verfahren wird die Grundplatte mit Zahnzement auf den Schädel geklebt (Abbildung 1C), aber das Schrumpfen des Zahnzements kann zu inakzeptablen Veränderungen des Abstands zwischen der implantierten Relaislinse und der Objektivlinseführen 8,17. Ist der verschobene Abstand zwischen den beiden Linsen zu groß, können Zellen nicht scharf gestellt werden.
Detaillierte Protokolle für Experimente zur Calcium-Bildgebung im tiefen Gehirn mit Miniskopen wurden bereits veröffentlicht8,10,16,17. Die Autoren dieser Protokolle haben das Inscopix-System verwendet8,10,16 oder andere kundenspezifische Designs17 und haben die experimentellen Verfahren für die Virusselektion, die Chirurgie und die Grundplattenbefestigung beschrieben. Ihre Protokolle können jedoch nicht präzise auf andere Open-Source-Systeme angewendet werden, wie z. B. das V3 UCLA Miniscope-System, NINscope6und Finchscope19. Eine Fehlausrichtung der beiden Linsen kann während der Aufnahme in einer Zwei-Linsen-Konfiguration mit einem UCLA Miniscope aufgrund der Art des Zahnzements, der verwendet wird, um die Grundplatte mit dem Schädel zu zementieren, auftreten8,17 (Abbildung 1C). Das vorliegende Protokoll ist erforderlich, da der Abstand zwischen der implantierten Relaislinse und der Objektivlinse aufgrund der unerwünschten Schrumpfung von Zahnzement während des Baseplating-Verfahrens anfällig für Verschiebungen ist. Während der Grundierung muss der optimale Arbeitsabstand zwischen der implantierten Relaislinse und der Objektivlinse gefunden werden, indem der Abstand zwischen dem Miniskop und der Oberseite der Relaislinse eingestellt wird, und die Grundplatte sollte dann an dieser idealen Stelle verklebt werden. Nachdem der richtige Abstand zwischen der Objektivlinse und der implantierten Relaislinse eingestellt wurde, können Längsmessungen mit zellulärer Auflösung (Abbildung 1B; in vivo Aufzeichnung). Da der optimale Arbeitsabstand eines Relaisobjektivs klein ist (50 - 350 μm)4,8kann es schwierig sein, das Objektiv und die implantierte Relaislinse im richtigen Bereich zu halten. Das übergeordnete Ziel dieses Berichts ist es, ein Protokoll zur Verringerung der Schrumpfungsprobleme bereitzustellen8,17 die während des Baseplating-Verfahrens auftreten und die Erfolgsrate von Miniscope-Aufnahmen von Fluoreszenzsignalen in einer Zwei-Linsen-Konfiguration erhöhen. Eine erfolgreiche Miniskop-Aufzeichnung ist definiert als die Aufzeichnung eines Livestreams von auffälligen relativen Veränderungen in der Fluoreszenz einzelner Neuronen in einem sich frei verhaltenden Tier. Obwohl verschiedene Marken von Dentzement unterschiedliche Schrumpfungsraten haben, können Forscher eine Marke auswählen, die zuvor getestet wurde6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22. Allerdings ist nicht jede Marke in einigen Ländern/Regionen aufgrund der Einfuhrbestimmungen für medizinische Materialien leicht zu erhalten. Daher haben wir Methoden entwickelt, um die Schrumpfraten verfügbarer Zahnzemente zu testen und vor allem ein alternatives Protokoll bereitzustellen, das das Schrumpfungsproblem minimiert. Der Vorteil gegenüber dem derzeitigen Baseplating-Protokoll ist eine Erhöhung der Erfolgsrate der Calcium-Bildgebung mit Werkzeugen und Zement, die in Laboratorien leicht gewonnen werden können. Das UCLA-Miniskop wird als Beispiel verwendet, aber das Protokoll ist auch auf andere Miniskope anwendbar. In diesem Bericht beschreiben wir ein optimiertes Baseplating-Verfahren und empfehlen auch einige Strategien für den Einbau des UCLA Miniskop-Zweilinsensystems (Abbildung 2A). Sowohl Beispiele für erfolgreiche Implantation (n=3 Mäuse) als auch Beispiele für fehlgeschlagene Implantation (n=2 Mäuse) für die Zwei-Linsen-Konfiguration mit dem UCLA-Miniskop werden vorgestellt und die Gründe für die Erfolge und Misserfolge diskutiert.
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Protocol
Alle in dieser Studie durchgeführten Verfahren wurden vom National Taiwan University Animal Care and Use Committee genehmigt (Zulassungsnummer: NTU-109-EL-00029 und NTU-108-EL-00158).
1. Beurteilung der Volumenveränderung von Zahnzement
HINWEIS: Änderungen des Volumens von Zahnzement treten während des Aushärtungsprozesses auf. Testen Sie die Volumenänderungen von Zahnzement vor der Implantation und Baseplattierung. Forscher können jede Marke von Dentzement testen und die Marke mit der geringsten Volumenänderung verwenden, um die Grundplatte zu zementieren. Ein Beispiel ist in Abbildung 3 dargestellt.
- Von jedem Zahnzementpulver werden 0,5 g abgewogen und mit der entsprechenden Lösung (1 ml) gemischt.
HINWEIS: Das empfohlene Pulver / Flüssigkeit-Verhältnis in der Zahnzementanleitung beträgt 0,5 g Pulver auf 0,25 ml der Lösung, um eine feste Form zu erhalten. Dieses Testprotokoll verdünnt das Verhältnis auf 0,5 g/ml, so dass das Gemisch in flüssiger Form abgesaugt werden kann, um die Volumenänderung in den Pipettenspitzen zu messen. - Verwenden Sie 0,1-10 μL Pipettenspitzen, um 2,5 μL der Zahnzementmischung zu entfernen, und versiegeln Sie dann die Pipettenspitze mit einem leicht härtenden Kleber.
- Legen Sie die Spitzen auf ein Gestell, markieren Sie die obersten Ebenen der Dentzement und messen Sie den Füllstand der Dentzement nach 40 min (Ergänzungsvideo S1).
- Messen Sie zusätzlich zur Überwachung der Füllstandsänderungen während der Zahnzementaushärtung in den Spitzen die verbleibende trockene Zahnzementdichte. Um die Dichte zu berechnen, messen Sie das Gewicht des Zahnzements und messen Sie das Volumen mit dem Archimedischen Prinzip.
- Kurz gesagt, legen Sie den verbleibenden trockenen Zahnzement in eine mit Wasser gefüllte Tasse und wiegen Sie das Wasser, das überläuft.
- Verwenden Sie den Zahnzement mit der geringsten Schrumpfung für alle unten aufgeführten Protokolle.
2. Anästhesie, chirurgische Implantation, Virusinjektion und Dummy-Baseplattierung
- Anästhesie
HINWEIS: Der vorliegende Bericht zielt darauf ab, das Operations- und Baseplating-Verfahren für das UCLA-Miniskop zu optimieren. Daher ging man davon aus, dass der optimale Virustiter für die Infektion der Zielhirnregionen bekannt ist. Die Methoden, um den optimalen viralen Titer zu finden, finden sich in den Schritten 1 bis 5 von Resendez et al.8. Sobald die Virusverdünnung optimiert ist, kann die chirurgische Implantation eingeleitet werden.- Legen Sie die Maus in einen Induktionsbehälter und geben Sie Sauerstoff (100% bei einem Luftdurchsatz von 0,2 l/min). Die Maus 5 bis 10 Minuten mit Sauerstoff versorgen.
- Verabreichen Sie 5 % Isofluran gemischt mit 100 % Sauerstoff (Luftvolumenstrom: 0,2 l/min), bis die Maus das Gleichgewicht verliert und schließlich betäubt wird.
- Nehmen Sie die Maus aus der Induktionskammer und injizieren Sie Atropin (0,04 mg/kg; subkutane Injektion), um die Ansammlung von Speichel und Buprenorphin (0,03 mg/kg; subkutane Injektion) als Analgetikum zu verhindern.
- Rasieren Sie den Kopf der Maus.
- Tragen Sie eine Maske, ein steriles Kleid und Handschuhe. Bereiten Sie einen sterilen Raum und sterile chirurgische Instrumente für die Operation vor. Stabilisieren Sie den Kopf der Maus (halten Sie die Anästhesie mit 3 bis 2,5% Isofluran während dieses Schritts aufrecht) auf dem stereotaktischen Apparat. Stellen Sie nach den analgetischen und anästhetischen Eingriffen sicher, dass die Ohrstangen den Kopf sicher stabilisieren. Bieten Sie thermische Unterstützung.
- Stellen Sie sicher, dass der Kopf in eine gerade Position gebracht wird, sterilisieren Sie den rasierten Kopf mit Betadin und sprühen Sie den Kopf dann mit Xylocain (10%), einem lokalen Analgetikum.
- Tragen Sie Veterinärsalbe auf die Augen auf, um Trockenheit zu verhindern.
HINWEIS: Verwenden Sie Augensalbe zum Augenschutz während aller Anästhesieereignisse, um Augenverletzungen zu vermeiden. - Testen Sie den tiefen Schmerzreflex des Tieres, indem Sie seine Hinterpfote kneifen. Sobald das Tier keinen Pfotenrückzugsreflex zeigt, fahren Sie mit chirurgischen Eingriffen fort.
- Machen Sie einen kleinen Schnitt entlang der mittleren sagittalen Ebene des Schädels (beginnend von etwa 2 mm vor dem Bregma und endend etwa 6 mm hinter dem Bregma). Reinigen Sie dann das Bindegewebe am Schädel und verankern Sie drei Edelstahlschrauben an den linken Stirn- und Scheeinelbeinen.
- Reduzieren Sie an dieser Stelle das Isofluran auf 1-2%. Überwachen Sie die Atemfrequenz während des gesamten chirurgischen Eingriffs. Wenn die Atemfrequenz zu langsam ist (ca. 1/s, je nach Tier), verringern Sie die Isoflurankonzentration.
- Führen Sie eine Kraniotomie für die Relaislinsenimplantation unter einem Operationsmikroskop oder Stereomikroskop mit einem Gratbohrer mit einem Spitzendurchmesser von 0,7 mm durch. Greifen Sie mit einem Mikrobohrer nach dem Gratbohrer und zeichnen Sie einen Umriss der vorgesehenen Kreisfläche (die volle Dicke des Schädeldachs muss nicht durchdrungen werden).
ANMERKUNG: Die im vorliegenden Protokoll verwendete Relaislinse hatte einen Durchmesser von 1,0 mm, eine Länge ~ 9,0 mm, einen Abstand von 1 und einen Arbeitsabstandsbereich von ~ 100 μm - 300 μm; Daher hatte die Kraniotomie einen Durchmesser von 1,2 mm.- Vertiefen Sie vorsichtig den Umriss, bis die Dura freigelegt ist.
- Bereiten Sie 3 ml sterile Kochsalzlösung in einer 3-ml-Spritze vor und kühlen Sie sie in einem Eiskübel ab. Spülen Sie den exponierten Bereich häufig mit 0,1 ml Kochsalzlösung aus der Spritze, um den Bereich zu kühlen und Hitzeschäden und Blutungen zu vermeiden.
- Pflücken Sie die Dura leicht und ziehen Sie sie mit einer 27G-Nadel ab.
- Eine stumpfe 27-G-Nadel in einem Abstand von 1 mm von der Spitze wird markiert und mit dieser vorsichtig die Hirnrinde abgesaugt, um ein Fenster für die Linsenimplantationzu schaffen 8,11,13,17 (Abbildung 2B1). Machen Sie bei Bedarf eine stumpfe Nadel, indem Sie die Spitze einer 27-g-Injektionsnadel mit Schleifpapier abschleifen. Verbinden Sie dann die Nadel mit einer Spritze, verbinden Sie die Spritze mit einem Schlauch und verbinden Sie den Schlauch mit einer Saugquelle, um ein Vakuum zu erzeugen.
HINWEIS: Die Relaislinse ist stumpf und komprimiert das Hirngewebe, wenn es in den tiefen Hirnbereich gelegt wird. So reduziert die Aspiration des Kortex die Gewebeschädigung durch die Implantation von Relaislinsen. Der Kortex ist bei Mäusen etwa 1 mm dick, aber unter einem Stereomikroskop schwer zu visualisieren. Die Markierung schafft eine Landmarke, mit der die Tiefe der Nadel genauer bestimmt werden kann als mit einem Stereomikroskop allein. Darüber hinaus kann man je nach Widerstand feststellen, ob die Kortexregion erreicht oder passiert wurde; Der obere Teil des Kortex fühlt sich relativ weich an, während sich die subkortikale Region dicht anfühlt. Sobald sich die Textur dichter anfühlt, stoppen Sie daher die Aspiration (Abbildung 2B3). - Bereiten Sie 3 ml sterile Kochsalzlösung in einer 3-ml-Spritze vor und kühlen Sie sie in einem Eiskübel ab. Spülen Sie den Bereich mit Kochsalzlösung, um die Blutung zu stoppen und die Möglichkeit eines Hirnödems zu verringern.
- Adeno-assoziierte Virusinjektion (AAV)
HINWEIS: AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE wurde im vorliegenden Experiment verwendet. jGCaMP7s ist ein genetisch kodierter Kalziumindikator, der grüne Fluoreszenz3 emittiert. Da die vorliegende Studie eine Wildtyp-Maus als Probanden verwendete, wurde ein viraler Vektor benötigt, um die Neuronen mit dem grün fluoreszierenden Kalzium-Indikatorgen zu transfizieren und die Expression zu ermöglichen. Forscher, die transgene Mäuse verwenden, die den grün fluoreszierenden Kalziumindikator als ihre Probanden exprimieren, können Protokoll 2.2 überspringen.- Montieren Sie die innere Nadel eines 20 G intravenösen (i.v.) Katheters auf den stereotaktischen Arm und punktieren Sie das Gehirn langsam (~100 - 200 μm/min) an den entsprechenden Koordinaten (die gleichen Koordinaten, die bei der Implantation der Relaislinse verwendet werden) (Abbildung 2B3).
- Senken Sie die Mikroinjektionsnadel mit einer Geschwindigkeit von 100-200 μm/min in den ventralen CA1 und infundiert (~ 25 nL/min) 200 nL des viralen Vektors in die Zielregion (-3,16 mm AP, 3,25 mm ML und -3,50 mm DV aus dem Bregma).
- Warten Sie 10 Minuten, damit das Virus diffundieren kann und der Rückfluss minimiert wird.
- Ziehen Sie die Mikroinjektionsnadel (~100-200 μm/min) heraus.
- Implantation von Relaislinsen
- Desinfizieren Sie die Relaislinse mit 75% Alkohol10,16 und spülen Sie sie anschließend mit pyrogenfreier Kochsalzlösung ab. Weichen Sie die Linse bis zur Implantation in kalter, pyrogenfreier Kochsalzlösung ein.
HINWEIS: Eine kalte Linse minimiert Hirnödeme, wenn sie in das Gehirn eingesetzt werden. - Halten Sie die Relaislinse mit einer Mikro-Bulldoggenklemme (Abbildung 2B3) fest, deren Zähne mit Schrumpfschläuchen abgedeckt sind.
HINWEIS: Die Bulldoggenklemme kann das Objektiv fest halten, ohne es zu beschädigen. Siehe Resendez et al.8 für das Verfahren zur Herstellung der mit Schläuchen bedeckten Bulldoggenklemme. - Platzieren Sie die Relaislinse langsam (~100 - 200 μm/min) auf dem Zielbereich (-3,16 mm AP, 3,50 mm ML und -3,50 mm DV vom Bregma) und stabilisieren Sie sie mit Zahnzement.
- Desinfizieren Sie die Relaislinse mit 75% Alkohol10,16 und spülen Sie sie anschließend mit pyrogenfreier Kochsalzlösung ab. Weichen Sie die Linse bis zur Implantation in kalter, pyrogenfreier Kochsalzlösung ein.
- Dummy-Grundplattierung
HINWEIS: Der Zweck der "Dummy-Baseplating" während der Implantationsoperation besteht darin, eine Zahnzementbasis zu schaffen, um die Menge an Zahnzement zu reduzieren, die während des eigentlichen Baseplating-Verfahrens einige Wochen später aufgetragen werden muss. Auf diese Weise wird das Risiko einer Veränderung des Volumens des Zahnzements minimiert.- Befestigen Sie das Objektiv an der Unterseite des Miniskops und montieren Sie die Grundplatte auf dem Miniskop (in diesem Schritt wurde die Montage der verankerten Objektivlinse, der Grundplatte und des Miniskops noch nicht über den Schädel der Maus gelegt).
- Wickeln Sie 10 cm Paraffinfolie um die Außenseite der Grundplatte (Abbildung 4A).
- Halten Sie das Miniskop mit der stereotaktischen Armsonde unter Verwendung von wiederverwendbarem Klebeton fest.
- Richten Sie das Objektiv auf der Oberseite der Relaislinse aus, wobei der Abstand zwischen den Linsen so gering wie möglich ist (Abbildung 4B).
- Verwenden Sie Zahnzement, um die Positionierung der Grundplatte zu sichern (so, dass der Zement nur die Paraffinfolie berührt).
- Wenn der Zahnzement getrocknet ist, entfernen Sie die Folie.
- Entfernen Sie die Grundplatte und das Miniskop. Der Zahnzementboden ist hohl (Abbildung 4B).
- Um die Relaislinse vor täglichen Aktivitäten und vor Kratzern durch die Maus zu schützen, versiegeln Sie die Relaislinse mit etwas geformtem Silikonkautschuk, bis die Relaislinse bedeckt ist, und bedecken Sie den Silikonkautschuk mit einer dünnen Schicht Zahnzement (Abbildung 4B).
- Trennen Sie die Maus von den stereotaktischen Instrumenten und legen Sie sie in eine Aufwachkammer.
- Injizieren Sie Carprofen (5 mg/kg; subkutane Injektion) oder Meloxicam (1 mg/kg; subkutane Injektion) zur Analgesie und Ceftazidim (25 mg/kg; subkutane Injektion) zur Vorbeugung einer Infektion.
HINWEIS: Der Einsatz von Antibiotika ist keine Alternative zu einer aseptischen Technik. Perioperative Antibiotika (z. B. Ceftazidim) können unter bestimmten Umständen indiziert sein, z. B. bei Langzeitoperationen oder beim Einsetzen chronischer Implantate. - Beobachten Sie das Tier, bis es wieder ausreichend Bewusstsein erlangt, um das Brustbein zu erhalten.
- Hausmäuse einzeln und injizieren Meloxicam (1 mg/kg; subkutane Injektion; alle 24 Stunden) für eine Woche, um postoperative Schmerzen zu lindern. Überprüfen Sie das Tier jeden Tag nach der Operation, um sicherzustellen, dass es normal isst, trinkt und defäkiert.
- Führen Sie nach 3 oder mehr Wochen eine Baseplattierung durch.
3. Grundbeschichtung
HINWEIS: In der Regel kann das Baseplating-Verfahren (Abbildung 5) aufgrund der Erholungs- und Virusinkubationszeit nicht innerhalb von 2-3 Wochen nach dem ersten Eingriff durchgeführt werden. Die Induktionsverfahren für die Grundplattierung ähneln denen, die in den Schritten 2.1.1 bis 2.1.8 beschrieben sind. Die Bodenbeschichtung ist jedoch kein invasives Verfahren, und das Tier benötigt nur eine leichte Sedierung. Daher sind 0,8-1,2% Isofluran ausreichend, solange sich das Tier nicht auf dem stereotaktischen Rahmen bewegen kann. Darüber hinaus kann eine relativ leichte Isofluran-Anästhesie auch dazu beitragen, die Expression der Fluoreszenztransienten von Neuronen während des Monitoringszu erleichtern 8 (Ergänzendes Video S2).
- Schneiden Sie die dünne Schicht des Dentalzementdaches vorsichtig mit einem Knochenrongeur und entfernen Sie den Silikonkautschuk. Reinigen Sie die Oberfläche der Relaislinse mit 75% igem Alkohol.
- Befestigen Sie eine Stellschraube neben der Grundplatte, um sie an der Unterseite des Miniskops zu befestigen (Abbildung 5A1).
HINWEIS: Die Grundplatte muss sicher unter der Unterseite des Miniskops festgezogen werden, da der Unterschied zwischen einer festgezogenen und einer leicht befestigten Grundplatte zu einem ungleichmäßigen Abstand führen kann. - Stellen Sie den Fokusschlitten so ein, dass er ca. 2,7 bis 3 mm vom Hauptgehäuse entfernt ist (Abbildung 5A2).
HINWEIS: Obwohl die Länge während des Grundplattierungsvorgangs weiter eingestellt werden kann, fixieren Sie sie auf ca. 2,7 mm, da das gleichzeitige Einstellen der Miniskoplänge und der optimalen Länge zwischen der implantierten Relaislinse und der vorverankerten Objektivlinse sehr verwirrend ist. - Schließen Sie das Miniskop an die Datenerfassungskarte an und schließen Sie es an einen USB 3.0-Anschluss (oder höher) an einem Computer an.
- Führen Sie die vom UCLA-Team entwickelte Datenerfassungssoftware aus.
- Stellen Sie die Belichtung auf 255, die Verstärkung auf 64x und die Anregungs-LED auf 5% ein. Diese Einstellungen werden für die anfängliche Grundplattierung empfohlen. Die spezifischen Einstellungen variieren in Abhängigkeit von den Hirnregionen und den Expressionsniveaus des genetisch kodierten Kalziumindikators.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Verbinden , um das Miniskop mit der Datenerfassungssoftware zu verbinden und den Livestream anzusehen.
- Richten Sie das Miniskop-Objektiv von Hand auf das Relaisobjektiv aus und beginnen Sie mit der Suche nach den Fluoreszenzsignalen (Abbildung 5B1).
HINWEIS: Die manuelle Suche nach dem Fluoreszenzsignal erleichtert zunächst die Anpassung. Da ein AAV-System verwendet wurde, um den genetisch kodierten Kalziumindikator zu exprimieren, beeinflussten sowohl der Promotortyp als auch der AAV-Serotyp die Effizienz der Transfektion23,24. Die Forscher sollten die Expression des Kalziumindikators überprüfen müssen, indem sie einzelne Neuronen finden, die Veränderungen in der Fluoreszenz zeigen, bevor sie mit zukünftigen Experimenten fortfahren. - Bohren Sie den Zahnzement an einer beliebigen Stelle aus, an der er das Miniskop blockiert (optional).
- Sehen Sie sich den Live-Stream der Datenerfassungssoftware an und nutzen Sie den Rand der Relaislinse als Orientierungspunkt (Ergänzungsvideo S2). Der Rand der Relaislinse erscheint als mondähnlicher grauer Kreis auf dem Monitor (Abbildung 5B1; weiße Pfeile).
- Sobald die Relaislinse gefunden wurde, stellen Sie die verschiedenen Winkel und Abstände des Miniskops sorgfältig ein, bis die Fluoreszenzsignale gefunden werden.
HINWEIS: Die Bilder der Neuronen sind weißer als der Hintergrund. Eine präzise neuronale Form zeigt an, dass die Neuronen perfekt auf der Brennebene der Relaislinse liegen. Runde Neuronen deuten darauf hin, dass sie sich in der Nähe der Brennebene befanden. Die neuronale Form ist im Gehirn unterschiedlich, hier wird ventrales CA1 als Beispiel gezeigt. - Wenn kein einzelnes Neuron Veränderungen der Fluoreszenz in Abhängigkeit von der Zeit aufweist, verschließen Sie die Basis mit Silikonkautschuk. Eine Fluoreszenz wird nicht beobachtet, da die Inkubationszeit auch von der Eigenschaft des Virus23,24 abhängt. Führen Sie die Schritte 3.1-3.12 nach einer weiteren Woche durch. (Dies ist optional).
- Halten Sie das Miniskop in der optimalen Position, und bewegen Sie den stereotaktischen Arm mit einer wiederverwendbaren Klebemasse in Richtung des Miniskops (Abbildung 5B2). Kleben Sie das Miniskop mit wiederverwendbarer Klebemasse auf den stereotaktischen Arm.
- Passen Sie die x-, y- und z-Arme leicht an, um nach der besten Ansicht zu suchen (ergänzendes Video S2). Passen Sie als Nächstes den Winkel zwischen der Oberfläche der Objektivlinse und der Relaislinse an, indem Sie die Ohrstange, die Zahnstange oder die wiederverwendbare Klebemasse auf der Z-Achse drehen. Die virale Expression und Linsenimplantation ist erfolgreich, wenn mindestens eine Zelle Fluoreszenztransienten aufweist (Abbildung 6A; Ergänzendes Video S2) während der Grundbeschichtung (die auch von der Region des Gehirns abhängt, wie z.B. die CA1).
HINWEIS: Wenn der Monitor nur weiße Zellen, aber keine Transienten anzeigt, liegt eine andere Ursache vor (siehe Abbildung 6B, C, Ergänzende Videos S4, S5, Abschnitt "Ergebnisse" und Abschnitt "Fehlerbehebung"). - Zementieren Sie die Grundplatte (Abbildung 5B2) mit dem Zahnzement.
- Überwachen Sie den interessierenden Bereich während der Zementierung, um sicherzustellen, dass sich die optimale Position nicht ändert.
- Verwenden Sie die kleinstmögliche Menge Zement und verkleben Sie die Grundplatte dennoch fest auf die Zahnzementbasis (Abbildung 5B2). Tragen Sie eine zweite und dritte Schicht Zement um die Grundplatte auf, aber achten Sie darauf, die GRIN-Linse nicht zu beeinträchtigen.
HINWEIS: Das Auftragen von Zement auf die Grundplatte ist in diesem Schritt einfacher, da die Basis der Grundplatte während des Dummy-Beschichtungsvorgangs geformt wurde. - Lösen Sie das Miniskop vorsichtig von der Grundplatte, wenn der Zement ausgehärtet ist. Schrauben Sie dann eine Schutzkappe auf.
- Bringen Sie das Tier in einen Aufwachkäfig. Beobachten Sie das Tier, bis es wieder ausreichend Bewusstsein erlangt, um das Brustbein zu erhalten.
- Hausmäuse einzeln. Stellen Sie sicher, dass es jeden Tag normal isst, trinkt und defäkiert. Warten Sie 5 Tage, bis sich die Maus vollständig erholt hat, und überprüfen Sie dann die Kalziumbildgebung.
HINWEIS: Es gibt nur eine kleine Menge Zahnzement, der die Grundplatte hält. Wenn sich die Grundplatte seit dem Baseplattierungsverfahren erheblich verschoben hat, entfernen Sie den Zahnzement mit einem Bohrer und führen Sie den Baseplattierungsvorgang erneut durch. - Anästhesieren (durch intraperitoneale Injektion eines Gemischs aus Ketamin (87 mg/kg)/Xylazin (13 mg/kg)) und Perfusion25 des Tieres, wenn alle Versuche durchgeführt sind.
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Representative Results
Beurteilung der Volumenveränderung des Dentzement
Da sich das Volumen des Zahnzement während des Aushärtungsprozesses ändert, kann dies die Abbildungsqualität erheblich beeinträchtigen, da der Arbeitsabstand einer GRIN-Linse etwa 50 bis 350 μm 4,8 beträgt. Daher wurden in diesem Fall zwei kommerziell erhältliche Zahnzemente, Tempron und Tokuso, vor der Implantation und Baseplattierung getestet (Abbildung 5). Zunächst wurden Videos ausgewertet, um festzustellen, ob die Zemente geschrumpft waren, und dann wurden die Volumina der Zemente verglichen, wenn sie vollständig getrocknet waren. Die gleiche Konzentration und das gleiche Volumen der Ausgangsmischungen von Dentalzementen wurden in Pipettenspitzen geladen und auf Video aufgezeichnet (Ergänzungsvideo S1). Video S1 zeigte, dass beide Zemente während des Trocknungsprozesses schrumpften. Tokuso schnitt besser ab als Tempron (d.h. es hatte auch nach dem Schrumpfen ein größeres Volumen als Tempron): Abbildung 3B; mittleres Volumen von Tempron: 0,93 ± 0,07 ml; mittleres Volumen von Tokuso: 1,18 ± 0,07 ml; t-Test: p = 0,048, t(6) = 2,46, was darauf hindeutet, dass es weniger geschrumpft ist. Die Dichten der Zemente wurden auch 4 mal nach vollständiger Trocknung getestet. Tokuso hatte eine niedrigere mittlere Dichte als Tempron (mittlere Dichte von Tempron: 1,07 ± 0,12 g/ml; mittlere Dichte von Tokuso: 0,93 ± 0,08 g/ml; t-Test: p = 0,38, t(6) = -0,94), was bedeutet, dass es eine niedrigere Schrumpfrate hatte. Daher wurde Tokuso für die folgenden Implantations- und Baseplating-Schritte verwendet. Der Zweck der Beschreibung des obigen Experiments besteht nicht darin, irgendwelche Marken zu empfehlen, sondern die Experimentatoren daran zu erinnern, einen Zahnzement zu finden, der beim Aushärten keine wesentliche Volumenänderung erfährt.
Messung der Bildverschiebung
Wir simulierten die Dummy-Baseplating- und Original-Baseplating-Verfahren an einem festen Objekt, um zu untersuchen, ob das Dummy-Baseplating-Verfahren zu einer geringeren Verschiebung der Grundplattenposition führt als das ursprüngliche Verfahren. Ein lichthärtender Klebstoff wurde verwendet, um eine 23 g 2,5 cm Spritzennadel in der Mitte einer Grundplatte zu fixieren, wobei 1 cm aus der Grundplatte herausragte (Abbildung 3C). Dann wurde die Grundbeschichtung simuliert, indem die Nadeln mit dem Arm eines stereotaktischen Instruments gehalten wurden. Anstelle von Versuchstieren wurde ein Aufkleber auf den Tisch des stereotaktischen Instruments geklebt. Die Spritzennadel durchbohrte den Aufkleber und stellte damit den ursprünglichen Ort dar. Dann wurde die Nadel um 0,5 mm angehoben und die Simulationsoperationen wurden gestartet. In einer Operation, die das einmalige Baseplating-Verfahren8 nachahmt, wurde Zahnzement aufgetragen, bis er die Grundplatte bedeckte, die sich 1 cm über dem Aufkleber befand. Dann gab es eine Wartezeit von 2 Stunden, bis der Zement ausgehärtet war, bevor die Nadel vorsichtig gedrückt wurde, um den Aufkleber erneut zu durchbohren. Da der lichthärtende Klebstoff die Nadel nicht vollständig stabilisierte, konnte die Nadel tiefer gedrückt werden, um ein weiteres Loch zu erzeugen, das die Position der Grundplatte darstellte, nachdem der Zahnzement getrocknet war. Der Abstand zwischen dem ersten Loch und dem zweiten Loch wurde gemessen, um die Ortsverschiebung der Nadel zu quantifizieren. Die Ergebnisse zeigten, dass die Grundplatte 1 cm über dem Schädel zu einer Positionsverschiebung von 1,76 ± 0,14 mm führte, die Dummy-Grundplatte jedoch nur zu einer Verschiebung von 0,75 ± 0,17 mm führte (Abbildung 3D; mittlerer Verschiebungsabstand der einmaligen Grundplattierung im Vergleich zur Dummy-Grundplatte; t-Test: p < 0,01, t(8) = 6,03).
Außerdem waren wir neugierig, ob die Höhe des Zahnzements die Verschiebung beeinflussen würde. Daher haben wir eine kürzere Höhe (Abbildung 3E; 0,5 cm oben) mit dem einmaligen Baseplating-Verfahren getestet. Die Grundplatte, die 0,5 cm über dem Schädel verankert war, verschob sich deutlich weniger als die Grundplatte 1 cm über dem Schädel (Abbildung 3F; mittlerer Verschiebungsabstand: 0,43 ± 0,11 vs. 1,76 ± 0,14 mm; t-Test: p < 0,01, t(8) = 9,73). Die Daten deuteten darauf hin, dass die Höhe der Grundplatte über dem Schädel und die Entfernung, in der sich die Grundplatte verschob, positiv korrelierten. Da auf die Dummy-Baseplattierung ein zweiter Baseplating-Schritt folgt, bei dem nur eine minimale Menge an Zahnzement verwendet wird, stützen diese Daten auch die Hypothese, dass die Dummy-Baseplattierung dazu beiträgt, die Präzision des Baseplattierungsverfahrens zu verbessern.
Bildgebung mit einem Zwei-Linsen-Miniskop-System
Durch die Befolgung der chirurgischen Protokolle für die virale Infusion, die Dummy-Baseplattierung und die Baseplattierung (Abbildung 2, Abbildung 4, Abbildung 5) beobachteten wir Fluoreszenztransienten einzelner Neuronen bei drei Mäusen (n = 3/5) (Abbildung 6A, Ergänzendes Video S3) während des Baseplating-Verfahrens und nach dem Baseplating-Verfahren, während sich die Mäuse frei bewegten, was bestätigte, dass der Arbeitsabstand zwischen dem Objektiv und der Relaislinse gleich blieb (Abbildung 6A1 Im Vergleich zu Abbildung 6A3 trat nur eine geringfügige Positionsverschiebung auf), nachdem der Zahnzement vollständig getrocknet war. Hier zeigen wir Videos von der Grundierung einer Maus (Ergänzungsvideo S2; Maus #5) und der anschließenden Kalziumbildgebung, während sich Mäuse frei bewegten (Ergänzungsvideo S3; Maus #3, #4, #5; Rohdaten). Bitte beachten Sie, dass die Datenerfassungssoftware für V3 keine Funktionen für die Hintergrundsubtraktion enthält und der Kontrast des Videos durch Offline-Verarbeitung verbessert werden kann. Für das ergänzende Video S2 wurde eine manuelle Suche nach den Fluoreszenzsignalen durchgeführt und dann das Miniskop zur Feineinstellung am stereotaktischen Arm befestigt. Einige Fluoreszenztransienten wurden während der Sondierung beobachtet (Ergänzendes Video S2; Abbildung 6A). Ein Transient ist eine sanfte Helligkeitsverschiebung in grauen oder weißen Flecken, kein Feuermuster, das einem blinkenden Licht ähnelt. Die Abbildungen 6A 1 bis 6A2 zeigen Bilder von Transienten. Das Video von sich frei verhaltenden Mäusen zeigte eine akzeptable räumliche Verschiebung im Vergleich zur interessierenden Region während des Baseplating-Verfahrens (Ergänzungsvideo S3). Die Ränder der Zellen konnten in diesem Stadium nicht signifikant verbessert werden, da wir den Abstand zwischen der Unterseite der Relaislinse und den aktiven Neuronen nicht einstellen konnten. Bemerkenswert ist, dass während des Grundplattierungsvorgangs häufig Probleme auftreten können, einschließlich des Fehlens von etwas anderem als einem einheitlichen Hintergrund (Abbildung 6B; Ergänzendes Video S4) oder Sichtbarkeit von weißen Blutkörperchenrändern ohne Fluoreszenztransienten (Abbildung 6C; Ergänzendes Video S5). Es werden auch zwei Beispiele für negative Ergebnisse angeführt (n = 2/5) (Abbildung 6B, C, Ergänzende Videos S4, S5). Die möglichen Gründe für die Fehler werden im Abschnitt Diskussion untersucht. Die chirurgischen Eingriffe für diese beiden Mäuse wurden durchgeführt, ohne dass eine Nadel mit einem Durchmesser von 1 mm verwendet wurde, um den Weg freizumachen. Somit wurde die Relaislinse direkt implantiert. Wir schlagen vor, dass in Maus #2 die Relaislinse die Neuronen komprimiert und einige Neuronen nach unten gezogen hat, was zu beschädigten Neuronen geführt hat. Daher wurden keine Fluoreszenztransienten gefunden.
Abbildung 1: Mechanismen des Miniskops und die Defekte, die normalerweise zu einem Abbildungsfehler führen. (A) Cartoon-Diagramm der Relaislinse und des Objektivs, das die Mechanismen zeigt, die für die Visualisierung von Fluoreszenzzellen in einem Zwei-Linsen-System erforderlich sind. Die Signalwellen jeder Linse betonen die Bedeutung und den Mechanismus, der bei der Suche nach einem Arbeitsabstand zur Visualisierung der fluoreszierenden Zellen eine Rolle spielt. (A1) Die Relais-GRIN-Linse wird über den Zielneuronen innerhalb des Arbeitsabstands platziert. Da der Abstand der Relaislinse 0,5 * N beträgt (wobei N eine ganze Zahl ist), ermöglicht die Linse die Visualisierung von Zielneuronen durch Weiterleitung von Licht, wodurch die ursprünglichen Fluoreszenzsignale an die Oberseite der Relaislinse gebracht werden. Dann wandert etwa 1/4 einer vollen sinusförmigen Lichtperiode durch das GRIN-Objektiv (~ 0,25 Pitch) und führt zu einem vergrößerten Bild. (A2) Das Objektiv überträgt die Bilder an einen komplementären Metall-Oxid-Halbleiter-Sensor (CMOS), der sich oben (die grüne Platte im Diagramm) des Miniskops befindet. (B) Cartoon-Diagramm, das die Unterschiede in den GRIN-Linsenimplantationsverfahren zwischen einem (B1) Zwei-Linsen-System und (B2) einem Ein-Linsen-System darstellt. Im Allgemeinen besteht der Hauptunterschied darin, dass das Ein-Linsen-System direkt seine Objektivlinse verwendet, um die Oberfläche des Gehirns abzubilden. Daher muss die Objektivlinse auf den Zielneuronen implantiert werden. (C) Im Gegensatz dazu wird beim Zwei-Linsen-System im Vergleich dazu eine zusätzliche Relaislinse in das Gehirn implantiert und das Objektiv im Miniskop vorverankert. (C1) Die Form der Grundplatte für die V3-Version des UCLA Miniscope kann zu einer ungleichmäßigen Verschiebung führen, nachdem der Zahnzement vollständig getrocknet ist. (C2) Diese Verschiebung führt zu einer Fehlausrichtung oder Abweichung vom Arbeitsabstand zwischen der Relaislinse und der Objektivlinse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Modifizierte Protokolle und detaillierte Operationsprotokolle zur Verbesserung der Erfolgsrate des Zwei-Linsen-Miniskop-Systems. (A1) Modifiziertes Operationsprotokoll für das Zwei-Linsen-System. Die Orte der viralen Injektion und der Implantation der Relais-GRIN-Linse sind dargestellt. Die Dummy-Baseplattierung ermöglicht es, dass der Arbeitsabstand die interessierenden Neuronen genau umfasst und die mit dem (A2) Baseplating-Verfahren verbundenen Positionsverschiebungen reduziert werden. Daher (A3) ist die Wahrscheinlichkeit, fluoreszierende Zellen in frei agierenden Mäusen abzubilden, erhöht. (B) Cartoon-Bild der Schritte für die virale Injektion und die Platzierung der Relais-GRIN-Linse. (B1) Markieren Sie zunächst die Aspirationsnadel mit einem Stift ca. 1 mm (für Mausexperimente) von der Spitze, um die Beurteilung der Aspirationstiefe des Kortex zu erleichtern. Dann saugen Sie das Bindegewebe und den Kortex (ca. 1 mm tief bei Mäusen) aus dem Gehirn ab. (B2) Verwenden Sie den ventralen Hippocampus als Zielbereich, um eine Relaislinse zu implantieren. Bemerkenswert ist, dass das zähe Corpus callosum der Orientierungspunkt für das Stoppen der Aspiration der kortikalen Region ist. Die faserige Textur des Corpus callosum ist während der Aspiration unter dem Stereomikroskop zu sehen. (B3) Zweitens punktieren Sie die interessierende Stelle mit einer inneren Nadel eines 20-G-Katheters (ca. 1 mm Durchmesser; der Durchmesser ist ähnlich dem der Relaislinse), um einen Weg vor der Virusinfusion freizumachen. Unter dem Stereomikroskop sollte eine durch die Nadel erzeugte Delle (gestrichelter Kreis im Bild) sichtbar sein. Senken Sie die Mikroinjektionsnadel und die Relaislinse an der Delle ab (oder nur 250 μm von der Mitte der Delle entfernt). Platzieren Sie schließlich die Relais-GRIN-Linse (in der vorliegenden Studie haben wir eine Relaislinse mit einem Durchmesser von 1 mm verwendet). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Messung der Volumenänderung des ausgehärteten Zahnzements . (A) Ein Beispiel mit ausgehärtetem Zahnzement zweier Marken. Die schwarzen Pfeile zeigen die ursprünglichen Werte an, nachdem wir das Pulver und die Lösung gemischt haben. Die weißen Pfeile zeigen die Werte nach 10, 20 und 40 Minuten Aushärtung an. Die roten Pfeile zeigen auf die Unterseite der Spitzen, die mit Lichtkleber versiegelt wurden. (B) Mittleres Volumen der verbleibenden Zahnzemente nach vollständiger Trocknung. Die Balken und Fehlerbalken sind die Mittel ± SEMs. * bezeichnet die Signifikanz (P < 0,05), die durch den t-Test des Schülers bestimmt wird. (C) Abbildungen und ein Foto, auf dem das Verfahren zur Messung der Lageverschiebung der Grundplatte erläutert wird. Eine Nadel wurde durch die Grundplatte geklebt und wurde verwendet, um das ursprüngliche Baseplating-Verfahren (One-Step-Baseplating) und das Dummy-Baseplating-Verfahren zu simulieren. Die roten und schwarzen Pfeile stellen die Positionen der Nadel vor und nach der Aushärtung des Zahnzement dar. (D) Mittlere Abstandsänderungen der Nadelspitze (E) Abbildungen der Methode zur Messung des Zusammenhangs zwischen der Grundplatte über Schädelhöhe und der Ortsverschiebung. (F) Mittlere Abstandsänderungen der Nadelspitze. Die Balken und Fehlerbalken sind die Mittel ± SEMs. ** bezeichnet die Signifikanz (P < 0,01), die durch den t-Test des Schülers bestimmt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Detailliertes Dummy-Baseplating-Verfahren (wird unmittelbar nach der Implantation der Relaislinse ausgeführt). (A1) Dreistufige Karikatur des Objektivs, der Grundplatte und der Paraffinfolie auf dem Miniskop. (A2) Fotoversion der Versammlung. (B1) Karikatur, die das Dummy-Baseplating-Verfahren zeigt. Zunächst wird das zusammengebaute Miniskop auf das Relaisobjektiv ausgerichtet. Das Objektiv ist so nah wie möglich am Relaisobjektiv positioniert. Zweitens wird dem Parafilm, der die Grundplatte umgibt, Zahnzement zugesetzt und auf den Schädel aufgetragen, um eine weibliche Form für die zukünftige Grundierung herzustellen. Dann wird die Grundplatte entfernt und Silikonkautschuk (rosa) wird hinzugefügt und mit Zahnzement überzogen, um die weibliche Form und die Relaislinse zu schützen. Das Tier darf sich dann von der Narkose erholen. Nach mindestens 3 Wochen wird das Baseplating-Verfahren durchgeführt. (B2) Fotoversion von (B1). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Schritte für das Baseplating-Verfahren. (A1) Befestigen Sie die Grundplatte und (A2) stellen Sie den Fokusschieberegler manuell auf 2,7 bis 3 mm ein. Eine Einstellung von 2,7 bis 3 mm (an der im Bild gezeigten Position) scheint der beste Ausgangspunkt zu sein, bevor man manuell nach den fluoreszierenden Zellen sucht. (B1) Das erste Cartoon-Diagramm veranschaulicht die Bedeutung der Länge zwischen der Objektivlinse und der Relaislinse für die Visualisierung der fluoreszierenden Zellen (fluoreszierende Zellen werden normalerweise in einem Abstand zwischen 0,5 und 2 mm beobachtet). Bevor die fluoreszierende Zelle austritt, sollte der Forscher den Rand der Relaislinse sehen (Pfeile im oberen Bild). Hilfreich ist es, das Objektiv zunächst manuell auf die optimale Betrachtungsposition einzustellen, da sich schnelle Einstellungen von Hand einfacher vornehmen lassen. (B2) Legen Sie wiederverwendbare Klebemasse auf die stereotaktische Armsonde und stabilisieren Sie dann das Miniskop, indem Sie es mit wiederverwendbarer Klebemasse auf den Arm kleben. In diesem Stadium kann sich der interessierende Bereich verschoben haben, aber dies kann leicht behoben werden, indem der stereotaktische Arm und der wiederverwendbare Klebeband leicht angepasst werden. Nachdem Sie die optimale Region von Interesse gesucht und gefunden haben, fügen Sie eine kleine Menge Zahnzement hinzu (rot dargestellt). Kleben Sie die Grundplatte mit so wenig Zahnzement wie möglich. Trennen Sie das Miniskop und die Grundplatte, nachdem der Zahnzement getrocknet ist. Wenn die Grundplatte nicht stabil genug ist, fügen Sie zusätzlichen Zahnzement hinzu. (C) Dieses Diagramm veranschaulicht die Bedeutung jedes Schritts für den Erfolg. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Beispiele für Erfolg und Misserfolg während des Baseplating-Vorgangs. (A) Ein Beispiel für eine erfolgreiche Bildgebung während des Baseplating-Vorgangs. Die Relaislinse zielte auf den ventralen Hippocampus. Fluoreszenztransienten wurden beobachtet, wenn das Tier unter Narkose mit Isofluran stand (siehe auch ergänzendes Video S2). (A2) Der Kontrast wurde für eine bessere Sichtbarkeit erhöht. Die roten gestrichelten Linien zeigen Blutgefäße an. (A3) Fluoreszenztransienten fünf Tage nach dem Baseplating, wenn sich die Maus # # # in ihrem Käfig frei verhält (siehe auch Ergänzungsvideo S3; die Bilder der Mäuse #3 und #4 sind auch im Ergänzungsvideo S3 enthalten). Es kam nur zu einer leichten Positionsverschiebung. (B1) Ein Beispiel für einen Fehler. Bei der Grundierung fielen nur homogene weiße/graue Bereiche auf, die nicht zellartig geformt waren (siehe auch Ergänzungsvideo S4). (B2) Die Relaislinse verfehlte den Zielbereich und befand sich über einer Region ohne infizierte Zellen. (C1) Ein weiteres Beispiel für einen Fehler. Obwohl bei dieser Maus viele runde Zellen beobachtet wurden, wurden während der Basisplattierung (nach dreiwöchiger Inkubation und während der Anästhesie/Sedierung der Maus) keine Fluoreszenztransienten beobachtet. Darüber hinaus traten keine Fluoreszenztransienten auf, wenn das Baseplating-Verfahren erneut durchgeführt wurde (in der fünften Woche der Inkubation) oder sogar, wenn sich das Tier frei verhielt. Das Bild wurde während des Baseplatings in der fünften Inkubationswoche aufgenommen (siehe auch Ergänzungsvideo S5). (C2 und C3) Die Relaislinse verfehlte die Pyramidenschicht des ventralen Hippocampus. Die blauen Punkte sind Kerne, die mit DAPI gefärbt wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Problem | Mögliche Ursache | Lösung | ||
| Hatte eine gute Bildgebung bei der Grundierung, aber am nächsten Tag völlig unscharf | Volumenänderung beim Aushärten des Zahnzements zwischen dem Schädel des Probanden und der Grundplatte | Nach der Linsenimplantation ist mit dem "Dummy-Baseplating" zu verfahren, wie im vorliegenden Bericht vorgeschlagen. Wählen Sie einen Zahnzement, der weniger Volumenänderung aufweist. | ||
| Hat homogene weiße/graue Bereiche ohne zellartige Form während der Grundbeschichtung (siehe auch ergänzendes Video S4) | Ein. Die Relaislinse verfehlte den Zielbereich B. Schlechte Expression des Fluoreszenzindikators C. Vergessen Sie, ein Objektiv unter dem Miniskop zu installieren, wo der Fluoreszenzindikator tatsächlich exprimiert wird | A. Verwenden Sie Dummy-Linsen zum Üben von Operationen. Überprüfen Sie die Koordinaten der Dummy-Linse nach der übenden Implantation B. Finden Sie einen optimalen viralen Titer für Calcium-Imaging-Experimente (siehe Resendez et al. 2016). Wenn aus irgendeinem Grund keine Vortests durchgeführt werden können, empfehlen wir Anfängern, zuerst einen höheren Titer zu versuchen. (Weitere Informationen finden Sie im Abschnitt Diskussion) C. Schrauben Sie ein GRIN-Objektiv (~ 0,25 Raster) auf. Stock #64-519) am unteren Rand des Miniskops. | ||
| Beobachtung vieler Zellen, aber keine Fluoreszenzdynamik während der Grundbeschichtung | A. Ungesunde Neuronen oder tote Neuronen B. Spärliche Schönung von Neuronen C. Tiefnarkosestatus | A. Seien Sie vorsichtig bei jedem chirurgischen Eingriff. Verwenden Sie eine neue Spritzennadel, die dem Durchmesser Ihrer Relaislinse entspricht, um zuerst den Infusions-/Implantationsweg zu unterbrechen, um den Druck durch Linsenimplantation zu verringern. Infundieren Sie langsam das Virus und implantieren Sie langsam die Linse. Warten Sie länger, um die Aktivitäten der Neuronen zu überwachen, oder kneifen Sie den Schwanz ein wenig zusammen, um die Maus zu stimulieren. C. Baseplating ist kein invasives Verfahren, und das Tier braucht nur Sedierung. Daher ist die Aufrechterhaltung von 1,2 ~ 0,8% Isofluran ausreichend, solange sich das Tier nicht auf dem stereotaktischen Rahmen bewegen kann. | ||
Tabelle 1: Diagramm zur Fehlerbehebung.
Ergänzendes Video S1: Dentalzement-Volumentest. Die Differenz zwischen dem Volumen wurde zu Beginn der Zahnzementherstellung und dem Volumen nach dem Trocknen des Zements gemessen. Zwei Marken von Dentzement (z. B. Tempron und Tokuso Curefast) wurden getestet. Um das Volumen des Zahnzements nach dem Trocknen zu testen, wurden 0,5 g jedes Zahnzementpulvers gewogen und mit der entsprechenden Lösung (1 ml) gemischt. Dann wurden 0,1-10 μL Pipettenspitzen mit 2,5 μL der Dentalzementmischung beladen und mit lichthärtendem Klebstoff versiegelt. Dann wurden die Spitzen auf ein Gestell gelegt, die Oberflächen der Dentalzementmischungen markiert und 40 Minuten lang gefilmt. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Ergänzendes Video S2: Demonstrationen des Baseplating-Verfahrens. Der Winkel zwischen der Oberfläche der Objektivlinse und der Relaislinse wurde durch Drehen der Ohrstange, der Zahnstange oder der wiederverwendbaren Klebemasse auf der z-Achse eingestellt. Der Rand der Relaislinse erschien als mondähnlicher grauer Kreis auf dem Monitor. Eine erfolgreiche Virusexpression und Linsenimplantation sollte mindestens eine Fluoreszenzdynamik (Pfeile) während der Grundbeschichtung zeigen. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Ergänzendes Video S3: Demonstrationen der Fluoreszenzdynamik in frei verhaltenden Mäusen. Fluoreszenztransienten von Mäusen #3, #4 und #5. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Ergänzendes Video S4: Ein Beispiel für einen Fehler. Während des Baseplating-Vorgangs erschien ein einheitlicher Hintergrund. Bitte beachten Sie, dass die Helligkeitsänderung nicht auf die Fluoreszenztransienten einzelner Zellen zurückzuführen ist. Es wurde durch das Suchverfahren verursacht. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Ergänzendes Video S5: Demonstration eines weiteren Fehlerbeispiels. Während des Baseplating-Verfahrens trat ein Mangel an Fluoreszenztransienten auf, aber einige runde Zellränder waren immer noch sichtbar. Bitte beachten Sie, dass die Helligkeitsänderung nicht durch die Fluoreszenztransienten einzelner Zellen verursacht wurde. Es wurde durch das Suchverfahren verursacht. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
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Discussion
Der vorliegende Bericht beschreibt ein detailliertes Versuchsprotokoll für Forscher, die das zweilinsige UCLA Miniscope-System verwenden. Die in unserem Protokoll entwickelten Werkzeuge sind relativ erschwinglich für jedes Labor, das die In-vivo-Calcium-Bildgebung ausprobieren möchte. Einige Protokolle, wie z. B. Virusinjektion, Linsenimplantation, Dummy-Baseplating und Baseplating, könnten auch für andere Versionen des Miniscope-Systems verwendet werden, um die Erfolgsrate der Kalzium-Bildgebung zu verbessern. Abgesehen von allgemeinen Problemen mit der Virusinjektion und der Linsenimplantation, die unabhängig von der Miniskop-Version behoben werden müssen, kann die Struktur der UCLA-Grundplatte zu einer Positionsverschiebung führen, die zu nicht übereinstimmenden Arbeitsabständen zwischen Objektiv und Relaislinse führen kann (Abbildung 1C). Ein modifiziertes Versuchsprotokoll wurde entwickelt, um die Positionsverschiebung der beiden Linsen zu minimieren (Abbildungen 2, Abbildung 4, Abbildung 5). Eine erfolgreiche Calcium-Bildgebung kann durch eine Kombination aus erfolgreicher Virusexpression, Linsenimplantation und Baseplating-Verfahren erreicht werden (Abbildung 5C). Die Verwendung eines Zwei-Linsen-Systems zur Beobachtung tiefer Hirnareale erfordert ein hohes Maß an Genauigkeit bei den Grundplattierungsverfahren, da auch die relativen Positionen der implantierten Relaislinse und der Objektivlinse genau sein müssen. Dieser Bericht stellt nicht nur ein Protokoll vor, das Probleme mit der Grundplattierung löst, sondern diskutiert auch einige Tipps für die Virusinjektion und die Linsenimplantation. Im Folgenden diskutieren wir zuerst die Baseplating-Verfahren, gefolgt von der viralen Injektion und den Linsenimplantationsverfahren, und wir beschreiben einige Beispiele für Fehler (Abbildung 6).
Bodenbeanspruchung
Die V3-Version des UCLA Miniscope ist derzeit das am häufigsten verwendete Design und kann online bestellt werden. Die Grundplatte dieser Version besteht aus zwei Kanten ohne Wände (Abbildung 1C1), aber ihre Form kann eine ungleichmäßige Verschiebung verursachen (Abbildung 1C1, C2), nachdem der Zahnzement vollständig trocken ist. Die Dummy-Baseplattierungsverfahren in unserem Protokoll (Abbildung 4) minimieren die Probleme mit der Fehlausrichtung und der Verschiebung der Grundplatte, da Paraffinfolie verwendet wird, um den verfügbaren Platz für den Dentzement während der realen Grundbeschichtung zu reduzieren (Abbildung 5B). Der verbleibende Platz reicht noch aus, um während des realen Baseplating-Prozesses eine optimale Abbildungsposition zu finden. Daher kann der Forscher die Grundplatte mit möglichst wenig Zahnzement verkleben (Abbildung 5B2). Darüber hinaus nimmt das Dummy-Baseplating-Verfahren relativ wenig Zeit in Anspruch (ca. 15 bis 20 Minuten), da kein perfekter Abstand zwischen Objektiv und Relaislinse erreicht werden muss. Die Dummy-Baseplattierung ist jedoch nur einer der Schlüsselfaktoren für eine erfolgreiche Calcium-Bildgebung. Zum Beispiel können Neuronen bei der Überwachung von Fluoreszenzsignalen verschwommen erscheinen, wenn sie sich leicht von der Arbeitsebene entfernen (abhängig vom Arbeitsabstand der Relaislinse; oft etwa 100 ~ 300 μm). Die Fähigkeit, den Arbeitsabstand zu verbessern, ist begrenzt, da der Arbeitsabstand der Neuronen durch das Verfahren der Relaislinsenimplantation vorgegeben ist. Ein Experiment wurde ohne das Dummy-Baseplating-Verfahren durchgeführt und der interessierende Bereich wurde nach einmaliger Baseplattierung immer (bei vier von vier Mäusen) übersehen. Daher wurden diese Lösungen entwickelt, um das Schrumpfungsproblem zu reduzieren. Einige lichthärtende Zahnzemente können das Problem der Schrumpfung während der Aushärtung vermeiden, da sie sehr schnell aushärten. Diese Zemente können den Forschern helfen, den Abstand während des Baseplating-Verfahrens anzupassen. Obwohl der Wellenlängenbereich für die Anregung der Kalziumindikatoren und die Aushärtung des Zahnzement unterschiedlich ist, muss ein Photobleaching während des Baseplating-Verfahrens verhindert werden. Um Photobleaching zu verhindern, muss der von der Lichtquelle erzeugte Wellenlängenbereich ziemlich eng sein, um Kreuzreaktionen zwischen den Kalziumindikatoren und dem lichthärtenden Zahnzement zu vermeiden. Daher wird die Verwendung von lichthärtendem Zahnzement für das Baseplating-Verfahren nicht empfohlen. Darüber hinaus werden einige bestimmte Marken von Dentalzementen häufig von anderen Forschungsteams zum Verkleben von Grundplatten verwendet 6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22 . Die geringen Schrumpfeigenschaften dieser Zemente können das Problem lösen, aber wir hatten nicht die Möglichkeit, diese Marken zu testen, da es schwierig war, sie zu kaufen (zu importieren). Medizinische Produkte können je nach Land/Region Einfuhrbestimmungen unterliegen. Wenn Forscher Schwierigkeiten haben, auf die in der Literatur 6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22 genannten Zemente zuzugreifen, wird unser Protokoll das Problem der Zahnzementschrumpfung lösen.
Neben dem Schrumpfungsproblem kann es im Laufe vieler Experimente zu strukturellem Verschleiß im Miniskop selbst und an der Grundplatte (insbesondere den Magneten in der Grundplatte) kommen. Jeder kleine Spalt, der durch Verschleiß verursacht wird, verringert die Stabilität des Abstands zwischen den beiden Linsen. Auch hier ist die Genauigkeit über den gesamten optischen Pfad der Schlüssel zur Bildgebung von Kalziumtransienten in frei verhaltenden Mäusen mit einem Miniskop.
Fehlerbehebung bei viraler Injektion/Linsenimplantation
Bevor das Virus in die Hirnregion infundiert wird, wird empfohlen, eine neue Nadel auf den stereotaktischen Arm zu setzen und das Gehirn langsam an den entsprechenden Koordinaten zu punktieren. Da die neue Nadel sehr scharf ist, dient diese Punktion als Vorbereitungsschritt, um den Weg für die eigentliche Mikroinjektionsnadel und Relaislinse freizumachen (oder einen Weg zu schneiden) und minimiert Gewebeschäden, die durch Kompression von der Mikroinjektionsnadel oder Relaislinse verursacht werden können. Die scharfe Nadel schneidet einen Weg für die stumpfe Relaislinse; Daher sollte die Nadelspitze auf die gleichen Koordinaten wie die Relaislinse abgesenkt werden. Die innere Nadel eines 20 G I.V. Katheters wurde gewählt, weil sie einen Durchmesser von 1 mm hatte, was dem Durchmesser unserer Relaislinse entsprach. Je nach Durchmesser der Relaislinse kann eine andere Nadelstärke verwendet werden.
Obwohl sich die vorliegende Studie nicht auf die Eigenschaften und Titer viraler Vektoren konzentrierte, sind diese Faktoren immer noch entscheidend für eine erfolgreiche Calcium-Bildgebung (Abbildung 5C). Es ist notwendig, die Expressionsqualität des viralen Vektors vorab zu testen. Die Schritte 1 bis 5 des Protokolls von Resendez et al. enthalten detaillierte Methoden zur Identifizierung eines optimalen viralen Titers für Calcium-Imaging-Experimente8. Wenn aus irgendeinem Grund kein Vortest durchgeführt werden kann, wird empfohlen, dass Anfänger zuerst einen relativ hohen Titer ausprobieren. Einer der Nachteile der Verwendung eines hohen Virustiters ist die Zytotoxizität8. Abgestorbene Neuronen verursachen eine Autofluoreszenz und sind als helle weiße Flecken unter dem Miniskop8 sichtbar. Diese toten Neuronen sind jedoch gute Orientierungspunkte für Anfänger, um das Baseplating-Verfahren zu finden und zu üben. Auf der anderen Seite, obwohl die Infusion eines Low-Titer-Virus ein geringeres Risiko hat, Zellen zu töten, kann die Fluoreszenz durch den Hintergrund maskiert werden, wenn die Zellen während des Baseplating-Verfahrens keine Fluoreszenztransienten zeigen. Es ist schwierig, die Gründe für das Versagen zu lokalisieren, da die Zielneuronen aufgrund der Implantation von Relaislinsen oder aufgrund der schlechten Expression durch den viralen Vektor übersehen werden können. Die Bestimmung der Ursache ist ohne histologische Bestätigung sehr verwirrend. Daher wird die Verwendung von Viren mit relativ hohem Titer empfohlen, wenn die viralen Vektoren nicht vorab getestet werden können.
Resendez et al. empfehlen, die Mikroinjektionsnadel 250 μm seitlich und ventral zur Platzierung der Linse einzuführen. Unsere Beobachtungen zeigten, dass die Infusion des Virus in der gleichen Tiefe wie die Relaislinse auch zur Expression guter Kalziumsignale führen kann. Wir schlagen vor, dass aufgrund der Möglichkeit einer Infektion und Ausbreitung die Infusion des Virus in der gleichen Tiefe wie die Koordinate der Relaislinse optimal ist, um Gewebeschäden zu reduzieren und die Genauigkeit des Abstands zwischen den infizierten Neuronen und der Relaislinse zu erhöhen. Resendez et al. empfehlen auch die Durchführung einer viralen Injektion und Linsenimplantation während derselben Operation angesichts des engen Arbeitsbereichs zwischen den Zielzellen und der Relaislinse8. Einige Forscher folgen jedoch einem Protokoll, bei dem der virale Infusionsschritt und der Linsenimplantationsschritt im Abstand von zwei (oder mehr) Wochen durchgeführt werden18,26. Die Verlängerung der Zeit zwischen den Schritten reduziert die individuelle Operationszeit. In diesem Protokoll wurden diese beiden Schritte jedoch zu einer Operation zusammengeführt, da der Chirurg im Ein-Operations-Protokoll die Position zwischen der Mikroinjektionsnadel und der Relaislinse überwachen kann, wenn er sie in den Zielbereich absenkt, was die Wahrscheinlichkeit eines fehlgeschlagenen Ziels verringert (Abbildung 2B3).
Bei zwei Mäusen (Mäuse #1 und #2) wurde auch auf die Verwendung einer Nadel verzichtet, um einen Pfad für die Linse zu schaffen, und bei Maus #2 wurden runde zellartige graue Flecken beobachtet (Abbildung 6C). Eine Fluoreszenzdynamik (Ergänzungsvideo S5) wurde jedoch nicht beobachtet. Bei der Untersuchung des Gehirnschnitts dieses Beispiels (Abbildung 6C2, C3) postulierten wir, dass die Relaislinse einige Zellen nach unten zog, während sie abgesenkt wurde. Diese gezogenen Neuronen waren ungesund, so dass während des Baseplating-Verfahrens oder während des Experiments keine Aktivität festgestellt wurde.
Wir hatten eine Maus mit einem völlig homogenen Grausignal und ohne sichtbare zellähnliche Bilder während des Baseplating-Verfahrens (Abbildung 6B1). Nachdem die Maus geopfert worden war, wurden ihre Gehirnschnitte beobachtet. Es wurde bemerkt, dass sich die Linse auf der medialen Seite der gekrümmten Pyramidenschicht befand; der Zielbereich (Abbildung 6B2) wurde komplett verfehlt. Diese erfolglosen Versuche waren wichtige Erfahrungen, die uns dazu brachten, unser Operationsprotokoll zu modifizieren und schließlich mit drei Mäusen erfolgreich zu sein (Ergänzungsvideo S3).
Mikroinjektionsnadel
Das Corpus callosum ist ein zäher fibröser Trakt, der den dorsalen Hippocampus überlagert. Aufgrund seiner Steifigkeit widersteht es dem Eindringen einer Mikroinjektionsnadel mit flacher Spitze. Daher empfehlen wir die Verwendung einer Mikroinjektionsnadel mit abgeschrägter Spitze. Diese Art von Nadel reduziert nicht nur die Gewebeschäden, sondern verringert auch die Möglichkeit, dass das Virus aufgrund einer Verstopfung durch benachbarte Fasern nicht in den Zielbereich infundiert wird. Die oben genannten Probleme haben wir in einer Tabelle zur Fehlerbehebung zusammengefasst (Tabelle 1).
Zeitfenster
Der Zeitrahmen für das gesamte Verfahren ist in Abbildung 2A zusammengefasst, wobei die Einheiten Tage sind. Im Detail kann der chirurgische Teil (Virusinjektion, Relaislinsenimplantation, Dummy-Baseplattierung) 3 Stunden für Anfänger oder 1,5 Stunden für ausreichend ausgebildete Forscher dauern. Mäuse haben eine geringe Körpergröße und einen schnellen Stoffwechsel, und sie sind anfälliger für Gesundheitsprobleme, die durch lange Zeiträume unter Narkose verursacht werden, als größere Spezies27. Die Forscher sollten darauf abzielen, die in der Operation verbrachte Zeit unter 3 Stunden zu halten. Eine echte Grundplattierung kann nach 3 bis 6 Wochen der Calciumindikatorexpression durchgeführt werden. Dieser Vorgang kann 1 Stunde dauern. Die anschließende longitudinale Calciumaktivitätsbeobachtung kann länger als 1 Monat fortgesetzt werden.
Schlüsse
Das UCLA Miniscope ist ein Open-Source-In-vivo-Calcium-Bildgebungsgerät. Ohne eine vorgefertigte, vorinstallierte Grundplatte oder ein Linsenmodul müssen Personen, die Experimente durchführen, in der Lage sein, den optimalen Abstand zwischen der Objektivlinse und der Relaislinse während des Baseplating-Vorgangs genau zu erreichen. Die erhöhte Schwierigkeit bei der Verwendung des zweilinsigen UCLA Miniscope-Systems liegt in der Volumenänderung des Zahnzements. Wir haben die ursprünglichen Protokolle optimiert und die durch die oben genannten Probleme verursachten Defekte minimiert, wodurch die Erfolgsrate der Calcium-Bildgebung mit dem zweilinsigen UCLA Miniscope-System erhöht wurde.
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Disclosures
Dies ist keine von der Industrie unterstützte Studie. Die Autoren berichten von keinen finanziellen Interessenkonflikten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom Ministerium für Wissenschaft und Technologie, Taiwan (108-2320-B-002-074, 109-2320-B-002-023-MY2) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.7-mm drill bit | #19008-07 | Fine Science Tools; USA | for surgery |
| 0.1–10 μl pipette tips | 104-Q; QSP | Fisher Scientific; Singapore | for testing dental cement |
| 20 G IV cathater | #SR-OX2032CA | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | for surgery |
| 27 G needle | AGANI, AN*2713R | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | for surgery |
| AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE | #104487-AAV9; 1.5*10^13 | Addgene viral prep; MA, USA | for viral injection |
| Atropine sulfate | Astart; Hsinchu, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Baseplate | V3 | http://miniscope.org | for dummy baseplating/baseplating |
| BLU TACK | #30840350 | Bostik; Chelsea, Massachusetts, USA | Reusable adhesive clay; for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Bone Rongeur Friedman | 13 cm | Diener; Tuttlingen, Germany | for baseplating |
| Buprenorphine | INDIVIOR; UK | for surgery | |
| Carprofen | Rimadyl | Zoetis; Exton, PA | analgesia |
| Ceftazidime | Taiwan Biotech; Taiwan | prevent infection | |
| Data Acquisition PCB for UCLA Miniscope | purchased on https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq | for baseplating | |
| Dental cement set | Tempron | GC Corp; Tokyo, Japan | for testing dental cement |
| Dental cement set | Tokuso Curefast | Tokuyama Dental Corp.; Tokyo, Japan | for testing dental cement/surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Dual Lab Standard with Mouse and Rat Adaptors | #51673 | Stoelting Co; Illinois, USA | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Duratear ointment | Alcon; Geneva, Switzerland | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Ibuprofen | YungShin; Taiwan | analgesia | |
| Isoflurane | Panion & BF Biotech INC.; Taoyuan, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Inscopix | nVista System | Inscopix; Palo Alto, CA | for comparison with V3 UCLA Miniscope |
| Ketamine | Pfizer; NY, NY | for euthanasia | |
| Normal saline | for surgery | ||
| Micro bulldog clamps | #12.102.04 | Dimedo; Tuttlingen, Germany | for lens implantation |
| Microliter Microsyringes, 2.0 µL, 25 gauge | #88400 | Hamilton; Bonaduz, Switzerland | for viral injection |
| Molding silicone rubber | ZA22 Thixo | Zhermack; Badia Polesine, Italy | for dummy baseplating |
| Objective Gradient index (GRIN) lens | #64519 | Edmund Optics; NJ, USA | for dummy baseplating/baseplating |
| Parafilm | #PM996 | Bemis; Neenah, USA | for dummy baseplating |
| Portable Suction | #DF-750 | Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc., Taichung, Taiwan | for surgery |
| Relay GRIN lens | #1050-002177 | Inscopix; Palo Alto, CA, USA | for dummy baseplating/baseplating |
| Stainless steel anchor screws | 1.00 mm diameter, total length 3.00 mm | for surgery | |
| Stereo microscope | #SL720 | Sage Vison; New Taipei City, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Stereotaxic apparatus | #51673 | Stoelting; IL, USA | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| UV Cure Adhesive | #3321 | Loctite; Düsseldorf, Germany | for testing dental cement |
| V3 UCLA Miniscope | purchased on https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Xylazine | X1126 | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | for euthanasia |
| Xylocaine pump spray 10% | AstraZeneca; Södertälje, Sweden | for surgery |
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