Summary
O encolhimento do cimento dentário durante a cura desloca a placa de base. Este protocolo minimiza o problema, criando uma base inicial do cimento dentário que deixa espaço para cimentar a placa de base. Semanas depois, a placa de base pode ser cimentada em posição neste andaime usando pouco cimento novo, reduzindo assim o encolhimento.
Abstract
Os neurocientistas usam microscópios em miniatura (miniscópios) para observar a atividade neuronal em animais que se comportam livremente. A equipe do Miniscope da Universidade da Califórnia, Los Angeles (UCLA) fornece recursos abertos para que os pesquisadores construam miniscópios eles mesmos. O V3 UCLA Miniscope é um dos miniscópios de código aberto mais populares atualmente em uso. Ele permite a imagem dos transientes de fluorescência emitidos por neurônios geneticamente modificados através de uma lente objetiva implantada no córtex superficial (um sistema de uma lente), ou em áreas cerebrais profundas através de uma combinação de uma lente de relé implantada no cérebro profundo e uma lente objetiva que é pré-ancorada no miniscópio para observar a imagem retransmitida (um sistema de duas lentes). Mesmo em condições ideais (quando os neurônios expressam indicadores de fluorescência e a lente de relé foi implantada adequadamente), uma mudança de volume do cimento dentário entre a placa de base e sua fixação ao crânio após a cura do cimento pode causar desalinhamento com uma distância alterada entre as lentes objetiva e de relé, resultando na má qualidade da imagem. Uma placa de base é uma placa que ajuda a montar o miniscópio no crânio e fixa a distância de trabalho entre as lentes objetiva e de relé. Assim, mudanças no volume do cimento dentário ao redor da placa de base alteram a distância entre as lentes. O presente protocolo tem como objetivo minimizar o problema de desalinhamento causado por alterações de volume no cimento dental. O protocolo reduz o desalinhamento construindo uma base inicial de cimento dentário durante o implante da lente de relé. O tempo de convalescença após a implantação é suficiente para a fundação do cimento dentário curar completamente a placa de base, de modo que a placa de base possa ser cimentada neste andaime usando o mínimo de cimento novo possível. No presente artigo, descrevemos estratégias de baseplating em camundongos para permitir a imagem da atividade neuronal com uma lente objetiva ancorada no miniscópio.
Introduction
Os repórteres de atividade fluorescente são ideais para a imagem da atividade neuronal, pois são sensíveis e apresentam grandes amplitudes dinâmicas 1,2,3. Portanto, um número crescente de experimentos está utilizando microscopia de fluorescência para observar diretamente a atividade neuronal 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16. O primeiro microscópio miniaturizado de fluorescência de um fóton (miniscópio) foi projetado em 2011 por Mark Schnitzer et al.5. Esse miniscópio permite que os pesquisadores monitorem a dinâmica de fluorescência das células cerebelares em animais de comportamento livre5 (ou seja, sem qualquer restrição física, apoio de cabeça, sedação ou anestesia para os animais). Atualmente, a técnica pode ser aplicada para monitorar áreas cerebrais superficiais, como o córtex 6,8,15,16; áreas subcorticais como o hipocampo dorsal 8,11,13,14 e o estriado 6,17; e áreas cerebrais profundas, como o hipocampo ventral14, a amígdala 10,18 e o hipotálamo 8,12.
Nos últimos anos, vários miniscópios de código aberto foram desenvolvidos4,5,6,7,11,13,17,19. O miniscópio pode ser montado economicamente por pesquisadores se eles seguirem as diretrizes passo a passo fornecidas pela equipe de miniscópio da Universidade da Califórnia, Los Angeles (UCLA)4,7,11,13. Porque o monitoramento óptico da atividade neural é restrito pelas limitações da transmissão de luz7 de e para a população neuronal de interesse, um miniscópio foi projetado que requer que uma lente de índice de refração de gradiente objetivo (GRIN) objetiva (ou lente objetiva) seja pré-ancorada na parte inferior do miniscópio para ampliar o campo de visão que é retransmitido de uma lente GRIN de relé (ou lente de relé)6,7,8,10,16,17. Esta lente de relé é implantada na região do cérebro alvo de tal forma que a atividade de fluorescência da região do cérebro alvo é retransmitida para a superfície da lente de relé6,7,8,10,16,17. Aproximadamente 1/4 de um período sinusoidal completo de luz viaja através da lente GRIN objetiva (~ 0,25 pitch) (Figura 1A1), resultando em uma imagem de fluorescência ampliada6,7. A lente objetiva nem sempre é fixada na parte inferior do miniscópio nem é necessária a implantação da lente de relé6,7,11,13,15. Especificamente, existem duas configurações: uma com uma lente objetiva fixa no miniscópio e uma lente de relé implantada no cérebro.8,10,12,14,16 (Figura 1B1) e outro com apenas uma lente objetiva removível6,7,11,13,15 (Figura 1B2). No projeto baseado na combinação de objetiva fixa e lente de relé implantada, os sinais de fluorescência do cérebro são trazidos para a superfície superior da lente de relé (Figura 1A1)7,8,10,12,14,16. Posteriormente, a lente objetiva pode ampliar e transmitir o campo visual a partir da superfície superior da lente relé (Figura 1A2). Por outro lado, o design da lente GRIN objetiva removível é mais flexível, o que significa que a pré-implantação de uma lente de relé no cérebro não é obrigatória (Figura 1B2)6,7,11,13,15. Ao usar um miniscópio baseado em um design de lente objetiva removível, os pesquisadores ainda precisam implantar uma lente na região do cérebro alvo, mas podem implantar uma lente objetiva.6,7,11,13,15 ou uma lente de relé no cérebro6,7. A escolha de uma objetiva ou de uma lente de relé para implantação determina a configuração do miniscópio que o pesquisador deve utilizar. Por exemplo, o V3 UCLA Miniscope é baseado em um design de lente GRIN de objetiva removível. Os pesquisadores podem optar por implantar diretamente uma lente objetiva na região do cérebro de interesse e montar o miniscópio "vazio" na lente objetiva.6,7,11,13,15 (um sistema de uma lente; Figura 1B2) ou para implantar uma lente de relé no cérebro e montar um miniscópio pré-ancorado com uma lente objetiva6,7 (um sistema de duas lentes; Figura 1B1). O miniscópio funciona então como uma câmera de fluorescência para capturar imagens de transmissão ao vivo de fluorescência neuronal produzidas por um indicador de cálcio geneticamente codificado.1,2,3. Depois que o miniscópio é conectado a um computador, essas imagens de fluorescência podem ser transferidas para o computador e salvas como clipes de vídeo. Os pesquisadores podem estudar a atividade neuronal analisando as mudanças relativas na fluorescência com alguns pacotes de análise20,21 ou escrever seus códigos para análise futura.
O V3 UCLA Miniscope oferece flexibilidade para os usuários determinarem se devem visualizar a atividade neuronal com um sistema de uma ou duas lentes7. A escolha do sistema de gravação é baseada na profundidade e no tamanho da área do cérebro alvo. Em resumo, um sistema de uma lente só pode obter imagens de uma área superficial (menos de aproximadamente 2,5 mm de profundidade) e relativamente grande (maior que aproximadamente 1,8 x 1,8 mm2) porque os fabricantes produzem apenas um certo tamanho de lente objetiva. Em contraste, um sistema de duas lentes pode ser aplicado a qualquer área do cérebro alvo. No entanto, o cimento dentário para colar a placa de base tende a causar desalinhamento com uma distância alterada entre as lentes objetiva e de relé, resultando em uma má qualidade de imagem. Se o sistema de duas lentes estiver sendo usado, duas distâncias de trabalho precisam ser direcionadas com precisão para alcançar a qualidade de imagem ideal (Figura 1A). Essas duas distâncias críticas de trabalho estão entre os neurônios e a superfície inferior da lente de relé e entre a superfície superior da lente de relé e a superfície inferior da lente objetiva (Figura 1A1). Qualquer desalinhamento ou mau posicionamento da lente fora da distância de trabalho resulta em falha de imagem (Figura 1C2). Em contraste, o sistema de uma lente requer apenas uma distância de trabalho precisa. No entanto, o tamanho da lente objetiva limita sua aplicação para o monitoramento de regiões cerebrais profundas (a lente objetiva que se encaixa no miniscópio é de aproximadamente 1,8 ~ 2,0 mm 6,11,13,15). Portanto, o implante de uma lente objetiva é limitado para a observação da superfície e de regiões cerebrais relativamente grandes, como o córtex6,15 e o cornu ammonis dorsal 1 (CA1) em camundongos11,13 . Além disso, uma grande área do córtex deve ser aspirada para atingir o CA1 dorsal11,13. Devido à limitação da configuração de uma lente que impede a imagem de regiões profundas do cérebro, os sistemas de miniscópio comerciais oferecem apenas um design combinado de lente objetiva / lente de relé (duas lentes). Por outro lado, o miniscópio V3 UCLA pode ser modificado em um sistema de uma lente ou duas lentes, porque sua lente objetiva é removível 6,11,13,15. Em outras palavras, os usuários do miniscópio V3 UCLA podem tirar proveito da lente removível implantando-a no cérebro (criando um sistema de uma lente), ao realizar experimentos envolvendo observações cerebrais superficiais (menos de 2,5 mm de profundidade) ou pré-ancorando-a no miniscópio e implantando uma lente de relé no cérebro (criando um sistema de duas lentes), ao realizar experimentos envolvendo observações cerebrais profundas. O sistema de duas lentes também pode ser aplicado para observar superficialmente o cérebro, mas o pesquisador deve conhecer as distâncias de trabalho precisas entre a lente objetiva e a lente de retransmissão. A principal vantagem do sistema de uma lente é que há uma chance menor de perder as distâncias de trabalho do que com um sistema de duas lentes, uma vez que existem duas distâncias de trabalho que precisam ser direcionadas com precisão para alcançar a qualidade de imagem ideal no sistema de duas lentes (Figura 1A). Portanto, recomendamos o uso de um sistema de uma lente para observações cerebrais superficiais. No entanto, se o experimento exigir imagens na área profunda do cérebro, o pesquisador deve aprender a evitar o desalinhamento das duas lentes.
O protocolo básico para configuração de miniscópios de duas lentes para experimentos inclui o implante de lentes e o baseplating 8,10,16,17. Baseplating é a colagem de uma placa de base na cabeça de um animal para que o miniscópio possa ser eventualmente montado em cima do animal e filmar os sinais de fluorescência dos neurônios (Figura 1B). Esse procedimento envolve o uso de cimento dentário para colar a placa de base no crânio (Figura 1C), mas o encolhimento do cimento dentário pode causar alterações inaceitáveis na distância entre a lente relé implantada e a lente objetiva 8,17. Se a distância deslocada entre as duas lentes for muito grande, as células não podem ser colocadas em foco.
Protocolos detalhados para experimentos de imagem de cálcio cerebral profundo usando miniscópios já foram publicados8,10,16,17. Os autores desses protocolos utilizaram o sistema Inscopix8,10,16 ou outros projetos personalizados17 e descreveram os procedimentos experimentais para seleção viral, cirurgia e fixação da placa de base. No entanto, seus protocolos não podem ser aplicados com precisão a outros sistemas de código aberto, como o sistema V3 UCLA Miniscope, NINscope6e Finchscope19. O desalinhamento das duas lentes pode ocorrer durante a gravação em uma configuração de duas lentes com um Miniscópio UCLA devido ao tipo de cimento dentário que é usado para cimentar a placa de base ao crânio8,17 (Figura 1C). O presente protocolo é necessário porque a distância entre a lente de relé implantada e a lente objetiva é propensa a mudar devido ao encolhimento indesejável do cimento dentário durante o procedimento de baseplating. Durante o baseplating, a distância de trabalho ideal entre a lente de relé implantada e a lente objetiva deve ser encontrada ajustando a distância entre o miniscópio e a parte superior da lente de relé, e a placa de base deve então ser colada neste local ideal. Após o ajuste da distância correta entre a lente objetiva e a lente relé implantada, medidas longitudinais podem ser obtidas na resolução celular (Figura 1B; in vivo gravação). Uma vez que a faixa ideal de distâncias de trabalho de uma lente de relé é pequena (50 - 350 μm)4,8, o encolhimento excessivo do cimento durante a cura pode dificultar a manutenção da lente objetiva e da lente de relé implantada dentro da faixa apropriada. O objetivo geral deste relatório é fornecer um protocolo para reduzir os problemas de encolhimento.8,17 que ocorrem durante o procedimento de baseplating e para aumentar a taxa de sucesso das gravações de miniscópio de sinais de fluorescência em uma configuração de duas lentes. A gravação bem-sucedida do miniscópio é definida como a gravação de uma transmissão ao vivo de mudanças relativas perceptíveis na fluorescência de neurônios individuais em um animal que se comporta livremente. Embora diferentes marcas de cimento dental tenham diferentes taxas de encolhimento, os pesquisadores podem selecionar uma marca que tenha sido testada anteriormente6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22. No entanto, nem todas as marcas são fáceis de obter em alguns países / regiões devido aos regulamentos de importação de materiais médicos. Portanto, desenvolvemos métodos para testar as taxas de encolhimento dos cimentos dentários disponíveis e, o que é mais importante, fornecer um protocolo alternativo que minimize o problema de encolhimento. A vantagem sobre o atual protocolo de baseplating é um aumento na taxa de sucesso da imagem de cálcio com ferramentas e cimento que podem ser facilmente obtidos em laboratórios. O miniscópio da UCLA é usado como exemplo, mas o protocolo também é aplicável a outros miniscópios. Neste relato, descrevemos um procedimento de baseplating otimizado e também recomendamos algumas estratégias para o ajuste do sistema de duas lentes do miniscópio UCLA (Figura 2A). Ambos os exemplos de implantação bem-sucedida (n = 3 camundongos) e exemplos de implantação fracassada (n = 2 camundongos) para a configuração de duas lentes com o miniscópio UCLA são apresentados juntamente com as discussões pelas razões dos sucessos e fracassos.
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Protocol
Todos os procedimentos realizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê Nacional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Nacional de Taiwan (Nº de Aprovação: NTU-109-EL-00029 e NTU-108-EL-00158).
1. Avaliação da alteração volêmica do cimento dentário
NOTA: Alterações no volume de cimento dental ocorrem durante o processo de cura. Testar as alterações de volume do cimento dentário antes da implantação e baseplating. Os pesquisadores podem testar qualquer marca de cimento dental e usar a marca com a menor mudança de volume para cimentar a placa de base. Um exemplo é mostrado na Figura 3.
- Pesar 0,5 g de cada pó de cimento dentário e misturá-lo com a sua solução adequada (1 ml).
NOTA: A relação pó/líquido recomendada nas instruções de cimento dentário é de 0,5 g de pó para 0,25 mL da solução para obter uma forma sólida. Este protocolo de ensaio dilui a relação para 0,5 g/ml para que a mistura possa ser aspirada sob a forma líquida, a fim de medir a mudança de volume nas pontas da pipeta. - Use as pontas da pipeta de 0,1-10 μL para remover 2,5 μL da mistura de cimento dentário e, em seguida, sele a ponta da pipeta com uma cola de cura leve.
- Coloque as pontas em uma prateleira, marque os níveis mais altos da mistura de cimento dental e meça o nível da mistura de cimento dental após 40 minutos (vídeo suplementar S1).
- Além de monitorar as mudanças de nível durante a cura do cimento dentário nas pontas, meça a densidade de cimento dental seco restante. Para calcular a densidade, meça o peso do cimento dentário e meça o volume com o princípio de Arquimedes.
- Em resumo, coloque o restante cimento dental seco em um copo cheio de água e pese a água que transborda.
- Use o cimento dentário com o menor encolhimento para todos os protocolos detalhados abaixo.
2. Anestesia, implante cirúrgico, injeção viral e baseplating fictício
- Anestesia
NOTA: O presente relatório visa otimizar o procedimento cirúrgico e de baseplating para o miniscópio da UCLA; portanto, assumiu-se que o título viral ideal para infectar as regiões-alvo do cérebro era conhecido. Os métodos para encontrar o título viral ideal podem ser encontrados nas etapas 1 a 5 de Resendez et al.8. Uma vez que a diluição viral tenha sido otimizada, o implante cirúrgico pode ser iniciado.- Coloque o rato num recipiente de indução e forneça oxigénio (100% a um caudal de ar de 0,2 L/min). Pré-oxigenar o rato durante 5 a 10 min.
- Administrar isoflurano a 5% misturado com 100% de oxigénio (taxa de fluxo de ar: 0,2 L/min) até que o rato comece a perder o equilíbrio e seja eventualmente anestesiado.
- Remova o rato da câmara de indução e injete atropina (0,04 mg/kg; injeção subcutânea), para evitar a acumulação de saliva e buprenorfina (0,03 mg/kg; injeção subcutânea) como analgésico.
- Raspe a cabeça do mouse.
- Use máscara, avental estéril e luvas. Prepare um espaço estéril e instrumentos cirúrgicos estéreis para a cirurgia. Estabilize a cabeça do rato (mantenha a anestesia com 3 a 2,5% de isoflurano durante esta etapa) no aparelho estereotáxico. Após os procedimentos analgésicos e anestésicos, certifique-se de que as barras auriculares estabilizem firmemente a cabeça. Fornecer suporte térmico.
- Certifique-se de que a cabeça está ajustada em uma posição reta, esterilize a cabeça raspada com betadine e, em seguida, pulverize a cabeça com xilocaína (10%), um analgésico local.
- Aplique pomada veterinária nos olhos para evitar a secura.
NOTA: Use pomada oftálmica para proteção ocular durante todos os eventos anestésicos para prevenir lesões oculares. - Teste o reflexo de dor profunda do animal apertando sua pata traseira. Uma vez que o animal não apresente reflexo de retirada da pata, prossiga com procedimentos cirúrgicos.
- Faça uma pequena incisão ao longo do plano sagital médio do crânio (começando de aproximadamente 2 mm anterior ao bregma e terminando aproximadamente 6 mm posterior ao bregma). Em seguida, limpe o tecido conjuntivo no crânio e ancore três parafusos de aço inoxidável nos ossos frontais e interparietais esquerdos.
- Neste ponto, reduza o isoflurano para 1-2%. Monitore a taxa de respiração durante todo o procedimento cirúrgico. Se a taxa de respiração for muito lenta (aproximadamente 1/s, dependendo do animal), diminua a concentração de isoflurano.
- Execute uma craniotomia para o implante da lente de relé sob um microscópio cirúrgico ou estereomicroscópio usando uma broca de rebarba com um diâmetro de ponta de 0,7 mm. Use uma microbroca para pegar a broca de rebarba e desenhar um contorno da área do círculo pretendida (a espessura total do calvário não precisa ser penetrada).
NOTA: A lente de relé utilizada no presente protocolo tinha um diâmetro de 1,0 mm, um comprimento ~ 9,0 mm um passo de 1 e uma faixa de distância de trabalho de ~100 μm - 300 μm; portanto, a craniotomia tinha diâmetro de 1,2 mm.- Aprofunde suavemente o contorno até que a dura-máter esteja exposta.
- Prepare 3 mL de solução salina estéril em uma seringa de 3 mL e esfrie em um balde de gelo. Lave frequentemente a área exposta com 0,1 mL de solução salina da seringa para resfriar a área e evitar danos causados pelo calor e hemorragia.
- Colha e descasque levemente a dura-máter com uma agulha 27G.
- Coloque uma marcação em uma agulha contundente de 27 G a 1 mm da ponta e use-a para aspirar cuidadosamente o córtex cerebral, a fim de criar uma janela para o implante da lente 8,11,13,17 (Figura 2B1). Se necessário, faça uma agulha contundente moendo a ponta de uma agulha de injeção 27 G com lixa. Em seguida, conecte a agulha a uma seringa, conecte a seringa a um tubo e conecte o tubo a uma fonte de sucção para criar um vácuo.
NOTA: A lente de relé é contundente e comprimirá o tecido cerebral quando for colocada na área profunda do cérebro. Assim, a aspiração do córtex reduz o dano tecidual devido ao implante da lente de relé. O córtex tem aproximadamente 1 mm de espessura em camundongos, mas é difícil de visualizar sob um estereomicroscópio. A marca cria um marco para permitir que a profundidade da agulha seja determinada com mais precisão do que apenas com um estereomicroscópio. Além disso, pode-se determinar se a região do córtex foi alcançada ou passada, dependendo da resistência; a porção superior do córtex parece relativamente macia, enquanto a região subcortical parece densa. Portanto, uma vez que a textura comece a parecer mais densa, pare a aspiração (Figura 2B3). - Prepare 3 mL de solução salina estéril em uma seringa de 3 mL e esfrie em um balde de gelo. Lave a área com solução salina para parar o sangramento e diminuir a possibilidade de edema cerebral.
- Injeção de vírus adenoassociado (AAV)
NOTA: AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE foi utilizado no presente experimento. jGCaMP7s é um indicador de cálcio geneticamente codificado que emite fluorescência verde3. Como o presente estudo utilizou um camundongo do tipo selvagem como sujeito, um vetor viral foi necessário para transfectar os neurônios com o gene indicador de cálcio verde-fluorescente e permitir a expressão. Pesquisadores usando camundongos transgênicos expressando o indicador de cálcio verde-fluorescente como seus sujeitos podem pular o protocolo 2.2.- Monte a agulha interna de um cateter intravenoso (i.v.) de 20 G no braço estereotáxico e puncione lentamente (~100 - 200 μm/min) o cérebro nas coordenadas apropriadas (as mesmas coordenadas usadas durante o implante da lente de relé) (Figura 2B3).
- Abaixe a agulha de microinjeção a uma velocidade de 100-200 μm/min no CA1 ventral e infunda (~ 25 nL/min) 200 nL do vetor viral na região alvo (-3,16 mm AP, 3,25 mm ML e -3,50 mm DV do bregma).
- Aguarde 10 minutos para permitir que o vírus se difunda e minimizar o fluxo de retorno.
- Retire (~100-200 μm/min) a agulha de microinjeção.
- Implante de lente de relé
- Desinfetar a lente do relé com álcool a 75%10,16 e, em seguida, enxaguar com solução salina isenta de pirogênio. Mergulhe a lente em solução salina fria livre de pirogênio até a implantação.
NOTA: Uma lente fria minimiza o edema cerebral quando colocada no cérebro. - Segure a lente do relé usando um grampo de micro buldogue (Figura 2B3) cujos dentes foram cobertos com tubos termoencolhíveis.
NOTA: O grampo do buldogue pode segurar firmemente a lente sem danificá-la. Consulte Resendez et al.8 para o método de fazer a braçadeira de buldogue coberta de tubos. - Coloque lentamente (~100 - 200 μm/min) a lente de relé no topo da região alvo (-3,16 mm AP, 3,50 mm ML e -3,50 mm DV do bregma) e estabilize-a com cimento dental.
- Desinfetar a lente do relé com álcool a 75%10,16 e, em seguida, enxaguar com solução salina isenta de pirogênio. Mergulhe a lente em solução salina fria livre de pirogênio até a implantação.
- Baseplating fictício
NOTA: O objetivo do "baseplating fictício" durante a cirurgia de implantação é criar uma base de cimento dentário, a fim de reduzir a quantidade de cimento dentário que precisa ser aplicado durante o procedimento de baseplating real várias semanas depois. Desta forma, o risco de uma mudança no volume do cimento dentário é minimizado.- Prenda a lente objetiva na parte inferior do miniscópio e monte a placa de base no miniscópio (nesta etapa, a montagem da lente objetiva ancorada, da placa de base e do miniscópio ainda não foi colocada sobre o crânio do mouse).
- Enrolar 10 cm de película de parafina em torno do exterior da placa de base (Figura 4A).
- Segure o miniscópio com a sonda de braço estereotáxica usando argila adesiva reutilizável.
- Alinhe a lente objetiva sobre a lente do relé com o mínimo de espaço possível entre as lentes (Figura 4B).
- Use cimento dentário para fixar o posicionamento da placa de base (de modo que o cimento toque apenas o filme de parafina).
- Quando o cimento dentário tiver secado, remova o filme.
- Remova a placa de base e o miniscópio. A base de cimento dental é oca (Figura 4B).
- Para proteger a lente do relé das atividades diárias e de ser arranhada pelo mouse, sele a lente do relé com um pouco de borracha de silicone de moldagem até que a lente do relé seja coberta e cubra a borracha de silicone com uma fina camada de cimento dental (Figura 4B).
- Desligue o mouse dos instrumentos estereotáxicos e coloque-o em uma câmara de recuperação.
- Injete carprofeno (5 mg/kg; injeção subcutânea) ou meloxicam (1 mg/kg; injeção subcutânea) para analgesia e ceftazidima (25 mg/kg; injeção subcutânea) para prevenir a infeção.
NOTA: O uso de antibióticos não é uma alternativa a uma técnica asséptica. Antibióticos perioperatórios (ou seja, ceftazidima) podem ser indicados em determinadas circunstâncias, como cirurgias de longa duração ou colocação de implantes crônicos. - Observe o animal até que ele recupere a consciência suficiente para manter a retração esternal.
- Ratos domésticos individualmente e injetam meloxicam (1 mg/kg; injeção subcutânea; q24h) durante uma semana para aliviar a dor pós-cirúrgica. Verifique o animal todos os dias após a cirurgia para se certificar de que ele está comendo, bebendo e defecando normalmente.
- Realize o baseplating após 3 ou mais semanas.
3. Baseplating
NOTA: Normalmente, o procedimento de baseplating (Figura 5) não pode ser realizado dentro de 2-3 semanas do procedimento inicial devido ao tempo de recuperação e incubação viral. Os procedimentos de indução para a baseplating são semelhantes aos descritos nas etapas 2.1.1 a 2.1.8. No entanto, o baseplating não é um procedimento invasivo, e o animal requer apenas sedação leve. Portanto, 0,8-1,2% de isoflurano é suficiente, desde que o animal não possa se mover no quadro estereotáxico. Além disso, a anestesia com isoflurano relativamente leve também pode ajudar a facilitar a expressão dos transientes de fluorescência dos neurônios durante o monitoramento8 (Vídeo suplementar S2).
- Corte cuidadosamente a fina camada do telhado de cimento dental com um rongeur ósseo e remova a borracha de silicone. Limpe a superfície da lente do relé com álcool a 75%.
- Prenda um parafuso ajustado ao lado da placa de base para fixá-lo na parte inferior do miniscópio (Figura 5A1).
NOTA: A placa de base deve ser apertada de forma segura sob a parte inferior do miniscópio porque a diferença entre uma placa de base apertada e levemente fixada pode causar uma distância inconsistente. - Ajuste o slide de foco para estar a aproximadamente 2,7 - 3 mm do invólucro principal (Figura 5A2).
NOTA: Embora o comprimento possa ser ajustado ainda mais durante o procedimento de baseplating, fixe-o em aproximadamente 2,7 mm, porque ajustar simultaneamente o comprimento do miniscópio e o comprimento ideal entre a lente de relé implantada e a lente objetiva pré-ancorada é muito confuso. - Conecte o miniscópio à placa de aquisição de dados e conecte-o a uma porta USB 3.0 (ou versão superior) em um computador.
- Execute o software de aquisição de dados desenvolvido pela equipe da UCLA.
- Ajuste a exposição para 255, o ganho para 64x e o LED de excitação para 5%. Essas configurações são recomendadas para o baseplating inicial; as configurações específicas variam dependendo das regiões do cérebro e dos níveis de expressão do indicador de cálcio geneticamente codificado.
- Clique no botão Conectar para conectar o miniscópio ao software de aquisição de dados e assistir à transmissão ao vivo.
- Alinhe a lente objetiva do miniscópio à lente do relé manualmente e comece a procurar os sinais de fluorescência (Figura 5B1).
NOTA: Inicialmente, a busca manual pelo sinal de fluorescência facilita os ajustes. Como um sistema AAV foi utilizado para expressar o indicador de cálcio geneticamente codificado, tanto o tipo promotor quanto o sorotipo AAV afetaram a eficiência da transfecção23,24. Os pesquisadores devem precisar verificar a expressão do indicador de cálcio, encontrando neurônios individuais que mostram mudanças na fluorescência antes de prosseguir com experimentos futuros. - Perfure o cimento dentário em qualquer lugar onde ele bloqueie o miniscópio (opcional).
- Assista à transmissão ao vivo do software de aquisição de dados e use a margem da lente de relé como um ponto de referência (Vídeo suplementar S2). A margem da lente de relé aparece como um círculo cinza semelhante à lua no monitor (Figura 5B1; setas brancas).
- Uma vez que a lente de relé é encontrada, ajuste cuidadosamente os vários ângulos e distâncias do miniscópio até que os sinais de fluorescência sejam encontrados.
NOTA: As imagens dos neurônios são mais brancas do que o fundo. Uma forma neuronal precisa indica que os neurônios se encontram perfeitamente no plano focal da lente de relé. Neurônios redondos sugerem que eles estavam perto do plano focal. A forma neuronal é diferente em todo o cérebro, aqui CA1 ventral é mostrado como um exemplo. - Se nenhum neurônio individual apresentar alterações na fluorescência em função do tempo, sele novamente a base com borracha de silicone. A fluorescência não é observada porque o período de incubação também é dependente da propriedade do vírus23,24. Execute as etapas 3.1-3.12 após uma semana adicional. (Isso é opcional).
- Segure o miniscópio na posição ideal e mova o braço estereotáxico com uma argila adesiva reutilizável em direção ao miniscópio (Figura 5B2). Adere o miniscópio ao braço estereotáxico com argila adesiva reutilizável.
- Ajuste ligeiramente os braços x, y e z para procurar a melhor visualização (vídeo suplementar S2). Em seguida, ajuste o ângulo entre a superfície da lente objetiva e a lente de relé girando a barra auricular, a barra do dente ou a argila adesiva reutilizável no eixo z. A expressão viral e o implante de lentes são bem-sucedidos quando pelo menos uma célula exibe transientes de fluorescência (Figura 6A; Vídeo suplementar S2) durante a baseplating (que também depende da área do cérebro, como o CA1).
Observação : se o monitor mostrar apenas células brancas, mas sem transientes, há outra causa (consulte a Figura 6B,C, Vídeos suplementares S4,S5, a seção Resultados e a seção Solução de problemas). - Cimento da placa de base (Figura 5B2) com o cimento dental.
- Monitore a região de interesse durante a cimentação para garantir que a posição ideal não mude.
- Use a menor quantidade possível de cimento enquanto ainda cola firmemente a placa de base na base de cimento dentário (Figura 5B2). Aplique uma segunda e terceira camada de cimento ao redor da placa de base, mas tenha cuidado para não afetar a lente GRIN.
NOTA: A aplicação de cimento na placa de base é mais fácil nesta etapa, uma vez que a base da placa de base foi formada durante o procedimento de revestimento fictício. - Retire cuidadosamente o miniscópio da placa de base quando o cimento estiver curado. Em seguida, parafuse uma tampa protetora.
- Mova o animal para uma gaiola de recuperação. Observe o animal até que ele recupere a consciência suficiente para manter a retração esternal.
- Ratos domésticos individualmente. Certifique-se de que ele está comendo, bebendo e defecando normalmente todos os dias. Aguarde 5 dias para que o rato recupere totalmente e, em seguida, verifique a imagem de cálcio.
NOTA: Há apenas uma pequena quantidade de cimento dental segurando a placa de base. Portanto, se a placa de base tiver mudado consideravelmente desde o procedimento de baseplating, remova o cimento dentário com uma broca execute o procedimento de baseplating novamente. - Anestesiar (por injeção intraperitoneal de uma mistura de cetamina (87 mg/kg) /xilazina (13 mg/kg)) e perfundir25 o animal quando todas as experiências estiverem concluídas.
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Representative Results
Avaliação da alteração do volume de cimento dentário
Uma vez que o volume de cimento dentário muda durante o processo de cura, pode impactar significativamente a qualidade da imagem, uma vez que a distância de trabalho de uma lente GRIN é de aproximadamente 50 a 350 μm 4,8. Portanto, dois cimentos dentários comercialmente disponíveis foram testados neste caso, Tempron e Tokuso, antes do procedimento de implantação e baseplating (Figura 5). Os vídeos foram primeiramente avaliados para determinar se os cimentos haviam encolhido e, em seguida, os volumes de cimentos foram comparados quando completamente secos. A mesma concentração e volumes das misturas iniciais de cimentos dentários foram carregados em pontas de pipeta e filmados (Vídeo suplementar S1). O vídeo S1 demonstrou que ambos os cimentos encolheram durante o processo de secagem. Tokuso teve melhor desempenho que Tempron (ou seja, teve um volume maior que Tempron mesmo após o encolhimento): Figura 3B; volume médio de Tempron: 0,93 ± 0,07 mL; volume médio de Tokuso: 1,18 ± 0,07 mL; teste t: p = 0,048, t(6) = 2,46, sugerindo que encolheu menos. As densidades dos cimentos também foram testadas 4 vezes após a secagem completa. Tokuso apresentou densidade média menor que Tempron (densidade média de Tempron: 1,07 ± 0,12 g/mL; densidade média de Tokuso: 0,93 ± 0,08 g/mL; teste t: p = 0,38, t(6) = -0,94), implicando que apresentou menor taxa de encolhimento. Portanto, o Tokuso foi utilizado para as seguintes etapas de implantação e baseplating. O objetivo ao descrever o experimento acima não é recomendar nenhuma marca, mas sim lembrar os experimentadores de encontrar um cimento dentário que não sofra uma mudança de volume considerável ao curar.
Medição do deslocamento da imagem
Simulamos os procedimentos de baseplating fictício e baseplating original em um objeto fixo para investigar se o procedimento de baseplating dummy resulta em uma mudança menor na localização da placa de base do que o procedimento original. Um adesivo de cura luminosa foi utilizado para fixar uma agulha de seringa 23 G 2,5 cm no centro de uma placa de base com 1 cm saindo da placa de base (Figura 3C). Em seguida, o baseplating foi simulado segurando as agulhas com o braço de um instrumento estereotáxico. Em vez de usar animais de laboratório, um adesivo foi anexado à mesa do instrumento estereotáxico. A agulha da seringa perfurou o adesivo, representando assim o local original. Em seguida, a agulha foi elevada em 0,5 mm e as cirurgias de simulação foram iniciadas. Em uma cirurgia que mimetizou o procedimento único de baseplating8, o cimento dentário foi aplicado até cobrir a placa de base, que estava 1 cm acima do adesivo. Em seguida, houve um período de espera de 2 horas para o cimento curar antes de empurrar suavemente a agulha para perfurar o adesivo novamente. Como o adesivo de cura leve não estabilizava completamente a agulha, a agulha podia ser empurrada mais profundamente para criar outro orifício, representando a localização da placa de base após a secagem do cimento dental. A distância entre o orifício inicial e o segundo orifício foi medida para quantificar o deslocamento de localização da agulha. Os resultados demonstraram que a placa de base 1 cm acima do crânio resultou em um deslocamento de localização de 1,76 ± 0,14 mm, mas o baseplating fictício resultou em deslocamento de apenas 0,75 ± 0,17 mm (Figura 3D; distância média de deslocamento do baseplating único versus baseplating fict; teste t: p < 0,01, t(8) = 6,03).
Além disso, estávamos curiosos para saber se a altura do cimento dentário influenciaria o turno. Portanto, testamos ainda uma altura mais curta (Figura 3E; 0,5 cm acima) usando o procedimento de baseplating único. A placa de base ancorada 0,5 cm acima do crânio deslocou-se significativamente menos do que a placa de base 1 cm acima do crânio (Figura 3F; distância média de deslocamento: 0,43 ± 0,11 vs 1,76 ± 0,14 mm; teste t: p < 0,01, t(8) = 9,73). Os dados sugeriram que a altura da placa de base acima do crânio e a distância que a placa de base se deslocou foram positivamente correlacionadas. Como o procedimento de baseplating fictício é seguido por uma segunda etapa de baseplating que usa apenas uma quantidade mínima de cimento dental, esses dados também suportam a hipótese de que o baseplating fictício ajuda a melhorar a precisão do procedimento de baseplating.
Imagens usando um sistema de miniscópio de duas lentes
Seguindo os protocolos cirúrgicos de infusão viral, baseplating fictício e baseplating (Figura 2, Figura 4, Figura 5), observamos transientes de fluorescência de neurônios individuais em três camundongos (n = 3/5) (Figura 6A, Vídeo suplementar S3) durante o procedimento de baseplating e após o procedimento de baseplating enquanto os camundongos estavam se movendo livremente, confirmando que a distância de trabalho entre as lentes objetiva e relé permaneceu a mesma (Figura 6A1 versus a Figura 6A3, ocorreu apenas uma ligeira mudança de posição) após a secagem completa do cimento. Aqui, fornecemos vídeos da baseplating de um mouse (vídeo suplementar S2; mouse # 5) e imagens de cálcio subsequentes enquanto os ratos estavam se movendo livremente (vídeo suplementar S3; mouse # 3, # 4, # 5; dados brutos). Observe que o software de aquisição de dados para V3 não contém funções para a subtração em segundo plano, e o contraste do vídeo pode ser melhorado pelo processamento off-line). Para o vídeo suplementar S2, foi realizada uma busca manual para os sinais de fluorescência e, em seguida, o miniscópio foi anexado ao braço estereotáxico para ajustes finos. Alguns transientes de fluorescência foram observados durante a sondagem (Vídeo suplementar S2; Figura 6A). Um transitório é uma mudança suave no brilho em manchas cinzas ou brancas, não um padrão de disparo semelhante a uma luz piscante; As Figuras 6A 1 a 6A2 exibem imagens de transientes. O vídeo de camundongos que se comportam livremente mostrou uma mudança espacial aceitável em comparação com a região de interesse durante o procedimento de baseplating (vídeo suplementar S3). As margens das células não puderam ser significativamente melhoradas nesta fase porque não conseguimos ajustar a distância entre a parte inferior da lente de relé e os neurônios ativos. Notavelmente, alguns problemas podem ocorrer com frequência durante o procedimento de baseplating, incluindo a ausência de qualquer coisa, exceto um fundo uniforme (Figura 6B; Vídeo suplementar S4) ou visibilidade das margens dos glóbulos brancos sem transientes de fluorescência (Figura 6C; Vídeo suplementar S5). Dois exemplos de resultados negativos também são fornecidos (n = 2/5) (Figura 6B,C, Vídeos complementares S4, S5). As possíveis razões para as falhas são examinadas na seção Discussão. Os procedimentos cirúrgicos para esses dois camundongos foram realizados sem o uso de agulha de 1 mm de diâmetro para desobstrução da via; assim, a lente do relé foi implantada diretamente. Propomos que no rato #2, a lente de relé pode ter comprimido os neurônios e arrastado alguns neurônios para baixo, resultando em neurônios danificados. Portanto, transientes de fluorescência não foram encontrados.
Figura 1: Mecanismos do miniscópio e os defeitos que geralmente causam falha de imagem . (A) Diagrama de desenho animado da lente de relé e lente objetiva exibindo os mecanismos necessários para a visualização de células fluorescentes em um sistema de duas lentes. As ondas de sinalização de cada lente enfatizam a importância e o mecanismo envolvido em encontrar uma distância de trabalho para visualizar as células fluorescentes. (A1) A lente GRIN do relé é colocada acima dos neurônios-alvo dentro da distância de trabalho. Como o tom da lente de relé é de 0,5 * N (onde N é um inteiro), a lente permite a visualização dos neurônios-alvo transmitindo luz, trazendo os sinais de fluorescência originais para o topo da lente de relé. Então, aproximadamente 1/4 de um período sinusoidal completo de luz viaja através da lente GRIN objetiva (~ 0,25 pitch) e resulta em uma imagem ampliada. (A2) A lente objetiva transmite as imagens para um sensor complementar de metal-óxido-semicondutor (CMOS) localizado na parte superior (a placa verde no diagrama) do miniscópio. (B) Diagrama de desenho animado apresentando as diferenças nos procedimentos de implantação de lentes GRIN entre um sistema de duas lentes (B1) e (B2) um sistema de uma lente. Em geral, a principal diferença é que o sistema de uma lente usa diretamente sua lente objetiva para visualizar a superfície do cérebro; como resultado, a lente objetiva precisa ser implantada em cima dos neurônios-alvo. (C) Em contraste, no sistema de duas lentes, em comparação, uma lente de relé adicional é implantada no cérebro e a lente objetiva é pré-ancorada no miniscópio. (C1) A forma da placa de base para a versão V3 do UCLA Miniscope pode causar uma mudança desigual depois que o cimento dentário secar completamente. (C2) Esse deslocamento causa desalinhamento ou desvio da distância de trabalho entre a lente de relé e a lente objetiva. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Protocolos modificados e protocolos cirúrgicos detalhados para melhorar a taxa de sucesso do sistema de miniscópio de duas lentes. (A1) Protocolo cirúrgico modificado para o sistema de duas lentes. Os locais da injeção viral e do implante da lente GRIN de relé são mostrados. O baseplating fictício permite que a distância de trabalho abranja com precisão os neurônios de interesse e reduz o deslocamento posicional associado ao procedimento de baseplating (A2). Assim, (A3) a probabilidade de imagem de células fluorescentes em camundongos que se comportam livremente é aumentada. (B) Imagem de desenho animado dos passos para injeção viral e colocação da lente GRIN de relé. (B1) Primeiro, marque a agulha de aspiração com uma caneta de aproximadamente 1 mm (para experimentos com camundongos) da ponta para ajudar na avaliação da profundidade de aspiração do córtex. Em seguida, aspirar o tecido conjuntivo e o córtex (aproximadamente 1 mm de profundidade em camundongos) do cérebro. (B2) Use o hipocampo ventral como a área alvo para implantar uma lente de relé; notavelmente, o corpo caloso duro é o marco para a interrupção da aspiração da região cortical. A textura fibrosa do corpo caloso pode ser vista sob o estereomicroscópio durante a aspiração. (B3) Em segundo lugar, perfure o ponto de interesse com uma agulha interna de um cateter 20 G (aproximadamente 1 mm de diâmetro; o diâmetro é semelhante ao da lente de relé) para limpar um caminho antes da infusão viral. Sob o estereomicroscópio, um amassado (círculo tracejado na imagem) criado pela agulha deve ser visível. Abaixe a agulha de microinjeção e a lente de relé no amassado (ou apenas a 250 μm de distância do centro do dente). Por fim, coloque a lente GRIN relé (no presente estudo, utilizou-se uma lente relé de 1 mm de diâmetro). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Medição da mudança de volume do cimento dentário curado . (A) Um exemplo com cimento dentário curado de duas marcas. As setas pretas indicam os níveis originais depois de misturarmos o pó e a solução. As setas brancas indicam os níveis após 10, 20 e 40 min de cura. As setas vermelhas apontam para os fundos das pontas, que foram seladas com cola de cura leve. (B) Volumes médios dos restantes cimentos dentários depois de completamente secos. As barras e as barras de erro são os meios ± SEMs. * denota significância (P < 0,05) determinada pelo teste t de Student. (C) Ilustrações e uma fotografia explicando o método utilizado para medir o deslocamento de localização da placa de base. Uma agulha foi colada através da placa de base e foi usada para simular o procedimento original de baseplating (baseplating de uma etapa) e o procedimento de baseplating fictício. As setas vermelhas e pretas representam os locais da agulha antes e depois que o cimento dentário foi curado. (D) Mudanças de distância média da ponta da agulha (E) Ilustrações do método utilizado para medir a relação entre a placa de base acima do nível do crânio e a mudança de localização. (F) Mudanças de distância média da ponta da agulha. As barras e as barras de erro são os meios ± SEMs. ** denota significância (P < 0,01) determinada pelo teste t de Student. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Procedimento detalhado de baseplating fictício (executado imediatamente após o implante da lente de relé). (A1) Desenho animado de três etapas da lente objetiva, placa de base e montagem de filme de parafina no miniscópio. (A2) Versão fotográfica da montagem. (B1) Desenho animado mostrando o procedimento de baseplating fictício. Primeiro, o miniscópio montado é alinhado com a lente do relé. A lente objetiva posicionada é o mais próximo possível da lente de relé. Em segundo lugar, o cimento dentário é adicionado ao parafilme ao redor da placa de base e aplicado no crânio para fazer um molde feminino para futura baseplating. Em seguida, a placa de base é removida e a borracha de silício de moldagem (rosa) é adicionada e coberta com cimento dental para proteger o molde feminino e a lente de relé. O animal é então autorizado a se recuperar da anestesia. Após pelo menos 3 semanas, o procedimento de baseplating é realizado. (B2) Versão fotográfica de (B1). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Etapas para o procedimento de baseplating. (A1) Anexe a placa de base e (A2) ajuste manualmente o controle deslizante de foco para 2,7 a 3 mm. Uma configuração de 2,7 a 3 mm (na posição mostrada na imagem) parece ser o melhor lugar para começar antes de procurar manualmente as células fluorescentes. (B1) O primeiro diagrama de desenho animado ilustra a importância do comprimento entre a lente objetiva e a lente de relé para visualização das células fluorescentes (as células fluorescentes são geralmente observadas a uma distância entre 0,5 e 2 mm). Antes que a célula fluorescente surja, o pesquisador deve ver a margem da lente de relé (setas na imagem superior). É útil primeiro ajustar manualmente a lente para a posição de visualização ideal, porque é mais fácil fazer ajustes rápidos à mão. (B2) Coloque a argila adesiva reutilizável na sonda estereotáxica do braço e, em seguida, estabilize o miniscópio aderindo-o ao braço com argila adesiva reutilizável. Nesta fase, a região de interesse pode ter mudado, mas isso pode ser facilmente corrigido ajustando ligeiramente o braço estereotáxico e a argila adesiva reutilizável. Depois de verificar e encontrar a região ideal de interesse, adicione uma pequena quantidade de cimento dental (representado em vermelho). Cole a placa de base com o mínimo de cimento dentário possível. Separe o miniscópio e a placa de base depois que o cimento dental secar. Se a placa de base não for estável o suficiente, adicione cimento dental adicional. (C) Este diagrama ilustra a importância de cada passo para alcançar o sucesso. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Exemplos de sucesso e falha durante o procedimento de baseplating. (A) Um exemplo de imagem bem-sucedida durante o procedimento de baseplating. A lente de relé tinha como alvo o hipocampo ventral. Transientes de fluorescência foram notados quando o animal estava sob anestesia com isoflurano (ver também vídeo suplementar S2). (A2) O contraste foi aumentado para melhor visibilidade. As linhas vermelhas tracejadas indicam vasos sanguíneos. (A3) Transientes de fluorescência cinco dias após a baseplating quando o rato estava se comportando livremente em sua homecage (veja também o vídeo suplementar S3; as imagens dos camundongos #3 e #4 também são fornecidas no vídeo suplementar S3). Apenas uma ligeira mudança de posição ocorreu. (B1) Um exemplo de falha. Durante a baseplating, apenas áreas brancas/cinzentas homogéneas foram notadas que não tinham forma semelhante a uma célula (ver também vídeo suplementar S4). (B2) A lente de relé errou a área alvo e estava localizada acima de uma região sem células infectadas. (C1) Outro exemplo de falha. Neste rato, embora muitas células redondas tenham sido observadas, não foram observados transientes de fluorescência durante a baseplating (após três semanas de incubação e enquanto o ratinho estava anestesiado/sedado). Além disso, não foram servidos transientes de fluorescência quando o procedimento de baseplating foi realizado novamente (na quinta semana de incubação) ou mesmo quando o animal estava se comportando livremente. A imagem foi obtida durante a baseplating na quinta semana de incubação (ver também vídeo suplementar S5). (C2 e C3) A lente de relé perdeu a camada piramidal do hipocampo ventral. Os pontos azuis são núcleos que foram corados com DAPI. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Problema | Possível causa | Solução | ||
| Teve boas imagens ao fazer baseplating, mas completamente fora de foco no dia seguinte | Mudança de volume ao curar o cimento dentário entre o crânio do sujeito e a placa de base | Proceder à "baseplating fictícia" após o procedimento de implantação da lente, conforme sugerido no presente relatório. Escolha um cimento dentário que tenha menos mudança de volume. | ||
| Tem áreas brancas/cinzentas homogéneas sem qualquer forma semelhante a uma célula durante a baseplating (ver também vídeo suplementar S4) | Um. A lente de relé perdeu a área alvo B. Má expressão do indicador de fluorescência C. Esqueça de instalar uma lente objetiva abaixo do miniscópio, onde o indicador de fluorescência é realmente expresso | A. Use lentes fictícias para a prática de cirurgias. Verifique as coordenadas da lente fictícia após a prática de implantação B. Encontre um título viral ideal para experimentos de imagem de cálcio (referido a Resendez et al. 2016). Se, por algum motivo, o pré-teste não puder ser realizado, recomendamos que os iniciantes tentem um título mais alto primeiro. (Consulte a seção Disscusion para obter detalhes) C. Parafuso em uma lente GRIN objetiva (~ 0,25 pitch. ex: Edmund Optics; Stock #64-519) na parte inferior do miniscópio. | ||
| Observe muitas células, mas nenhuma dinâmica de fluorescência durante o baseplating | A. Neurônios insalubres ou neurônios mortos B. Tipo de afinamento esparso de neurônios C. Estado de anestesia profunda | R. Tenha cuidado com cada procedimento cirúrgico. Use uma nova agulha de seringa que seja semelhante ao diâmetro da lente do relé para cortar o caminho de infusão/implantação primeiro para liberar a pressão pelo implante da lente. Infundir lentamente o vírus e implantar lentamente a lente. B. Espere por mais tempo para monitorar as atividades dos neurônios ou aperte um pouco a cauda para estimular o rato. C. Baseplating não é um procedimento invasivo, e o animal só precisa de sedação. Portanto, manter 1,2 ~ 0,8% de isoflurano é suficiente, desde que o animal seja incapaz de se mover no quadro estereotáxico. | ||
Tabela 1: Gráfico de solução de problemas.
Vídeo suplementar S1: Teste de volume de cimento dental. A diferença entre o volume foi medida no início do preparo do cimento dentário e o volume após a secagem do cimento. Duas marcas de cimento dental (por exemplo, Tempron e Tokuso Curefast) foram testadas. Para testar o volume do cimento dentário após a secagem, 0,5 g de cada pó de cimento dental foram pesados e misturados com sua solução apropriada (1 mL). Em seguida, as pontas da pipeta de 0,1-10 μL foram carregadas com 2,5 μL da mistura de cimento dental e seladas com cola de cura leve. Em seguida, as pontas foram colocadas em uma cremalheira, as superfícies das misturas de cimento dental foram marcadas e filmadas por 40 minutos. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo suplementar S2: Demonstrações do procedimento de baseplating. O ângulo entre a superfície da lente objetiva e a lente relé foi ajustado girando a barra auricular, a barra dentária ou a argila adesiva reutilizável no eixo z. A margem da lente de relé apareceu como um círculo cinza semelhante à lua no monitor. A expressão viral bem-sucedida e o implante do cristalino devem revelar pelo menos uma dinâmica de fluorescência (setas) durante a baseplating. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo suplementar S3: Demonstrações da dinâmica de fluorescência em camundongos de comportamento livre. Transientes de fluorescência dos camundongos #3, #4 e #5. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo suplementar S4: Um exemplo de falha. Um fundo uniforme apareceu durante o procedimento de baseplating. Por favor, note que a alteração no brilho não foi por causa dos transientes de fluorescência de células individuais; foi causada pelo procedimento de busca. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo suplementar S5: Demonstração de outro exemplo de falha. A falta de transientes de fluorescência ocorreu durante o procedimento de baseplating, mas algumas margens celulares redondas ainda eram visíveis. Por favor, note que a alteração no brilho não foi causada pelos transientes de fluorescência de células individuais; foi causada pelo procedimento de busca. Clique aqui para baixar este vídeo.
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Discussion
O presente relatório descreve um protocolo experimental detalhado para pesquisadores que usam o sistema UCLA Miniscope de duas lentes. As ferramentas projetadas em nosso protocolo são relativamente acessíveis para qualquer laboratório que deseje experimentar imagens de cálcio in vivo. Alguns protocolos, como injeção viral, implantação de lentes, baseplating fictício e baseplating, também podem ser usados para outras versões do sistema miniscópio para melhorar a taxa de sucesso da imagem de cálcio. Além dos problemas gerais com a injeção viral e o implante da lente que precisam ser corrigidos independentemente da versão do miniscópio, a estrutura da placa de base da UCLA pode causar uma mudança de posição, o que pode levar a distâncias de trabalho incompatíveis entre as lentes objetiva e de relé (Figura 1C). Um protocolo experimental modificado foi desenvolvido para minimizar o deslocamento posicional das duas lentes (Figuras 2, Figura 4, Figura 5). A imagem bem-sucedida do cálcio pode ser obtida por meio de uma combinação de expressão viral bem-sucedida, implantação de lentes e procedimentos de baseplating (Figura 5C). O uso de um sistema de duas lentes para observar áreas cerebrais profundas requer um alto nível de precisão nos procedimentos de baseplating, porque as posições relativas da lente de relé implantada e da lente objetiva também precisam ser precisas. Este relatório não apenas apresenta um protocolo que resolve problemas de baseplating, mas também discute algumas dicas para injeção viral e implantação de lentes. A seguir, discutimos primeiro os procedimentos de baseplating, seguidos da injeção viral e dos procedimentos de implante de lentes, e descrevemos alguns exemplos de falhas (Figura 6).
Baseplating
A versão V3 do UCLA Miniscope é atualmente o projeto mais comumente usado e pode ser encomendado on-line. A placa de base desta versão consiste em duas bordas sem paredes (Figura 1C1), mas sua forma pode causar um deslocamento desigual (Figura 1C1, C2) após o cimento dentário estar completamente seco. Os procedimentos de basplating fictício em nosso protocolo (Figura 4) minimizam os problemas de desalinhamento e deslocamento da placa de base, pois utiliza filme de parafina para reduzir o espaço disponível para o cimento dentário durante o baseplating real (Figura 5B). O espaço restante ainda é suficiente para encontrar uma posição de imagem ideal durante o procedimento de baseplating real. Portanto, o pesquisador pode colar a placa de base com o mínimo de cimento dentário possível (Figura 5B2). Além disso, o procedimento de baseplating fictício leva relativamente pouco tempo (aproximadamente 15 a 20 min), uma vez que não requer uma distância perfeita entre a lente objetiva e a lente relé para ser alcançado. No entanto, o baseplating fictício é apenas um dos fatores-chave para o sucesso da imagem de cálcio; por exemplo, durante o monitoramento de sinais de fluorescência, os neurônios podem parecer embaçados se estiverem ligeiramente fora do plano de trabalho (dependendo da distância de trabalho da lente de relé; muitas vezes aproximadamente 100 ~ 300 μm). A capacidade de melhorar a distância de trabalho é limitada, uma vez que a distância de trabalho dos neurônios é predeterminada pelo procedimento de implantação da lente de relé. Um experimento foi realizado sem o procedimento de baseplating fictício e a região de interesse foi sempre (em quatro em cada quatro camundongos) perdida após o baseplating único. Portanto, essas soluções foram concebidas para reduzir o problema do encolhimento. Alguns cimentos dentários de cura leve podem evitar o problema de encolhimento durante a cura, porque curam muito rapidamente; esses cimentos podem ajudar os pesquisadores a ajustar a distância durante o procedimento de baseplating. Embora a faixa de comprimentos de onda para excitar os indicadores de cálcio e curar o cimento dentário seja diferente, o fotobranqueamento durante o procedimento de baseplating precisa ser evitado. A fim de evitar o fotobranqueamento, a gama de comprimentos de onda gerados pela fonte de luz precisa ser bastante estreita para evitar reações cruzadas entre os indicadores de cálcio e o cimento dentário de cura luminosa. Portanto, o uso de cimento dental light-cure não é recomendado para o procedimento de baseplating. Além disso, algumas marcas específicas de cimentos dentários são frequentemente utilizadas para colagem de placas de base por outras equipesde pesquisa 6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22 . As propriedades de baixo encolhimento desses cimentos podem resolver o problema, mas não tivemos a oportunidade de testar essas marcas devido a dificuldades em comprá-las (importá-las). Os produtos de grau médico podem estar sujeitos a regulamentos de importação, dependendo do país/região. Se os pesquisadores tiverem dificuldade de acesso aos cimentos mencionados na literatura 6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22, nosso protocolo resolverá o problema do encolhimento do cimento dental.
Além do problema de encolhimento, o desgaste estrutural pode ocorrer no próprio miniscópio e na placa de base (especialmente os ímãs na placa de base) ao longo de muitos experimentos. Qualquer pequena lacuna causada pelo desgaste reduz a estabilidade da distância entre as duas lentes. Novamente, a precisão sobre todo o caminho óptico é fundamental para a imagem de transientes de cálcio em camundongos que se comportam livremente usando um miniscópio.
Solução de problemas de injeção/implantação de lentes virais
Antes de infundir o vírus na região do cérebro, recomenda-se montar uma nova agulha no braço estereotáxico e perfurar lentamente o cérebro nas coordenadas apropriadas. Como a nova agulha é muito nítida, essa punção serve como uma etapa de preparação para limpar o caminho (ou cortar um caminho) para a agulha de microinjeção real e a lente de relé e minimiza o dano tecidual, que pode ser causado pela compressão da agulha de microinjeção ou lente de relé. A agulha afiada corta um caminho para a lente de relé contundente; assim, a ponta da agulha deve ser abaixada para as mesmas coordenadas com a lente do relé. A agulha interna de um cateter de 20 G I.V. foi escolhida por possuir diâmetro de 1 mm, semelhante ao diâmetro da nossa lente de relé. Um medidor de agulha diferente pode ser usado dependendo do diâmetro da lente do relé.
Embora o presente estudo não tenha enfocado as propriedades e os títulos dos vetores virais, esses fatores ainda são críticos para o sucesso da imagem do cálcio (Figura 5C). É necessário pré-testar a qualidade da expressão do vetor viral. As etapas 1 a 5 do protocolo de Resendez et al. fornecem métodos detalhados para a identificação de um título viral ideal para experimentos de imagem de cálcio8. Se o pré-teste não puder ser realizado por algum motivo, recomenda-se que os iniciantes tentem um título relativamente alto primeiro. Uma das desvantagens do uso de um título viral elevado é a citotoxicidade8. Os neurônios mortos dão origem à autofluorescência e são visíveis como pontos brancos brilhantes sob o miniscópio8. No entanto, esses neurônios mortos são bons marcos para iniciantes encontrarem e praticarem o procedimento de baseplating. Por outro lado, embora a infusão de um vírus de baixo título tenha um risco menor de matar células, a fluorescência pode ser mascarada pelo fundo se as células não mostrarem transientes de fluorescência durante o procedimento de baseplating. É difícil identificar as razões para a falha porque os neurônios-alvo podem ser perdidos devido ao implante da lente de relé ou devido à má expressão pelo vetor viral. Determinar a causa é muito confuso sem confirmação histológica. Portanto, o uso de vírus de título relativamente alto é recomendado se os vetores virais não puderem ser pré-testados.
Resendez et al. recomendam a inserção da agulha de microinjeção 250 μm lateral e ventral para a colocação da lente. Nossas observações demonstraram que a infusão do vírus na mesma profundidade que a lente de retransmissão também pode levar à expressão de bons sinais de cálcio. Propomos que, devido à possibilidade de infecção e disseminação, a infusão do vírus na mesma profundidade que a coordenada da lente de relé é ideal para reduzir o dano tecidual e aumentar a precisão da distância entre os neurônios infectados e a lente de retransmissão. Resendez et al também recomendam a realização de injeção viral e implantação de lentes durante a mesma cirurgia, dada a estreita faixa de distâncias de trabalho entre as células-alvo e a lente de relé8. No entanto, alguns pesquisadores seguem um protocolo no qual a etapa de infusão viral e a etapa de implantação do cristalino são realizadas com duas (ou mais) semanas de intervalo18,26. Prolongar o tempo entre as etapas reduz o tempo operatório individual. Mas neste protocolo essas duas etapas foram fundidas em uma cirurgia, pois no protocolo de uma cirurgia, o cirurgião pode monitorar a posição entre a agulha de microinjeção e a lente de relé ao baixá-las na área alvo, o que reduz a chance de falha no direcionamento (Figura 2B3).
Para dois camundongos (camundongos #1 e #2), o uso de uma agulha para criar um caminho para a lente também foi omitido, e no rato #2, foram observadas manchas cinzentas arredondadas semelhantes a células (Figura 6C). No entanto, a dinâmica de fluorescência (vídeo suplementar S5) não foi observada. Ao examinar a fatia cerebral deste exemplo (Figura 6C2, C3), postulamos que a lente do relé arrastou algumas células para baixo enquanto estava sendo abaixada. Esses neurônios arrastados não eram saudáveis, portanto, nenhuma atividade foi notada durante o procedimento de baseplating ou durante o experimento.
Tivemos um rato com um sinal cinza completamente homogêneo e sem imagens visíveis semelhantes a células durante o procedimento de baseplating (Figura 6B1). Depois de sacrificar o rato, foram observadas fatias cerebrais. Percebeu-se que o cristalino estava no lado medial da camada piramidal curva; a área-alvo (Figura 6B2) foi completamente perdida. Essas tentativas malsucedidas foram experiências críticas que nos levaram a modificar nosso protocolo cirúrgico e, finalmente, ter sucesso com três camundongos (vídeo suplementar S3).
Agulha de microinjeção
O corpo caloso é um trato fibroso resistente que se sobrepõe ao hipocampo dorsal. Devido à sua rigidez, resiste à penetração por uma agulha de microinjeção de ponta plana. Portanto, recomendamos o uso de uma agulha de microinjeção com uma ponta chanfrada. Este tipo de agulha não só reduz o dano tecidual, mas também reduz a possibilidade de falha em infundir o vírus na área alvo devido ao bloqueio por fibras próximas. Resumimos os problemas acima mencionados em um gráfico de solução de problemas (Tabela 1).
Prazo
O prazo para todo o procedimento está resumido na Figura 2A, com dias como as unidades. Em detalhe, a parte da cirurgia (injeção viral, implante de lente de relé, baseplating fictício) pode levar 3 h para iniciantes ou 1,5 h para pesquisadores suficientemente treinados. Os camundongos têm um pequeno tamanho corporal e metabolismo rápido, sendo mais suscetíveis a problemas de saúde causados por longos períodos sob anestesia do que as espécies maiores27. Os pesquisadores devem procurar manter o tempo gasto em cirurgia abaixo de 3 h. O baseplating real pode ser realizado após 3 a 6 semanas de expressão do indicador de cálcio. Este procedimento pode demorar 1 h. A observação longitudinal subsequente da atividade do cálcio pode ser continuada por mais de 1 mês.
Conclusões
O UCLA Miniscope é um dispositivo de imagem de cálcio in vivo de código aberto. Sem uma placa de base ou módulo de lente pré-instalado e pronto, os indivíduos que realizam experimentos precisam ser capazes de atingir com precisão a distância ideal entre a lente objetiva e a lente de relé durante o procedimento de baseplating. O aumento da dificuldade de usar o sistema UCLA Miniscope de duas lentes reside na mudança de volume do cimento dental. Otimizamos os protocolos originais e minimizamos os defeitos causados pelos problemas mencionados acima, aumentando assim a taxa de sucesso da imagem de cálcio com o sistema UCLA Miniscope de duas lentes.
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Disclosures
Este não é um estudo apoiado pela indústria. Os autores não relatam conflitos de interesse financeiros.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da Ciência e Tecnologia, Taiwan (108-2320-B-002 -074, 109-2320-B-002-023-MY2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.7-mm drill bit | #19008-07 | Fine Science Tools; USA | for surgery |
| 0.1–10 μl pipette tips | 104-Q; QSP | Fisher Scientific; Singapore | for testing dental cement |
| 20 G IV cathater | #SR-OX2032CA | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | for surgery |
| 27 G needle | AGANI, AN*2713R | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | for surgery |
| AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE | #104487-AAV9; 1.5*10^13 | Addgene viral prep; MA, USA | for viral injection |
| Atropine sulfate | Astart; Hsinchu, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Baseplate | V3 | http://miniscope.org | for dummy baseplating/baseplating |
| BLU TACK | #30840350 | Bostik; Chelsea, Massachusetts, USA | Reusable adhesive clay; for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Bone Rongeur Friedman | 13 cm | Diener; Tuttlingen, Germany | for baseplating |
| Buprenorphine | INDIVIOR; UK | for surgery | |
| Carprofen | Rimadyl | Zoetis; Exton, PA | analgesia |
| Ceftazidime | Taiwan Biotech; Taiwan | prevent infection | |
| Data Acquisition PCB for UCLA Miniscope | purchased on https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq | for baseplating | |
| Dental cement set | Tempron | GC Corp; Tokyo, Japan | for testing dental cement |
| Dental cement set | Tokuso Curefast | Tokuyama Dental Corp.; Tokyo, Japan | for testing dental cement/surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Dual Lab Standard with Mouse and Rat Adaptors | #51673 | Stoelting Co; Illinois, USA | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Duratear ointment | Alcon; Geneva, Switzerland | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Ibuprofen | YungShin; Taiwan | analgesia | |
| Isoflurane | Panion & BF Biotech INC.; Taoyuan, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Inscopix | nVista System | Inscopix; Palo Alto, CA | for comparison with V3 UCLA Miniscope |
| Ketamine | Pfizer; NY, NY | for euthanasia | |
| Normal saline | for surgery | ||
| Micro bulldog clamps | #12.102.04 | Dimedo; Tuttlingen, Germany | for lens implantation |
| Microliter Microsyringes, 2.0 µL, 25 gauge | #88400 | Hamilton; Bonaduz, Switzerland | for viral injection |
| Molding silicone rubber | ZA22 Thixo | Zhermack; Badia Polesine, Italy | for dummy baseplating |
| Objective Gradient index (GRIN) lens | #64519 | Edmund Optics; NJ, USA | for dummy baseplating/baseplating |
| Parafilm | #PM996 | Bemis; Neenah, USA | for dummy baseplating |
| Portable Suction | #DF-750 | Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc., Taichung, Taiwan | for surgery |
| Relay GRIN lens | #1050-002177 | Inscopix; Palo Alto, CA, USA | for dummy baseplating/baseplating |
| Stainless steel anchor screws | 1.00 mm diameter, total length 3.00 mm | for surgery | |
| Stereo microscope | #SL720 | Sage Vison; New Taipei City, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Stereotaxic apparatus | #51673 | Stoelting; IL, USA | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| UV Cure Adhesive | #3321 | Loctite; Düsseldorf, Germany | for testing dental cement |
| V3 UCLA Miniscope | purchased on https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Xylazine | X1126 | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | for euthanasia |
| Xylocaine pump spray 10% | AstraZeneca; Södertälje, Sweden | for surgery |
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