Summary
Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol voor het voorbereiden van monsterrasters bij temperaturen tot 70 °C, voorafgaand aan het invriezen van de duik voor cryo-EM-experimenten.
Abstract
De monsterrasters voor cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) experimenten worden meestal voorbereid bij een temperatuur die optimaal is voor de opslag van biologische monsters, meestal bij 4 °C en soms bij kamertemperatuur. Onlangs ontdekten we dat de eiwitstructuur die bij lage temperatuur wordt opgelost, mogelijk niet functioneel relevant is, met name voor eiwitten uit thermofiele archaea. Er werd een procedure ontwikkeld om eiwitmonsters bij hogere temperaturen (tot 70 °C) voor cryo-EM-analyse voor te bereiden. We toonden aan dat de structuren van monsters die bij hogere temperaturen worden bereid, functioneel relevant en temperatuurafhankelijk zijn. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het voorbereiden van monsterroosters bij hoge temperatuur, met 55 °C als voorbeeld. Het experiment maakte gebruik van een verglazingsapparaat dat was aangepast met behulp van een extra centrifugebuis en monsters werden geïncubeerd bij 55 °C. De gedetailleerde procedures werden verfijnd om dampcondensatie te minimaliseren en een dunne laag ijs op het rooster te verkrijgen. Voorbeelden van succesvolle en mislukte experimenten worden gegeven.
Introduction
De cryo-EM-technologie voor het oplossen van de structuren van eiwitcomplexen is blijven verbeteren, met name in de richting van het verkrijgen van structuren met hoge resolutie 1,2. In de tussentijd is het landschap van de toepassing ervan ook uitgebreid door de monsteromstandigheden te variëren, zoals pH of liganden voorafgaand aan het vitrificatieproces3, waarbij monsterroosters worden voorbereid, gevolgd door dompelbevriezing 4,5. Een andere belangrijke voorwaarde is de temperatuur. Hoewel cryo-EM-experimenten, zoals röntgenkristallografie, worden uitgevoerd bij lage temperaturen, weerspiegelt de structuur die door cryo-EM wordt opgelost de structuur in de oplossingstoestand voorafgaand aan vitrificatie. Tot voor kort gebruikten de meeste cryo-EM-onderzoeken met enkelvoudige deeltjesanalyse (SPA) monsters die op ijs worden bewaard (d.w.z. bij 4 °C) voorafgaand aan vitrificatie6, hoewel een aantal studies monsters gebruiken bij ongeveer kamertemperatuur 7,8,9,10 of zo hoog als 42 °C11. In een recent rapport voerden we temperatuurafhankelijke studies uit van het enzym ketolzuurreductoisomerase (KARI) van het thermofiele archaeon Sulfolobus solfataricus (Sso) bij zes verschillende temperaturen van 4 °C tot 70 °C12. Onze studies suggereren dat het belangrijk is om monsterrasters voor te bereiden op functioneel relevante temperaturen en dat cryo-EM de enige structurele methode is die praktisch haalbaar is voor het oplossen van de structuur van hetzelfde eiwitcomplex bij meerdere temperaturen.
De grootste moeilijkheid voor vitrificatie bij hoge temperaturen is het minimaliseren van dampcondensatie en het bereiken van dun ijs. Hier rapporteren we het gedetailleerde protocol dat wordt gebruikt voor het voorbereiden van monsterroosters bij hoge temperaturen in onze eerdere studie van de Sso-KARI 12. We gaan ervan uit dat de lezers of kijkers al ervaring hebben met de algemene monstervoorbereiding en gegevensverwerkingsprocedures voor cryo-EM-experimenten en benadrukken de aspecten die relevant zijn voor hoge temperaturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Dit protocol heeft tot doel een gemodificeerd commercieel verglazingsapparaat te gebruiken om de cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) monsters voor te bereiden bij specifieke temperaturen, vooral hoger dan 37 °C. De algemene experimentele opzet is weergegeven in figuur 1. Het protocol gebruikt 55 °C als voorbeeld. Voor de specifieke omstandigheden bij andere temperaturen wordt verwezen naar aanvullende tabel 2 in referentie12.
1. Bereiding van het verglazingsapparaat
- Maak een gat van 1 cm in een centrifugebuis van 50 ml aan het gesloten uiteinde.
- Plaats de buis in de vitrificatiekamer bij de ultrasone wateruitlaat, zoals weergegeven in figuur 2.
OPMERKING: Het doel is om watercondensatie te minimaliseren door waterdamp door de buis naar de warmtewisselaar te leiden voordat deze de hele kamer bereikt. - Stel de temperatuur van het vitrificatieapparaat in op de gespecificeerde temperatuur (bv. 55 °C, zoals weergegeven in figuur 3) en laat de vitrificatie-apparaatkamer tot 55 °C en 100% relatieve vochtigheid bereiken. Laat het minstens een half uur staan om de omstandigheden te stabiliseren voordat u met het experiment begint.
2. Het monster en de gereedschappen opwarmen
- Plaats het waterbad op een kookplaat en zet de kookplaat op de gewenste temperatuur (hier 55 °C). Controleer met een thermometer of het water 55 °C bereikt.
- Incubeer het monster in het waterbad en verwarm de pipetpunt aan de rand van de kookplaat gedurende 2 minuten of langer voor het blotting-experiment.
OPMERKING: De hoogste temperatuurinstelling voor de vitrificatie-apparaatkamer is 60 °C. Om roosters met een hogere temperatuur voor cyro-EM-experimenten voor te bereiden (bv. 70 °C), wordt het monster geïncubeerd in het waterbad bij 80 °C en wordt het gemiddelde tussen de monstertemperatuur en de temperatuur van het verglazingsapparaat geschat op de werkelijke temperatuur van het monster op het rooster (70 °C in dit geval). Zie het gedeelte Discussie voor meer informatie en beperkingen van deze schatting.
3. Voorbereiding op het vloeiexperiment
- Gloeiafvoer een gatvormig koolstofondersteund raster bij 25 mA gedurende 30 s, of een alternatief voor de waarden afhankelijk van het gebruikte apparaat.
- Incubeer het pincet met het rooster in het vitrificatieapparaat gedurende 2 minuten of langer.
- Vul de ethaancontainer met ethaan volgens standaardprocedures. Laat het ethaan niet overlopen.
OPMERKING: Deze stap duurt ongeveer 10 minuten en moet onmiddellijk worden gevolgd met het blotting-experiment om bevriezing te voorkomen. - Plaats het vitrificatiefilterpapier niet eerder dan 5 minuten voor het vloeiexperiment in de vitrificatiekamer.
OPMERKING: Als u het filterpapier te vroeg in de kamer plaatst, wordt het te nat.
4. Blotting experiment
OPMERKING: Wanneer u het rooster vasthoudt, moet u ervoor zorgen dat het rooster stabiel is en dat er een minimaal contactoppervlak is met het pincet (figuur 4). Dit wordt gedaan om de beste koelefficiëntie van ethaan te behouden en om niet-glasachtig ijs te vermijden.
- Gebruik een pipetpunt om 7-9 μL van het monster op het rooster aan te brengen. Wacht vervolgens op 1-2 s, dep 1-1,5 s en dompel het monster snel in vloeibaar ethaan.
- Breng het rooster over van vloeibaar ethaan naar de cryobox, die wordt opgeslagen in vloeibare stikstof.
OPMERKING: Deze stap moet zeer zorgvuldig worden uitgevoerd omdat het pincet nog steeds heet is, dus de hele koeltank zit op dit moment vol damp.
5. Kwaliteitscontrole voor de roosters
- Knip de rasters en upload ze naar een cryo-EM-instrument.
- Gebruik het beeldscherm van het cryo-EM-instrument en de lage dosisfunctie van de software om de ijsconditie op het rooster en de verdeling van het monster op het rooster te screenen.
OPMERKING: Vaak zijn de roosters erg droog of is de ijslaag te dik. Het slagingspercentage van de roosters die bij hoge temperaturen worden bereid, is aanzienlijk lager dan dat bij kamertemperatuur of 4 °C. Representatieve resultaten van goede rasters en niet-bevredigende rasters worden weergegeven in de volgende sectie. - Als de kwaliteit van het resulterende raster niet goed is, herhaal dan het proces van rastervoorbereiding met verschillende omstandigheden (zoals wachttijd, blotting-tijd, enz.). Als de kwaliteit van het resulterende raster goed is, herhaalt u dezelfde stappen om rasters met een andere temperatuur te maken.
6. Gegevensverzameling
- Breng de roosters van goede kwaliteit over naar een cryo-EM-instrument met hoge resolutie.
- Voer gegevensverzameling en gegevensanalyses uit volgens vastgestelde procedures.
OPMERKING: Zoals getoond in onze vorige publicatie, wordt de resolutie van de structuur niet beïnvloed door de hoge temperatuur12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het overzicht van de lage vergroting is weergegeven in figuur 5A,B. Paneel A is een voorbeeld van een succesvol raster. Er is een ijsgradiënt van linksboven (dikker) naar rechtsonder (dunner of leeg). Zo'n raster maakt het gemakkelijker om een geschikte dikte van de ijslaag in het middengebied te vinden die geschikt is voor gegevensverzameling, zoals de blauwe en groene dozen. Het rooster B is te droog. De vierkanten in het raster hebben een helder contrast, wat betekent dat de ijslaag te dun is of dat er helemaal geen ijslaag is. Alleen de twee vierkanten die door de rode pijlen worden aangegeven, zijn geschikt voor gegevensverzameling.
Verder zijn voorbeelden van de lage dosis beelden uit verschillende rasters weergegeven in figuur 5C,D. De afbeelding in paneel C laat zien dat het grootste deel van het ijs in de kristallijne vorm is, niet geschikt voor gegevensverzameling. Aan de andere kant laat de afbeelding in paneel D zien dat de ijslaag zich meestal in een amorfe toestand bevindt, geschikt voor gegevensverzameling.
Houd er rekening mee dat dit een korte paper is die zich richt op rastervoorbereiding bij hoge temperaturen. Het raster bevat alleen het voorbeeld voor gegevensverzameling. Een goed raster heeft een goede kans, maar geen definitieve kans, om goede gegevens te genereren voor het oplossen van een structuur met hoge resolutie. De echte cryo-EM-gegevens en uiteindelijke structuren voor de voorbeelden die in dit artikel worden beschreven, worden al beschreven in het gepubliceerde artikel12. Kortom, we hebben rasters verkregen die goed genoeg zijn voor gegevensverzameling, de structuren van twee Sso-KARI-complexen bij elk zes verschillende temperaturen opgelost en de structuren van verschillende temperaturen voor elk complex vergeleken, evenals de structuren tussen de twee complexen met dezelfde temperatuur. De resultaten geven aan dat de structuur van elk complex temperatuurafhankelijk is en dat de temperatuurafhankelijke veranderingen verschillen tussen de twee complexen. Belangrijk is dat de opeenvolgende structurele veranderingen goed correleren met de opeenvolgende temperatuurveranderingen, wat een sterke indicatie is voor het succes van de temperatuurafhankelijke monsterrastervoorbereiding.
Figuur 1: De algemene experimentele opstelling voor cryo-EM-monstervoorbereiding op hoge temperatuur. De getoonde items omvatten vitrificatieapparatuur, incubator, timer, pipetpuntplaatsing, koeltank en pincet. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Wijziging van de kamer van het vitrificatieapparaat. Een buis van 50 ml wordt geïnstalleerd bij de ultrasone spuituitlaat zoals aangegeven door de rode pijl12. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Uiterlijk van het verglazingsapparaat tijdens het experiment. Het scherm toont de temperatuur bij 55 °C en de luchtvochtigheid bij 100%. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Gebruik een pincet om het rooster te pakken. Het wordt aanbevolen dat het pincet het rooster met zo min mogelijk contact vastgrijpt, maar het moet het rooster stabiel kunnen houden tijdens het proces van de bewerking. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Representatieve resultaten: Rastercontrole door Cryo-EM. (A,B) de algemene toestand van het raster weergeven. (C,D) tonen voorbeelden van de lage dosis beelden uit verschillende rasters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zorg er in stap 1 van het protocol voor dat de centrifugebuis goed is geïnstalleerd en niet valt wanneer het experiment aan de gang is. Vanwege de accumulatie van een groot aantal waterdruppels in de kamer, die de adsorptiecapaciteit van het filterpapier kunnen veranderen, wordt aanbevolen dat de totale tijd van het experiment niet langer mag zijn dan 30 minuten nadat de vitrificatieapparaatkamer de evenwichtstemperatuur heeft bereikt. Als de bedrijfstijd langer is dan 30 minuten, moet de operator het filterpapier vervangen en wachten tot de cabine de temperatuur en vochtigheid weer in evenwicht heeft gebracht. Bij stap 8 van het protocol is het voorgestelde monstervolume van 7-9 μL groter dan normaal, omdat het monster anders snel verdampt bij hoge temperatuur, wat leidt tot lege vierkanten op het rooster. Aan de andere kant wordt het ten zeerste aanbevolen dat het aangebrachte monster niet groter is dan 9 μL. Anders is het zeer waarschijnlijk dat het monster naar beneden druppelt tijdens het verplaatsen van het pincet voordat het wordt gevlekt. Over het algemeen is een sleutel tot het succes van deze techniek het stabiel en snel grijpen van rasters en een correcte en stabiele uitvoering van elke tijdsgebonden actie. Bovendien wordt aanbevolen dat elke ronde van experimenten slechts betrekking heeft op één specifieke hoge temperatuur. Voordat u het experiment bij een andere temperatuur uitvoert, moeten alle systemen volledig worden hersteld en gereset.
Vanwege de hoge temperatuur en hoge luchtvochtigheid van de kamer is het raam vaak bedekt met mist, wat leidt tot problemen bij het starten van het experiment. Het gebruik van een beetje zeepsuds wordt aanbevolen om het raam vrij te maken. Als roosters niet goed zijn, zijn mogelijke redenen dat de hierboven beschreven stappen niet nauwkeurig worden gevolgd en/of dat de stappen te lang duren. Probeer de voorbereiding van monsterrasters met precisie en snelheid te herhalen. Als de roosters na herhalingen nog steeds niet goed zijn, probeer dan de omstandigheden aan te passen. Het meest voorkomende probleem dat in dit experiment wordt waargenomen, is geen ijs op het rooster bij de hoge temperatuur. Als dat zo is, probeer dan de blotting-tijd verder te verkorten. Aan de andere kant, als het ijs te dik is, probeer dan de blotting-tijd te verlengen.
Een beperking van de hoge temperatuur cryo-EM is dat de maximale verwarmingstemperatuur op het vitrificatieapparaat 60 °C is. Om de hogere temperatuur te bereiken, werd het monster verwarmd boven 60 °C (bv. 80 °C) en werd het gemiddelde tussen de monstertemperatuur en de verglaastemperatuur geschat op de werkelijke temperatuur van het monster op het rooster (in dit geval 70 °C). Er kan sprake zijn van enige onnauwkeurigheid op basis van deze schatting. Een mogelijke toekomstige oplossing is om een thermokoppel te bouwen om de rastertemperatuur nauwkeurig te meten vlak voordat het bevriest. Een andere mogelijke beperking is de stabiliteit van het eiwit bij hoge temperaturen. Een afzonderlijk experiment met circulair dichroïsme moet worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat het eiwit stabiel is bij de temperatuur voor het geplande cryo-EM-experiment.
Een andere beperking is dat slechts twee soorten in de handel verkrijgbare vitrificatieapparatuur kunnen worden verwarmd tot boven 37 °C en tot 60 °C zoals hierboven vermeld (bijv. Thermo Fischer Vitrobot en Leica EM-GP). De vitrificatieapparatuur van andere verkopers is beperkt tot kamertemperatuur of alleen instelbaar tussen 4 °C en 37 °C. Het is echter mogelijk voor onderzoeksgroepen om in de toekomst hun eigen duikapparaten te bouwen met uitgebreide temperatuurbereiken.
Ons protocol is aangepast van bestaande protocollen 4,5,6, met als doel de roosters voor te bereiden op temperaturen hoger dan kamertemperatuur. Zonder de hier beschreven wijzigingen aan te brengen, is de kans op succes voor het maken van goede hogetemperatuurmonsterroosters die geschikt zijn voor cryo-EM-beeldverzameling zeer klein.
Twee artikelen in 2019 hebben aangetoond dat eiwitstructuren temperatuurafhankelijk zijn, in correlatie met de temperatuurafhankelijkheid van eiwitfuncties, in het bereik van 4 °C tot 42 °C voor het TRP-kanaal TRPV311 en 4 °C tot 70 °C voor Sso-KARI 12. Deze rapporten zullen waarschijnlijk een verandering in cryo-EM-onderzoek aanmoedigen, in die zin dat meer toekomstige studies zullen worden uitgevoerd bij functioneel relevante temperaturen, meestal bij 37 ° C. De stabiliteit van het gezuiverde eiwit bij deze temperatuur kan een probleem zijn. Het is echter vereist om het eiwitmonster bij deze temperatuur slechts 2 minuten volgens ons protocol te incuberen. Als alternatief kunnen fysiologische omstandigheden worden bereikt door eiwitten in cellen in beeld te brengen met behulp van tomografie en sub-tomomiddeling. Bovendien kan cryo-EM worden gebruikt om het mechanisme en de tussenproducten van eiwitten te bestuderen die zich ontvouwen bij hoge temperaturen, waarschijnlijk in het bereik van 40 ° C tot 80 ° C. Deze studies zullen allemaal profiteren van het hier beschreven protocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Dr. Hervé Remigy van Thermo Fisher Scientific voor nuttig advies. De cryo-EM experimenten werden uitgevoerd in de Academia Sinica Cryo-EM Facility (ASCEM). ASCEM wordt ondersteund door Academia Sinica (Grant No. AS-CFII-108-110) en Taiwan Protein Project (subsidienr. AS-KPQ-109-TPP2). De auteurs bedanken ook mevrouw Hui-Ju Huang voor de hulp bij de monstervoorbereiding.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Falcon tube | Falcon | 352070 | size: 50 mL |
| Filter paper | Ted Pella | 47000-100 | Ø55/20mm, Grade 595 |
| HI1210 | Leica | water bath | |
| K100X | Electron Microscopy Sciences | glow discharge | |
| Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu grid | Ted Pella | 658-200-CU-100 | |
| Titan Krios G3 | Thermo Fisher Scientific | 1063996 | low dose imaging |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | 1086439 | |
| Vitrobot Tweezer | Ted Pella | 47000-500 |
References
- Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587, 157-161 (2020).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587, 152-156 (2020).
- Chen, C. Y., et al. Use of Cryo-EM to uncover structural bases of pH effect and cofactor bi-specificity of ketol-acid reductoisomerase. Journal of the American Chemical Society. 141, 6136-6140 (2019).
- Cabra, V., Samsó, M. Do's and don'ts of cryo-electron microscopy: A primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3D reconstruction. Journal of Visualized Experiments. (95), e52311 (2015).
- Klebl, D. P., et al. Need for speed: Examining protein behavior during CryoEM grid preparation at different timescales. Structure. 28 (11), 1238-1248 (2020).
- Passmore, L. A., Russo, C. Specimen preparation for high resolution cryo-EM. J. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).
- Laughlin, T. G., Bayne, A. N., Trempe, J. -F., Savage, D. F., Davies, K. M. Structure of the complex I-like molecule NDH of oxygenic photosynthesis. Nature. 566, 411-414 (2019).
- Gao, Y., et al. Structures and operating principles of the replisome. Science. 363, (2019).
- Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. -J., Gouaux, E. Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM. Science. 364, 355-362 (2019).
- Chen, B., et al. Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy. Structure. 23, 1097-1105 (2015).
- Singh, A. K., et al. Structural basis of temperature sensation by the TRP channel TRPV3. Nature Structure and Molecular Biology. 26, 994-998 (2019).
- Chen, C. Y., Chang, Y. C., Lin, B. L., Huang, C. H., Tsai, M. D. Temperature-resolved cryo-EM uncovers structural bases of temperature-dependent enzyme functions. Journal of the American Chemical Society. 141, 19983-19987 (2019).
