Summary
Den nuværende protokol beskriver isoleringen af fykobiliomer fra cyanobakterier ved centrifugering gennem en diskontinuerlig saccharosetæthedsgradient. Fraktioner af intakte phycobilisomes bekræftes af 77K fluorescerende emissionsspektrum og SDS-PAGE analyse. De resulterende fykobilisome fraktioner er velegnede til negativ farvning af TEM og massespektrometri analyse.
Abstract
I cyanobakterier er phycobilisome et vitalt antenneproteinkompleks, der høster lys og overfører energi til fotosystem I og II til fotokemi. At studere strukturen og sammensætningen af fycobilisome er af stor interesse for forskere, fordi det afslører udviklingen og divergensen af fotosyntese i cyanobakterier. Denne protokol giver en detaljeret og optimeret metode til at bryde cyanobakterielle celler til lave omkostninger med en perle-tæppebanker effektivt. Den intakte phycobilisome kan derefter isoleres fra celleekstraktet ved saccharose gradient ultracentrifugering. Denne metode har vist, at den er egnet til både model og ikke-model cyanobakterier med forskellige celletyper. En trin-for-trin procedure er også fastsat for at bekræfte integriteten og egenskaben af phycobiliproteiner ved 77K fluorescens spektroskopi og SDS-PAGE plettet af zink sulfat og Coomassie Blue. Det isolerede fycobilisome kan også underkastes yderligere strukturelle og kompositoriske analyser. Samlet set giver denne protokol en nyttig startvejledning, der giver forskere, der ikke er bekendt med cyanobakterier, mulighed for hurtigt at isolere og karakterisere intakt fycobilisome.
Introduction
Phycobilisome (PBS) er et enormt vandopløseligt pigmentproteinkompleks, der fastgøres til den cytoplasmatiske side af fotosystemerne i thylakoidmembranerne i cyanobakterier1. PBS består primært af farvede phycobiliproteiner og farveløse linkerproteiner1,2. De phycobiliproteiner kan opdeles i fire store grupper: phycoerythrin, phycoerythrocyanin, phycocyanin, og allophycocyanin3. De fire store grupper absorberer forskellige bølgelængder af lysenergi i intervallet 490-650 nm, som klorofyl absorberes ineffektivt3. PBS kan fungere som en lyshøstantenne til opsamling af lysenergi og levering til Photosystem II og I4.
Strukturen og sammensætningen af PBS varierer fra art til art. Samlet set er tre former for phycobilisome (hemidiscodial, bundtformet og stangformet) blevet identificeret i forskellige cyanobakterielle arter5. Selv i de samme arter ændres sammensætningen af PBS som reaktion på miljøet, såsom lyskvalitet og næringsstofudtømning6,7,8,9,10,11. Derfor har forsøgsproceduren for at isolere PBS fra cyanobakterier været medvirkende til at studere PBS12. I løbet af flere årtier har mange forskellige protokoller isoleret PBS og analyseret dets struktur, sammensætning og funktion6,7,8,12,13,14,15,16,17. De mange forskellige metoder til PBS-isolering giver faktisk fleksibilitet til at isolere komplekset hos forskellige arter med forskellige reagenser og instrumenter. Det gør dog også det vanskeligere at vælge en passende protokol for forskere, der ikke er bekendt med cyanobakterier og PBS. Derfor er en generaliseret og ligetil protokol udviklet i dette arbejde for dem, der er interesseret i at starte PBS isolation fra cyanobakterier.
Metoderne til isolering af PBS fra tidligere publikationer er sammenfattet her. Da PBS er et vandopløseligt proteinkompleks og let adskilles, kræves der en høj ionisk styrkephosphatbuffer for at stabilisere PBS under ekstraktion18. Flere forskningsartikler, der beskriver metoder til isolering af PBS fra cyanobakterium, er tidligere blevet offentliggjort. De fleste af metoderne kræver en høj koncentration af fosfatbuffer8,14,15,18,19. Men procedurerne for mekanisk forstyrrelse af cellerne varierer, såsom glasperler-assisteret ekstraktion, sonikering20, og fransk presse6,8,14. Forskellige phycobiliproteiner kan fås ved nedbør med ammoniumsulfat20 og renses af HPLC21 eller en kromatografisk kolonne22. På den anden side kan intakt PBS let isoleres ved saccharosetæthedsgradient ultracentrifugering6,8,15.
I denne protokol blev et model cyanobacterium og et ikke-model cyanobacterium brugt som materialer til PBS-isolering. De er model encellede glukose-tolerante Synechocystis sp. PCC 6803 (herefter Syn6803) og ikke-model filamentous Leptolyngbya sp. JSC-1 (herefter JSC-1), henholdsvis7,23,24. Protokollen begynder med afbrydelse af den encellede og filamentøse cyanobakterier i en høj-ionisk styrke fosfat buffer. Efter lysis opsamles supernatanterne ved centrifugering og behandles derefter med et ikkeionisk vaskemiddel (Triton X-100) for at opløse de vandopløselige proteiner fra thylakoidmembranerne. De samlede vandopløselige proteiner påføres en diskontinurosetæthedsgradient for at fraktionere PBS. Den diskontinuerlige saccharosegradient i denne protokol består af fire saccharoseopløsninger og opdeler den intakte PBS i de laveste fraktioner saccharoselag25. PBS' integritet kan analyseres af SDS-PAGE, zinkfarvning og 77K fluorescensspektroskopi6,7,8,26. Denne metode er velegnet til forskere, der har til formål at isolere intakt PBS fra cyanobakterier og studere dens spektrale, strukturelle og kompositoriske egenskaber.
Der er flere fordele ved denne protokol. (1) Denne metode er standardiseret og kan anvendes til isolering af intakt PBS fra både encellet og filamentøs cyanobakterier. De fleste af artiklerne beskriver den metode, der anvendes i enten én type cyanobakterier4,7,8,12,13,14,16,18. (2) Denne metode udføres ved stuetemperatur, da PBS tager afstand ved lav temperatur19,27. (3) Denne metode beskriver brugen af en perle-tæppebanker til at forstyrre cellerne; derfor er det billigere og sikrere end højtrykt fransk presse og mulig høreskade fra soniker i andre metoder8,13,14,20. (4) Denne metode isolerer intakt PBS ved saccharosegradient ultracentrifugering. På denne måde kan intakt PBS med forskellige størrelser og delvist dissocierede PBS adskilles baseret på saccharosekoncentration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Synechocystis sp. PCC 6803, modellen glukosetolerant stamme, blev fremstillet af Dr. Chu, Hsiu-An på Academia Sinica, Taiwan. Leptolyngbya sp. JSC-1, den ikke-model filamentous,blev opnået fra Dr. Donald A. Bryant på Pennsylvania State University, USA.
1. Cellekultur og høst
- Pod syn6803- eller JSC-1-celler ved hjælp af en metallisk podningsløkke i en 100 mL konisk kolbe indeholdende 50 mL B-HEPES medium28. Opdel cellerne ved 30 °C under 50 μmol fotoner m-2 s-1 (hvidlys LED) i 1% (v/v) CO2 med konstant omrøring af en magnetisk omrører (120 rpm), indtil kulturen når midten af eksponentiel vækstfase (OD750 = 0,6-0,8).
BEMÆRK: Høst cellekulturen, når kulturens optiske tæthed ved 750 nm (OD750) når 0,6-0,8 ved at overføre til en ny kolbe. Optisk densitet blev rutinemæssigt brugt til at estimere mikrobiel celletæthed i flydende kulturer29. Bølgelængderne fra 720-750 nm blev anvendt i forskellige undersøgelser til måling af cyanoberiel vækst30,31,32. I denne protokol bruges OD750, fordi JSC-1 kan producere pigmenter, der absorberer rødt lys7. Alternativt blev klorofylkoncentrationen også brugt til at måle væksten af cyanobakterier33. - Overfør cellekulturen (OD750 ~0,8) til en 1L konisk kolbe og fortynd den til OD750 = 0,2 i 500 mL B-HEPES medium. Dyrk kulturen indtil den sene eksponentielle vækstfase (OD750 = 0,8-1,0) i samme tilstand, der er nævnt ovenfor (trin 1.1), og høst derefter kulturen ved centrifugering.
- Centrifuge kulturen på 10.000 x g i 20 min ved stuetemperatur og helt kassere supernatant.
BEMÆRK: Cellerne pellets kan opbevares ved -80 °C i op til 6 måneder.
2. Cells lysis
- Afbryd cellepillerne og vask to gange med 0,75 M K-fosfatbuffer, pH 7.
BEMÆRK: For at lave 0,75 M K-fosfatbuffer ved pH 7 skal du forberede 1,5 M K2HPO4 og 1,5 M KH2PO4 separat. Bland 615 ml 1,5 M K2HPO4 og 385 ml 1,5 M KH2PO4 for at få 1,5 M K-fosfatbuffer ved pH 7. Du skal blot fortynde det med den samme mængde ddH2O til at gøre 0,75 M K-fosfat buffer på pH 7. - Pellet cellerne i 50 mL centrifugerør ved centrifugering ved 10.000 x g i 20 min ved stuetemperatur. Kassér supernatanten, og brug cellerne igen med 0,75 M K-fosfatbuffer. Mål pelletens våde vægt med en elektronisk balance og genbrug 1 g vådvægt af pelleten i 5 mL af bufferen.
BEMÆRK: Vådvægt af en pellet blev målt ved at trække vægten af et tomt centrifugerør fra vægten af centrifugerøret, der indeholder cellepillen. - Der tilsættes 1 mL celleaffjedring og 0,4-0,6 g 0,1 mm glasperler (se Materialetabel) i et 2 mm skruedækselglas.
- Bryd cellerne i 30 s med en perle-tæppebanker (se Tabel over materialer). Lad rørene køle af i et vandbad med stuetemperatur i 2 min og gentag brudcyklussen 5 gange.
- Efter lysis centrifugerer hætteglasset ved 500 x g for 10 s ved stuetemperatur. Saml supernatanten med en pipette i et 15 mL centrifugerør. Vask perlerne med 0,5 mL 0,75 M K-fosfat buffer én gang, derefter overføre til samme centrifuge rør.
- Tilsættes Triton X-100 (2% w/v, endelig koncentration) til den lysede celleaffjedring og inkuberes på en gyngende shaker (40 rpm) ved stuetemperatur, indtil opløsningen bliver homogen (~ 20 min).
- Centrifugere rørene på 17.210 g i 20 minutter for at fjerne de intakte celler og store cellerester. Opbevar supernatanten uden det øverste Triton micellelag ved stuetemperatur i op til 1 time.
BEMÆRK: Supernatanten indeholder to adskilte lag. Det øverste hydrofobiske Triton X-lag indeholder klorofylbindende proteiner og hydrofobiske stangformede fykobiliomer6. Det nederste vandige lag indeholder vandopløselige PBS.
3. Forberedelse af saccharosegradientbuffere og PBS-isolering
- Der laves fire koncentrationer af saccharose (2,0 M, 1,0 M, 0,75 M og 0,5 M) i 0,75 M K-fosfatbuffer ved pH 7.
BEMÆRK: Det foreslås at bruge 1,5 M K-fosfatbuffer ved pH 7 til at forberede saccharosegradienten, fordi tilsætning af saccharose fortynder koncentrationen af K-fosfatbuffer. Når saccharose er helt opløst, tilsættes ddH2O for at justere koncentrationen til 0,75 M, pH 7. - Placer 2,8 mL 2,0 M saccharosebuffer i bunden af 40 mL centrifugerøret og overlejringen med tre lag saccharoseopløsninger (8 mL 1,0 M; 12 mL på 0,75 M og 11 mL på 0,5 M for 40 mL centrifugerør) og endelig PBS-holdige supernatantfraktion (3,0 mL) (figur 1A).
BEMÆRK: Tilsæt forsigtigt saccharoseopløsningen, og lad saccharose falde meget langsomt inde i røret. Hold pipettespidsen lige over overfladen af opløsningen i røret, mens opløsningen læsses. Saccharoselag kan observeres, når de lægges langsomt i lag. - Centrifugere de resulterende gradienter ved 125.800 x g for ~ 16h-20 h ved 25 °C.BEMÆRK: En ultracentrifuge (se Materialetabel) er påkrævet for dette trin.
- Ved ultracentrifugering kondenseres de fraktionerede PBS og phycobiliproteiner mellem lagene. Blå bånd i Syn6803 (lilla bånd vist i JSC-1) blev observeret i grænsefladerne (Figur 1D).
- Saml langsomt brøker med en pipette fra toppen af saccharosegradienterne. Saccharose fjernes ved gentagne gange at koncentrere (3.500 x g i 20 min) og fortynde fraktioner med 0,75 M K-fosfatbuffer i membrancentrifugalfilterenheder (10 K molekylvægtsafskæring, se Materialetabel).
4. Måling af PBS fluorescens ved 77K
BEMÆRK: Et fluormeter udstyret med en flydende nitrogenbeholder (se Materialetabel) bruges til at måle fluorescensspektre ved 77K.
- Den koncentrerede PBS-prøve fortyndes med en K-fosfatbuffer på 0,75 M for at opnå mindst 500 μL.
BEMÆRK: Koncentrationerne af fysiocyanin af prøver var ~4,2 μg mL-1 baseret på formlen: (OD615 0,474 x OD652)/5,34 [mg/mL]34. - Der tilsættes 500 μL af PBS-prøven til et gennemsigtigt glasrør, og røret fryses i flydende nitrogen, indtil det er helt frosset. Flyt det frosne rør til en gennemsigtig Dewar container (se Tabel over materialer) fyldt med flydende nitrogen.
BEMÆRK: Glasrørets indvendige diameter er 3 mm i denne protokol. Tynde glasrør blev brugt til at minimere re-absorption af kort bølgelængde emission i prøven. - Vælg excitation bølgelængder for phycoerythrin og phycocyanin at være 550 nm og 580 nm, henholdsvis.
BEMÆRK: Fluorescensemissioner blev registreret fra 560-800 nm (for 550 nm excitation) eller 600-800 nm (for 580 nm excitation).
5. SDS-PAGE analyse af PBS
- Bufferbytter de koncentrerede PBS-prøver i 0,75 M K-fosfat med 50 mM Tris buffer (pH 8.0) i membrancentrifugalfilterenheder (3K molekylvægt cut-off, se Materialetabel).
- Bland 50 μL PBS-opløsning med 10 μL 6x SDS-belastningsbuffer [300 mM Tris pH 6,8, 12% (w/v) Natrium dodecyl sulfat, 0,06% (w/v) Bromphenolblå, 50% (v/v) Glycerol, 6% (v/v) β-Mercaptoethanol] (se Materialetabel) i et mikrocentrifugerør og inkubation ved 95 °C i 10 min i en varmeblok.
- Adskil proteinprøverne med SDS-PAGE (8%-20% (w/v) polyacrylamidgel) og fortsæt med zink og Coomassie farvning. Den detaljerede procedure er beskrevet i Reference8.
- Ved zinkfarvning inkuberes gelen i 50 mM ZnSO4-opløsning i 10 min ved stuetemperatur, gelen vaskes med destilleret vand og visualiserer zinkinduceret fluorescens under UV-bestråling (312 nm).
- For Coomassie blå farvning, inkubere gelen i Coomassie Blue farvning buffer [0,25% (w /v) af Coomassie R-250, 10% (v/v) af eddikesyre, 50% (v/v) af Methanol, se Tabel over materialer] i 1 time ved stuetemperatur. Gelen vaskes med destilleret vand to gange for at fjerne den resterende farvningsbuffer, og inkuber gelen med afsmitningsbuffer [10% (v/v) Eddikesyre, 30 % (v/v) Methanol] på en gyngende shaker (40 omdr./ t.v.) ved stuetemperatur natten over. Visualiser den helt afdjernede gel med et digitalt kamera eller en scanner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Syn6803- og JSC-1-cellerne blev dyrket i koniske kolber med konstant omrøring i B-HEPES medium ved 30 °C under et LED hvidt lys (50 μmol fotoner m-2s-1) i et vækstkammer fyldt med 1% (v/v) CO2. I den eksponentielle vækstfase (OD750 = ~ 0,5) blev cellerne subkulturerede i frisk medium med en endelig optisk tæthed OD750 = ~ 0,2. Efter at have nået den sene eksponentielle vækstfase (OD750 = 0,6-0,8) blev kulturerne indsamlet og centrifugeret (10.000 x g ved stuetemperatur i 20 min). Supernatanten blev kasseret, og cellepillerne blev opbevaret ved -80 °C, indtil næste trin var tilgængeligt.
For at bryde cellerne blev cellerne først optøet ved stuetemperatur. Cellerne blev forstyrret af perle-slå med 0,1 mm glasperler inden for 0,75 M K-fosfat buffer. Komplet celle lysis viser supernatant i mørkeblå-grøn farve før centrifugering (Figur 1B). Efter solubilisering af Triton X-100 og centrifugering for at fjerne de uopløselige membraner og cellerester blev supernatanten lastet på toppen af saccharosegradientopløsning i et 40 mL centrifugerør (Figur 1C). Efter 18 timers centrifugering flyttede den intakte PBS til gradientens centrum som et klart blåt bånd til Syn6803 og et lilla bånd til JSC-1. Forskellen i deres farve skyldes de forskellige sammensætninger af PBS i Syn6803 og JSC-1. PBS fra Syn6803 bærer fycocyanin35, mens PBS af JSC-1 bærer phycocyanin og phycoerythrin7. Resultatet af saccharosetæthedsgradgradientering af isoleret PBS viser flere fraktioner af dissocierede phycobiliproteiner, og den laveste fraktion repræsenterer den intakte PBS (Figur 1D).
Absorptionsspektret for de forskellige fraktioner pbs isoleret fra JSC-1 og Syn6803 sammenlignes i figur 2A. Den detaljerede procedure for absorptionsspektre er beskrevet i artiklerne7,8. Absorptionsspektret fra den dissocierede PBS og intakt PBS af JSC-1 og Syn6803 har samme top ved 622 nm, svarende til fysiocyanin. Og phycoerythrin absorption peak på 571 nm findes i både dissociated PBS og intakt PBS af JSC-1. Allophycocyanin viser en mindre top med en skulder på 670 nm i de intakte PBS fraktioner af JSC-1 og Syn6803. De spektrale forskelle indikerer, at stangen (phycocyanin) til kerne (allophycocyanin) forholdet er højere i dissociated PBS end i den intakte PBS-fraktion, da spektrale egenskaber af phycobiliproteiner er blevet bestemt tidligere5. Da de dissocierede PBS og de intakte PBS-fraktioner viser lignende absorptionsspektre og fluorescerende emissionsegenskaber ved stuetemperatur, blev 77K fluorescensspektroskopi derefter brugt til at analysere de forskellige fraktioner isoleret fra saccharosegradienten. 77K fluorescerende emission spektre af dissociated PBS og intakt PBS fraktioner var ophidset af 580 nm. Emissionsspektret for den dissocierede PBS har en stærk top på ~ 650 nm i Syn6803 og JSC-1, der repræsenterer emissionen fra phycocyanin (Figur 2B). Det fluorescerende emissionsspektre i den intakte PBS viser to fluorescerende emissionsmaksimum: den svage ved 651 nm og den stærke ved 684 nm, der afslører den energi, der høstes af phycocyanin, blev overført effektivt til allophycocyanin og terminale udledere (ApcD og ApcE) i kerne9 (Figur 2C). Disse funktioner viser, at de laveste fraktioner i saccharosegradienten indeholder intakt PBS.
Den dissocierede PBS og den intakte PBS blev adskilt af SDS-PAGE på en 8%-20% (w/v) SDS polyacrylamid lineær gradient gel. De α og β underenheder af phycocyanin og allophycocyanin var synlige på gelen uden farvning (figur 3A). Gelen blev efterfølgende plettet med 10 mM ZnSO4 i 10 min. De kromohoreholdige phycobiliproteiner blev observeret af zinkfarvningen under UV-bestråling8. Phycobiliprotein subenheder (14-21 kDa) er stærkt fluorescerende, og ApcE (pil) viste svag fluorescens (Figur 3B). Desuden viser Coomassie Blue farvning den forskellige proteinsammensætning mellem de dissocierede PBS-fraktioner og de intakte PBS-fraktioner (Figur 3C). De øverste fraktioner indeholder andre ikke-PBS vandopløselige proteiner, da flere proteiner farves end i intakte PBS-fraktioner. Den intakte PBS i Syn6803 viser et fremtrædende ApcE-bånd (pil), der mangler i de dissocierede PBS-fraktioner (Figur 3C).
Volumenforholdet mellem PBS-ekstraktet og saccharosegradienten er afgørende for at opnå skarpe bånd i saccharosegradienten efter ultracentrifugering. Det foreslåede forhold mellem opløsede PBS-ekstrakter til saccharosegradientopløsning er 1:10. Baseret på tidligere erfaringer viser det en højere opløsning end saccharosegradienten i 13 ML-rørene, der er baseret på tidligere erfaringer. Den diskontinuerlige saccharosegradient diffuser over tid på grund af vibrationer på bænken. Derfor kan 13 ml centrifugerøret være et godt valg til håndtering af masser af prøver samtidigt. For at påvise, at saccharosegradienterne i 13 mL centrifugrør ved forholdet som 1:3 og 1:10 er fremstillet mellem de rå ekstrakter af Syn6803 eller JSC-1 til saccharosegradientopløsningen (figur 4A). Efter ultracentrifugering viser den saccharosegradient, der er forberedt ved forhold 1:3, bredere bånd end den gradient, der er foretaget ved forholdet 1:10 (figur 4B). De laveste fraktioner af hver gradient indeholder intakt PBS, bekræftet af 77K fluorescerende emission spektroskopi.
Figur 1: Afbrydelse af Syn6803- og JSC-1-celler og saccharosegradient ultracentrifugering. (A) Skematisk illustration af forberedelsen af den udgåede saccharosegradient i et 40 mL centrifugerør. (B) Skruehætteglassene blev fyldt med 0,4 g glasperler og 1 mL celleaffjedring af Syn6803 eller JSC-1, og derefter blev cellerne lyset af en perle-tæppebanker. (C) Supernatanten af Triton X-100 solubiliseret ekstrakt blev lagdelt på toppen af en saccharosetæthedsgradient. (D) Efter centrifugering i 18 timer blev PBS-fraktioner visualiseret som klare blå bånd i gradienten i Syn6803 og som lilla bånd i JSC-1. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Spektroskopisk karakterisering af forskellige fraktioner af saccharosegradienter. (A) Absorptionsspektre af dissocierede PBS og intakte PBS-fraktioner fra JSC-1 og Syn6803. Fluorescensemissionsspektre blev målt til 77 K ved hjælp af excitationsbølgelængden ved 580 nm for (B) de dissocierede PBS-fraktioner og (C) de intakte PBS-fraktioner af Syn6803 og JSC-1. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: SDS-PAGE analyse af PBS isoleret fra saccharosegradienter. De dissocierede og intakte PBS-fraktioner blev kvantificeret (20 μg protein pr. bane) og læsset på en 8%-20% (w/v) gradient polyacrylamidgel. Efter gelelektroforese blev gelen visualiseret af zinkfarvning og Coomassie Blue farvning, efterfølgende. (A) Farven på phycobiliproteiner er synlig på gelen uden farvning. (B) Zinkplettet gel viser fluorescensen af fycobiliproteiner. (C) Gelen farves med Coomassie Blue viser fycobiliproteiner og andre proteiner. Pilene angiver placeringen af ApcE. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Saccharosegradienten i 13 mL centrifugerør. Forholdet mellem det rå ekstrakt og saccharosegradientopløsningen er markeret øverst på billederne. (A) Supernatanten af Triton X-100-opløsede ekstrakter af Syn6803 og JSC-1 var lagdelt over saccharosetæthedsgradienter med forskellige nøgletal for de opløsede ekstrakter til saccharosegradientopløsning. (B) Efter centrifugering i 18 timer blev PBS-fraktionerne i Syn6803 og JSC-1 observeret i saccharosegradienterne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver en enkel og standardmetode til isolering af intakt PBS i to typer cyanobakterier, encellet model Syn6803 og filamentøs ikke-model JSC-1. De kritiske trin i protokollen er celle homogenisering og ultracentrifugering på en diskontinuerlig tæthed gradient af saccharose. Generelt er afbrydelsen af filamentøse celler mere kompliceret end encellede celler. Forøgelse af mængden af udgangsmaterialet (den våde vægt af cellepillen) og gentagelsen af perle-slå var nyttigt at øge udbyttet af PBS fra filamentøse cyanobakterielle celler. For filamentous cyanobacterium, JSC-1, tre gange flere celler blev brugt end encellet en, Syn6803. Hertil kommer, at helt bryde filamentous cyanobacterium, det kræver perle-slå flere gange end den encellede cyanobakterier at observere den mørke blålig-lilla farve i ekstraktion buffer.
Varigheden af perle-slå er ikke foreslået at overstige 30 s, da prøverne er opvarmet i løbet af hver perle-slå cyklus. Rørene anbefales at køle ved stuetemperatur på en bænk (eller i et vandbad) mellem hver cyklus, da den intakte PBS let adskilles ved lav temperatur25. Derfor foreslås hver procedure i denne protokol at blive udført ved stuetemperatur. Mange forskningsartikler har beskrevet forskellige celleforstyrrelsesmetoder, herunder en højtryks homogenisator (Fransk-Press) eller en soniker6,8,20. En perlemølle homogenisator foreslås, fordi det er billigere, sikrere, lettere at håndtere, hurtigere, mere tilgængelig og mere effektiv til behandling af flere prøver samtidigt.
Phycobilisomes viser tre forskellige former, hemidiscoidal, bundt-formet, og stang-formet5. De intakte phycobilisomes isoleret i figur 2 tilhører den hemidiscoide form som beskrevet i tidligere publikationer7,13,36. Den øverste brøk, der repræsenterer dissocierede PBS, kan dog også indeholde stangformet PBS. Syn6803 og JSC-1 koder en bestemt stang-core linker CpcL, hvilket tyder på tilstedeværelsen af stangformet PBS ud over den hemidiscoide PBS6,37. Stangformet PBS er blevet direkte identificeret i Syn6803, men ikke i JSC-17,13,37. På den anden side ombygger JSC-1 sin PBS ved at udføre type III kromatisk akklimatisering i grønt/rødt lys og fjernrødt lysfotoacclimation i rødt/fjernrødt lys6,7. Alle disse forskelligheder indikerer, at der kan være andre typer PBS i saccharosegradienterne ud over den laveste intakte hemidiscoide PBS-fraktion. For eksempel er to typer PBS til stede på samme tid, når Synechococcus sp. PCC 7335 og JSC-1 akklimatificerer sig til langt rødt lys8,13. Det foreslås, at den person, der isolerer PBS fra en ukarakteriseret cyanobakteriel stamme, skal være mere forsigtig med at analysere hver brøkdel i saccharosegradienten for at identificere eventuelle typer PBS.
Samlet set giver denne protokol en billig, enkel og hurtig metode til celleforstyrrelser. Det er også blevet påvist, at denne metode er pålidelig til at isolere PBS fra forskellige cyanobakterier med forskellige celletyper og PBS-sammensætninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesse.
Acknowledgments
Forfatterne takker Technology Commons, College of Life Science, National Taiwan University for bekvem brug af ultracentrifugen. De cyanobakterielle stammer Synechocystis sp. PCC 6803 og Leptolyngbya sp. JSC-1 blev begavet fra Dr. Chu, Hsiu-An på den akademiske verden Sinica, Taiwan, og Dr. Donald A. Bryant på Pennsylvania State University, USA, henholdsvis. Dette arbejde blev finansieret af Ministeriet for Videnskab og Teknologi (Taiwan) (109-2636-B-002-013- og 110-2628-B-002-065-) og Undervisningsministeriet (Taiwan) Yushan Young Scholar Program (109V1102 og 110V1102).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 mm glass beads | BioSpec | 11079101 | for PBS extraction |
| 13 mL centrifugation tube | Hitachi | 13PA | ultracentrifugation |
| 40 mL centrifugation tube | Hitachi | 40PA | ultracentrifugation |
| Acetic acid | Merck | 8.1875.2500 | for Coomassie Blue staining |
| B-HEPES medium | A modified cyanobacterial medium from BG-11 medium | ||
| Brilliant Blue R-250 | Sigma | B-0149 | for Coomassie Blue staining |
| Bromophenol blue | Wako pure chemical industries | 2-291 | protein loading buffer |
| Electronic balance | Radwag | WLC 2/A2/C/2 | for the wet weight measurement of cell pellets |
| Fluorescence spectrophotometer | Hitachi | F-7000 | Spectrophotometer |
| Glycerol | BioShop | Gly001.500 | protein loading buffer |
| High-Speed refrigerated centrifuge | Hitachi | CR22N | for buffer exchange |
| Leptolyngbya sp. JSC-1 | from Dr. Donald A. Bryant at Pennsylvania State University, USA. | ||
| Low temperature measurement accessory | Hitachi | 5J0-0112 | The accessory includes a transparent Dewar container for 77K fluorescence spectroscopy. |
| Methanol | Merck | 1.07018,2511 | for Coomassie Blue staining |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher | Pico 21 | for PBS extraction |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | Model 607 | for PBS extraction |
| Potassium phosphate dibasic | PanReac AppliChem | 121512.121 | for PBS extraction |
| Potassium phosphate monobasic | PanReac AppliChem | 141509.121 | for PBS extraction |
| Screw cap vial | BioSpec | 10832 | for PBS extraction |
| SmartView Pro Imager | Major Science | UVCI-2300 | for Znic staining signal detection |
| Sodium dodecyl sulfate | Zymeset | BSD101 | protein loading buffer |
| Sucrose | Zymeset | BSU101 | for PBS isolation |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | glucose-tolerant strain from Dr. Chu, Hsiu-An at Academia Sinica, Taiwan | ||
| Tris | BioShop | TRS 011.1 | protein loading buffer |
| Triton X-100 | BioShop | TRX 506.500 | for PBS extraction |
| Ultra 10 K membrane centrifugal filter | Millipore | UFC901024 | for buffer exchange |
| Ultra 3 K membrane centrifugal filter | Millipore | UFC500324 | for buffer exchange |
| Ultracentrifuge | Hitachi | CP80WX | ultracentrifugation |
| UV/Vis spectrophotometer | Agilent | Cary 60 | Spectrophotometer |
| Zinc sulfate | PanReac AppliChem | 131787.121 | for Znic staining |
| β-Mercaptoethanol | BioBasic | MB0338 | protein loading buffer |
References
- Bryant, D. A., Guglielmi, G., de Marsac, N. T., Castets, A. M., Cohen-Bazire, G. The structure of cyanobacterial phycobilisomes: A model. Archives of Microbiology. 123 (2), 113-127 (1979).
- Glazer, A. N.
- Glazer, A. N.
- Liu, H., et al. Phycobilisomes supply excitations to both photosystems in a megacomplex in cyanobacteria. Science. 342 (6162), 1104 (2013).
- Bryant, D. A., Canniffe, D. P. How nature designs light-harvesting antenna systems: Design principles and functional realization in chlorophototrophic prokaryotes. Journal of Physics B: Atomic, Molecular and Optical Physics. 51 (3), 033001 (2018).
- Hirose, Y., et al. Diverse chromatic acclimation processes regulating phycoerythrocyanin and rod-shaped phycobilisome in cyanobacteria. Molecular Plant. 12 (5), 715-725 (2019).
- Gan, F., et al. Extensive remodeling of a cyanobacterial photosynthetic apparatus in far-red light. Science. 345 (6202), 1312-1317 (2014).
- Ho, M. Y., Gan, F., Shen, G., Bryant, D. A. Far-red light photoacclimation (FaRLiP) in Synechococcus sp. PCC 7335. II. Characterization of phycobiliproteins produced during acclimation to far-red light. Photosynthesis Research. 131 (2), 187-202 (2017).
- Ho, M. Y., et al. Extensive remodeling of the photosynthetic apparatus alters energy transfer among photosynthetic complexes when cyanobacteria acclimate to far-red light. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1861 (4), 148064 (2020).
- Sanfilippo, J. E., Garczarek, L., Partensky, F., Kehoe, D. M. Chromatic Acclimation in Cyanobacteria: A diverse and widespread process for optimizing photosynthesis. Annual Review of Microbiology. 73, 407-433 (2019).
- Grossman, A. R., Schaefer, M. R., Chiang, G. G., Collier, J. L. The phycobilisome, a light-harvesting complex responsive to environmental conditions. Microbiological Reviews. 57 (3), 725-749 (1993).
- Bryant, D. A., Glazer, A. N., Eiserling, F. A. Characterization and structural properties of the major biliproteins of Anabaena sp. Archives of Microbiology. 110 (1), 61-75 (1976).
- Soulier, N., Laremore, T. N., Bryant, D. A. Characterization of cyanobacterial allophycocyanins absorbing far-red light. Photosynthesis Research. 145 (3), 189-207 (2020).
- Guglielmi, G., Cohen-Bazire, G., Bryant, D. A. The structure of Gloeobacter violaceus and its phycobilisomes. Archives of Microbiology. 129 (3), 181-189 (1981).
- Zhang, J., et al. Structure of phycobilisome from the red alga Griffithsia pacifica. Nature. 551 (7678), 57-63 (2017).
- Li, Y., et al. Characterization of red-shifted phycobilisomes isolated from the chlorophyll f-containing cyanobacterium Halomicronema hongdechloris. Biochimica et Biophysica Acta. 1857 (1), 107-114 (2016).
- Herrera-Salgado, P., Leyva-Castillo, L. E., Rios-Castro, E., Gomez-Lojero, C. Complementary chromatic and far-red photoacclimations in Synechococcus ATCC 29403 (PCC 7335). I: The phycobilisomes, a proteomic approach. Photosynthesis Research. 138 (1), 39-56 (2018).
- Yamanaka, G., Glazer, A. N., Williams, R. C. Cyanobacterial phycobilisomes. Characterization of the phycobilisomes of Synechococcus sp. 6301. Journal of Biological Chemistry. 253 (22), 8303-8310 (1978).
- Gantt, E., Lipschultz, C. A., Grabowski, J., Zimmerman, B. K. Phycobilisomes from blue-green and red algae: Isolation criteria and dissociation characteristics. Plant Physiology. 63 (4), 615-620 (1979).
- Patel, A., Mishra, S., Pawar, R., Ghosh, P. K. Purification and characterization of C-Phycocyanin from cyanobacterial species of marine and freshwater habitat. Protein Expression and Purification. 40 (2), 248-255 (2005).
- Zolla, L., Bianchetti, M. High-performance liquid chromatography coupled on-line with electrospray ionization mass spectrometry for the simultaneous separation and identification of the Synechocystis PCC 6803 phycobilisome proteins. Journal of Chromatography A. 912 (2), 269-279 (2001).
- Soni, B., Kalavadia, B., Trivedi, U., Madamwar, D. Extraction, purification and characterization of phycocyanin from Oscillatoria quadripunctulata-Isolated from the rocky shores of Bet-Dwarka, Gujarat, India. Process Biochemistry. 41 (9), 2017-2023 (2006).
- Williams, J. G. K. Methods in Enzymology. , Academic Press. 766-778 (1988).
- Brown Igor, I., et al. Polyphasic characterization of a thermotolerant siderophilic filamentous cyanobacterium that produces intracellular iron deposits. Applied and Environmental Microbiology. 76 (19), 6664-6672 (2010).
- Wang, L., et al. Isolation, purification and properties of an R-phycocyanin from the phycobilisomes of a marine red macroalga Polysiphonia urceolata. PLoS One. 9 (2), 87833 (2014).
- Berkelman, T. R., Lagarias, J. C. Visualization of bilin-linked peptides and proteins in polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry. 156 (1), 194-201 (1986).
- Rigbi, M., Rosinski, J., Siegelman, H. W., Sutherland, J. C. Cyanobacterial phycobilisomes: Selective dissociation monitored by fluorescence and circular dichroism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 77 (4), 1961-1965 (1980).
- Dubbs, J. M., Bryant, D. A. Molecular cloning and transcriptional analysis of the cpeBA operon of the cyanobacterium Pseudanabaena species PCC 7409. Molecular Microbiology. 5 (12), 3073-3085 (1991).
- Stevenson, K., McVey, A. F., Clark, I. B. N., Swain, P. S., Pilizota, T. General calibration of microbial growth in microplate readers. Scientific Reports. 6 (1), 38828 (2016).
- Zhang, S., Shen, G., Li, Z., Golbeck, J. H., Bryant, D. A. Vipp1 is essential for the biogenesis of Photosystem I but not thylakoid membranes in Synechococcus sp. PCC 7002. Journal Biological Chemistry. 289 (23), 15904-15914 (2014).
- Zhang, S., Bryant, D. A. Biochemical validation of the glyoxylate cycle in the cyanobacterium Chlorogloeopsis fritschii Strain PCC 9212. Journal Biological Chemistry. 290 (22), 14019-14030 (2015).
- Huang, J. Y., et al. Mutations of cytochrome b559 and Psbj on and near the QC site in photosystem II influence the regulation of short-term light response and photosynthetic growth of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Biochemistry. 55 (15), 2214-2226 (2016).
- Li, Y., Lin, Y., Loughlin, P., Chen, M. Optimization and effects of different culture conditions on growth of Halomicronema hongdechloris - A filamentous cyanobacterium containing chlorophyll f. Frontiers in Plant Science. 5, 67 (2014).
- Bennett, A., Bogorad, L. Complementary chromatic adaptation in a filamentous blue-green alga. Journal of Cell Biology. 58 (2), 419-435 (1973).
- Su, X., Fraenkel, P. G., Bogorad, L. Excitation energy transfer from phycocyanin to chlorophyll in an apcA-defective mutant of Synechocystis sp. PCC 6803. Journal of Biological Chemistry. 267 (32), 22944-22950 (1992).
- Arteni, A. A., Ajlani, G., Boekema, E. J. Structural organisation of phycobilisomes from Synechocystis sp. strain PCC6803 and their interaction with the membrane. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1787 (4), 272-279 (2009).
- Kondo, K., Ochiai, Y., Katayama, M., Ikeuchi, M. The Membrane-associated CpcG2-phycobilisome in Synechocystis: A new photosystem I antenna. Plant Physiology. 144 (2), 1200-1210 (2007).
