Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल एक असंतत सुक्रोज घनत्व ढाल के माध्यम से centrifugation द्वारा साइनोबैक्टीरिया से phycobilisomes के अलगाव का विवरण देता है। बरकरार phycobilisomes के अंश 77K फ्लोरोसेंट उत्सर्जन स्पेक्ट्रम और SDS-पेज विश्लेषण द्वारा पुष्टि कर रहे हैं। परिणामस्वरूप phycobilisome अंश TEM और मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के नकारात्मक धुंधला के लिए उपयुक्त हैं।
Abstract
साइनोबैक्टीरिया में, phycobilisome एक महत्वपूर्ण एंटीना प्रोटीन कॉम्प्लेक्स है जो प्रकाश की कटाई करता है और फोटोकेमिस्ट्री के लिए फोटोसिस्टम I और II में ऊर्जा स्थानांतरित करता है। phycobilisome की संरचना और संरचना का अध्ययन वैज्ञानिकों के लिए बहुत रुचि का है क्योंकि यह साइनोबैक्टीरिया में प्रकाश संश्लेषण के विकास और विचलन को प्रकट करता है। यह प्रोटोकॉल एक मनका-बीटर द्वारा कम लागत पर साइनोबैक्टीरिया कोशिकाओं को कुशलतापूर्वक तोड़ने के लिए एक विस्तृत और अनुकूलित विधि प्रदान करता है। बरकरार phycobilisome तो सुक्रोज ढाल ultracentrifugation द्वारा सेल निकालने से अलग किया जा सकता है. इस विधि ने विभिन्न सेल प्रकारों के साथ मॉडल और गैर-मॉडल साइनोबैक्टीरिया दोनों के लिए उपयुक्त होने का प्रदर्शन किया है। जस्ता सल्फेट और कूमासी ब्लू द्वारा दागे गए 77K प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी और एसडीएस-पेज द्वारा फाइकोबिलिप्रोटीन की अखंडता और संपत्ति की पुष्टि करने के लिए एक चरण-दर-चरण प्रक्रिया भी प्रदान की जाती है। अलग-थलग phycobilisome भी आगे संरचनात्मक और compositional विश्लेषण के अधीन किया जा सकता है। कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल एक सहायक शुरुआती मार्गदर्शिका प्रदान करता है जो साइनोबैक्टीरिया से अपरिचित शोधकर्ताओं को जल्दी से अलग करने और बरकरार phycobilisome को चिह्नित करने की अनुमति देता है।
Introduction
Phycobilisome (PBS) एक विशाल पानी में घुलनशील वर्णक-प्रोटीन कॉम्प्लेक्स है जो साइनोबैक्टीरिया 1 के थाइलाकोइड झिल्ली में फोटोसिस्टम के साइटोप्लाज्मिक पक्ष से जुड़ा हुआ है। पीबीएस मुख्य रूप से रंगीन phycobiliproteins और रंगहीन linker प्रोटीन 1,2 से बना है। phycobiliproteins को चार प्रमुख समूहों में विभाजित किया जा सकता है: phycoerythrin, phycoerythrocyanin, phycocyanin, और allophycocyanin3। चार प्रमुख समूह 490-650 एनएम की सीमा में प्रकाश ऊर्जा के विभिन्न तरंग दैर्ध्य को अवशोषित करते हैं, जो क्लोरोफिल ने अकुशलता से अवशोषित किया। पीबीएस प्रकाश ऊर्जा एकत्र करने और इसे फोटोसिस्टम II और I4 तक पहुंचाने के लिए एक प्रकाश-कटाई एंटीना के रूप में कार्य कर सकता है।
पीबीएस की संरचना और संरचना प्रजातियों से प्रजातियों में भिन्न होती है। सामूहिक रूप से, phycobilisome के तीन आकार (hemidiscodial, बंडल के आकार का, और रॉड के आकार का) विभिन्न साइनोबैक्टीरिया प्रजातियों में पहचाना गया है5। यहां तक कि एक ही प्रजाति में, पीबीएस की संरचना पर्यावरण के जवाब में बदलती है, जैसे कि प्रकाश की गुणवत्ता और पोषक तत्वों की कमी 6,7,8,9,10,11। इसलिए, साइनोबैक्टीरिया से पीबीएस को अलग करने की प्रयोगात्मक प्रक्रिया पीबीएस 12 का अध्ययन करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई गई है। कई दशकों में, कई अलग-अलग प्रोटोकॉल ने पीबीएस को अलग-थलग कर दिया है और इसकी संरचना, संरचना और कार्य 6,7,8,12,13,14,15,16,17 का विश्लेषण किया है। पीबीएस अलगाव के लिए तरीकों की विस्तृत विविधता वास्तव में विभिन्न अभिकर्मकों और उपकरणों के साथ विभिन्न प्रजातियों में परिसर को अलग करने में लचीलापन प्रदान करती है। हालांकि, यह साइनोबैक्टीरिया और पीबीएस से अपरिचित वैज्ञानिकों के लिए एक उपयुक्त प्रोटोकॉल चुनने को और अधिक कठिन बनाता है। इसलिए, साइनोबैक्टीरिया से पीबीएस अलगाव शुरू करने में रुचि रखने वालों के लिए इस काम में एक सामान्यीकृत और सीधा प्रोटोकॉल विकसित किया गया है।
पिछले प्रकाशनों से पीबीएस को अलग करने के तरीकों को यहां संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है। चूंकि पीबीएस एक पानी में घुलनशील प्रोटीन कॉम्प्लेक्स है और आसानी से अलग हो जाता है, इसलिए निष्कर्षण 18 के दौरान पीबीएस को स्थिर करने के लिए एक उच्च आयनिक ताकत फॉस्फेट बफर की आवश्यकता होती है। कई शोध लेख जो साइनोबैक्टीरियम से पीबीएस के अलगाव के तरीकों का वर्णन करते हैं, अतीत में प्रकाशित किए गए हैं। अधिकांश विधियों को फॉस्फेट बफर 8,14,15,18,19 की उच्च सांद्रता की आवश्यकता होती है। हालांकि, कोशिकाओं के यांत्रिक विघटन के लिए प्रक्रियाएं अलग-अलग होती हैं, जैसे कि ग्लास मोतियों-सहायता प्राप्त निष्कर्षण, sonication20, और फ्रेंच प्रेस 6,8,14। अमोनियम सल्फेट 20 के साथ वर्षा द्वारा विभिन्न phycobiliproteins प्राप्त किया जा सकता है और HPLC21 या एक क्रोमैटोग्राफिक कॉलम 22 द्वारा शुद्ध किया जा सकता है। दूसरी ओर, बरकरार पीबीएस को आसानी से सुक्रोज घनत्व ग्रेडिएंट अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन 6,8,15 द्वारा अलग किया जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल में, एक मॉडल साइनोबैक्टीरियम और एक गैर-मॉडल साइनोबैक्टीरियम का उपयोग पीबीएस अलगाव के लिए सामग्री के रूप में किया गया था। वे मॉडल एककोशिकीय ग्लूकोज-सहिष्णु Synechocystis sp. PCC 6803 (इसके बाद Syn6803) और गैर मॉडल फिलामेंटस Leptolyngbya sp. JSC-1 (इसके बाद JSC-1) क्रमशः 7,23,24 हैं। प्रोटोकॉल एक उच्च आयनिक-शक्ति फॉस्फेट बफर में एककोशिकीय और फिलामेंटस साइनोबैक्टीरिया के विघटन से शुरू होता है। lysis के बाद, supernatants centrifugation द्वारा एकत्र किए जाते हैं और फिर थाइलाकोइड झिल्ली से पानी में घुलनशील प्रोटीन को घुलनशील बनाने के लिए एक गैर-आयनिक डिटर्जेंट (ट्राइटन एक्स -100) के साथ इलाज किया जाता है। कुल पानी में घुलनशील प्रोटीन को पीबीएस को विभाजित करने के लिए एक असंतत सुक्रोज घनत्व ढाल पर लागू किया जाता है। इस प्रोटोकॉल में असंतत सुक्रोज ढाल में चार सुक्रोज समाधान होते हैं और सुक्रोज परत 25 के सबसे कम अंशों में बरकरार पीबीएस को विभाजित करते हैं। पीबीएस की अखंडता का विश्लेषण एसडीएस-पेज, जस्ता-धुंधला, और 77K प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी 6,7,8,26 द्वारा किया जा सकता है। यह विधि उन वैज्ञानिकों के लिए उपयुक्त है जो साइनोबैक्टीरिया से बरकरार पीबीएस को अलग करने और इसके वर्णक्रमीय, संरचनात्मक और रचनात्मक गुणों का अध्ययन करने का लक्ष्य रखते हैं।
इस प्रोटोकॉल के कई फायदे हैं। (1) इस विधि को मानकीकृत किया गया है और इसका उपयोग एककोशिकीय और फिलामेंटस साइनोबैक्टीरिया दोनों से बरकरार पीबीएस को अलग करने के लिए किया जा सकता है। अधिकांश लेख उस विधि का वर्णन करते हैं जो या तो एक प्रकार के साइनोबैक्टीरिया 4,7,8,12,13,14,16,18 में लागू होती है। (2) यह विधि कमरे के तापमान पर की जाती है, क्योंकि पीबीएस कम तापमान 19,27 पर अलग हो जाता है। (3) यह विधि कोशिकाओं को बाधित करने के लिए एक मनका-बीटर का उपयोग करने का वर्णन करती है; इसलिए, यह उच्च दबाव वाले फ्रांसीसी प्रेस और अन्य तरीकों में सोनिकेटर से संभावित सुनवाई क्षति की तुलना में सस्ता और सुरक्षित है8,13,14,20। (4) यह विधि सुक्रोज ग्रेडिएंट अल्ट्रा-सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा बरकरार पीबीएस को अलग करती है। इस तरह, विभिन्न आकारों और आंशिक रूप से अलग किए गए पीबीएस के साथ बरकरार पीबीएस को सुक्रोज एकाग्रता के आधार पर अलग किया जा सकता है।
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Protocol
Synechocystis sp. PCC 6803, मॉडल ग्लूकोज-सहिष्णु तनाव, डॉ चू, Hsiu-An से अकादमिक Sinica, ताइवान में प्राप्त किया गया था। Leptolyngbya एसपी जेएससी -1, गैर मॉडल फिलामेंटस, पेंसिल्वेनिया स्टेट यूनिवर्सिटी, संयुक्त राज्य अमेरिका में डॉ डोनाल्ड ए ब्रायंट से प्राप्त किया गया था।
1. सेल संस्कृति और कटाई
- Syn6803 या JSC-1 कोशिकाओं को एक 100 mL शंक्वाकार फ्लास्क में एक धातु इनोक्यूलेशन लूप का उपयोग करके संक्रमित करें जिसमें B-HEPES medium28 के 50 mL होते हैं। 50 μmol फोटॉनों m-2 s-1 (सफेद प्रकाश एलईडी) के तहत 30 °C पर कोशिकाओं को 1 % (v / v) CO2 में एक चुंबकीय हलचल (120 rpm) द्वारा निरंतर सरगर्मी के साथ संस्कृति को तब तक संस्कृति करें जब तक कि संस्कृति मध्य-घातीय विकास चरण (OD750 = 0.6-0.8 ) तक नहीं पहुंच जाती।
नोट: सेल संस्कृति फसल जब 750 एनएम (OD750) पर संस्कृति का ऑप्टिकल घनत्व एक नए फ्लास्क में स्थानांतरित करके 0.6-0.8 तक पहुँचता है। ऑप्टिकल घनत्व का उपयोग नियमित रूप से तरल संस्कृतियों में माइक्रोबियल सेल घनत्व का अनुमान लगाने के लिए किया जाता था29। 720-750 एनएम से तरंग दैर्ध्य का उपयोग साइनोबैक्टीरिया विकास को मापने के लिए विभिन्न अध्ययनों में किया गया था30,31,32। इस प्रोटोकॉल में, OD750 का उपयोग किया जाता है क्योंकि JSC-1 पिगमेंट का उत्पादन कर सकता है जो दूर-लाल लाइट 7 को अवशोषित करता है। वैकल्पिक रूप से, क्लोरोफिल एकाग्रता का उपयोग साइनोबैक्टीरिया 33 के विकास को मापने के लिए भी किया गया था। - सेल संस्कृति (OD750 ~ 0.8 ) को 1L शंक्वाकार फ्लास्क में स्थानांतरित करें और इसे B-HEPES माध्यम के 500 mL में OD750 = 0.2 तक पतला करें। ऊपर उल्लिखित एक ही स्थिति (चरण 1.1) में देर से घातीय विकास चरण (OD750 = 0.8-1.0) तक संस्कृति को बढ़ाएं और फिर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा संस्कृति की कटाई करें।
- कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 10,000 x g पर संस्कृति को सेंट्रीफ्यूज करें और supernatant को पूरी तरह से त्याग दें।
नोट: कोशिकाओं छर्रों को 6 महीने तक के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
2. कोशिकाओं lysis
- सेल छर्रों को निलंबित करें और 0.75 एम के-फॉस्फेट बफर, पीएच 7 के साथ दो बार धोएं।
नोट: पीएच 7 पर 0.75 एम के-फॉस्फेट बफर बनाने के लिए, K2HPO4 के 1.5 M और KH2PO4 के 1.5 M को अलग से तैयार करें। पीएच 7 पर 1.5 एम के-फॉस्फेट बफर प्राप्त करने के लिए 1.5 M K2HPO4 के 615 mL और 1.5M KH2PO4 के 385 मिलीलीटर को मिलाएं। बस इसे ddH2O की एक ही राशि के साथ पतला करने के लिए पीएच 7 पर 0.75 एम के-फॉस्फेट बफर बनाने के लिए। - कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 10,000 x g पर centrifugation द्वारा 50 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में कोशिकाओं गोली। supernatant को छोड़ दें और 0.75 M K-फॉस्फेट बफर के साथ कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें। एक इलेक्ट्रॉनिक संतुलन द्वारा गोली के गीले वजन को मापें और बफर के 5 मिलीलीटर में गोली के 1 ग्राम गीले वजन को फिर से निलंबित करें।
नोट: एक गोली के गीले वजन को सेल पैलेट युक्त सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के वजन से एक खाली सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के वजन को घटाकर मापा गया था। - सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर और 0.4-0.6 ग्राम 0.1 मिमी ग्लास मोतियों ( सामग्री की तालिका देखें) को 2 एमएल स्क्रू कैप शीशी में जोड़ें।
- एक मनका-बीटर द्वारा 30 s के लिए कोशिकाओं को तोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)। ट्यूबों को 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पानी के स्नान में ठंडा होने दें और ब्रेकिंग चक्र को 5 बार दोहराएं।
- लाइसिस के बाद, कमरे के तापमान पर 10 s के लिए 500 x g पर शीशियों को सेंट्रीफ्यूज करें। एक 15 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में एक पिपेट के साथ supernatant ले लीजिए. 0.75 M K-फॉस्फेट बफर के 0.5 mL के साथ मोतियों को एक बार धोएं, फिर उसी सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
- Lysed सेल निलंबन के लिए Triton X-100 (2% w / v, अंतिम एकाग्रता) जोड़ें और कमरे के तापमान पर एक रॉकिंग शेकर (40 rpm) पर इनक्यूबेट करें जब तक कि समाधान समरूप (~ 20 मिनट) न हो जाए।
- बरकरार कोशिकाओं और बड़े सेल मलबे को हटाने के लिए 20 मिनट के लिए 17,210 ग्राम पर ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें। 1 घंटे तक के लिए कमरे के तापमान पर ऊपरी Triton मिसेल परत के बिना supernatant स्टोर।
नोट:: supernatant दो अलग परतों शामिल हैं। ऊपरी हाइड्रोफोबिक ट्राइटन एक्स परत में क्लोरोफिल-बाइंडिंग प्रोटीन और हाइड्रोफोबिक रॉड के आकार के फाइकोबिलिसोम्स 6 होते हैं। निचली जलीय परत में पानी में घुलनशील पीबीएस होता है।
3. सुक्रोज ढाल buffers और पीबीएस अलगाव की तैयारी
- पीएच 7 पर 0.75 एम के-फॉस्फेट बफर में सुक्रोज (2.0 एम, 1.0 एम, 0.75 एम और 0.5 एम) की चार सांद्रता बनाएं।
नोट: सुक्रोज ग्रेडिएंट तैयार करने के लिए पीएच 7 पर 1.5 एम के-फॉस्फेट बफर का उपयोग करने का सुझाव दिया जाता है क्योंकि सुक्रोज जोड़ने से के-फॉस्फेट बफर की एकाग्रता कम हो जाती है। सुक्रोज पूरी तरह से भंग होने के बाद, 0.75 एम, पीएच 7 में एकाग्रता को समायोजित करने के लिए डीडीएच 2 ओ जोड़ें। - 40 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के तल पर 2.0 M सुक्रोज बफर के 2.8 mL को रखें और सुक्रोज समाधानों की तीन परतों (1.0 M के 8 mL; 0.75 M के 12 mL और 40 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के लिए 0.5 M के 11 mL) के साथ ओवरले करें, और अंत में PBS-supernatant fraction (3.0 mL) (चित्रा 1A) युक्त।
नोट: ध्यान से सुक्रोज समाधान जोड़ें और सुक्रोज को ट्यूब के अंदर बहुत धीरे-धीरे छोड़ने की अनुमति दें। समाधान लोड करते समय ट्यूब में समाधान की सतह के ठीक ऊपर पिपेट टिप को पकड़ो। सुक्रोज परतों को तब देखा जा सकता है जब वे धीरे-धीरे स्तरित होते हैं। - 125,800 x g पर परिणामी gradients centrifuge ~ 16h-20 h के लिए 25 °C.NOTE: इस चरण के लिए एक ultracentrifuge ( सामग्री की तालिका देखें) की आवश्यकता है।
- अल्ट्रा-सेंट्रीफ्यूजेशन पर, परतों के बीच fractionated PBS और phycobiliproteins को संघनित करें। Syn6803 में नीले बैंड (JSC-1 में दिखाए गए बैंगनी बैंड) इंटरफेस (चित्रा 1 D) में देखे गए थे।
- धीरे-धीरे सुक्रोज ग्रेडिएंट के शीर्ष से एक पिपेट के साथ अंशों को इकट्ठा करें। बार-बार ध्यान केंद्रित करके सुक्रोज को हटा दें (20 मिनट के लिए 3,500 x g ) और झिल्ली केन्द्रापसारक फ़िल्टर इकाइयों में 0.75 M K-फॉस्फेट बफर के साथ अंशों को पतला करें (10 K आणविक वजन कट-ऑफ, सामग्री की तालिका देखें)।
4. 77K पर PBS प्रतिदीप्ति का मापन
नोट: एक तरल नाइट्रोजन कंटेनर से सुसज्जित एक फ्लोरीमीटर ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग 77K पर प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा को मापने के लिए किया जाता है।
- कम से कम 500 μL प्राप्त करने के लिए 0.75 एम के-फॉस्फेट बफर के साथ केंद्रित पीबीएस नमूने को पतला करें।
नोट: नमूने के phycocyanin की सांद्रता ~ 4.2 μg mL-1 सूत्र के आधार पर थे: (OD615 0.474 x OD652)/5.34 [mg/ mL]34. - एक पारदर्शी ग्लास ट्यूब के लिए पीबीएस नमूने के 500 μL जोड़ें और तरल नाइट्रोजन में ट्यूब फ्रीज जब तक यह पूरी तरह से जमे हुए है. जमे हुए ट्यूब को एक पारदर्शी देवर कंटेनर में ले जाएं ( सामग्री की तालिका देखें) तरल नाइट्रोजन से पहले से भरा हुआ है।
नोट: इस प्रोटोकॉल में ग्लास ट्यूब का आंतरिक व्यास 3 मिमी है। नमूने में लघु तरंग दैर्ध्य उत्सर्जन के पुन: अवशोषण को कम करने के लिए पतली कांच की ट्यूबों का उपयोग किया गया था। - phycoerythrin और phycocyanin के लिए उत्तेजना तरंग दैर्ध्य क्रमशः 550 एनएम और 580 एनएम होने के लिए चुनें।
नोट: प्रतिदीप्ति उत्सर्जन 560-800 एनएम (550 एनएम उत्तेजना के लिए) या 600-800 एनएम (580 एनएम उत्तेजना के लिए) से दर्ज किया गया था।
5. पीबीएस के एसडीएस-पेज विश्लेषण
- बफर झिल्ली केन्द्रापसारक फिल्टर इकाइयों (3K आणविक वजन कट-ऑफ, सामग्री की तालिका देखें) में Tris बफर (pH 8.0) के 50 mM के साथ K-फॉस्फेट के 0.75 M में केंद्रित PBS नमूनों का आदान-प्रदान करें।
- पीबीएस समाधान के 50 μL को 6x SDS लोडिंग बफर के 10 μL के साथ मिलाएं [300 mM Tris pH 6.8, 12% (w/v) सोडियम डोडेसिल सल्फेट, 0.06% (w/v) ब्रोम्फेनॉल ब्लू, 50% (v/v) ग्लिसरॉल, 6% (v/v) β-Mercaptoethanol] ( सामग्री की तालिका देखें) एक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में 95 °C पर इनक्यूबेट करें।
- एसडीएस-पेज (8% -20% (डब्ल्यू / वी) पॉलीएक्रिलामाइड जेल) द्वारा प्रोटीन के नमूनों को अलग करें और जस्ता और कूमासी स्टेनिंग के साथ जारी रखें। विस्तृत प्रक्रिया संदर्भ 8 में वर्णित किया गया है।
- जस्ता धुंधला करने के लिए, कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 50 mM ZnSO4 समाधान में जेल को इनक्यूबेट करें, आसुत पानी के साथ जेल को धोएं, और यूवी विकिरण (312 एनएम) के तहत जस्ता-प्रेरित प्रतिदीप्ति की कल्पना करें।
- Coomassie नीले दाग के लिए, Coomassie ब्लू स्टेनिंग बफर में जेल इनक्यूबेट [0.25% (w / v) Coomassie R-250, एसिटिक एसिड के 10% (v / v), मेथनॉल के 50% (v / v), कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सामग्री की तालिका देखें] । अवशिष्ट धुंधला बफर को हटाने के लिए आसुत पानी के साथ जेल को दो बार धोएं और रात भर कमरे के तापमान पर एक रॉकिंग शेकर (40 आरपीएम) पर डीस्टेनिंग बफर [10% (वी / वी) एसिटिक एसिड, 30% (वी / वी) मेथनॉल] के साथ जेल को इनक्यूबेट करें। एक डिजिटल कैमरा या एक स्कैनर के साथ पूरी तरह से destained जेल कल्पना.
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Representative Results
Syn6803 और JSC-1 कोशिकाओं को 30 डिग्री सेल्सियस पर B-HEPES माध्यम में निरंतर सरगर्मी के साथ शंक्वाकार फ्लास्क में खेती की गई थी, एक एलईडी सफेद प्रकाश (50 μmol फोटॉन m-2s-1) के तहत 1% (v / v) CO2 से भरे विकास कक्ष में। घातीय विकास चरण (OD750 = ~ 0.5) पर, कोशिकाओं को अंतिम ऑप्टिकल घनत्व OD750 = ~ 0.2 के साथ ताजा माध्यम में उपसंस्कृत किया गया था। देर से घातीय विकास चरण (OD750 = 0.6-0.8 ) तक पहुंचने के बाद, संस्कृतियों को एकत्र किया गया और सेंट्रीफ्यूज किया गया (20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 10,000 x g )। supernatant को छोड़ दिया गया था, और सेल छर्रों को -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था जब तक कि अगला चरण उपलब्ध नहीं था।
कोशिकाओं को तोड़ने के लिए, कोशिकाओं को पहले कमरे के तापमान पर पिघलाया गया था। कोशिकाओं को 0.75 एम के-फॉस्फेट बफर के भीतर 0.1 मिमी ग्लास मोतियों के साथ मनका-पिटाई से बाधित किया गया था। पूर्ण सेल lysis centrifugation (चित्रा 1B) से पहले गहरे नीले-हरे रंग में supernatant से पता चलता है। अघुलनशील झिल्ली और सेल मलबे को हटाने के लिए ट्राइटन एक्स -100 और सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा घुलनशीलता के बाद, supernatant को 40 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब (चित्रा 1 C) में सुक्रोज ग्रेडिएंट समाधान के शीर्ष पर लोड किया गया था। सेंट्रीफ्यूजेशन के 18 घंटे के बाद, बरकरार पीबीएस Syn6803 के लिए एक स्पष्ट नीले बैंड और JSC-1 के लिए एक बैंगनी बैंड के रूप में ग्रेडिएंट के केंद्र में चला गया। उनके रंग में अंतर Syn6803 और JSC-1 में PBS की विभिन्न रचनाओं से परिणाम। Syn6803 से PBS phycocyanin35 वहन करता है, जबकि JSC-1 के PBS में phycocyanin और phycoerythrin7 होता है। पृथक पीबीएस के सुक्रोज घनत्व-ढाल पृथक्करण का परिणाम विघटित फाइकोबिलिप्रोटीन के कई अंशों को दर्शाता है, और सबसे कम अंश बरकरार पीबीएस (चित्रा 1 डी) का प्रतिनिधित्व करता है।
जेएससी -1 और Syn6803 से अलग पीबीएस के विभिन्न अंशों के अवशोषण स्पेक्ट्रा की तुलना चित्र 2 ए में की गई है। अवशोषण स्पेक्ट्रा की विस्तृत प्रक्रिया लेख7,8 में वर्णित किया गया है। JSC-1 और Syn6803 के विघटित PBS और बरकरार PBS से अवशोषण स्पेक्ट्रा में phycocyanin के अनुरूप 622 nm पर एक ही चोटी है। और 571 एनएम पर phycoerythrin अवशोषण शिखर दोनों अलग पीबीएस और जेएससी -1 के बरकरार पीबीएस में पाया जाता है। एलोफिलिकोसायनिन जेएससी -1 और Syn6803 के बरकरार पीबीएस अंशों में 670 एनएम पर कंधे के साथ एक मामूली चोटी दिखाता है। वर्णक्रमीय अंतर से संकेत मिलता है कि रॉड (phycocyanin) से कोर (एलोफिकोसायनिन) अनुपात में बरकरार पीबीएस अंश की तुलना में अलग पीबीएस में अधिक है, क्योंकि फाइकोबिलिप्रोटीन के वर्णक्रमीय गुण पहले निर्धारित किए गए हैं5। चूंकि विघटित पीबीएस और बरकरार पीबीएस अंश कमरे के तापमान पर समान अवशोषण स्पेक्ट्रा और फ्लोरोसेंट उत्सर्जन विशेषताओं को दिखाते हैं, इसलिए 77K प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग सुक्रोज ढाल से अलग-अलग विभिन्न अंशों का विश्लेषण करने के लिए किया गया था। विघटित पीबीएस के 77K फ्लोरोसेंट उत्सर्जन स्पेक्ट्रा और बरकरार पीबीएस अंश580 एनएम से उत्साहित थे। विघटित पीबीएस के उत्सर्जन स्पेक्ट्रा में Syn6803 और JSC-1 में ~ 650 एनएम पर एक मजबूत चोटी है, जो phycocyanin (चित्रा 2B) से उत्सर्जन का प्रतिनिधित्व करती है। बरकरार पीबीएस के फ्लोरोसेंट उत्सर्जन स्पेक्ट्रा दो फ्लोरोसेंट उत्सर्जन अधिकतम चोटियों को दिखाते हैं: 651 एनएम पर कमजोर एक और 684 एनएम पर मजबूत एक, फाइकोसाइनिन द्वारा काटी गई ऊर्जा का खुलासा करते हुए कोर 9 (चित्रा 2 सी) में एलोफिलाइकोसायनिन और टर्मिनल एमिटर्स (एपीसीडी और एपीसीई) को कुशलतापूर्वक स्थानांतरित कर दिया गया था। इन विशेषताओं से पता चलता है कि सुक्रोज ढाल में सबसे कम अंशों में बरकरार पीबीएस होता है।
विघटित पीबीएस और बरकरार पीबीएस को एसडीएस-पेज द्वारा 8% -20% (डब्ल्यू / वी) एसडीएस पॉलीएक्रिलामाइड रैखिक ग्रेडिएंट जेल पर अलग किया गया था। phycocyanin और allophycocyanin के α और β सबयूनिट्स बिना दाग के जेल पर दिखाई दे रहे थे (चित्रा 3 ए)। जेल को बाद में 10 मिनट के लिए 10 mM ZnSO4 के साथ दाग दिया गया था। क्रोमोफोर युक्त phycobiliproteins यूवी विकिरण 8 के दौरान जस्ता धुंधला द्वारा मनाया गया था। Phycobiliprotein subunits (14-21 kDa) दृढ़ता से फ्लोरोसेंट हैं, और ApcE (तीर) ने कमजोर प्रतिदीप्ति (चित्रा 3 B) दिखाया। इसके अलावा, Coomassie ब्लू धुंधला विघटित पीबीएस अंशों और बरकरार पीबीएस अंशों (चित्रा 3 सी) के बीच विभिन्न प्रोटीन संरचना से पता चलता है। ऊपरी अंशों में अन्य गैर-पीबीएस पानी में घुलनशील प्रोटीन होते हैं क्योंकि बरकरार पीबीएस अंशों की तुलना में अधिक प्रोटीन दाग होते हैं। Syn6803 में बरकरार PBS एक प्रमुख ApcE बैंड (तीर) विघटित PBS अंशों (चित्रा 3C) में कमी से पता चलता है।
PBS निकालने और सुक्रोज ढाल के बीच आयतन अनुपात ultracentrifugation के बाद सुक्रोज ढाल में तेज बैंड प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। सुक्रोज ग्रेडिएंट समाधान के लिए घुलनशील पीबीएस अर्क का सुझाया गया अनुपात 1: 10 है। पिछले अनुभव के आधार पर, 40 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में सुक्रोज ग्रेडिएंट बनाना 13 एमएल ट्यूबों में बने सुक्रोज ग्रेडिएंट की तुलना में एक उच्च रिज़ॉल्यूशन दिखाता है। असंतत सुक्रोज ढाल बेंच पर कंपन के कारण समय के साथ फैलता है। इसलिए, 13 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब एक साथ बहुत सारे नमूनों को संभालने के लिए एक अच्छा विकल्प हो सकता है। यह प्रदर्शित करने के लिए, 13 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में सुक्रोज ग्रेडिएंट्स को 1: 3 और 1: 10 के अनुपात में Syn6803 या JSC-1 के कच्चे अर्क के बीच सुक्रोज ग्रेडिएंट समाधान (चित्रा 4 ए) के बीच तैयार किया गया है। अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, 1: 3 के अनुपात में तैयार सुक्रोज ग्रेडिएंट 1: 10 (चित्रा 4 बी) के अनुपात में बनाए गए ग्रेडिएंट की तुलना में व्यापक बैंड प्रदर्शित करता है। प्रत्येक ढाल के सबसे कम अंशों में बरकरार पीबीएस होता है, जिसकी पुष्टि 77K फ्लोरोसेंट उत्सर्जन स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा की जाती है।
चित्र 1: Syn6803 और JSC-1 कोशिकाओं और सुक्रोज ग्रेडिएंट ultracentrifugation का विघटन। (A) 40 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में बंद सुक्रोज ग्रेडिएंट तैयार करने का योजनाबद्ध चित्रण। (बी) स्क्रू-कैप शीशियों को 0.4 ग्राम कांच के मोतियों और Syn6803 या JSC-1 के सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर से भरा गया था, और फिर कोशिकाओं को एक मनका-बीटर द्वारा झूठ बोला गया था। (सी) ट्राइटन एक्स -100 घुलनशील अर्क के supernatant एक सुक्रोज घनत्व ढाल के शीर्ष पर स्तरित किया गया था। (डी) 18 घंटे के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, पीबीएस अंशों को Syn6803 में ढाल में स्पष्ट नीले बैंड के रूप में और जेएससी -1 में बैंगनी बैंड के रूप में देखा गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: सुक्रोज ग्रेडिएंट के विभिन्न अंशों का स्पेक्ट्रोस्कोपिक लक्षण वर्णन। (ए) जेएससी -1 और Syn6803 से अलग किए गए पीबीएस और बरकरार पीबीएस अंशों का अवशोषण स्पेक्ट्रा। प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रा को 77 K पर मापा गया था, जिसमें 580 nm पर उत्तेजना तरंग दैर्ध्य का उपयोग करके (B) विघटित PBS अंशों और (C) Syn6803 और JSC-1 के अक्षुण्ण PBS अंशों के लिए मापा गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: सुक्रोज gradients से अलग पीबीएस के SDS-पृष्ठ विश्लेषण. अलग-अलग और बरकरार पीबीएस अंशों को परिमाणित किया गया था (प्रति लेन 20 μg प्रोटीन) और 8% -20% (डब्ल्यू / वी) ग्रेडिएंट पॉलीएक्रिलामाइड जेल पर लोड किया गया था। जेल वैद्युतकणसंचलन के बाद, जेल को जस्ता धुंधला और कूमासी ब्लू स्टेनिंग द्वारा कल्पना की गई थी, बाद में। (ए) फाइकोबिलिप्रोटीन का रंग बिना दाग के जेल पर दिखाई देता है। (बी) जस्ता-सना हुआ जेल फाइकोबिलिप्रोटीन के प्रतिदीप्ति को दर्शाता है। (सी) जेल Coomassie ब्लू शो phycobiliproteins और अन्य प्रोटीन के साथ दाग. तीर ApcE की स्थिति को इंगित करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: सुक्रोज ढाल 13 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में बनाया गया है। कच्चे अर्क और सुक्रोज ढाल समाधान के बीच अनुपात छवियों के शीर्ष पर चिह्नित कर रहे हैं। (ए) Syn6803 और JSC-1 के Triton X-100 घुलनशील अर्क के supernatant सुक्रोज ग्रेडिएंट समाधान के लिए घुलनशील अर्क के विभिन्न अनुपातों के साथ सुक्रोज घनत्व ग्रेडिएंट पर स्तरित किया गया था। (बी) 18 घंटे के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, Syn6803 और JSC-1 में PBS अंशसुक्रोज ग्रेडिएंट में देखे गए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
यह प्रोटोकॉल दो प्रकार के साइनोबैक्टीरिया, एककोशिकीय मॉडल Syn6803, और फिलामेंटस गैर-मॉडल JSC-1 में बरकरार पीबीएस को अलग करने के लिए एक सरल और मानक विधि का वर्णन करता है। प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण चरणसुक्रोज के एक असंतत घनत्व ढाल पर सेल समरूपता और अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन हैं। आम तौर पर, फिलामेंटस कोशिकाओं का विघटन एककोशिकीय लोगों की तुलना में अधिक जटिल होता है। शुरुआती सामग्री की मात्रा (सेल पैलेट का गीला वजन) और मनका-पिटाई की पुनरावृत्ति की मात्रा में वृद्धि फिलामेंटस साइनोबैक्टीरिया कोशिकाओं से पीबीएस की उपज को बढ़ाने में सहायक थी। फिलामेंटस साइनोबैक्टीरियम, जेएससी -1 के लिए, एककोशिकीय एक, Syn6803 की तुलना में तीन गुना अधिक कोशिकाओं का उपयोग किया गया था। इसके अलावा, फिलामेंटस साइनोबैक्टीरियम को पूरी तरह से तोड़ने के लिए, निष्कर्षण बफर में गहरे नीले-बैंगनी रंग का निरीक्षण करने के लिए एककोशिकीय साइनोबैक्टीरिया की तुलना में अधिक बार मनका-पिटाई की आवश्यकता होती है।
मनका-पिटाई की अवधि 30 सेकंड से अधिक होने का सुझाव नहीं दिया जाता है क्योंकि नमूनों को प्रत्येक मनका-पिटाई चक्र के दौरान गर्म किया जाता है। ट्यूबों को प्रत्येक चक्र के बीच एक बेंच (या पानी के स्नान में) पर कमरे के तापमान पर ठंडा करने की सिफारिश की जाती है, क्योंकि बरकरार पीबीएस को कम तापमान पर आसानी से अलग कर दिया जाता है। इसलिए, इस प्रोटोकॉल में प्रत्येक प्रक्रिया को कमरे के तापमान पर करने का सुझाव दिया जाता है। कई शोध लेखों ने विभिन्न सेल व्यवधान विधियों का वर्णन किया है, जिसमें एक उच्च दबाव वाले होमोजेनाइज़र (फ्रेंच-प्रेस) या एक सोनिकेटर 6,8,20 शामिल हैं। एक मनका मिल homogenizer का सुझाव दिया जाता है क्योंकि यह सस्ता, सुरक्षित, संभाल करने में आसान, तेज, अधिक सुलभ, और एक साथ कई नमूनों को संसाधित करने में अधिक कुशल है।
Phycobilisomes तीन अलग-अलग आकार दिखाते हैं, hemidiscoidal, बंडल के आकार का, और रॉड के आकार का5। चित्रा 2 में अलग किए गए अक्षुण्ण phycobilisomes hemidiscoidal आकार से संबंधित हैं जैसा कि पहले के प्रकाशनों 7,13,36 में चर्चा की गई है। ऊपरी अंश जो विघटित पीबीएस का प्रतिनिधित्व करता है, हालांकि, इसमें रॉड के आकार का पीबीएस भी हो सकता है। Syn6803 और JSC-1 एक विशिष्ट रॉड-कोर लिंकर CpcL को एन्कोड करते हैं, जो हेमिडिकोइडल PBS6,37 के अलावा रॉड के आकार के पीबीएस की उपस्थिति का सुझाव देता है। रॉड के आकार के पीबीएस को सीधे Syn6803 में पहचाना गया है, लेकिन JSC-17,13,37 में नहीं। दूसरी ओर, जेएससी -1 हरे / लाल प्रकाश में टाइप III रंगीन अनुकूलन और लाल / दूर-लाल प्रकाश 6,7 में दूर-लाल प्रकाश फोटोएक्लिमेशन करके अपने पीबीएस को फिर से तैयार करता है। इन सभी विविधताओं से संकेत मिलता है कि सुक्रोज ग्रेडिएंट में पीबीएस के अन्य प्रकार हो सकते हैं, इसके अलावा सबसे कम बरकरार हेमिडिकोइडल पीबीएस अंश के अलावा। उदाहरण के लिए, दो प्रकार के पीबीएस एक ही समय में मौजूद होते हैं जब Synechococcus sp. PCC 7335 और JSC-1 दूर-लाल बत्ती 8,13 के लिए acclimates। यह सुझाव दिया जाता है कि पीबीएस को एक अनिर्दिष्ट साइनोबैक्टीरिया तनाव से अलग करने वाले व्यक्ति को किसी भी संभावित प्रकार के पीबीएस की पहचान करने के लिए सुक्रोज ग्रेडिएंट में प्रत्येक अंश का विश्लेषण करने में अधिक सतर्क होना चाहिए।
कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल सेल व्यवधान के लिए एक सस्ता, सरल और तेज़ तरीका प्रदान करता है। यह भी प्रदर्शित किया गया है कि यह विधि विभिन्न सेल प्रकारों और पीबीएस रचनाओं के साथ विभिन्न साइनोबैक्टीरिया से पीबीएस को अलग करने के लिए विश्वसनीय है।
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Disclosures
लेखकों ने कोई प्रतिस्पर्धी रुचि की घोषणा नहीं की है।
Acknowledgments
लेखकों प्रौद्योगिकी कॉमन्स, जीवन विज्ञान के कॉलेज, राष्ट्रीय ताइवान विश्वविद्यालय ultracentrifuge के सुविधाजनक उपयोग के लिए धन्यवाद. साइनोबैक्टीरिया उपभेदों Synechocystis एसपी पीसीसी 6803 और Leptolyngbya एसपी जेएससी -1 को क्रमशः अकादमिक सिनिका, ताइवान में डॉ चू, Hsiu-An और पेंसिल्वेनिया स्टेट यूनिवर्सिटी, संयुक्त राज्य अमेरिका में डॉ डोनाल्ड ए ब्रायंट से उपहार में दिया गया था। इस काम को विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (ताइवान) (109-2636-B-002-013- और 110-2628-B-002-065-) और शिक्षा मंत्रालय (ताइवान) द्वारा वित्त पोषित किया गया था युशान यंग स्कॉलर प्रोग्राम (109V1102 और 110V1102)।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 mm glass beads | BioSpec | 11079101 | for PBS extraction |
| 13 mL centrifugation tube | Hitachi | 13PA | ultracentrifugation |
| 40 mL centrifugation tube | Hitachi | 40PA | ultracentrifugation |
| Acetic acid | Merck | 8.1875.2500 | for Coomassie Blue staining |
| B-HEPES medium | A modified cyanobacterial medium from BG-11 medium | ||
| Brilliant Blue R-250 | Sigma | B-0149 | for Coomassie Blue staining |
| Bromophenol blue | Wako pure chemical industries | 2-291 | protein loading buffer |
| Electronic balance | Radwag | WLC 2/A2/C/2 | for the wet weight measurement of cell pellets |
| Fluorescence spectrophotometer | Hitachi | F-7000 | Spectrophotometer |
| Glycerol | BioShop | Gly001.500 | protein loading buffer |
| High-Speed refrigerated centrifuge | Hitachi | CR22N | for buffer exchange |
| Leptolyngbya sp. JSC-1 | from Dr. Donald A. Bryant at Pennsylvania State University, USA. | ||
| Low temperature measurement accessory | Hitachi | 5J0-0112 | The accessory includes a transparent Dewar container for 77K fluorescence spectroscopy. |
| Methanol | Merck | 1.07018,2511 | for Coomassie Blue staining |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher | Pico 21 | for PBS extraction |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | Model 607 | for PBS extraction |
| Potassium phosphate dibasic | PanReac AppliChem | 121512.121 | for PBS extraction |
| Potassium phosphate monobasic | PanReac AppliChem | 141509.121 | for PBS extraction |
| Screw cap vial | BioSpec | 10832 | for PBS extraction |
| SmartView Pro Imager | Major Science | UVCI-2300 | for Znic staining signal detection |
| Sodium dodecyl sulfate | Zymeset | BSD101 | protein loading buffer |
| Sucrose | Zymeset | BSU101 | for PBS isolation |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | glucose-tolerant strain from Dr. Chu, Hsiu-An at Academia Sinica, Taiwan | ||
| Tris | BioShop | TRS 011.1 | protein loading buffer |
| Triton X-100 | BioShop | TRX 506.500 | for PBS extraction |
| Ultra 10 K membrane centrifugal filter | Millipore | UFC901024 | for buffer exchange |
| Ultra 3 K membrane centrifugal filter | Millipore | UFC500324 | for buffer exchange |
| Ultracentrifuge | Hitachi | CP80WX | ultracentrifugation |
| UV/Vis spectrophotometer | Agilent | Cary 60 | Spectrophotometer |
| Zinc sulfate | PanReac AppliChem | 131787.121 | for Znic staining |
| β-Mercaptoethanol | BioBasic | MB0338 | protein loading buffer |
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