Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Rester-spesifikk utveksling av proline av proline analoger i fluorescerende proteiner: Hvordan "molekylær kirurgi" av ryggraden påvirker folding og stabilitet

Published: February 3, 2022 doi: 10.3791/63320
Automatic Translation
1, 2, 3, 1,2, 1
1Institute of Chemistry, Technische Universität Berlin, 2Department of Chemistry, University of Manitoba, 3Institute of Physics, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg

Summary

For å overvinne begrensningene til klassisk stedsstyrt mutagenese ble prolineanaloger med spesifikke modifikasjoner innlemmet i flere fluorescerende proteiner. Vi viser hvordan utskifting av hydrogen ved fluor eller av singel ved doble bindinger i prolinrester ("molekylær kirurgi") påvirker grunnleggende proteinegenskaper, inkludert folding og interaksjon med lys.

Abstract

Utskifting av prolin (Pro) rester i proteiner av den tradisjonelle stedsstyrte mutagenesen av noen av de resterende 19 kanoniske aminosyrene er ofte skadelig for proteinfolding og spesielt kromoformodning i grønne fluorescerende proteiner og relaterte varianter. Et rimelig alternativ er å manipulere oversettelsen av proteinet slik at alle Pro-rester erstattes rester- spesielt av analoger, en metode kjent som selektiv trykkinkorporering (SPI). De innebygde kjemiske modifikasjonene kan brukes som en slags "molekylær kirurgi" for å fint dissekere målbare endringer eller til og med rasjonelt manipulere forskjellige proteinegenskaper. Her demonstrerer studien nytten av SPI-metoden for å studere rollen som proliner i organiseringen av den typiske β-fatstrukturen av spektralvarianter av det grønne fluorescerende proteinet (GFP) med 10-15 proliner i sekvensen: forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP), NowGFP og KillerOrange. Pro rester er til stede i forbindelsesseksjoner mellom individuelle β-tråder og utgjør lukkelokkene på fatets stillas, og er dermed ansvarlig for isolasjon av kromofor fra vann, det vil si fluorescensegenskaper. Selektive trykkinkorporeringsforsøk med (4R)-fluoroprolin (R-Flp), (4S)-fluoroprolin (S-Flp), 4,4-difluoroprolin (Dfp) og 3,4-dehydroprolin (Dhp) ble utført ved hjelp av en proline-auxotrofisk E. coli-stamme som uttrykksvert. Vi fant at fluorescerende proteiner med S-Flp og Dhp er aktive (dvs. fluorescerende), mens de to andre analogene (Dfp og R-Flp) produserte dysfunksjonelle, feilfoldede proteiner. Inspeksjon av UV-Vis absorpsjon og fluorescensutslippsprofiler viste få karakteristiske endringer i proteinene som inneholder Pro-analoger. Undersøkelse av de sammenleggbare kinetiske profilene i EGFP-varianter viste en akselerert omfoldingsprosess i nærvær av S-Flp, mens prosessen lignet villtype i proteinet som inneholder Dhp. Denne studien viser kapasiteten til SPI-metoden for å produsere subtile modifikasjoner av proteinrester på atomnivå ("molekylær kirurgi"), som kan vedtas for studiet av andre proteiner av interesse. Det illustrerer resultatene av proline erstatninger med nære kjemiske analoger på folding og spektroskopiske egenskaper i klassen av β-fat fluorescerende proteiner.

Introduction

Klassisk stedsstyrt mutagenese tillater permutasjon av enhver eksisterende genkodet proteinsekvens ved kodonmanipulering på DNA-nivå. For å studere proteinfolding og stabilitet er det ofte ønskelig å erstatte lignende aminosyrer med lignende kolleger. Imidlertid er tradisjonell proteinmutagenese definitivt begrenset til strukturelt lignende erstatninger blant kanoniske aminosyrer som Ser / Ala / Cys, Thr / Val, Glu / Gln, Asp / Asn, Tyr / Phe, som er til stede i standard genetisk koderepertoar. På den annen side er det ingen slike muligheter for andre kanoniske aminosyrer som Trp, Met, His eller Pro, som ofte spiller essensielle strukturelle og funksjonelle roller i proteiner1. En ideell tilnærming for å studere disse interaksjonene i sammenheng med den svært spesifikke interne arkitekturen av proteiner og deres foldeprosess er å generere ikke-forstyrrende isosteriske modifikasjoner. Faktisk, når isosteriske aminosyreanaloger av disse kanoniske aminosyrene, også kjent som ikke-kanoniske aminosyrer (ncAAer), settes inn i proteiner, tillater de subtile endringer selv på nivået av enkeltatomer eller atomgrupper som H / F, CH2 / S / Se / Te kjent som "atommutasjoner"2. Slike "molekylær kirurgi" produserer endrede proteiner hvis egenskaper utelukkende skyldes utveksling av enkeltatomer eller grupper av atomer, som i gunstige tilfeller kan analyseres, og de oppdagede endringene kan rasjonaliseres. På denne måten utvides omfanget av proteinsyntese for å studere proteinfolding og struktur langt utover klassisk DNA-mutagenese. Legg merke til at proteiner generert av stedsstyrt mutagenese vanligvis kalles "mutanter", mens proteiner med erstattede kanoniske aminosyrer kalles "varianter" 3, "alloproteiner"4 eller "proteinkongeners"5.

Det grønne fluorescerende proteinet (GFP), først identifisert i den marine organismen Aequorea victoria, viser lysegrønn fluorescens når det utsettes for ultrafiolett-til-blått lys 6,7. I dag brukes GFP ofte som et svært følsomt merkingsverktøy for rutinemessig visualisering av genuttrykk og proteinlokalisering i celler via fluorescerende mikroskopi. GFP har også vist seg nyttig i ulike biofysiske 8,9,10 og biomedisinske11,12 studier, samt i protein engineering 13,14,15. Streng analyse av GFP-strukturen gjorde det mulig å lage mange varianter preget av variert stabilitet og fluorescens maxima16,17. De fleste GFP-variantene som brukes i celle- og molekylærbiologi er monomeriske proteiner både i løsning og i krystall18. Deres viktigste strukturelle organisasjon er typisk for alle medlemmer av GFP-familien, uavhengig av deres fylogenetiske opprinnelse, og består av 11 β tråder som danner en såkalt β-fat, mens en knekt α-helix løper gjennom midten av fatet og bærer kromoforen (figur 1A). Den autokatalytiske modningen av kromoforen (figur 1B) krever presis posisjonering av sidekjedene som omgir den i det sentrale stedet for proteinet; mange av disse sidekjedene er svært bevart i andre GFP-varianter19. I de fleste fluorescerende proteiner fra maneter som Aequorea victoria består den grønn-emitterende kromoforen av to aromatiske ringer, inkludert en fenolring av Tyr66 og den femdelte heterosykliske strukturen til imidazolinone (figur 1B). Kromoforen, når den er riktig innebygd i proteinmatrisen, er ansvarlig for den karakteristiske fluorescensen til hele proteinet. Den ligger i midten av strukturen, mens fatstrukturen isolerer den fra det vandige mediet20. Eksponering av kromofor til bulkvannet vil føre til fluorescensslukking, det vil si tap av fluorescens21.

Riktig folding av den fatlignende strukturen er avgjørende for å beskytte kromofor mot fluorescensslukking22. Proline (Pro) rester spiller en spesiell rolle i den strukturelle organiseringen av GFP23. Å ikke kunne støtte en β-tråd, utgjør de koblingsløkker som er ansvarlige for å opprettholde proteinstrukturen som helhet. Ikke overraskende finnes 10-15 proline rester i både Aequorea- og Anthoathecata-avledede fastleger; noen av dem er svært bevart i andre typer fluorescerende β-fat proteiner. Prolines forventes å kritisk påvirke foldeegenskaper på grunn av deres særegne geometriske egenskaper. For eksempel, i Aequorea-avledede fastleger, av de ti proline-rester (figur 2A), danner ni form trans- og bare en danner en cis-peptidbinding (Pro89). Pro58 er viktig, det vil si ikke utskiftbar med resten av de 19 kanoniske aminosyrene. Denne resten kan være ansvarlig for riktig posisjonering av Trp57-rester, som har blitt rapportert å være avgjørende for kromoformodning og den samlede GFP-foldingen24. Fragmentet PVPWP med tre prolinerester (Pro54, Pro56, Pro58) og Trp57 er den essensielle delen av "nedre lokk" i GFP-strukturen fra figur 1A. Det strukturelle PVPWP-motivet finnes i flere proteiner som cytokromer og eukaryote spenningsaktiverte kaliumkanaler25. Prolin-til-alanin substitusjoner i stillingene 75 og 89 er også skadelige for proteinuttrykk og folding og avskaffe kromoformodning. Pro75 og Pro89 er en del av "øvre lokk" som begraver kromofor (figur 1A) og er bevart over 11-strandede β-fat fluorescerende proteiner23. Disse to "lokkene" holder kromoforen utelukket fra det vandige løsningsmidlet, selv når den stabile tertiære strukturen er delvis ødelagt26. En slik spesifikk molekylær arkitektur beskytter fluoroforen mot kollisjons-(dynamisk) fluorescensslukking, for eksempel ved vann, oksygen eller andre diffusible ligander.

For å utføre molekylær prosjektering av GFP-strukturen, bør man introdusere aminosyreerstatninger i proteinets primære struktur. Tallrike mutasjoner har blitt utført på GFP, og gir varianter med forhøyet stabilitet, rask og pålitelig folding og variable fluorescensegenskaper17. Likevel, i de fleste tilfeller, mutasjon av prolinrester anses som en risikabel tilnærming på grunn av det faktum at ingen av de resterende 19 kanoniske aminosyrene kan gjenopprette konformasjonsprofilen til prolinerester27 riktig. Dermed er det utviklet en alternativ tilnærming, der proline rester erstattes med andre proline-baserte strukturer, kalt proline analoger28. På grunn av sin unike sykliske kjemiske struktur viser prolin to karakteristiske konformasjonsoverganger (figur 1C): 1) proline-ringen puckering, en rask prosess som innebærer organisering av ryggraden, som først og fremst påvirker φ torsjonsvinkel, og 2) peptidbindingen cis / trans isomerisering, en langsom prosess som påvirker ryggradsfolding via ω torsjonsvinkler. På grunn av sin langsomme natur er sistnevnte overgang ofte ansvarlig for de hastighetsbegrensende trinnene i foldeprosessen til hele proteinet. Det har tidligere vist seg at peptidbinding cis / trans isomerisering rundt noen proline rester har langsomme trinn i foldingen av GFP-varianter. For eksempel har dannelsen av cis-peptidbindingen hos Pro89 det langsomme trinnet i foldeprosessen fordi den er avhengig av bindingsovergangen fra trans til cis29. En raskere bretting kan oppnås etter å ha erstattet Pro89 med en all-trans peptidsløyfe, det vil si ved å avskaffe en cis-to-trans isomeriseringshendelse30. I tillegg til cis /trans-isomeriseringen, kan puckerovergangene også generere dype endringer i proteinfolding på grunn av ryggradsorganisasjonen og pakking i proteininteriøret 27,31.

Kjemiske modifikasjoner resulterer i endring av de iboende konformasjonsovergangene til prolinrester, og påvirker dermed proteinets evne til å brette seg. Visse proline analoger er spesielt attraktive kandidater for proline substitusjon i proteiner som de tillater manipulering og studie av folding egenskaper. For eksempel er (4R)-fluoroprolin (R-Flp), (4S)-fluoroprolin (S-Flp), 4,4-difluoroproline (Dfp) og 3,4-dehydroproline (Dhp) fire analoger (figur 1D) som skiller seg minimalt fra prolin når det gjelder både molekylært volum og polaritet32. Samtidig viser hver analog en distinkt ringpuckering: S-Flp stabiliserer C 4-endo pucker, R-Flp stabiliserer C 4-exo pucker, Dfp viser ingen tilsynelatende pucker preferanse, mens Dhp avskaffer puckering (Figur 1D)33. Ved å bruke disse analogene i proteinstrukturen kan man manipulere med konformasjonsovergangen til prolinerester, og med dette påvirke egenskapene til de resulterende GFP-variantene.

I dette arbeidet bestemte vi oss for å innlemme det angitte settet med prolineanaloger (figur 1D) i strukturen til GFP-varianter ved hjelp av selektiv trykkinnarbeidingsmetode (SPI, figur 3)34. Utskifting av aminosyrerester med sine nærmeste isostrukturelle analoger er et anvendt bioteknologisk konsept i proteindesign35,36. Dermed illustrerer effekten av prolineanaloger i et modellprotein deres potensial til å tjene som verktøy i proteinteknikk37. Produksjonen av proteiner som inneholder ønskede analoger ble utført i modifiserte E. coli-stammer som ikke er i stand til å produsere prolin (prolin-auxotrofi). Dermed kan de bli tvunget til å akseptere erstatning av substrater i prosessen med proteinbiosyntese38. Denne globale substitusjonen av prolin er aktivert av den naturlige substratfleksibiliteten til endogene aminoacyl-tRNA-synthetaser39, de viktigste enzymene katalyserer esterifiseringen av tRNAer med passende aminosyrer40. Generelt, som beskrevet i figur 3, utføres cellulær vekst i et definert medium til den midterlig logaritmiske vekstfasen er nådd. I neste trinn er aminosyren som skal erstattes intracellulært utarmet fra uttrykkssystemet under gjæring og deretter utveksles av ønsket analog eller ncAA. Målproteinuttrykk induseres deretter for rester-spesifikk ikke-kanonisk aminosyre inkorporering. Substitusjonen av cognate aminosyren med analogen skjer på en proteom bred måte. Selv om denne bivirkningen kan ha en negativ innvirkning på veksten av vertsstammen, påvirkes kvaliteten på målproteinproduksjonen for det meste ikke, siden de cellulære ressursene i rekombinant uttrykk hovedsakelig er rettet mot produksjonen av målproteinet41,42. Derfor er et tett regulert, utydelig uttrykkssystem og sterke promotører avgjørende for høy inkorporeringseffektivitet43. Vår tilnærming er basert på flere rester-spesifikk inkorporering av ncAAs som svar på sans codons (sense codon omplassering), hvorved innenfor målgenet, antall posisjoner for Pro analog innsetting kan manipuleres via sted-rettet mutagenesis44. En lignende tilnærming ble brukt i vår forrige rapport om fremstilling av rekombinante peptider med antimikrobielle egenskaper45. I dette arbeidet har vi brukt SPI-metoden, som gjør at alle prolinrester kan erstattes av relaterte analoger, for å generere proteiner som forventes å ha distinkte fysisk-kjemiske egenskaper som ikke finnes i proteiner syntetisert med det kanoniske aminosyrerepertoaret. Ved å karakterisere folde- og fluorescensprofilen til resulterende varianter, tar vi sikte på å vise frem effekten av atomerstatninger i varianter av GFP.

Protocol

1. Innføring av uttrykksplasmider i kompetente Pro-auxotrofiske E. coli-celler

  1. Bland 1 ng av hver prøveplasmid, pQE-80L H 6-EGFP, pQE-80L H6-NowGFP, og pQE-80L H6-KillerOrange, med 50 μL kjemisk kompetente eller elektrokompetente celler i pro-auxotrofisk E. coli K12-avledet stamme JM83 (Addgene #50348, eller ATCC #35607) for transformasjon ved varmesjokkmetoden eller elektroporasjon i henhold til protokollene som er tilgjengelige46, 47.
    MERK: Uttrykksvektoren pQE-80L EGFP-H6 koder et C-terminalt 6xHis-merket forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP), uttrykksvektorene pQE-80L H 6-NowGFP og pQE-80L H6-KillerOrange koder en N-terminalt 6xHis-merket NowGFP48 eller en N-terminally 6xHis-tagget KillerOrange49, henholdsvis, hver i en pQE-80L plasmid ryggrad. Alle målgener er under kontroll av en bakteriell T5-promotor regulert av laktoperatøren. Ampicillin motstand ble brukt som en utvalgsmarkør og kolE1 som opprinnelsen til replikasjon. Se materialtabellen for mer informasjon om pQE-80L plasmid. Alternativ Pro-auxotrophic E. coli som stammer fra stammer K-12 og B kan også brukes til uttrykk og bør gi lignende resultater. Den beregnede molekylære massen av H6-merket singly protonated ([M +H]+) wild-type proteiner (etter kromofor modning) er 27,745.33 Da (EGFP- H6), 27,931.50 Da (H 6-NowGFP), og 27,606.09 Da (H6-Killero). De primære strukturene til målproteinene er gitt i tabell 1 (His-tag understreket). Glutaminet (Q) innenfor His-tag-sekvensen til NowGFP ble identifisert ved DNA-sekvensering etter subkloning av NowGFP cDNA mottatt fra Pletnev et al.51 til pQE-80L plasmid. Det hindrer ikke proteinrensing eller egenskapene til det fluorescerende proteinet.
  2. Gjenopprett cellene i 950 μL SOC medium ved 37 °C i 1 time.
  3. Spred 50 μL av de gjenvunne cellene på Luria Agar (LA) middels plater (se Tilleggsmateriale) som inneholder glukose (10 g/L) og ampicillin (100 μg/ml).
  4. Inkuber LA mediumplatene ved 37 °C over natten eller 30 °C i 24 timer.

2. Produksjon av rekombinante fluorescerende proteiner av vill type (med kanonisk prolin) og prosedyre for selektiv trykkinkorporering (SPI) for å produsere fluorescerende proteiner med prolineanaloger (S-Flp, R-Flp, Dfp, Dhp)

  1. Nattkultur av Pro-auxotrofisk E. coli K12-avledet stamme JM83 som huser pQE-80L EGFP- H6, pQE-80L H 6-NowGFP og pQE-80L H 6-KillerOrange
    1. Bruk en steril pipettespiss eller inokulasjonssløyfe for å velge en enkelt koloni fra en LA-mediumplate og resuspender cellene i 5 ml Lysogeny Broth (LB) medium (se Tilleggsmateriale; inneholder 10 g/L glukose, 100 μg/ml ampicillin) i et sterilt 14 ml polystyrenkulturrør.
      MERK: Ny transformerte kolonier anbefales for inokulering. Celler på LA-middels plater (fra trinn 2.2.) lagret ved 4 °C skal brukes i løpet av få dager.
    2. Vokse cellekulturen over natten ved 37 °C i en orbital shaker ved 200-250 o/min.
  2. Produksjon av rekombinant EGFP- H6, H6-NowGFP og H6-KillerOrange med innfødt prolin og tilsvarende proteinvarianter med prolinanaloger
    1. Inokuler 200 ml ferskt NMM-medium (7,5 mM (NH4)2SO4, 50 mM K2HPO4 og 22 mM KH2PO4, 8,5 mM NaCl, 1 mM MgSO4, 20 mM D-glukose, 1 μg/ml FeCl2, 1 μg/ml CaCl2, 10 μg/ml tiamin, 10 μg/ml biotin, 0,01 μg/ml sporstoffer (CuSO4, ZnCl2, MnCl2, (NH4)2MoO4), pH ~7,2) med alle kanoniske l-aminosyrer (50 mg/l); se Tilleggsmateriale) supplert med 100 μg/ml ampicillin med 2 ml av nattkulturen i en 2-L Erlenmeyer-kolbe.
      MERK: Avhengig av type protein, kan alternative dyrkingsmedier som MOPS medium52, glukose-mineralsalter medium53, Davis minimal medium54, M9 minimal medium55 eller GMML56 testes for å optimalisere proteinutbyttet.
    2. Inkuber cellene ved 37 °C i en orbital shaker ved 220 o/min i ~3 t 30 min.
    3. Mål den optiske tettheten ved 600 nm (OD600) i et spektrofotometer hvert 30.
      MERK: For OD600-bestemmelse i et spektrofotometer, bør cuvette ha en banelengde på 1 cm. Det tilsvarende dyrkingsmediet brukes til referansemålingen ("null"). Inkubasjonstiden til en OD600-verdi på ~ 0,7 er nådd, kan avhenge av kulturvolumet. 3 t 30 min er en omtrentlig verdi. I en variant av protokolldeltrinnene 2.2.1-2.2.3., kulturen fra deltrinn 2.1.2. brukes til å inokulere ferskt NMMΔPro medium (se Tilleggsmateriale) supplert med en begrenset konsentrasjon av prolin (f.eks. 5 mg/l i stedet for 50 mg/l), og cellene dyrkes over natten ved 37 °C i en orbital shaker ved 220 o/min. Neste dag utføres OD600-bestemmelsen hvert 30. Den maksimale OD600-verdien må være rundt 1 (± 0,3). Den første, begrensede prolinekonsentrasjonen kan justeres avhengig av uttrykksstammen og dyrkingsmediet (se Diskusjon).
    4. Snurr ned cellefjæringen i 10 min ved 3000 x g og 4 °C.
    5. Dekanter supernatanten forsiktig i avfall.
    6. Vasketrinn: Resuspend cellene i 50 ml iskald NMMΔAA (uten aminosyre, se Tilleggsmateriale) eller NMMΔPro (uten prolin, se Tilleggsmateriale) medium ved forsiktig pipettering.
      MERK: For dette vasketrinnet kan en av de to oppgitte bufferne brukes, siden det bare er viktig å kvitte seg med gjenværende proline i inkubasjonsmediet.
    7. Skill cellene fra mediet ved sedimentering ved 4 °C i en sentrifuge ved 3000 x g i 10 minutter.
    8. Dekanter supernatanten forsiktig i avfall.
    9. Pipette forsiktig opp og ned for å resuspendere cellepellet i 200 ml NMMΔPro medium supplert med 100 μg / ml ampicillin i en 2-L Erlenmeyer kolbe.
      MERK: Den resulterende cellefjæringen kan deles inn i flere prøver med likt volum for å oppnå identiske startkulturer for å sammenligne proteinuttrykk i nærvær av Pro- eller proline-analoger (f.eks. separasjon i 4 x 50 ml i 100 ml Erlenmeyer-kolber).
    10. Inkuber i 30 min ved 37 °C i en orbital shaker ved 220 o/min for fullstendig uttømming av Pro.
      MERK: Dette trinnet er avgjørende for å tømme Pro helt fra celler.
    11. Legg til et passende volum av enten L-proline eller R-Flp, S-Flp, Dfp og Dhp fra 50 mM lagerløsning for å justere 1 mM endelig konsentrasjon i cellefjæringen.
      MERK: Som hovedregel bør det alltid utarbeides ferske 50 mM lagerløsninger av Pro- eller prolinederivater før bruk. Bare hvis hydrolyse av den spesielle kanoniske eller ikke-kanoniske aminosyren i en vandig løsning ikke er en bekymring, kan frosne lagre også brukes.
    12. Tilsett 0,5 mM IPTG fra en 1 M lagerløsning for å indusere målproteinuttrykk.
    13. Uttrykk målproteinet over natten (12 timer) ved 37 °C i en orbital shaker ved 220 o/min.
    14. Mål OD600 neste dag.
      MERK: OD600-bestemmelse gjøres for å kvantifisere mengden celler etter proteinuttrykk. En lavere OD600-verdi sammenlignet med verdien målt før vasketrinnet 2.2.3 indikerer cytotoksisitet av den medfølgende aminosyren. I dette tilfellet bør prosedyren gjentas med konsentrasjonen av den medfølgende aminosyren minimert (ned til 0,1 mM).
    15. Sentrifuger og samle bakteriecellene ved 5000 x g og 4 °C i 10 minutter og dekanter supernatanten i avfall.
    16. Vasketrinn: Resuspend cellene ved forsiktig pipettering i 50 ml bindingsbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM DTT) som inneholder 10% glyserol og overfører cellefjæringen til et 50 ml konisk polystyrenrør.
    17. Sentrifuger og samle bakteriecellene ved 5000 x g og 4 °C i 10 minutter og dekanter supernatanten i avfall.
    18. Oppbevar cellepellet i et konisk polystyrenrør på 50 ml ved -20 °C eller -80 °C til videre bruk (proteinrensing, se nedenfor).

3. Renseprosedyre av proteinprøver ved immobilisert metallionaffinitetskromatografi (IMAC)

  1. Bakteriell cellelys
    MERK: Utfør alle trinnene i cellelysene på is eller ved 4 °C for å forhindre nedbrytning av målproteinet.
    1. Tine bakteriecellepellet på is eller ved 4 °C i et konisk polystyrenrør på 50 ml i 10-20 minutter.
    2. Tilsett 10 ml iskald bindingsbuffer (se Tilleggsmateriale) og rør forsiktig opp og ned for å resuspendere cellepelleten.
    3. Tilsett 100 μL 50 mg/ml lysozym, 100 μL 1 mg/ml DNase I, 100 μL 1 mg/ml RNase A, 30 μL av 1 M MgCl2. Snu cellefjæringen forsiktig fem ganger, og hold det lukkede røret på is eller ved 4 °C i 60 minutter.
      MERK: Lysozyme induserer kjemisk cellelys ved å forstyrre bakteriecelleveggen.
    4. Soniker prøven for celleforstyrrelser ved hjelp av en ultralyd homogenisator (f.eks. 3 ganger i 3 minutter i et 50 ml polystyrenrør på en isvannsblanding, puls 2 s/pause 4 s, 45% amplitude).
      MERK: Alternativt kan andre celleavbruddsmetoder brukes, for eksempel høytrykkshomogenisering i 20 sykluser ved 14 000 psi. Fortynn om nødvendig ved hjelp av en bindingsbuffer (se Tilleggsmateriale) for å nå minimalt instrumentvolum. Videre kan proteinutvinningsreagenser brukes til celleforstyrrelser. Se materiallisten hvis du vil ha eksempler.
    5. Sentrifuge i 60 min ved 18 000 x g, 4 °C.
    6. Legg merke til væskevolumet for substep 3.1.9. og hell supernatanten i et friskt 50 ml polystyrenrør.
    7. Fjern supernatanten ved hjelp av et membranfilter med 0,45 μm porediameter.
    8. Ta et utvalg av "lysate" for SDS-PAGE (se avsnitt 4. nedenfor); Dette tilsvarer "løselig proteinfraksjon", supernatanten fra substep 3,1,6.
    9. Legg til et likt volum av ddH2O som bestemt i deltrinn 3.1.6. for å resuspendere celleavfallet for å opprettholde samme fortynning av prøvene for etterfølgende SDS-PAGE-analyse.
    10. Ta et utvalg av "pellet" for SDS-PAGE (se avsnitt 4. nedenfor); Dette tilsvarer "uoppløselig proteinfraksjon", celleavfallssuspensjonen fra substep 3.1.9.
  2. Immobilisert metallaffinitet kromatografi (IMAC) rensing
    MERK: Rensing av målet fluorescerende protein kan utføres ved 4 °C eller ved romtemperatur (RT). For sistnevnte alternativ, vent på at lysate, kolonne og alle buffere skal likevektere ved RT for å forhindre luftbobledannelse på grunn av fordampning av luft fanget i kald løsning ved plassering i en varm kolonne.
    1. Rens prøven ved hjelp av en 1 ml forhåndspakket eller selvpakket IMAC FPLC-kolonne (hurtigprotein [eller ytelse] flytende kromatografi) i henhold til produsentens instruksjoner; sett maksimalt kolonnetrykk til 0,3 MPa, og strømningshastigheten til 1 ml/min; bruke bindingsbuffer (se Tilleggsmateriale) for kolonnelikevekt, vaskebuffer (se Tilleggsmateriale) for vasketrinnet og elutionbuffer (se Tilleggsmateriale) for målproteinutnyttelse.
      MERK: Alternativt kan et automatisert FPLC-system påføres for å unngå målproteinet med elutionbuffer som kjører en lineær imidazolkonsentrasjonsgradient (20-200 mM).
    2. Samle og basseng eluate fraksjoner med fluorescerende proteiner (velg ved synlig grønn eller oransje farge).
    3. Overfør de samlede brøkene til en dialysemembran (MWCO ( Molecular Weight Cutoff) på 5000-10 000) i henhold til produsentens instruksjoner og dialyse minst tre ganger mot dialysebuffer eller MS-buffer (se Tilleggsmateriale). For eksempel, utfør dialyse av en 1 ml prøve tre ganger mot 100 ml buffer i minst 2 timer hver runde. For en detaljert protokoll, se Budisa et al.34.
    4. Forbered en 1:100-fold fortynning av den dialyzed elutionfraksjonen i PBS-buffer (se Tilleggsmateriale).
    5. Registrer absorbansspekteret av de fortynnede prøvene i et UV-Vis spektrofotometer.
    6. Beregn proteinkonsentrasjonen basert på Lambert-Beer-loven som følger, ved hjelp av litteraturverdier av molarutryddelseskoeffisientene ε ved spesifikk bølgelengde (for EGFP ved 488 nm ε488 = 55 000 cm-1· M-1, NowGFP ved 493 nm ε493 = 53 600 cm-1· M-1, KillerOrange ved 514 nm ε514 = 22 600 cm-1· M-1):
      Equation 1 (Lambert-Øl lov)
      cprotein = proteinkonsentrasjon [mg/ml]
      A = absorbans ved spesifikk bølgelengde
      ε = molar utryddelseskoeffisient ved spesifikk bølgelengde [M-1·cm-1]
      d = cuvette bane lengde, her 1 cm
      MW = molekylvekt av protein [g/mol]
      Bruk dialysebuffer (se Tilleggsmateriale) for referansemålet ("null").
    7. Ta en prøve av "eluate" for SDS-PAGE (se avsnitt 4 nedenfor), last 1-10 μg protein (beregnet i henhold til forrige trinn) per prøvebrønn for Coomassie Brilliant Blue-farget geler.
      MERK: Juster SDS-prøvemengder avhengig av den påførte fargingsmetoden og følsomheten til fargestoffet hvis forbindelser som er forskjellige fra Coomassie Brilliant Blue, brukes til proteinbåndfarging.
    8. Frys og oppbevar proteinprøven i dialysebuffer (se Tilleggsmateriale) ved -80 °C.
      MERK: Under denne lagringstilstanden bør proteinprøver være stabile i minst 6 måneder. Alternativt laboratorium UV-Vis og fluorescensspektrofotometere kan brukes til registrering av absorpsjon og fluorescensutslippsspektra av målproteiner. Følgende eksitasjonsbølgelengder kan brukes til fluorescensutslippsmålinger: 488 nm (EGFP), 493 nm (NowGFP) og 510 nm (KillerOrange).

4. SDS-PAGE prøvepreparering

  1. Bestem absorbans A ved 280 nm (A280nm) for prøver "eluate", "lysate" og "pellet" fra § 3. Juster probevolumet for å oppnå A280nm = 2 ved å legge til en passende mengde elutionbuffer (endelig sondevolum skal være minst 80 μL).
  2. Bland prøven med et forhold på 4:1 (v/v) med 5x SDS lastefargebuffer (se Tilleggsmateriale) ved pipettering, for eksempel 80 μL av prøven med 20 μL 5x SDS-lastebuffer.
  3. Kok SDS-prøvene ved 95 °C i 5 minutter i et vannbad eller en varmeblokk for å tette proteinene.
  4. La prøvene avkjøles ned til RT og spinn ned sondene på 13 000 x g i 1 min i en mikrocentrifuge før de lastes på gelen.
  5. Bruk 5-10 μL for Coomassie Brilliant Blue-farget SDS-PAGE. Hvis du vil ha mer informasjon om SDS-PAGE-prosedyren, kan du se57.
    MERK: Juster SDS-prøvemengdene avhengig av fargemetoden og følsomheten til fargestoffet. Resultatet av SDS-PAGE bør kontrolleres nøye for å sikre at prøvene inneholder mer enn 95% av det totale proteinet i et bånd som tilsvarer forventet molekylvekt av ønsket protein. For dette, ta et bilde av Coomassie-farget gel og sammenlign intensiteten av proteinbåndet med ønsket molekylvekt med intensiteten til alle andre bånd i banen (hvis noen) ved densitometri. For densitometrisk evaluering av båndintensiteter kan programvaren ImageJ brukes58. For å eksperimentelt bevise inkorporering av de ønskede ncAAene i proteinet av interesse, bør intakt proteinmasseanalyse ved høyytelses væskekromatografi (HPLC) koblet til elektrosprayionization time-of-flight massespektrometri (LC-ESI-TOF-MS) utføres som beskrevet59 (se protokoll § 5 og Tabell over materialer der for eksemplarisk utstyr).

5. Fluorescensutslipp av proteinvarianter

  1. Før prosedyren må du kontrollere resultatet fra SDS-PAGE-eksperimentet for å forsikre deg om at prøverenhet er >95 % (se MERKNAD etter trinn 4.5.)
  2. Juster prøvene av hver renset proteinvariant til en konsentrasjon på 0,3 μM, og ta den beregnede absorbansverdien ved riktig bølgelengde som referanse (substep 3,2,5.). Kontroller at det omtrentlige endelige prøvevolumet er 200 μL.
  3. La de fortynnede prøvene likevekte i 1 time ved RT.
  4. Overfør prøvene til en 1 cm kvarts cuvette og mål et fluorescensutslippsspekter av prøvene ved hjelp av et fluorescensspektrometer (se Materialliste) som bruker følgende eksitasjonsbølgelengder: 488 nm (for EGFP), 493 nm (for NowGFP), 510 nm (for KillerOrange).

6. Denaturering og bretting av EGFP-varianter

  1. Før prosedyren må du kontrollere resultatet fra SDS-PAGE-eksperimentet for å forsikre deg om at prøverenhet er >95 % (se MERKNAD etter trinn 4.5.)
  2. Forbered deg på hver renset proteinvariant to prøver av 2 μL sluttvolum i en konsentrasjon på 300 μM (se proteinkonsentrasjonsbestemmelse i substeps 3,2,4-3,2,6).
  3. Tilsett 18 μL 1,11x PBS-buffer (se Tilleggsmateriale) som inneholder 8,89 M urea og 5,56 mM DTT til 2 μL av hver rensede proteinvariant (for å oppnå 1x PBS som inneholder 8 M urea og 5 mM DTT) for å indusere denaturering.
    MERK: For trinn 6.4-6.6, behandle hver prøve separat.
  4. Inkuber prøvene i 5 min ved 95 °C.
  5. Fortynn 20 μL-prøvene 100 ganger ved å tilsette 1980 μL 1x PBS (se Tilleggsmateriale) som inneholder 5 mM DTT for å indusere renaturering, noe som gir 0,3 μM endelig proteinkonsentrasjon og overfører umiddelbart 200 μL av prøvene til en 1 cm kvarts cuvette.
    MERK: Det er veldig viktig å jobbe raskt her siden renaturation starter umiddelbart.
  6. Sett kvarts cuvette inn i et passende fluorescensspektrometer (se Materialfortegnelse) og overvåk proteinfolding i prøvene ved å anskaffe et fluorescensspekter hver tredje s over 30 min. For hver proteinvariant, bruk 295 nm fluorescenseksitasjon for den første prøven og 488 nm fluorescenseksitasjon for den andre.
  7. Overfør brettingsprøvene til 1,5 ml mikrosenterrør, lukk lokket og oppbevar prøvene på RT i mørket i 24 timer for å tillate fullstendig bretting av EGFP-varianter.
  8. Mål fluorescensutslipp av refoldede proteinprøver i henhold til trinn 6.6 ved hjelp av samme eksitasjonsbølgelengde som før for å fange det tidsmessige endepunktet for fluorescensgjenvinning.

Representative Results

I begynnelsen av studien valgte vi tre forskjellige fluorescerende proteinvarianter som delte den overordnede GFP-arkitekturen. Det første proteinet som ble valgt var EGFP, som er en konstruert variant avledet fra den opprinnelige GFP fra maneter Aequorea victoria som inneholder Phe64Leu / Ser65Thr mutasjoner. Det andre valgte proteinet var NowGFP51,60. Det er også en variant av A. victoria GFP avledet av mutagenese i flere trinn via tidligere fluorescerende proteiner. NowGFP inneholder 18 mutasjoner sammenlignet med det umiddelbare forgjengerens fluorescerende protein "Cerulean"61. I sin tur er "Cerulean" -proteinet et derivat av det forbedrede cyan fluorescerende proteinet (ECFP) 62,63, et protein som tidligere ble valgt av rettet laboratorieutvikling og inneholder en tryptofanbasert kromofor. Både EGFP og NowGFP er mye brukt i cellebiologi og biofysiske studier, og de inneholder ti bevarte proline rester i sine strukturer. I tillegg har NowGFP en ellevte proline rester i posisjon 230, som dukket opp på grunn av den omfattende mutasjonshistorien til denne proteinvarianten. Det tredje proteinet som ble valgt var KillerOrange fluorescerende protein64,65. Det er et derivat av kromoprotein anm2CP fra hydrozoan slekten Anthoathecata. Proteinsekvensen inneholder 15 prolinrester, og kromoforen er basert på en tryptofan i stedet for en tyrosinrester. Røntgenstrukturer med høy oppløsning er rapportert for alle de tre utvalgte proteinene (figur 2)51,65,66.

I det første trinnet ble prolineanaloger (figur 1D) innlemmet i alle proline-posisjoner av tre modellproteiner (EGFP, NowGFP og KillerOrange) ved selektiv trykkinnarbeidelse (SPI, en ordning av prosedyren er gitt i figur 3). Instrumentalt ble den prolin-auxotrofiske E. coli K12-stammen JM8367 brukt til uttrykk for proteinene i nærvær av prolin og analoger (figur 1D), noe som gir henholdsvis villtype og modifiserte proteiner. Pellets fra celler som uttrykker det opprinnelige proteinet og varianter med S-Flp og Dhp hadde den typiske lyse fargen på grunn av den intakte kromoforen, mens varianter som inneholder R-Flp og Dfp forble fargeløse, noe som indikerer feilfolding og avsetning av utfoldet protein i inklusjonslegemer (figur 4A). SDS-PAGE-analyse av de uttrykte prøvene verifiserte tilstedeværelsen av uoppløselige R-Flp-inneholdende proteiner (figur 4B-D), som utelukket videre undersøkelser. Selv om dette er utenfor omfanget av den nåværende studien, bør det bemerkes at proteinløselighet og feilfoldingsproblemer til en viss grad kan lindres ved in vitro-brettingsprosedyrer68. I motsetning ble det funnet innfødte proteiner samt S-Flp- og Dhp-bærende varianter hovedsakelig i de oppløselige fraksjonene (figur 4B-D). Den ville typen, så vel som S-Flp- og Dhp-inneholdende varianter, kan isoleres ytterligere og karakteriseres i fluorescensstudier. Løselige proteiner ble renset av immobilisert metallionaffinitetskromatografi (IMAC), noe som ga 20-30 mg / L kulturvolum for EGFP, 60-80 mg for NowGFP og KillerOrange, hvis utbytter for villtype og modifiserte proteiner var svært like. Væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS)-koblet analyse bekreftet forventet identitet og renhet av isolasjonene oppnådd på denne måten (figur 5). I massespektraet produserte hver proline-erstatning med S-Flp et +18 Da skift per hver proline-rest i sekvensen, mens for proline-til-Dhp-erstatningen var skiftet −2 Da per rest.

I neste trinn ble det registrert lysabsorpsjon og utslippsspektra for å analysere de potensielle effektene av ikke-kanoniske prolinanaloger inkorporering på spektroskopiske egenskaper til de overordnede fluorescerende proteinene (figur 6). UV-Vis absorpsjonsspektra viste et typisk bånd rundt 280 nm karakteristisk for aromatiske rester, tyrosin og tryptofan, mens kromoforabsorberingen ble funnet ved 488 nm for EGFP, og 493 nm for NowGFP (figur 6A,B). I KillerOrange besto kromoforabsorberingsregionen av to bånd (figur 6C), som tilsvarer to mulige konfigurasjons- og ladetilstander i den komplekse kromoforen. Båndet rundt 510 nm er kjent som tilstanden som fluorescens oppstår med høyt kvanteutbytte49,65. I proline erstatningsvarianter ble følgende observert: Inkorporering av Dhp endret ikke absorbansspektraet til EGFP og NowGFP, mens S-Flp produserte en forbedret UV-absorpsjon. Sistnevnte kan forklares med induserte forskjeller i tryptofanrestermikromiljøet, spesielt Trp57 mellom tre S-Flp i PVPWP-motivet (figur 6A, B)69. En mer triviell forklaring på høyere UV-absorpsjon kan imidlertid stamme fra en økt brøkdel av feil brettet protein. Siden konsentrasjonen av proteinet ble vurdert ved kvantifisering av absorbansfunksjoner, kan tilstedeværelsen av et protein med feil moden kromofor øke absorbansen, mens denne fraksjonen ikke telles i den totale konsentrasjonen (figur 6A, B). Ved å støtte denne hypotesen observerte vi at den S-Flp-inneholdende EGFP viste et markant redusert forhold mellom kromofor versus kombinert tryptofan og tyrosinabsorbering (ε(CRO)/ε(Tyr+Trp) = 0,96) sammenlignet med en høyere verdi (1,57) i foreldreproteinet (tabell 2)70. Tilstedeværelsen av en ikke-fluorescerende brøkdel i den S-Flp-inneholdende EGFP vil være en viktig medvirkende faktor i videre analyse av proteinegenskapene. I KillerOrange-varianten som inneholder S-Flp, ble det observert en forbedret absorbans sammen med et rødt skifte i kromoforbåndet. Dette faktum indikerte at kromoforformasjonen favoriserte en konfigurasjon med et stort fluorescens kvanteutbytte (figur 6C).

Deretter analyserte vi fluorescensspektraet til proteinene som ble registrert ved eksitasjon ved de tilsvarende maksimale absorbansbølgelengdene. Resultatene viser at spektraet i hovedsak forble identisk for de undersøkte fluorescerende proteinvariantene som bærer prolin og erstatninger, S-Flp og Dhp. Dette utfallet innebærer at analogene ikke endret kromoforens kjemiske miljø i alle fall (figur 6G-I). Til tross for dette faktum ble det sett markerte forskjeller i fluorescensspektraet til KillerOrange registrert ved eksitasjon ved 295 nm, derav ved tryptofan eksitasjon. Dette eksperimentet sporer fluorescensresonansenergioverføring (FRET) eller direkte eksitionisk kobling som oppstår mellom tryptofan sidekjedene og den modne kromoforen, da begge ligger i kort avstand på ikke mer enn 25 Å. For EGFP- og NowGFP-varianter, da utslippsspektraet ble målt ved hjelp av 295 nm eksitasjon, ble det observert et sterkt kromoforutslipp sammen med knapt noen tryptofanutslipp (figur 6D,E). Variantene som inneholder S-Flp viste imidlertid et litt større tryptofan-spesifikt utslipp. Denne observasjonen kan knyttes til et utellingsbidrag av det utfoldede apoproteinet som inneholder tryptofans, men ikke den modne kromoforen. Betydelig økt tryptofan-spesifikk utslipp ble sett i KillerOrange, noe som indikerer mangel på fluorescens slukking via den forventede mekanismen for eksitasjon energioverføring eller eksitionisk kobling. Proteinvariantene som inneholder prolin og S-Flp viste sammenlignbare tryptofan-utslipp sammen med den favoriserte rødskiftede fluorescensfunksjonen til et høyt kvanteutbytte. I kontrast viste varianten som inneholdt Dhp en drastisk reduksjon i kromoforfluorescensintensiteten, antagelig på grunn av mindre strukturelle effekter (figur 6F).

Deretter sammenlignet vi proteinenes sammenleggbare egenskaper ved å utføre et utfoldende / renatureringseksperiment. Fluorescensutslippsspektra ble registrert i foldet tilstand (protokoll § 5), etter kjemisk denaturering og deretter i ferd med å brettes over en periode på 24 timer (protokoll § 6). Spektra ble registrert ved eksitasjon ved både relevante bølgelengder, 295 nm, og ved maksimal av kromoforenes absorbansspektra, mens den resulterende fluorescensen presenteres som normalisert til maksimumsverdien for hvert protein (figur 7). På slutten av protokollen observerte vi at EGFP-varianter kunne brettes om, mens NowGFP- og KillerOrange-variantene - når de ble denaturert - forble utfoldet (data ikke vist). Dermed varierte omfoldingskapasiteten til de opprinnelige fluorescensproteinene betydelig. Vær oppmerksom på at KillerOrange er utviklet som en fotosensibilisator fra den hydrozoanske kromoproteinvarianten KillerRed65,71, og omformingen henger vanligvis etter til tross for den robuste β-fat-strukturen. I våre eksperimenter fant vi ut at den ville typen EGFP-kromoforfluorescens bare ble delvis gjenvunnet, selv om den tryptofan-spesifikke fluorescensen var større etter renaturering (figur 7A,D). I hovedsak ble lignende oppførsel observert i varianten som inneholder Dhp (Figur 7C, F). I S-Flp-inneholdende EGFP ble det observert et lignende resultat da eksitasjonen ble utført ved den tryptofanspesifikke bølgelengden på 295 nm (figur 7B). Påfallende nok gjenvunnet fluorescensen til en mye høyere rekkevidde da kromoforen var spent på 488 nm (figur 7E). Det ser ut til at S-Flp induserer et mye bedre utbytte av bretting sammenlignet med de to andre variantene. Denne gunstige effekten ble imidlertid ikke sett ved bruk av 295 nm eksitasjon på grunn av ukjente molekylære interaksjoner.

Deretter ble omfoldingshastigheten overvåket ved å registrere fluorescens av både tryptofan og kromofor, separat, mens endepunktet i prosessen ble bestemt til 24 timer etter starten av renaturation. Bare EGFP-varianter viste en relativt rask refolding kinetikk som kunne evalueres pålitelig, mens ingen av de denaturerte NowGFP- og KillerOrange-variantene kunne gjenopprette til en verdi som muliggjorde ytterligere kvantitative målinger. I EGFP var utvinningen av tryptofan-utslipp dobbelt så rask (fullført i 750 s) sammenlignet med utvinning av kromoforutslipp (fullført i 1500 s), noe som indikerer kompleksiteten i de underliggende prosessene (figur 8). Ved begge eksitasjonsbølgelengdene ble omfoldingsraten forhøyet av tilstedeværelsen av S-Flp, i samsvar med litteraturdata25. Samtidig viste den Dhp-inneholdende varianten en bretteprofil som ligner på wild-type.

Figure 1
Figur 1: Grønt fluorescerende protein (GFP) strukturelt stillas, kromoforbygning, prolinkonformasjonsoverganger og syntetiske analoger som brukes i denne studien. (A) Strukturen til GFP består av β tråder som danner en nesten perfekt tønne (dvs. en "boks" med dimensjoner 4,2 nm x 2,4 nm) som er avkortet i begge ender med α heliske lokk. 27 kDa GFP-proteinet viser en tertiær struktur som består av elleve β tråder, to korte α-helikvier og kromofor i midten. Konformasjonstilstandene til tilstøtende proliner er knyttet til kromofordannelse. (B) Autokatalytisk modning (kondensering) av kromofor forekommer ved rester Ser65, Tyr66 og Gly67, og fortsetter i flere trinn: For det første torsjonsjusteringer i polypeptidrydets ryggrad for å bringe karboksylkarbonet av Thr65 i nærheten av det midterste nitrogenet til Gly67. Deretter oppstår dannelsen av et heterosyklisk imidazolin-5-en ringsystem ved nukleofilt angrep på dette karbonatomet av mellom nitrogen av glycin og etterfølgende dehydrering. Til slutt får systemet synlig fluorescens når oksidasjon av tyrosin alfa-beta karbonbinding ved molekylært oksygen fører til forlengelsen av det konjugerte systemet til imidazolinringsystemet, på slutten inkludert tyrosinfenylringen og dens para-oksygen substituent. Den resulterende parahydroksybenzyliden imidazolinonekromofor i midten av β-fatet er helt skilt fra bulkløsningsmidlet. (C) Skjelettstrukturformlene og geometriene til 1) prolineringen (puckers) og 2) den foregående amidbindingen representerer de viktigste konformasjonsovergangene til prolinerester. (D) Proline-analogene som brukes i dette arbeidet med de angitte proline ring puckers. Figuren ble generert ved hjelp av ChemDraw og Discovery Studio Visualizer. GFP-strukturen er fra PDB-strukturoppføring 2Q6P. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Fluorescerende proteiner som brukes i denne studien. Panelene viser båndrepresentasjonen av de typiske β-fat-strukturene til tre forskjellige varianter av fluorescerende proteiner: EGFP, NowGFP og KillerOrange, med båndfarge som representerer fargen på fluorescensutslipp av hver variant. Proline rester (en-bokstav kode) er uthevet som pinner, og de riktige posisjonene er kommentert. Kromoforer er vist med innledende aminosyresammensetning i fet skrift. Alle strukturrepresentasjoner ble produsert med PyMol basert på følgende PDB-strukturoppføringer: 2Q6P for EGFP, 4RYS for NowGFP, 4ZFS for KillerOrange. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Presentasjon av SPI-metoden for resterspesifikk inkorporering av ikke-kanoniske prolineanaloger. En prolin-auxotrofisk Escherichia coli (E. coli) vert belastning som bærer genet av interesse på et uttrykk plasmid vokser i et definert minimalt medium med alle 20 kanoniske aminosyrer til en OD600 av ~ 0,7 nås der cellekulturen er i midt-logaritmisk vekstfase. Celler høstes og overføres til friskt minimalt medium som inneholder 19 kanoniske aminosyrer og en prolinanalog. Etter tilsetning av en induser utføres proteinuttrykk over natten. Til slutt er målproteinet isolert av cellelys og renset før videre analyse. I en variant av protokollen dyrkes cellene i et definert minimalt medium med 19 kanoniske aminosyrer, og prolin tilsettes i en begrenset mengde (f.eks. en femtedel av konsentrasjonen av de andre aminosyrene). Ved dette tiltaket eksoserer cellene prolin i mediet før de kan gå ut av den logaritmiske vekstfasen, og deretter tilsetts analogen, og proteinet av interesseproduksjon induserer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Uttrykksanalyse av EGFP-, NowGFP- og KillerOrange-varianter. (A) Cellepellets fra 1 ml uttrykkskultur, normalisert til OD600 = 2. SDS-PAGE analyse av (B) EGFP, (C) NowGFP og (D) KillerOrange varianter. Løselige (S) og uoppløselige fraksjoner (I) av hvert fluorescerende proteinavledninger ble lastet på 15% akrylamidgel, samt unngikk fraksjoner (E) fra IMAC av løselige proteiner. PageRuler Unstained Protein Ladder ble brukt som en markør (M) i banene betegnet av (M). De forventede områdene av det aktuelle proteinet er innrammet. Inkorporerte aminosyrer i prolinposisjoner er Pro, R-Flp, S-Flp og Dhp (i (A) cellepellets fra fluorescerende proteinvarianter som inkorporerer Dfp i stedet for Dhp vises). Geler ble farget av 1% (m / v) Coomassie Brillant Blue. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Massespektrometrisk analyse av fluorescerende proteinvarianter. (A) Representant dekonvoluted ESI-MS spektra av H6-merket EGFP (svart), S-Flp-EGFP (oransje) og Dhp-EGFP (cyan) med plasseringen av de viktigste massetoppene gitt som tall (i Da). De beregnede molekylære massene [M+H]+ av H6-taggede proteiner er: For EGFP 27,745.33 Da (observert 27,746,15 Da); for S-Flp-EGFP 27,925.33 Da (observert 27,925.73 Da); for Dhp-EGFP 27,725.33 Da (observert 27,726.01 Da). (B) Representativt dekonvolutert ESI-MS-spektra av H6-tagget NowGFP (svart), S-Flp-NowGFP (oransje) og Dhp-NowGFP (cyan) med plasseringen av de viktigste massetoppene gitt som tall (i Da). De beregnede massene av H6-taggede proteiner er: For NowGFP 27,931.50 Da (observert 27,946.46 Da; forskjellen på ~ 16 Da skyldes sannsynligvis oksidasjon av et metionin i proteinet); for S-Flp-NowGFP 28,129.50 Da (observert 28,130.08 Da); for Dhp-NowGFP 27,909.50 Da (observert 27,910.22 Da). (C) Representant deconvoluted ESI-MS spektra av H6-tagget KillerOrange (svart), S-Flp-KillerOrange (oransje) og Dhp-KillerOrange (cyan) med plasseringen av de viktigste massetoppene gitt som tall (i Da). De beregnede massene av H6-taggede proteiner er: For KillerOrange 27,606.09 Da (observert 27,605.91 Da); for S-Flp-KillerOrange 27,876.09 Da (observert 27,876.08 Da); for Dhp-KillerOrange 27,576.09 Da (observert 27,575.93 Da). Avvik mellom de observerte og beregnede molekylære massene på ca. 1 Da er innenfor feilområdet til ESI-MS-utstyret. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Lysabsorpsjon og fluorescensutslippsspektra av fluorescerende proteinvarianter. Normalisert UV-Vis absorpsjon spektra er vist for varianter (A) av EGFP, (B) av NowGFP, og (C) av KillerOrange. Spectra ble normalisert til maksimalt kromoforabsorbering (rundt 500 nm). Normalisert fluorescens utslipp spektra er vist av varianter (D, G) av EGFP, (E, H) av NowGFP, og (F, I) av KillerOrange. Spektra i (D,E,F) ble målt ved eksitasjon med ultrafiolett lys (295 nm), for spektra i (G,H,I) 488 nm, 493 nm, og 510 nm lys ble brukt for eksitasjon, henholdsvis, og spektra ble normalisert til den respektive maxima av kromoforutslipp (rundt 500 nm). I hvert panel tilsvarer svarte kurver spektraet til den fluorescerende proteinvarianten med innfødt prolin, oransje kurver indikerer spektraet av S-Flp-erstattede proteiner, og blå kurver tilsvarer Dhp-erstattede proteiner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Fluorescensutslippsspektra av EGFP-varianter i omfoldingsforsøk. Normaliserte fluorescensutslippsspektra av 0,3 μM-løsninger av fluorescerende proteinvarianter i opprinnelig tilstand og etter denaturering og bretting: Spectra in (A,B,C) ble målt ved eksitasjon med ultrafiolett lys (295 nm) (A) for EGFP, (B) for S-Flp-EGFP, og (C) for Dhp-EGFP. Spectra in (D,E,F) ble målt ved eksitasjon med grønt lys (488 nm) (D) for EFGP, (E) for S-Flp-EGFP, og (F) for Dhp-EGFP. Utslippsspektraet til de innfødte (svarte kurvene) og refoldede prøver (grønn tilsvarer EGFP, oransje til henholdsvis S-Flp-EGFP og blå til Dhp-EGFP) av hver proteinvariant normaliseres til maksimal fluorescens av riktig innfødt tilstand. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Overvåking av proteinfolding og kromoformodning av EGFP-varianter med fluorescens. (A) Fluorescensutslipp i Trp-fluorescensområdet (utslipp ble satt til 330 nm) registrert ved eksitasjon med ultrafiolett lys (295 nm). (B) Utvikling av fluorescensamplituden i regionen kromoforutslipp ved eksitasjon med grønt lys (488 nm). De tidsavhengige fluorescenssporene ble normalisert til enhet (100%) i henhold til fluorescensamplituden som ble nådd på slutten av overvåkingsintervallet. I hvert panel tilsvarer svarte kurver spektraet til den fluorescerende proteinvarianten med innfødt prolin, oransje kurver indikerer spektraet av S-Flp-erstattede proteiner og blå kurver tilsvarer Dhp-erstattede proteiner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Konstruere Aminosyresekvenser (6xHis tag understreket):
EGFP-H6 MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVVGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVP
WPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTR
AEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVN
FKIRHNIEDGSVQLADHYQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDH
MVLLEFVTAAGITLGMDELYKHHHHHHHH
H6-NåGFP MRGSHHQHHGSVSKGEKLFTGVVPILVELDDVVGHKFSVSGEGEGDATYGKK
MSLKFICTTGKLPVPWPTLKTTLTWGMQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGY
VQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGVDFKEDGNILGHKLEYN
AISGNANITADKQKNGIKAYFTIRHDVEDGSVLLADHYQNTPIGDGPVLLPD
NHYLSTQSKQSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGLGADELYK
H6-KillerOrange MRGSHHHHHHGSECGPALFQSDMTFKIFIDGEVNGQKFTIVADGSSKFPH
GDFNVHAVCETGKLPMSWKPICHLIQWGEPFFARYPDGISHFAQECFPEG
LSIDRTVRFENDGTMTSHHTYELSDTCVVSRITVNCDGFQPDGPIMRDQ
LVDILPSETHMFPHGPNAVRQLAFIGFTTADGGLMMGHLDSKMTFNGSR
AIEIPGPHFVTIITKQMRDTSDKRDHVCQREVAHAHSVPRITSAIGSDQD

Tabell 1: Primærstrukturer av målproteinene. Hans tagger er understreket i hver sekvens.

λ [nm] ε [M-1·cm-1] (EGFP) ε [M-1·cm-1] (S-Flp-EGFP) ε [M-1·cm-1] (Dhp-EGFP)
488 (≡ CRO) 31.657 (± 1.341) 22 950 (± 290) 27 800 (± 542)
280 (≡ Tyr+Trp) 20.116 (± 172) 23 800 (± 715) 17 300 (± 554)
Verdier for utryddelseskoeffisient ε (i M-1·cm-1) beregnes fra registrerte UV-Vis absorpsjonsspektra av passende EGFP-varianter ved hjelp av kjente proteinkonsentrasjoner. Valgt bølgelengde ved 280 nm tilsvarer maksimal absorbans av aromatiske rester, tyrosin og tryptofan, og 488 nm representerer kromoforabsorberingsbølgelengden.

Tabell 2: Utryddelseskoeffisienter (ε) av EGFP-varianter ved utvalgte bølgelengder. Verdier for utryddelseskoeffisienten ε (i M-1·cm-1) beregnes ut fra registrerte UV-Vis absorpsjonsspektra av passende EGFP-varianter ved hjelp av kjente proteinkonsentrasjoner. Den valgte bølgelengden på 280 nm tilsvarer maksimal absorbans av aromatiske rester, tyrosin og tryptofan, mens 488 nm representerer maksimal kromoforabsorberingsbølgelengde.

Tilleggsmateriale: Utarbeidelse av lagerløsninger og buffere Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

I naturen oppstår manipulasjoner med proteinstrukturer og funksjoner vanligvis på grunn av mutasjoner, fenomenet som fører til utveksling av en aminosyreidentitet i visse stillinger i proteinsekvensen. Denne naturlige mekanismen er mye brukt som en bioteknologisk metode for proteinteknikk i form av mutagenese, og den er avhengig av repertoaret til de 20 kanoniske aminosyrene som er involvert i prosessen. Utveksling av proline rester er imidlertid problematisk. På grunn av sin spesielle ryggradsgruppearkitektur er den neppe utskiftbar med de resterende 19 rester for erstatning72. Proline er for eksempel vanligvis kjent som en sekundær strukturbryter i polypeptidsekvenser på grunn av sin dårlige kompatibilitet med de vanligste sekundære strukturene, det vil si α-helix og β-strand. Denne proline-funksjonen går lett tapt når restene muteres til en annen aminosyre fra det vanlige repertoaret. Utskifting av proline med sine kjemiske analoger tilbyr en alternativ tilnærming, som gjør det mulig å holde de grunnleggende ryggradsfunksjonene til foreldre proline rester mens du pålegger bias på sine spesifikke konformasjonsoverganger eller produserer moduler av molekylært volum og polaritet. For eksempel er det mulig å levere bakteriekulturer med analoge strukturer som hydroksy-, fluor-, alkyl-, dehydroproliner, strukturer som har variable ringstørrelser og mer, og dermed letter produksjonen av et protein som inneholder spesifikke prolineresterendringer.

Den selektive trykkinkorporeringsmetoden (SPI) som er beskrevet i denne studien, muliggjør en global, det vil si resterspesifikk erstatning av alle proliner i målproteinet med relaterte kjemiske analoger. Betydningen av metoden gjenspeiles av det faktum at SPI tillater å skape sekvensendringer utilgjengelige for vanlige mutageneseteknikker. For eksempel tillater det produksjon av et målprotein som inneholder ganske små strukturelle endringer som vanligvis ikke overstiger en eller to atomerstatninger / slettinger / tillegg, som vist i denne studien. Slike protein modifikasjoner kalles "atommutasjoner"73,74. I et fluorescerende protein som GFP kan resultatet av denne molekylære inntrengningen ses i hastigheten på folding, lokale polariteter, proteinpakking, stabilitet av de involverte strukturelle egenskapene. Endringene i absorbans- og fluorescensegenskapene produseres indirekte på grunn av påvirkningen på proteinfolding og rester av mikromiljøet. Presisjonen til de molekylære endringene utført av SPI er vanligvis mye høyere, sammenlignet med mutasjoner av proliner til andre kanoniske rester, sistnevnte er vanligvis skadelig for proteinfolding, produksjon og isolasjon.

Som en produksjonsmetode bruker SPI-tilnærmingen substrattoleransen til aminoacyl-tRNA-syntetaselommen mot kjemiske analoger av den innfødte aminosyren. Syntetase er ansvarlig for riktig identifisering av aminosyrestrukturen, mens inkorporering i proteiner skjer nedstrøms i oversettelsesprosessen. Instrumentalt utføres proteinproduksjonen, isolasjonen og rensingen i SPI på en måte som er typisk for andre rekombinante proteinuttrykksteknikker; Men med noen tillegg til protokollen som følger: Proline, som er bundet til utskifting, leveres i begynnelsen av gjæringsprosessen, slik at cellene kan vokse og utvikle sine intakte cellulære maskiner. Cellekulturen har imidlertid ikke lov til å nå maksimal optisk tetthet, for å holde cellene i den logaritmiske fasen optimale for proteinuttrykk. Det er to store variasjoner av SPI-metoden på dette tidspunktet. I den første justeres konsentrasjonen av prolin i det første vekstmediet (et kjemisk definert medium) slik at uttømming av prolin skjer uten ekstern inntrengning. Cellene eksos proline i mediet før de kan gå ut av den logaritmiske vekstfasen, og deretter tilsetts analogen, og proteinet av interesseproduksjon blir indusert. I den andre versjonen av metoden vokser cellene i mediet som inneholder proline til midten av deres logaritmiske fase. På dette tidspunktet bør cellene tas ut og fysisk overføres til et annet medium, som ikke lenger inneholder prolin, bare analogen, med etterfølgende induksjon av proteinet av interesse. I begge versjoner leveres analogen og proteininduksjonsreagensen til de forvoksne cellene. Isolasjon og rensing av villtypeproteinet utføres på samme måte som for varianter. I prinsippet kan alle tilgjengelige pro-auxotrofiske stammer brukes som uttrykksvert. Likevel er uttrykkstester for å identifisere den mest passende verten tilrådelig. Også tester av forskjellige kjemisk definerte medier kan brukes til å optimalisere proteinutbyttet.

Det er visse krav til de kjemiske analogene som må vurderes for SPI, for eksempel løselighet og konsentrasjon. Den metabolske tilgjengeligheten og opptaket av aminosyrer er avhengig av antall oppløste molekyler i mediet. For å øke løseligheten til en bestemt forbindelse, kan det velges litt sure eller alkaliske forhold. Siden de kunstige molekylene kan forårsake veksthemmende effekter på grunn av deres celletoksisitet, bør konsentrasjonen senkes til et minimum for å unngå cellestress75.

En mindre svakhet ved SPI er reduksjonen av inkorporeringseffektivitet med et større antall stillinger som må byttes ut. I prinsippet kan en reduksjon av aminosyrefrekvensen innenfor målet biomolekyl ved stedsstyrt mutagenese løse dette problemet. Imidlertid kan de strukturelle og funksjonelle egenskapene til et ønsket protein påvirkes ved å endre primærstrukturen.

Som nevnt tidligere tillater SPI resterspesifikk utskifting av den kanoniske aminosyren. Dette innebærer at ikke-kanoniske aminosyrer settes inn i hver posisjon av den kanoniske aminosyren i målproteinet, inkludert konserverte rester som er uunnværlige for proteinfunksjon eller folding. Alternative metoder for stedsspesifikk innlemmelse er den eneste muligheten til å løse dette problemet3. I løpet av de siste tiårene har den ortogonale parmetoden blitt utviklet som kan produsere proteiner som inneholder modifiserte rester på forhåndsdefinerte steder. Den vanligste modifikasjonen av denne metoden er kjent som stop codon-undertrykkelse. Denne metoden er basert på et konstruert ortogonalt oversettelsessystem dedikert til stedsspesifikk inkorporering av syntetiske aminosyrer76. Mer enn 200 aminosyrer med forskjellige sidekjedemodifikasjoner har blitt innlemmet i proteiner til dags dato ved hjelp av denne tilnærmingen77. Imidlertid er disse oversettelsessystemene fortsatt ikke egnet for innsetting av proline-analoger i målproteiner. Videre anses metodens ytelse som lav ved mindre aminosyreendringer fordi noe bakgrunnspromiskuitet av aminoacyl-tRNA-syntesen vanligvis forblir i de konstruerte oversettelsessystemene.

Ved hjelp av SPI produserte vi en rekke β-fat fluorescerende proteinvarianter og studerte resultatene av utveksling av proline med sine unaturlige analoger. Ved proline erstatning med R-Flp og Dfp ble et dysfunksjonelt protein produsert av uttrykksverten. Effekten er sannsynligvis produsert av protein feilfolding. Sistnevnte kan stamme fra C 4-exo-konformasjonen fremmet av R-Flp, som er ugunstig av de overordnede proteinstrukturene27. Med Dfp vil feilfoldingen sannsynligvis bli produsert av den reduserte hastigheten til trans-til-cis peptidbindingsisomerisering ved prolinerester27. Sistnevnte er kjent for å være blant de begrensende trinnene i den kinetiske profilen til proteinfoldingen som påvirker β-fatdannelse og påfølgende kromoformodning. Faktisk, for både aminosyrer, R-Flp og Dfp, resulterte proteinproduksjonen i et aggregert og uoppløselig protein. Følgelig kunne kromofordannelse ikke forekomme, og fluorescensen gikk helt tapt. Med S-Flp og Dhp ble det imidlertid observert riktig proteinmodning, noe som resulterte i fluorescerende proteinprøver for hver analog/ proteinkombinasjon. Til tross for noen moduler i proteinets absorbans- og fluorescensegenskaper, forble disse i stor grad lik de av de ville proteinene. Effekten av aminosyrerstatningen ble avslørt i de refoldende kinetikkstudiene. Sistnevnte viste en raskere bretting ved utskifting med S-Flp. Modellstudier har vist at denne resten kan generere en viss forbedring i trans-til-cis midt i rotasjonshastigheten og føre til dannelsen av C 4-endo-konformasjonen. Begge disse faktorene vil sannsynligvis bidra til de gunstige kinetiske effektene av denne resten i EGFP. I motsetning produserte Dhp kinetiske foldeprofiler som maksimalt ligner på foreldreproteinet. Mangfoldet av resultatene produsert av bare atommutasjoner i de undersøkte fluorescerende proteinene illustrerer potensialet i SPI-produksjonsmetoden ved å endre målproteinegenskaper. Proteinendringene forårsaket av proline-erstatning med analogene har ytterligere implikasjoner i konstruksjonen av enzymer 78,79,80 og ionkanaler 81,82, samt generell prosjektering av proteinstabilitet.

Den grunnleggende begrensningen av SPI-metoden er dens "alt-eller-ingen" -modus i utveksling av proline ligger med relaterte analoger. Det ville være til stor fordel å kunne velge nøyaktig hvilke proline rester som skal erstattes med analogene, og hvilke som skal forbli uendret. For tiden er det imidlertid ingen teknikk som kan utføre en så sofistikert produksjon ved hjelp av en mikrobiell produksjonsvert. Kjemisk syntese av proteiner83,84, samt cellefri produksjon85,86, er de to alternative metodene som kan produsere posisjonsspesifikke proline modifikasjoner. Likevel gjør deres operasjonelle kompleksitet og lave produksjonsutbytter dem dårligere sammenlignet med produksjonen i levende celler. Per nå er SPI fortsatt den mest operasjonelt enkle og robuste tilnærmingen for produksjon av komplekse proteiner som bærer atommutasjoner. Ved å introdusere unaturlige aminosyreerstatninger, tillater metoden modifisere proteinegenskaper på en målrettet måte, som eksemplifisert her ved endringer i folding og lysabsorpsjon / utslipp av fluorescerende proteiner generert av proline erstatninger.

Disclosures

Forfatterne avslører alle og eventuelle interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Den tyske forskningsstiftelsen (Cluster of Excellence "Unifying Systems in Catalysis) til T.F. og N.B. og av Federal Ministry of Education and Science (BMBF Program "HSP 2020", TU-WIMIplus Project SynTUBio) til F.-J.S. og T.M.T.T.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile VWR HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642 LC-MS grade required
Acrylamide and bisacrylamide aqueous stock solution at a ratio of 37.5:1 (ROTIPHORESE Gel 30) Carl Roth 3029.1
Agar-agar Carl Roth 5210
Ammonium molybdate ((NH4)2MoO4) Sigma-Aldrich 277908
Ammonium peroxydisulphate (APS) Carl Roth 9592.2 ≥98 %, p.a., ACS grade required
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) Sigma-Aldrich A4418
Ampicillin sodium salt Carl Roth K029
Biotin Sigma-Aldrich B4501
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C5670
Coomassie Brillant Blue R 250 Carl Roth 3862
Copper sulfate (CuSO4) Carl Roth CP86.1
D-glucose Carl Roth 6780
1,2-Bis-(dimethylamino)-ethane, N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Carl Roth 2367.3 ≥99 %, p.a., for electrophoresis
1,4-dithiothreitol (DTT) Carl Roth 6908
Dichloromethane (DCM) Sigma-Aldrich 270997
di-potassium hydrogen phosphate (K2HPO4) Carl Roth P749.1
di-sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4) Carl Roth X987
DNase I Sigma-Aldrich D5025
Dowex 50WX8-100 (hydrogen form) Acros Organics / Thermo Fisher Scientific (Waltham, U.S.A.) 10731181 cation exchange resin
Ethanol Carl Roth 9065.1
Formic acid VWR HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865 LC-MS grade required
Glacial acetic acid Carl Roth 3738.5 100 %, p. a.
Glycerol Carl Roth 3783
Imidazole Carl Roth X998
Hydrogen chlroide (HCl) Merck 295426
Iron(II) chloride (FeCl2) Sigma-Aldrich 380024
Isopropanol Carl Roth AE73.1
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma-Aldrich I6758
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876
Magnesium chloride (MgCl2) Carl Roth KK36.1
Magnesium sulfate (MgSO4) Carl Roth 8283.2
Manganese chloride (MnCl2) Sigma-Aldrich 63535
β-mercaptoethanol Carl Roth 4227.3
PageRuler Unstained Protein Ladder Thermo Fisher Scientific 26614
Potassium chloride (KCl) Carl Roth 6781.3
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5655
RNase A Carl Roth 7156
Sodium chloride (NaCl) Carl Roth P029
Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) Carl Roth T879
Sodium dodecyl sulphate (NaC12H25SO4) Carl Roth 0183
Thiamine Sigma-Aldrich T4625
Trifluoroacetic acid (TFA) Sigma-Aldrich T6508
Tris hydrochloride (Tris-HCl) Sigma-Aldrich 857645
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane (Tris) Carl Roth 5429
Tryptone Carl Roth 8952
Yeast extract Carl Roth 2363
Zinc chloride (ZnCl2) Sigma-Aldrich 229997
L-alanine Sigma-Aldrich A7627
L-arginine Sigma-Aldrich A5006
L-asparagine Sigma-Aldrich A8381
L-aspartic acid Sigma-Aldrich A0884
L-cysteine Sigma-Aldrich C7352
L-glutamic acid Sigma-Aldrich G2128
L-glutamine Sigma-Aldrich G3126
L-glycine Sigma-Aldrich G7126
L-histidine Sigma-Aldrich H8000
L-isoleucine Sigma-Aldrich I2752
L-leucine Sigma-Aldrich L8000
L-lysine Sigma-Aldrich L5501
L-methionine Sigma-Aldrich M9625
L-phenylalanine Sigma-Aldrich P2126
L-proline Sigma-Aldrich P0380
L-serine Sigma-Aldrich S4500
L-threonine Sigma-Aldrich T8625
L-tryptophan Sigma-Aldrich T0254
L-tyrosine Sigma-Aldrich T3754
L-valine Sigma-Aldrich V0500
(4S)-fluoroproline Bachem 4033274 Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression.
(4R)-fluoroproline Bachem 4033275 Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression
3,4-dehydroproline Bachem 4003545 Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression
4,4-difluoroproline Enamine EN400-17448 Make sure that all proline analogs are proline free, check content. Otherwise include a step to consume proline contaminations during expression
Conical polystyrene (Falcon) tubes, 15 mL Fisher Scientific 14-959-49B
Conical polystyrene (Falcon) tubes, 50 mL Fisher Scientific 14-432-22
Dialysis membrane, Molecular Weight Cut-Off (MWCO) 5,000 Spectrum Medical Industries Spectra/Por MWCO 5000 dialysis membrane, 133198
Immobilized Metal ion Affinity Chromatography (IMAC) column 1 mL, Ni-NTA GE Healthcare HisTrap HP, 1 mL, 17-5247-01
Luer-Lock syringe, 5 mL Carl Roth EP96.1
Luer-Lock syringe, 20 mL Carl Roth T550.1
Luer-Lock syringe, 50 mL Carl Roth T552.1
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL Eppendorf 30120086
Petri dishes (polystyrene, sterile) Carl Roth TA19
pQE-80L plasmid vector Qiagen no longer available replaced by N-terminus pQE Vector set Cat No./ID: 32915
Pro-auxotrophic E. coli strain JM83 Addgene 50348 https://www.addgene.org/50348/
Pro-auxotrophic E. coli strain JM83 ATCC 35607
Round-bottom polystyrene tubes, 14 mL Fisher Scientific Corning Falcon, 14-959-1B
Syringe filter 0.45 µm with polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane Carl Roth CCY1.1
High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) column for LC-ESI-TOF-MS Sigma-Aldrich Supelco Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC column, 3 µm particle size, 10 cm x 2.1 mm with conical 0.1 mL glass inserts, screw caps and septa
HPLC autosampler vials 1.5 mL Sigma-Aldrich Supelco 854165
Mass spectrometer for LC-ESI-TOF-MS Agilent Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF
Mass spectrometry data analysis software Agilent MassHunter Qualitative Analysis software v. B.06.00
Benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes Eppendorf 5427 R
Cooling centrifuge for 50 mL Falcon tubes Eppendorf 5810 R
Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system GE Healthcare ÄKTA pure 25 L
Fluorescence spectrometer Perkin Elmer LS 55
High pressure microfluidizer for bacterial cell disruption Microfluidics LM series with “Z” type chamber
Orbital shaker for bacterial cultivation Infors HT Minitron
Peristaltic pump for liquid chromatography (LC) GE Healthcare P-1
Ultrasonic homogenizer for bacterial cell disruption Omnilab Bandelin SONOPULS HD 3200, 5650182 with MS72 sonifier tip
UV-Vis spectrophotometer Biochrom ULTROSPEC 2100
UV-Vis/NIR spectrophotometer Perkin Elmer LAMBDA 950 UV/Vis/NIR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Agostini, F., Völler, J. -S., Koksch, B., Acevedo-Rocha, C. G., Kubyshkin, V., Budisa, N. Biocatalysis with unnatural amino acids: Enzymology meets xenobiology. Angewandte Chemie (International ed. In English). 56 (33), 9680-9703 (2017).
  2. Minks, C., Alefelder, S., Moroder, L., Huber, R., Budisa, N. Towards new protein engineering: In vivo building and folding of protein shuttles for drug delivery and targeting by the selective pressure incorporation (SPI) method. Tetrahedron. 56 (48), 9431-9442 (2000).
  3. Hoesl, M. G., Budisa, N. Expanding and engineering the genetic code in a single expression experiment. Chembiochem: A, European Journal of Chemical Biology. 12 (4), 552-555 (2011).
  4. Wiltschi, B., Budisa, N. Natural history and experimental evolution of the genetic code. Applied Microbiology and Biotechnology. 74 (4), 739-753 (2007).
  5. Hoesl, M. G., et al. Lipase congeners designed by genetic code engineering. ChemCatChem. 3 (1), 213-221 (2011).
  6. FPbase avGFP. , Available from: https://www.fpbase.org/protein/avgfp/ (2011).
  7. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).
  8. Zhang, Y., et al. Identification of genes expressed in C. elegans touch receptor neurons. Nature. 418 (6895), 331-335 (2002).
  9. Misteli, T., Spector, D. L. Applications of the green fluorescent protein in cell biology and biotechnology. Nature Biotechnology. 15 (10), 961-964 (1997).
  10. Hanson, M. R., Köhler, R. H. GFP imaging: methodology and application to investigate cellular compartmentation in plants. Journal of Experimental Botany. 52 (356), 529-539 (2001).
  11. Sakamoto, S., Shoyama, Y., Tanaka, H., Morimoto, S. Application of green fluorescent protein in immunoassays. Advances in Bioscience and Biotechnology. 05 (6), 557-563 (2014).
  12. Akbar, M., Kim, H. Y. Green fluorescent protein tagging: A novel tool in biomedical research. Indian Journal of Biotechnology. 4, 466-470 (2005).
  13. Kobayashi, T., Morone, N., Kashiyama, T., Oyamada, H., Kurebayashi, N., Murayama, T. Engineering a novel multifunctional green fluorescent protein tag for a wide variety of protein research. PloS One. 3 (12), 3822 (2008).
  14. Kent, K. P., Oltrogge, L. M., Boxer, S. G. Synthetic control of green fluorescent protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (44), 15988-15989 (2009).
  15. Born, J., Pfeifer, F. Improved GFP variants to study gene expression in Haloarchaea. Frontiers in Microbiology. 10, 1200 (2019).
  16. Pakhomov, A. A., Martynov, V. I. GFP family: structural insights into spectral tuning. Chemistry & Biology. 15 (8), 755-764 (2008).
  17. Zimmer, M. Green fluorescent protein (GFP): applications, structure, and related photophysical behavior. Chemical Reviews. 102 (3), 759-781 (2002).
  18. Valbuena, F. M., Fitzgerald, I., Strack, R. L., Andruska, N., Smith, L., Glick, B. S. A photostable monomeric superfolder green fluorescent protein. Traffic. 21 (8), Copenhagen, Denmark. 534-544 (2020).
  19. Craggs, T. D. Green fluorescent protein: structure, folding and chromophore maturation. Chemical Society Reviews. 38 (10), 2865-2875 (2009).
  20. Maddalo, S. L., Zimmer, M. The role of the protein matrix in green fluorescent protein fluorescence. Photochemistry and Photobiology. 82 (2), 367-372 (2006).
  21. Cui, G., Lan, Z., Thiel, W. Intramolecular hydrogen bonding plays a crucial role in the photophysics and photochemistry of the GFP chromophore. Journal of the American Chemical Society. 134 (3), 1662-1672 (2012).
  22. Yang, F., Moss, L. G., Phillips, G. N. The molecular structure of green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 14 (10), 1246-1251 (1996).
  23. Andrews, B. T., Roy, M., Jennings, P. A. Chromophore packing leads to hysteresis in GFP. Journal of Molecular Biology. 392 (1), 218-227 (2009).
  24. Xie, J. -B., Zhou, J. -M. Trigger factor assisted folding of green fluorescent protein. Biochemistry. 47 (1), 348-357 (2008).
  25. Steiner, T., Hess, P., Bae, J. H., Wiltschi, B., Moroder, L., Budisa, N. Synthetic biology of proteins: tuning GFPs folding and stability with fluoroproline. PloS One. 3 (3), 1680 (2008).
  26. Andrews, B. T., Schoenfish, A. R., Roy, M., Waldo, G., Jennings, P. A. The rough energy landscape of superfolder GFP is linked to the chromophore. Journal of Molecular Biology. 373 (2), 476-490 (2007).
  27. Kubyshkin, V., Davis, R., Budisa, N. Biochemistry of fluoroprolines: the prospect of making fluorine a bioelement. Beilstein Journal of Organic Chemistry. 17, 439-460 (2021).
  28. Renner, C., Alefelder, S., Bae, J. H., Budisa, N., Huber, R., Moroder, L. Fluoroprolines as tools for protein design and engineering. Angewandte Chemie (International ed. In English). 40 (5), 923-925 (2001).
  29. Fukuda, H., Arai, M., Kuwajima, K. Folding of green fluorescent protein and the cycle3 mutant. Biochemistry. 39 (39), 12025-12032 (2000).
  30. Rosenman, D. J., et al. Green-lighting green fluorescent protein: faster and more efficient folding by eliminating a cis-trans peptide isomerization event. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 23 (4), 400-410 (2014).
  31. Vitagliano, L., Berisio, R., Mastrangelo, A., Mazzarella, L., Zagari, A. Preferred proline puckerings in cis and trans peptide groups: implications for collagen stability. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 10 (12), 2627-2632 (2001).
  32. Kubyshkin, V. Experimental lipophilicity scale for coded and noncoded amino acid residues. Organic and Biomolecular Chemistry. 19 (32), 7031-7040 (2021).
  33. Kubyshkin, V., Budisa, N. cis-trans-Amide isomerism of the 3,4-dehydroproline residue, the 'unpuckered' proline. Beilstein Journal of Organic Chemistry. 12, 589-593 (2016).
  34. Budisa, N. Prolegomena to future experimental efforts on genetic code engineering by expanding its amino acid repertoire. Angewandte Chemie (International ed. In English). 43 (47), 6426-6463 (2004).
  35. Beatty, K. E., Tirrel, D. A. Noncanonical amino acids in protein science and engineering. Protein Engineering. Nucleic Acids and Molecular Biology. 22, Springer. Berlin, Heidelberg. (2009).
  36. Budisa, N. Engineering the Genetic Code: Expanding the Amino Acid Repertoire for the Design of Novel Proteins. , WILEY-VCH. Weinheim. (2006).
  37. Merkel, L., Budisa, N. Organic fluorine as a polypeptide building element: in vivo expression of fluorinated peptides, proteins and proteomes. Organic & Biomolecular Chemistry. 10 (36), 7241-7261 (2012).
  38. van Eldijk, M. B., van Hest, J. C. M. Residue-specific incorporation of non-canonical amino acids for protein engineering. Methods in Molecular Biology. 1728, Clifton, N.J. 137-145 (2018).
  39. Hartman, M. C. T. Non-canonical amino acid substrates of E. coli aminoacyl-tRNA synthetases. Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. , (2021).
  40. Gomez, M. A. R., Ibba, M. Aminoacyl-tRNA synthetases. RNA. 26 (8), 910-936 (2020).
  41. Grant, M. M., Brown, A. S., Corwin, L. M., Troxler, R. F., Franzblau, C. Effect of l-azetidine 2-carboxylic acid on growth and proline metabolism in Escherichia coli. Biochimica et Biophysica Acta. 404 (2), 180-187 (1975).
  42. Budisa, N., Steipe, B., Demange, P., Eckerskorn, C., Kellermann, J., Huber, R. High-level biosynthetic substitution of methionine in proteins by its analogs 2-aminohexanoic acid, selenomethionine, telluromethionine and ethionine in Escherichia coli. European Journal of Biochemistry. 230 (2), 788-796 (1995).
  43. Budisa, N., Pal, P. P. Designing novel spectral classes of proteins with a tryptophan-expanded genetic code. Biological Chemistry. 385 (10), 893-904 (2004).
  44. Hoesl, M. G., Budisa, N. Recent advances in genetic code engineering in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 751-757 (2012).
  45. Nickling, J. H., et al. Antimicrobial peptides produced by selective pressure incorporation of non-canonical amino acids. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57551 (2018).
  46. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).
  47. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).
  48. Sarkisyan, K. S., et al. fluorescent protein with anionic tryptophan-based chromophore and long fluorescence lifetime. Biophysical Journal. 109 (2), 380-389 (2015).
  49. Sarkisyan, K. S., et al. KillerOrange, a genetically encoded photosensitizer activated by blue and green light. PloS One. 10 (12), 0145287 (2015).
  50. Grigorenko, B. L., Krylov, A. I., Nemukhin, A. V. Molecular modeling clarifies the mechanism of chromophore maturation in the green fluorescent protein. Journal of the American Chemical Society. 139 (30), 10239-10249 (2017).
  51. Pletnev, V. Z., et al. Structure of the green fluorescent protein NowGFP with an anionic tryptophan-based chromophore. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 71, Pt 8 1699-1707 (2015).
  52. Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).
  53. Hörnsten, E. G. On culturing Escherichia coli on a mineral salts medium during anaerobic conditions. Bioprocess Engineering. 12 (3), 157-162 (1995).
  54. Davis, B. D. The Isolation of biochemically deficient mutants of bacteria by means of penicillin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 35 (1), 1-10 (1949).
  55. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY, USA. (2001).
  56. Wang, Y. -S., et al. The de novo engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase for genetic incorporation of L-phenylalanine and its derivatives. Molecular bioSystems. 7 (3), 714-717 (2011).
  57. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. ImageJ at (2021).
  58. ImageJ. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/ (2021).
  59. Baumann, T., et al. Engineering 'Golden' fluorescence by selective pressure incorporation of non-canonical amino acids and protein analysis by mass spectrometry and fluorescence. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57017 (2018).
  60. FPbase NowFFP. , Available from: https://www.fpbase.org/protein/nowgfp/ (2021).
  61. Markwardt, M. L., et al. An improved cerulean fluorescent protein with enhanced brightness and reduced reversible photoswitching. PloS One. 6 (3), 17896 (2011).
  62. Gotthard, G., von Stetten, D., Clavel, D., Noirclerc-Savoye, M., Royant, A. Chromophore isomer stabilization is critical to the efficient fluorescence of cyan fluorescent proteins. Biochemistry. 56 (49), 6418-6422 (2017).
  63. Lelimousin, M., et al. Intrinsic dynamics in ECFP and Cerulean control fluorescence quantum yield. Biochemistry. 48 (42), 10038-10046 (2009).
  64. FPbase mKillerOrange. , Available from: https://www.fpbase.org/protein/mkillerorange/ (2021).
  65. Pletneva, N. V., et al. Crystal structure of phototoxic orange fluorescent proteins with a tryptophan-based chromophore. PloS One. 10 (12), 0145740 (2015).
  66. Royant, A., Noirclerc-Savoye, M. Stabilizing role of glutamic acid 222 in the structure of Enhanced Green Fluorescent Protein. Journal of Structural Biology. 174 (2), 385-390 (2011).
  67. Larregola, M., Moore, S., Budisa, N. Congeneric bio-adhesive mussel foot proteins designed by modified prolines revealed a chiral bias in unnatural translation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 421 (4), 646-650 (2012).
  68. Yamaguchi, H., Miyazaki, M. Refolding techniques for recovering biologically active recombinant proteins from inclusion bodies. Biomolecules. 4 (1), 235-251 (2014).
  69. Ghisaidoobe, A. B. T., Chung, S. J. Intrinsic tryptophan fluorescence in the detection and analysis of proteins: A focus on Förster resonance energy transfer techniques. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 22518-22538 (2014).
  70. Pal, P. P., et al. Structural and spectral response of Aequorea victoria green fluorescent proteins to chromophore fluorination. Biochemistry. 44 (10), 3663-3672 (2005).
  71. Pletnev, S., et al. Structural basis for phototoxicity of the genetically encoded photosensitizer KillerRed. The Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 32028-32039 (2009).
  72. Kubyshkin, V., Budisa, N. Anticipating alien cells with alternative genetic codes: away from the alanine world. Current Opinion in Biotechnology. 60, 242-249 (2019).
  73. Minks, C., Huber, R., Moroder, L., Budisa, N. Atomic mutations at the single tryptophan residue of human recombinant annexin V: effects on structure, stability, and activity. Biochemistry. 38 (33), 10649-10659 (1999).
  74. Budisa, N., Huber, R., Golbik, R., Minks, C., Weyher, E., Moroder, L. Atomic mutations in annexin V thermodynamic studies of isomorphous protein variants. European Journal of Biochemistry. 253, 1-9 (1998).
  75. Lin, X., Yu, A. C. S., Chan, T. F. Efforts and challenges in engineering the genetic code. Life. 7, Basel, Switzerland. (2017).
  76. Völler, J. -S., Budisa, N. Coupling genetic code expansion and metabolic engineering for synthetic cells. Current Opinion in Biotechnology. 48, 1-7 (2017).
  77. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annual Review of Biochemistry. 79, 413-444 (2010).
  78. Lukesch, M. S., Pavkov-Keller, T., Gruber, K., Zangger, K., Wiltschi, B. Substituting the catalytic proline of 4-oxalocrotonate tautomerase with non-canonical analogues reveals a finely tuned catalytic system. Scientific Reports. 9 (1), 2697 (2019).
  79. Acevedo-Rocha, C. G., et al. Non-canonical amino acids as a useful synthetic biological tool for lipase-catalysed reactions in hostile environments. Catalysis Science & Technology. 3 (5), 1198 (2013).
  80. Holzberger, B., Marx, A. Replacing 32 proline residues by a non-canonical amino acid results in a highly active DNA polymerase. Journal of the American Chemical Society. 132 (44), 15708-15713 (2010).
  81. Mosesso, R., Dougherty, D. A., Lummis, S. C. R. Proline residues in the transmembrane/extracellular domain interface loops have different behaviors in 5-HT3 and nACh receptors. ACS Chemical Neuroscience. 10 (7), 3327-3333 (2019).
  82. Mosesso, R., Dougherty, D. A., Lummis, S. C. R. Probing proline residues in the prokaryotic ligand-gated ion channel, ELIC. Biochemistry. 57 (27), 4036-4043 (2018).
  83. Torbeev, V. Deciphering protein folding using chemical protein synthesis. Total Chemical Synthesis of Proteins. 1st ed. , WILEY-VCH. Weinheim. (2021).
  84. Torbeev, V. Y., Hilvert, D. Both the cis-trans equilibrium and isomerization dynamics of a single proline amide modulate β2-microglobulin amyloid assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20051-20056 (2013).
  85. Kawakami, T., Ishizawa, T., Murakami, H. Extensive reprogramming of the genetic code for genetically encoded synthesis of highly N-alkylated polycyclic peptidomimetics. Journal of the American Chemical Society. 135 (33), 12297-12304 (2013).
  86. Cui, Z., Johnston, W. A., Alexandrov, K. Cell-free approach for non-canonical amino acids incorporation into polypeptides. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 1031 (2020).

Tags

Bioengineering Utgave 180 ikke-kanoniske aminosyrer prolineanaloger selektiv trykkinkorporering proteinfolding sammenleggbare kinetikk proteinstabilitet
Rester-spesifikk utveksling av proline av proline analoger i fluorescerende proteiner: Hvordan "molekylær kirurgi" av ryggraden påvirker folding og stabilitet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thi To, T. M., Kubyshkin, V.,… More

Thi To, T. M., Kubyshkin, V., Schmitt, F. J., Budisa, N., Friedrich, T. Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability. J. Vis. Exp. (180), e63320, doi:10.3791/63320 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter