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Biology

प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए संयंत्र ऊतकों का ऑप्टिकल समाशोधन

Published: January 5, 2022 doi: 10.3791/63428
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1,3, 1,3,4
1Institute of Transformative Bio-Molecules (ITbM), Nagoya University, 2Institute for Advanced Research (IAR), Nagoya University, 3Division of Biological Science, Graduate School of Science, Nagoya University, 4Department of Biological Sciences, Graduate School of Science, The University of Tokyo

Summary

यहां, फ्लोरोसेंट प्रोटीन की स्थिरता को बनाए रखते हुए पौधे के ऊतकों को पारदर्शी बनाने के लिए एक विधि का वर्णन किया गया है। यह तकनीक भौतिक विभाजन के बिना साफ किए गए पौधे के ऊतकों की गहरी इमेजिंग की सुविधा प्रदान करती है।

Abstract

माइक्रोस्कोप के तहत विच्छेदन के बिना, बहु-स्तरित और अपारदर्शी पौधे के नमूनों की आंतरिक संरचना का सीधे निरीक्षण करना चुनौतीपूर्ण है। इसके अलावा, क्लोरोफिल के लिए जिम्मेदार ऑटोफ्लोरेसेंस पौधों में फ्लोरोसेंट प्रोटीन के अवलोकन में बाधा डालता है। लंबे समय से, पौधों को पारदर्शी बनाने के लिए विभिन्न समाशोधन अभिकर्मकों का उपयोग किया गया है। हालांकि, पारंपरिक समाशोधन अभिकर्मक फ्लोरोसेंट संकेतों को कम करते हैं; इसलिए, फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ सेलुलर और इंट्रासेल्युलर संरचनाओं का निरीक्षण करना संभव नहीं है। अभिकर्मकों को विकसित किया गया था जो फ्लोरोसेंट प्रोटीन स्थिरता को बनाए रखते हुए क्लोरोफिल को हटाकर पौधे के ऊतकों को साफ कर सकते हैं। समाशोधन अभिकर्मकों, ClearSee (CS) या ClearSeeAlpha (CSA) का उपयोग करके पौधे के ऊतकों के ऑप्टिकल समाशोधन के लिए यहां एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है। साफ किए गए पौधे के ऊतकों की तैयारी में तीन चरण शामिल हैं: निर्धारण, धोना और समाशोधन। निर्धारण सेलुलर संरचनाओं और फ्लोरोसेंट प्रोटीन की इंट्रासेल्युलर स्थिरता को बनाए रखने में एक महत्वपूर्ण कदम है। समाशोधन के लिए इनक्यूबेशन समय ऊतक प्रकार और प्रजातियों पर निर्भर करता है। Arabidopsis thaliana में, सीएस के साथ समाशोधन के लिए आवश्यक समय पत्तियों और जड़ों के लिए 4 दिन, रोपाई के लिए 7 दिन, और pistils के लिए 1 महीने था। सीएस को 4 दिनों के अपेक्षाकृत कम समय की भी आवश्यकता होती है ताकि Physcomitrium patens के गैमेटोफाइटिक पत्तियों को पारदर्शी बनाया जा सके। इसके विपरीत, तंबाकू और टोरेनिया में पिस्टिल्स ने सीएस उपचार के दौरान ऑक्सीकरण के कारण भूरे रंग के वर्णक का उत्पादन किया। सीएसए ने ऑक्सीकरण को रोककर भूरे रंग के वर्णक को कम कर दिया और तंबाकू और टोरेनिया पिस्टिल्स को पारदर्शी बना सकता है, हालांकि इसमें अपेक्षाकृत लंबा समय (1 या 2 महीने) लगा। सीएस और सीएसए भी रासायनिक रंगों का उपयोग करके धुंधला करने के साथ संगत थे, जैसे कि डीएपीआई (4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलइंडोल) और डीएनए और कैलकोफ्लोर व्हाइट के लिए होचस्ट 33342, एसआर 2200, और सेल की दीवार के लिए डायरेक्ट रेड 23। यह विधि पूरे पौधे इमेजिंग के लिए उपयोगी हो सकती है ताकि बरकरार आकृति विज्ञान, विकास प्रक्रियाओं, पौधे-माइक्रोब इंटरैक्शन और नेमाटोड संक्रमण को प्रकट किया जा सके।

Introduction

सेलुलर संरचनाओं का विज़ुअलाइज़ेशन और जीवित जीवों में प्रोटीन का स्थानीयकरण विवो में उनके कार्यों को स्पष्ट करने के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, चूंकि जीवित शरीर पारदर्शी नहीं है, इसलिए विच्छेदन के बिना जीवित जीवों की आंतरिक संरचना का निरीक्षण करना चुनौतीपूर्ण है। विशेष रूप से, पौधे के ऊतकों के मामले में, जो विभिन्न आकारों की कोशिकाओं के साथ बहु-स्तरित होते हैं, उनकी संरचना और प्रकाश-अवशोषित वर्णकों की उपस्थिति के कारण सूचकांक बेमेल समस्याग्रस्त है। उदाहरण के लिए, पौधे की पत्तियों में एक जटिल संरचना होती है जो उन्हें प्रकाश संश्लेषण के लिए उनके शरीर में प्रवेश करने वाले प्रकाश का कुशलतापूर्वक उपयोग करने की अनुमति देती है1, जबकि संरचना अपवर्तक सूचकांक बेमेल का कारण भी बनती है, जिससे उन्हें निरीक्षण करना मुश्किल हो जाता है। हालांकि, पत्तियों में कई प्रकाश-अवशोषित वर्णक होते हैं, जैसे कि क्लोरोफिल, जो मजबूत लाल प्रतिदीप्ति का उत्सर्जन करते हैं और भूरे रंग के पिगमेंट ऑक्सीकरण 2,3 द्वारा उत्पादित होते हैं। ये पिगमेंट पौधों में पूरे-माउंट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी टिप्पणियों में भी बाधा डालते हैं। इसलिए, पौधों की आंतरिक संरचना का निरीक्षण करने के लिए, अल्कोहल द्वारा डिकॉलोराइजेशन और फिक्सेशन और क्लोरल हाइड्रेट का उपयोग करके समाशोधन का उपयोग अपवर्तक सूचकांक बेमेल और ऑटोफ्लोरेसेंस 4,5 को खत्म करने के लिए लंबे समय से किया गया है। इन पारंपरिक तरीकों को कई वर्षों से अपनाया गया है, लेकिन उनके पास एक ही समय में फ्लोरोसेंट प्रोटीन के प्रतिदीप्ति को समाप्त करने का दोष है6,7। यह समस्याग्रस्त है क्योंकि फ्लोरोसेंट प्रोटीन वर्तमान फ्लोरोसेंट इमेजिंग में अपरिहार्य हो गए हैं।

इसलिए, ClearSee (CS) और ClearSeeAlpha (CSA) को पौधे के ऊतकों के लिए ऑप्टिकल समाशोधन अभिकर्मकों के रूप में विकसित किया गया है। दोनों अभिकर्मक फ्लोरोसेंट प्रोटीन की स्थिरता को बनाए रखते हुए क्लोरोफिल ऑटोफ्लोरेसेंस को कम करते हैं7,8। सीएसए विशेष रूप से उपयोगी होता है जब ऊतक ऑक्सीकरण के कारण भूरे रंग के पिगमेंट का उत्पादन होता है। इन समाशोधन अभिकर्मकों का उपयोग करके, भौतिक विभाजन के बिना पौधे के शरीर के अंदर सेलुलर संरचना और प्रोटीन स्थानीयकरण का निरीक्षण करना संभव है।

Protocol

1. समाशोधन समाधान की तैयारी

  1. सीएस समाधान तैयार करने के लिए, एक चुंबकीय हलचल पर आसुत पानी में 10% (डब्ल्यू / वी) xylitol, 15% (डब्ल्यू / वी) सोडियम डीऑक्सीकोलेट, और 25% (डब्ल्यू / वी) यूरिया को भंग करें।
    नोट: सोडियम deoxycholate पाउडर एक मसौदा कक्ष में तौला जाना चाहिए के रूप में यह आसानी से हवा में तैरता है. सीएस को 1 वर्ष से अधिक समय तक अंधेरे में कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. सीएसए समाधान तैयार करने के लिए, ऊपर प्राप्त सीएस समाधान में सोडियम सल्फाइट (50 एमएम अंतिम एकाग्रता) जोड़ें।
    नोट:: कम करने वाले एजेंट आसानी से निष्क्रिय हो जाता है के रूप में उपयोग करने से पहले सही सीएस समाधान के लिए सोडियम sulfite जोड़ें।

2. फिक्सेटिव समाधान की तैयारी

  1. एक शंक्वाकार ट्यूब में 40 मिलीलीटर निष्फल पानी स्थानांतरित करें और पैराफॉर्मेल्डिहाइड के 2 ग्राम जोड़ें। समाधान के पीएच को बढ़ाने के लिए 2 N NaOH के 200 μL जोड़ें। पैराफिल्म के साथ ट्यूब को बंद करने और सील करने के बाद, 60 डिग्री सेल्सियस पर कभी-कभी इनवर्सन के साथ इनक्यूबेट करें जब तक कि सब कुछ भंग न हो जाए।
  2. कमरे के तापमान पर समाधान को ठंडा करने के बाद, पीएच को 7.4 पर समायोजित करने के लिए 10x फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पीबीएस) का 5 मिलीलीटर जोड़ें। 50 मिलीलीटर की मात्रा बनाने के लिए निष्फल पानी जोड़ें।
    नोट: एक ताजा तैयार fixative समाधान पसंद किया जाता है। समाधान को कई महीनों के लिए -30 डिग्री सेल्सियस पर भी संग्रहीत किया जा सकता है।

3. नमूनों का निर्धारण

  1. एक माइक्रोट्यूब (चित्रा 1A) में फिक्सेटिव समाधान में पौधे के नमूनों को विसर्जित करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि फिक्सेटिव समाधान की मात्रा नमूना मात्रा से पांच गुना से अधिक है।
  2. एक पैराफिल्म के साथ माइक्रोट्यूब को सील करें और एक सुई का उपयोग करके छेद करें। वैक्यूम अपघटन के दौरान नमूना फैलाव के जोखिम के कारण ट्यूब को खुला न छोड़ें।
  3. माइक्रोट्यूब को एक desiccator में रखें और धीरे-धीरे वैक्यूम (~ 690 mmHg) की डिग्री को समायोजित करें ताकि बुलबुले नमूनों से धीरे-धीरे दिखाई दें (चित्रा 1 B-C)। desiccator खाली करने के बाद वैक्यूम पंप बंद कर दें। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए माइक्रोट्यूब को अबाधित छोड़ दें।
  4. नमूनों को परेशान करने से रोकने के लिए desiccator ध्यान से वेंट. वैक्यूम पंप को फिर से चालू करें और डेसिकेटर को खाली करने के बाद इसे बंद कर दें। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए माइक्रोट्यूब को अबाधित छोड़ दें।
    नोट: desiccator venting करते समय नमूनों को नुकसान को रोकने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। नमूनों में फिक्सेटिव समाधान के प्रवेश को दो वैक्यूम उपचारों द्वारा बढ़ाया जाता है। आगे वैक्यूम उपचार मोटे नमूनों में फिक्सेटिव समाधान को भेदने में मदद करता है।
  5. माइक्रोट्यूब में फिक्सेटिव समाधान को टक्कर दिए बिना desiccator को ध्यान से खोलें। एक micropipette का उपयोग कर, fixative समाधान निकालें और 1x PBS जोड़ें। 1 मिनट के लिए संग्रहीत करने के बाद, पुराने पीबीएस को नए 1x पीबीएस (चित्रा 1 डी) के साथ बदलें।

4. समाशोधन

  1. PBS को निकालने के बाद, समाशोधन समाधान का नमूना वॉल्यूम पांच गुना जोड़ें।
  2. पैराफिल्म के साथ माइक्रोट्यूब को सील करें और एक सुई का उपयोग करके छेद करें। नमूनों को desiccator में रखें, चरण 3.3 के रूप में खाली करें, और वैक्यूम पंप को बंद कर दें। कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए माइक्रोट्यूब को अबाधित छोड़ दें।
  3. desiccator को धीरे से खोलें। पैराफिल्म के साथ माइक्रोट्यूब को बंद करें और फ्लोरोसेंट प्रोटीन के फोटोब्लीचिंग से बचने के लिए इसे अंधेरे में कमरे के तापमान पर स्टोर करें। समाशोधन प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए हर 1-2 दिनों में माइक्रोट्यूब को उलटें।
  4. जब समाशोधन समाधान हरा हो जाता है, तो इसे नए समाशोधन समाधानों के साथ तब तक बदलें जब तक कि समाधान रंगहीन न हो जाए (चित्रा 1E-H)।

Figure 1
चित्रा 1: सीएस उपचार के लिए प्रक्रिया( ए) 4% पीएफए (पैराफॉर्मल्डिहाइड) समाधान में एराबिडोप्सिस अंकुर। (बी) नमूने को एक डेसिकेटर में रखा जाता है। (c) अंकुर एक निर्वात के तहत तय किया गया है। (डी) अंकुर को वैक्यूम उपचार के बाद पीएफए समाधान में भिगोया जाता है। (ई) परिणामस्वरूप 3-दिवसीय समाशोधन समाधान-उपचारित अंकुर। समाशोधन समाधान के हरे रंग पर ध्यान दें। (एफ) समाशोधन समाधान उपचार के 3 दिन बाद बदल दिया जाता है। (जी) जिसके परिणामस्वरूप 5-दिवसीय समाशोधन समाधान-उपचारित अंकुर। (एच) समाशोधन समाधान उपचार के 5 दिनों के बाद बदल दिया जाता है। स्केल बार: 1 सेमी (ए, सी-एच) और 5 सेमी (बी)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

5. रासायनिक डाई धुंधला

  1. माइक्रोट्यूब के लिए, परमाणु धुंधला या कैलकोफ्लोर व्हाइट (1 मिलीग्राम / एमएल की अंतिम एकाग्रता) के लिए होचस्ट 33342 (10 μg / mL की अंतिम एकाग्रता) जोड़ें सेल दीवार धुंधला करने के लिए और 1 घंटे के लिए प्रतीक्षा करें। डाई समाधान को हटाने के बाद, 1 घंटे के लिए एक ताजा समाशोधन समाधान के साथ नमूने को धो लें।
    नोट: रात भर धुंधला और धोने ऊतकों में फ्लोरोसेंट डाई प्रवेश में सुधार कर सकते हैं और पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को कम कर सकते हैं। विभिन्न फ्लोरोसेंट रंजक सीएस समाधान के साथ संगत हैं जैसे कि बेसिक फ्यूचसिन 9 (लिग्निन), ऑरामाइन ओ 9 (लिग्निन, सुबेरिन, और क्यूटिन), नील रेड 9 (सुबेरिन), डायरेक्ट येलो 969, डायरेक्ट रेड 239, और एसआर 220010,11 (सेल दीवारें)।

6. अवलोकन

  1. स्पेसर के लिए एक फ्रेम तैयार करने के लिए एक रेजर ब्लेड के साथ सिलिकॉन रबर शीट काटें (चित्रा 2 ए)।
    नोट:: नमूने की मोटाई के अनुसार सिलिकॉन रबर शीट की मोटाई समायोजित करें। चूंकि समाशोधन समाधान के साथ इलाज किए गए नमूने नरम होते हैं, इसलिए यदि वे सीधे कवर ग्लास के साथ कवर किए जाते हैं तो वे क्षतिग्रस्त हो जाएंगे।
  2. कवर ग्लास पर सिलिकॉन फ्रेम रखें (उदाहरण के लिए, 25 x 60 मिमी) (चित्रा 2 बी)। फ्रेम के भीतर इलाज किए गए नमूनों को रखें और फ्रेम में किसी भी बुलबुले को हटाने के लिए समाशोधन समाधान के ~ 100 μL जोड़ें। समाशोधन समाधान (चित्रा 2 सी) के वाष्पीकरण को रोकने के लिए एक और कवर ग्लास (18 x 18 मिमी या 24 x 24 मिमी) के साथ कवर करें।
  3. एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत नमूनों का निरीक्षण करें। अवलोकन के बाद, नमूनों को माइक्रोट्यूब में लिए गए समाशोधन समाधान पर वापस करें और अंधेरे में कमरे के तापमान पर स्टोर करें।

Figure 2
चित्र 2: माइक्रोस्कोपिक अवलोकन के लिए नमूना तैयारी। (A) एक फ्रेम में एक 0.2 मिमी मोटी सिलिकॉन शीट काटें। (बी) कवर ग्लास पर सिलिकॉन शीट फ्रेम रखो। (सी) फ्रेम के भीतर समाशोधन समाधान (बिंदीदार सीमा द्वारा चिह्नित) के साथ इलाज किए गए नमूने को रखें और इसे कवर ग्लास के साथ कवर करें। स्केल सलाखों: 5 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Representative Results

सीएस विभिन्न प्रजातियों की पत्तियों को साफ कर सकता है (चित्रा 3 ए-एच)। सीएस समाधान के लिए चावल की पत्ती में प्रवेश करना मुश्किल है क्योंकि पत्ती की सतह इस पौधे में क्यूटिकुलर मोम द्वारा कवर की जाती है। हालांकि, 10 सेकंड के लिए क्लोरोफॉर्म में डुबकी लगाकर क्यूटिकुलर मोम को निकालने के बाद, सीएस चावल के पत्तों को साफ कर सकता है (चित्रा 3 एच)। सीएस, हालांकि, Chamaecyparis obtusa पत्तियों में प्रवेश नहीं कर सका जो सीएस (चित्रा 3I, J) के लिए कम पारगम्य हैं। क्रिसेंथेमम पत्तियों में, पॉलीफेनोल ऑक्सीकरण द्वारा प्रेरित भूरे रंग का रंजकता सीएस-उपचारित पत्तियों (चित्रा 3K, एल) में देखा गया था। इसी तरह, तम्बाकू और टोरेनिया पिस्टिल्स ने सीएस उपचार के दौरान भूरे रंग का रंजकता दिखाया (चित्रा 3 एम, ओ)। चूंकि सीएसए में सोडियम सल्फाइट घटक कम करने वाले प्रभाव के कारण पॉलीफेनोल ऑक्सीकरण को रोकता है, इसलिए सीएसए किसी भी भूरे रंग के रंजकता के बिना तंबाकू और टोरेनिया पिस्टिल्स को साफ कर सकता है (चित्रा 3 एन, पी)।

आंकड़े 4 बी से पता चलता है कि सीएस उपचार ने Arabidopsis H2B-mClover पत्ती (उज्ज्वल क्षेत्र) के पीले हरे रंग को कम कर दिया और PBS इनक्यूबेशन (चित्रा 4A) की तुलना में H2B-mClover की प्रतिदीप्ति तीव्रता को बढ़ाया। फूलों के पौधों के अलावा, सीएस काई पौधों पर भी लागू होता है (चित्रा 4 सी); सीएस उपचार के 4 दिनों के बाद, एच 2 बी-एमआरएफपी की प्रतिदीप्ति को स्पष्ट रूप से कम क्लोरोफिल ऑटोफ्लोरेसेंस के साथ पूरे गेम्टोफोर के लिए पाया गया था। आंकड़े 4 डी, ई H2B-mClover pistil के 3 डी पुनर्निर्माण छवियों को Nicotiana benthamiana में सीएसए का उपयोग करके साफ कर दिया दिखाने के लिए। नमूना गहराई 440 μm था। जैसा कि गहराई-कोडित अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण छवि से पता चलता है, सीएसए चुनौतीपूर्ण ऊतकों की गहरी इमेजिंग के लिए अनुमति देता है, जैसे कि तम्बाकू पिस्टिल।

सीएस और सीएसए भी फ्लोरोसेंट डाई धुंधला के साथ संगत थे। चित्रा 5 से पता चलता है कि सीएस का उपयोग एक साथ फ्लोरोसेंट प्रोटीन (H2B-mClover) और कार्बनिक फ्लोरोसेंट डाई स्टेनिंग (Calcofluor White) का निरीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। जेड-स्टैक छवियों से 3 डी पुनर्निर्माण के बाद, किसी भी अनुभाग को देखा जा सकता है।

Figure 3
चित्र 3: समाशोधन समाधानों का उपयोग करके पत्तियों और पिस्टिलों का ऑप्टिकल समाशोधन। (A-L) विभिन्न प्रजातियों की निश्चित पत्तियों को PBS (A, C, E, G, I, K) या CS (B, D, F, H, J, L) में 8 दिनों के लिए और CS (M, O) या CSA (N,P) में 2 दिनों के लिए इनक्यूबेट किया गया था। (A, B, O, P) Torenia fournieri, (सी, डी) Nicotiana tabacum, (ई, एफ) Cucumis sativus, (जी, एच) Oryza sativa, (मैं, जे) Chamaecyparis obtusa, (के, एल) क्रिसेंथेमम मोरिफोलियम, (एम, एन) Nicotiana benthamiana. स्केल सलाखों: 1 सेमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: क्लियरिंग समाधानों के साथ इलाज किए गए ऊतकों की प्रतिदीप्ति इमेजिंग( A,B) UBQ10pro:::Arabidopsis thaliana के H2B-mClover पत्तियों को 3 दिनों के लिए PBS (A) या CS (B) के साथ इलाज किया गया था। (सी) Physcomitrium patens के H2B-mRFP पत्तेदार gametophores 4 दिनों के लिए सीएस के साथ इलाज किया गया था। नाभिक को H2B-mRFP (हरे रंग) के साथ लेबल किया गया था। सीएस उपचार ने क्लोरोफिल ऑटोफ्लोरेसेंस (मैजेंटा) को कम कर दिया। एपिकल क्षेत्र में H2B-mRFP सिग्नल को H2B-mRFP और autofluorescence या उज्ज्वल क्षेत्र दोनों की विलय की गई छवियों के लिए स्पष्ट रूप से देखा गया था। (D,E) UBQ10pro::H2B-mClover कलंक Nicotiana benthamiana 1 महीने के लिए सीएसए में इलाज किया गया था। अधिकतम-तीव्रता प्रक्षेपण (डी) और गहराई-कोडित अधिकतम-तीव्रता प्रक्षेपण (ई) 5 μm अंतराल पर 88 z-स्टैक छवियों से उत्पन्न किए गए थे। स्केल सलाखों: 100 μm. छवियों को वाइड-फील्ड (ए, बी), कॉन्फोकल (सी), और दो-फोटॉन उत्तेजना (डी, ई) माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके लिया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: फ्लोरोसेंट डाई धुंधला सीएस के साथ संगत है. (ए) सीएस-उपचारित पत्तियां 950 एनएम उत्तेजना के साथ दो-फोटॉन उत्तेजना माइक्रोस्कोपी द्वारा देखी गई हैं। सेल की दीवार Calcofluor White (cyan) के साथ दागदार है। नाभिक को UBQ10pro::H2B-mClover (पीला) के साथ लेबल किया गया है। yz (B) और xz (C) छवियाँ (A) में सफेद धराशायी रेखाओं द्वारा इंगित स्थिति पर क्रॉस-सेक्शन हैं। स्केल बार: 100 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: सोडियम deoxycholate की पारदर्शिता. (A) विभिन्न 15% सोडियम deoxycholates के रंग ( सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध). (बी) 380 एनएम उत्तेजना के साथ प्रत्येक 15% सोडियम डीऑक्सीकोलेट का प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

इस विधि में निर्धारण, धोने और सफाई शामिल है। निर्धारण इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम है। यदि पीएफए निर्धारण के बाद फ्लोरोसेंट प्रोटीन का पालन नहीं किया जाता है, तो इसे समाशोधन समाधान के साथ उपचार के बाद नहीं देखा जाएगा। ऊतकों में पीएफए समाधान का प्रवेश महत्वपूर्ण है, लेकिन उच्च वैक्यूम उपचार की सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि यह सेल संरचना को नष्ट कर सकता है। वैक्यूम की स्थिति और निर्धारण अवधि को प्रत्येक प्रकार के ऊतकों और प्रजातियों के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। निर्धारण के बाद भी फ्लोरोसेंट प्रोटीन की जांच करने की सिफारिश की जाती है। हालांकि नमूने आमतौर पर कमरे के तापमान पर 30-60 मिनट के लिए तय किए गए थे, उन्हें लंबे समय तक (रात भर या अधिक) के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर तय किया जा सकता है।

जैसा कि चित्र 6 ए में दिखाया गया है, कुछ सोडियम डीऑक्सीकोलेट्स में भंग होने पर एक पीला-पीला रंग था। इस तरह के सोडियम डीऑक्सीकोलेट समाधानों ने 380 एनएम (चित्रा 6 बी) पर उत्तेजना के बाद 400-600 एनएम क्षेत्र में मजबूत ऑटोफ्लोरेसेंस दिखाया। यह autofluorescence ऑप्टिकल समाशोधन और प्रतिदीप्ति इमेजिंग को रोकता है। उपयोगकर्ताओं को सोडियम डीऑक्सीकोलेट समाधान के रंग की जांच करनी चाहिए क्योंकि अभिकर्मक की गुणवत्ता शुद्धता, बहुत-से-बहुत भिन्नता, या अन्य कारणों से भिन्न हो सकती है।

यहां उपयोग किए जाने वाले समाशोधन समाधानों में सोडियम डीऑक्सीकोलेट की उच्च सांद्रता होती है, जो झिल्ली संरचना को नष्ट कर सकती है। प्लाज्मा झिल्ली मार्कर (RPS5Apro::tdTomato-LTI6b) सीएस उपचार 7 के बाद भी मनाया गया था। हालांकि, ब्याज की संरचना और ऊतक के आधार पर सोडियम डीऑक्सीकोलेट की एकाग्रता को कम करना बेहतर हो सकता है। दरअसल, संशोधित सीएस के साथ Arabidopsis pistils के लिए बेहतर स्पष्टता के साथ छवियों को प्राप्त किया गया था, जिसमें सोडियम डीऑक्सीकोलेट की एकाग्रता आधे से कम हो जाती है; हालांकि, सोडियम डीऑक्सीकोलेट की कम सांद्रता को लंबे समय तक उपचार के समय की आवश्यकता होती है (उदाहरण के लिए, Arabidopsis pistils के लिए 1 महीना)।

सीएस उपचारित नमूनों में क्लोरोफिल को हटाने के लिए लाल ऑटोफ्लोरेसेंस (>610 एनएम) को कम कर सकता है। हालांकि, 500-600 एनएम रेंज ऑटोफ्लोरेसेंस (पीले से नारंगी) सीएस-उपचारित नमूनों में भी बने रहे। माना जाता है कि यह ऑटोफ्लोरेसेंस सेल की दीवार और अन्य सेलुलर घटकों से व्युत्पन्न है, जैसे कि लिग्निन 12,13। इसलिए, ऊतकों को बनाना मुश्किल है, जैसे कि विकसित माध्यमिक दीवारों के साथ उपजी, सीएस उपचार द्वारा पूरी तरह से पारदर्शी।

फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी 14,15,16,17 का उपयोग करके पौधों में फ्लोरोसेंट प्रोटीन का निरीक्षण करने के लिए यहां उपयोग किए जाने वाले लोगों के अलावा कई समाशोधन अभिकर्मकों को विकसित किया गया है। इन तरीकों की तुलना में, सीएस और सीएसए क्लोरोफिल को हटा देते हैं और ऑटोफ्लोरेसेंस को कम करते हैं, जिससे पौधे के ऊतक अधिक पारदर्शी हो जाते हैं। हाल ही में, सकामोटो एट अल ने एक बेहतर विधि, iTOMEI, निर्धारण, डिटर्जेंट समाशोधन और अपवर्तक सूचकांक बेमेल 18 को समायोजित करने के लिए बढ़ते के लिए विकसित की। Arabidopsis रोपाई में, iTOMEI ने 26 घंटे के भीतर ऊतक को साफ कर दिया।

सीएस पौधों की प्रजातियों की एक विस्तृत श्रृंखला पर लागू होता है, जैसे कि Arabidopsis thaliana, Physcomitrium patens7, Chrysanthemum morifolium, Cucumis sativus, Nicotiana benthamiana, Nicotiana tabacum, Torenia fournieri8, Allium ochotense19, Astragalus sinicus20, avocado21, barley22, Brasica rapa23, Callitriche 24, नीलगिरी 25, मक्का 26, Marchantia polymorpha27, Monophyllaea glabra28, Orobanche minor29, petunia30, rice31, Solanum lycopersicum32, सोयाबीन 33, स्ट्रॉबेरी 34, wheat35, और Wolffiella hyalina36. मोटे ऊतकों के लिए, सीएस भी वाइब्रेटोम वर्गों को पारदर्शी 37,38 बना सकता है। इस विधि ने पौधों में सेलुलर संरचना और जीन अभिव्यक्ति पैटर्न के अध्ययन की अनुमति दी37,38। इसके अलावा, नेमाटोड संक्रमण 20,39, फंगल संक्रमण, और सहजीवन 19,40,41 भी सीएस-उपचारित ऊतकों के अंदर गहराई से देखे गए थे। इस प्रकार, यह विधि माइक्रो से मैक्रो-स्केल तक पूरे ऊतक इमेजिंग के लिए उपयोगी है और विभिन्न कोशिकाओं, ऊतकों, अंगों और जीवों के बीच उपन्यास इंटरैक्शन की खोज करने में मदद कर सकती है।

Disclosures

ClearSee का व्यावसायीकरण किया गया है (Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation, Japan)। Nagoya University एक पेटेंट (JP6601842) समाशोधन अभिकर्मक ClearSee पर रखती है। D. Kurihara पेटेंट आविष्कारक है। लेखकों ने कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस काम को विज्ञान के संवर्धन के लिए जापान सोसायटी (अभिनव क्षेत्रों पर वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए अनुदान-इन-एड (JP16H06464, JP16H06280 से T.H.), वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए अनुदान-इन-एड (B, JP17H03697 से D.K.), चुनौतीपूर्ण अन्वेषणात्मक अनुसंधान के लिए अनुदान-इन-एड (JP18K19331 से D.K.), वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए अनुदान-इन-एड (JP18K19331 से D.K.), वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए अनुदान-इन-एड (JP18K19331 से D.K.), वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए अनुदान-इन-एड (JP18K19331) द्वारा समर्थित किया गया था.M। JPMJPR18K4 से D.K.)) लेखक अंग्रेजी भाषा संपादन के लिए सूक्ष्म अध्ययन और संपादन (www.editage.com) का समर्थन करने के लिए नागोया विश्वविद्यालय के इंस्टीट्यूट ऑफ ट्रांसफॉर्मेटिव बायो-मॉलिक्यूल्स (डब्ल्यूपीआई-आईटीबीएम) में लाइव इमेजिंग सेंटर के आभारी हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Calcofluor White Sigma-Aldrich F3543 Fluorescent Brightener 28; 100 mg/mL in H2O
ClearSee 10% (w/v) xylitol, 15% (w/v) sodium deoxycholate, 25% (w/v) urea
Cover glass (18×18 No.1) MATSUNAMI C018181
Cover glass (24×24 No.1) MATSUNAMI C024241
Cover glass (25×60 No.1) MATSUNAMI C025601
Desiccator AS One 1-5801-11
Hoechst 33342 DOJINDO 346-07951 1 mg/mL in H2O
Needle TERUMO NN-2238S
Parafilm Bemis PM-996
Paraformaldehyde Nacalai Tesque 26126-25
Phosphate buffered saline, pH 7.4
Silicone rubber sheet AS One 6-9085-12
Sodium deoxycholate Tokyo Chemical Industry C0316 Figure 6_1; Lot PSGYK-QB
Sodium deoxycholate Kishida Chemical 260-71412 Figure 6_2; Lot C05543H
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750 Figure 6_3; Lot SLBS7362
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich 30970 Figure 6_4; Lot BCBW0612
Sodium deoxycholate Nacalai Tesque 10712-96 Figure 6_5; Lot M5R3403
Sodium deoxycholate FUJIFILM Wako Pure Chemical 194-08311 Figure 6_6; Lot LKL0648
Sodium hydroxide Nacalai Tesque 31511-05
Sodium sulphite FUJIFILM Wako Pure Chemical 190-03411
Urea FUJIFILM Wako Pure Chemical 211-01213
Vacuum pump BUCHI V-700
Xylitol FUJIFILM Wako Pure Chemical 248-00545

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Kurihara, D., Mizuta, Y., Nagahara, S., Sato, Y., Higashiyama, T. Optical Clearing of Plant Tissues for Fluorescence Imaging. J. Vis. Exp. (179), e63428, doi:10.3791/63428 (2022).

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