Метод очистки тканей для визуализации нейронов от мезоскопических до микроскопических масштабов

Kenta Yamauchi; Shinichiro Okamoto; Megumu Takahashi; Masato Koike; Takahiro Furuta; Hiroyuki Hioki

doi:10.3791/63941

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Метод очистки тканей для визуализации нейронов от мезоскопических до микроскопических масштабов

3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63941

⸱

10 мая 2022 г.

Kenta Yamauchi¹^,² , Shinichiro Okamoto¹^,²^,³ , Megumu Takahashi¹^,²^,⁴^,⁵ , Masato Koike²^,³ , Takahiro Furuta⁶ , Hiroyuki Hioki¹^,²^,⁷

¹Department of Neuroanatomy, Juntendo University Graduate School of Medicine, ²Department of Cell Biology and Neuroscience, Juntendo University Graduate School of Medicine, ³Advanced Research Institute for Health Sciences, Juntendo University, ⁴Department of Neuroscience, Graduate School of Medicine, Kyoto University, ⁵Japan Society for the Promotion of Science, ⁶Department of Oral Anatomy and Neurobiology, Graduate School of Dentistry, Osaka University, ⁷Department of Multi-Scale Brain Structure Imaging, Juntendo University Graduate School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Протокол предоставляет подробный метод визуализации нейронов в срезе мозга с использованием метода очистки тканей ScaleSF. Протокол включает в себя подготовку тканей головного мозга, осветление тканей, обработку очищенных срезов и конфокальную лазерную сканирующую микроскопическую визуализацию нейронных структур от мезоскопического до микроскопического уровней.

Аннотация

Здесь представлен подробный протокол для визуализации нейронных структур от мезоскопического до микроскопического уровней в тканях мозга. Нейронные структуры, начиная от нейронных цепей и заканчивая субклеточными нейронными структурами, визуализируются в срезах мозга мыши, оптически очищенных с помощью ScaleSF. Этот метод очистки является модифицированной версией ScaleS и представляет собой гидрофильный метод очистки тканей для срезов тканей, который обеспечивает мощную очищающую способность, а также высокий уровень сохранения флуоресцентных сигналов и структурной целостности. Настраиваемая трехмерная (3D)-печатная камера визуализации предназначена для надежного монтажа очищенных тканей мозга. Мозг мыши, которому вводили аденоассоциированный вирусный вектор, несущий усиленный ген зеленого флуоресцентного белка, фиксировали 4% параформальдегидом и разрезали на срезы толщиной 1 мм с помощью вибрирующего слайсера тканей. Срезы мозга очищали в соответствии с протоколом очистки, который включал последовательные инкубации в трех растворах, а именно: раствор scaleS0, фосфатный буферный физиологический раствор (-) и раствор ScaleS4, в общей сложности 10,5-14,5 ч. Очищенные срезы мозга были установлены на камере визуализации и встроены в 1,5% агарозный гель, растворенный в растворе ScaleS4D25(0). Получение 3D-изображения срезов осуществлялось с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа, оснащенного мульти-погружным объективом большого рабочего расстояния. Начиная с мезоскопической нейрональной визуализации, нам удалось визуализировать тонкие субклеточные нейронные структуры, такие как дендритные шипы и аксональные бутоны, в оптически очищенных срезах мозга. Этот протокол облегчит понимание нейронных структур от схемы до субклеточных компонентных масштабов.

Введение

Методы очистки тканей улучшили глубинно-независимую визуализацию биологических и клинических образцов с помощью световой микроскопии, что позволяет извлекать структурную информацию на интактных тканях ^1,2. Методы оптической очистки также могут потенциально ускорить и снизить стоимость гистологического анализа. В настоящее время существуют три основных подхода к очистке: гидрофильный, гидрофобный и гидрогелевой методы ^1,2. Гидрофильные подходы превосходят в сохранении флуоресцентных сигналов и целостности тканей и менее токсичны по