Summary
Protokollet ger en detaljerad metod för neuronal avbildning i hjärnskiva med hjälp av en vävnadsrensningsmetod, ScaleSF. Protokollet inkluderar beredning av hjärnvävnad, vävnadsförtydligande, hantering av rensade skivor och konfokal laserskanningsmikroskopiavbildning av neuronala strukturer från mesoskopiska till mikroskopiska nivåer.
Abstract
Ett detaljerat protokoll tillhandahålls här för att visualisera neuronala strukturer från mesoskopiska till mikroskopiska nivåer i hjärnvävnader. Neuronala strukturer som sträcker sig från neurala kretsar till subcellulära neuronala strukturer visualiseras i mushjärnskivor optiskt rensade med ScaleSF. Denna clearingmetod är en modifierad version av ScaleS och är en hydrofil vävnadsrensningsmetod för vävnadsskivor som uppnår potent röjningsförmåga samt en hög grad av bevarande av fluorescenssignaler och strukturell integritet. En anpassningsbar tredimensionell (3D) tryckt bildkammare är utformad för tillförlitlig montering av rensade hjärnvävnader. Mushjärnor injicerade med en adenoassocierad virusvektor som bär förbättrad grön fluorescerande proteingen fixerades med 4% paraformaldehyd och skars i skivor med 1 mm tjocklek med en vibrerande vävnadsskivare. Hjärnskivorna rensades genom att följa clearingprotokollet, som inkluderar sekventiella inkubationer i tre lösningar, nämligen ScaleS0-lösning, fosfatbuffertsaltlösning (–) och ScaleS4-lösning, i totalt 10,5–14,5 timmar. De rensade hjärnskivorna monterades på bildkammaren och inbäddades i 1,5% agarosgel upplöst i ScaleS4D25(0)-lösning. 3D-bildinhämtningen av skivorna utfördes med hjälp av ett konfokalt laserscanningsmikroskop utrustat med en objektivlins med flera nedsänkningar med långt arbetsavstånd. Från och med mesoskopisk neuronal avbildning lyckades vi visualisera fina subcellulära neuronala strukturer, såsom dendritiska ryggar och axonala boutoner, i de optiskt rensade hjärnskivorna. Detta protokoll skulle underlätta förståelsen av neuronala strukturer från krets till subcellulära komponentskalor.
Introduction
Vävnadsrensningsmetoder har förbättrat djupoberoende avbildning av biologiska och kliniska prover med ljusmikroskopi, vilket möjliggör extraktion av strukturell information på intakta vävnader 1,2. Optiska röjningstekniker kan också potentiellt påskynda och minska kostnaden för histologisk analys. För närvarande finns tre huvudsakliga clearingmetoder tillgängliga: hydrofila, hydrofoba och hydrogelbaserade metoder 1,2. Hydrofila tillvägagångssätt överträffar när det gäller att bevara fluorescenssignaler och vävnadsintegritet och är mindre giftiga jämfört med de andra två tillvägagångssätten 3,4.
En hydrofil röjningsmetod, ScaleS, har en särställning med sitt bevarande av strukturell och molekylär integritet samt potent röjningsförmåga (clearing-bevarandespektrum)5. I en tidigare studie utvecklade vi ett snabbt och isometriskt clearingprotokoll, ScaleSF, för vävnadsskivor (~1 mm tjocklek) genom att modifiera röjningsproceduren för ScaleS6. Detta clearingprotokoll kräver sekventiella inkubationer av hjärnskivor i tre lösningar för 10,5-14,5 h. Metoden har ett högt clearing-bevarandespektrum, vilket är kompatibelt även med elektronmikroskopi (EM) -analys (kompletterande figur 1), vilket möjliggör flerskalig högupplöst tredimensionell (3D) avbildning med exakt signalrekonstruktion6. Således bör ScaleSF vara effektiv särskilt i hjärnan, där neuronala celler utarbetar sprudlande processer av enorm längd och ordnar specialiserade fina subcellulära strukturer för överföring och mottagning av information. Att extrahera strukturell information med skalor från krets till subcellulära nivåer på neuronala celler är ganska användbart för bättre förståelse av hjärnans funktioner.
Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för att visualisera neuronala strukturer med skalor från den mesoskopiska / kretsen till mikroskopisk / subcellulär nivå med ScaleSF. Protokollet inkluderar vävnadsberedning, vävnadsförtydligande, hantering av rensade vävnader och konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM) avbildning av rensade vävnader. Vårt protokoll fokuserar på att förhöra neuronala strukturer från krets till subcellulära komponentskalor. För en detaljerad procedur för beredning av lösningarna och stereotaxisk injektion av adenoassocierade virusvektorer (AAV) i mushjärnor, se Miyawaki et al.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment godkändes av Institutional Animal Care and Use Committees of Juntendo University (godkännande nr 2021245, 2021246) och utfördes i enlighet med grundläggande riktlinjer för korrekt genomförande av djurförsök av Japans vetenskapsråd (2006). Här användes manliga C57BL / 6J-möss injicerade med AAV-vektor som bär förbättrad grön fluorescerande protein (EGFP) gen och parvalbumin (PV) / myristoylering-EGFP-low-density lipoprotein receptor C-terminal bakteriell artificiell kromosom (BAC) transgena möss (PV-FGL möss)9 . PV-FGL-möss upprätthölls i C57BL/6J-bakgrund. Inga könsbaserade skillnader hittades med avseende på denna studie.
1. Vävnadsberedning
- Perfusion fixering
OBS: Utför steg 1.1.1 till 1.1.3 i en dragskåp för att begränsa exponeringen för paraformaldehyd (PFA).- Bedöva vuxna hanmöss (8–16 veckor gamla) genom en intraperitoneal injektion av överdosering av natriumpentobarbital (200 mg/kg). Bekräfta tillräckligheten av anestesi genom frånvaro av tå-nypa uttag och ögon-blink reflexer.
- Öppna brösthålan och skär rätt förmaksbihang med kirurgisk sax. Perfuse mössen med 20 ml iskall fosfatbuffert saltlösning (PBS) med en 23 G nål fäst vid en 20 ml spruta, följt av perfusion av 20 ml iskall 4% PFA i 0,1 M fosfatbuffert (PB) med ytterligare 20 ml spruta.
VARNING: PFA är giftigt och teratogent. Undvik inandning eller kontakt med hud, ögon och slemhinnor. - Ta bort hjärnvävnader från skallen med pincett. Överför hjärnvävnaderna till ett 15 ml rör som innehåller 4% PFA i 0,1 M PB, skydda proverna från ljus och gunga försiktigt över natten vid 4 ° C på en shaker vid 50–100 rpm.
- OBS: De skördade hjärnvävnaderna kan lagras i flera veckor i 0,02% natriumazid (NaN3) i PBS vid 4 °C.
VARNING: NaN3 är giftigt. Undvik inandning eller kontakt med hud, ögon och slemhinnor. Hantera den inuti en dragskåp.
- Förberedelse av hjärnskiva
- Förbered 4% agar i PBS genom att tillsätta 2 g agar till 50 ml PBS. Mikrovågsugn blandningen tills agar är helt upplöst. Låt lösningen svalna till 40-45 °C.
OBS: Den viskösa egenskapen som tillhandahålls av agaropektin, en huvudkomponent i agar, förbättrar lättheten att skära av vävnadsskivor. - Tillsätt 10 ml av agarlösningen till en 6-brunns odlingsplatta. Sänk ner hjärnvävnaden i agarlösningen med hjälp av pincett. Låt agar stelna på is.
- Ta bort den inbäddade hjärnvävnaden från brunnen och trimma agar med ett rakblad. Säkra agarblocket på botten av vibratombadet med superlim och häll 0,1 M PB i buffertbrickan.
- Rengör ett annat rakblad med ett luddfritt silkespapper indränkt i etanol och fäst bladet i bladhållaren på den vibrerande vävnadsskivaren.
- Ställ in sektioneringshastigheten till 0,14 mm/s med 1,4 mm amplitud och frekvensen till 75–77 Hz. Skär hjärnvävnaden i 1 mm tjocka skivor och samla skivorna i en 6-brunns cellodlingsplatta som innehåller PBS.
OBS: Hjärnskivorna kan lagras i flera veckor i 0,02% NaN3 i PBS vid 4 °C.
- Förbered 4% agar i PBS genom att tillsätta 2 g agar till 50 ml PBS. Mikrovågsugn blandningen tills agar är helt upplöst. Låt lösningen svalna till 40-45 °C.
2. Vävnad förtydligande
OBS: Sammansättningen av ScaleS-lösningar som används anges i tabell 1. Prover bör skyddas mot ljus genom att täcka med en folie. Rensningsstegen visas i figur 1A.
- Tillsätt 8 ml ScaleS0-lösning till en brunn på en 6-brunns cellodlingsplatta och tillsätt 8 ml ScaleS4-lösning till en annan brunn på plattan och förvärm till 37 °C i en inkubator.
- Överför hjärnskivorna till den förvärmda ScaleS0-lösningen med en spatel och inkubera i 2 timmar vid 37 °C i en skakningsinkubator vid 90 rpm.
- Överför de permeabiliserade hjärnskivorna i 8 ml PBS (–) i en 6-brunns cellodlingsplatta med en spatel och tvätta i 15 minuter genom att hålla i en orbitalskakare vid 40–60 rpm. Upprepa detta två gånger.
- Överför hjärnskivorna i den förvärmda 8 ml ScaleS4-lösningen med en spatel och rensa dem genom att inkubera i en skakinkubator vid 90 rpm i 8–12 timmar vid 37 °C. En rensad hjärnskiva kan ses i figur 1.
3. Montering av hjärnskiva
OBS: En anpassningsbar bildkammare används för tillförlitlig montering av rensade hjärnskivor (figur 2)6. Kammaren består av kammarramen och bottenkåpan. Mikroskopstegsadaptrarna är också utformade för att montera bildkammaren direkt på mikroskopsteg (figur 2A, B). Kammarramen och mikroskopets scenadaptrar kan 3D-skrivas ut med hjälp av interna eller outsourcade 3D-utskriftstjänster. 3D-datorstödd design (CAD) -data för bildkammaren finns i Furuta et al.
- För kammarförberedelse, fäst kammarramen på ett täckglas med ett tryckkänsligt lim.
- Bered 1,5 % agaros i ScaleS4D25(0)-lösning (ScaleS4 gel) genom att tillsätta 1,5 g agaros till 100 ml av lösningen i en flaska. Blanda lösningen väl genom omrörning och mikrovågsugn lösningen tills agarosen är helt upplöst. När du är klar, låt lösningen svalna till 37 °C.
- Montera den rensade hjärnskivan på bildkammarens nedre täckglas med en spatel. Torka bort överskottslösningen från den rensade skivan med ett rent luddfritt silkespapper.
- Tillsätt ScaleS4-gelén på hjärnskivan med hjälp av en mikropipett för att fylla bildkammaren. Placera ett annat täckglas ovanpå med pincett och placera en bit luddfritt silkespapper och en glasskiva på täckglaset i denna ordning.
- Överför bildkammaren till ett kylskåp vid 4 °C. Placera metallvikter på glasskivan och låt dem stå i 30 minuter.
- Ta bort metallvikterna, glasskivan, luddfritt silkespapper och täckglaset från bildkammaren och torka bort överflödig gel (figur 2A,B).
- Placera bildkammaren i en 60 mm petriskål i glas och fäst bildkammarens kant på skålen med ett kittliknande tryckkänsligt lim. Fäst kammaren på flera punkter på petriskålen.
- Häll ScaleS4-lösningen i skålen och skaka försiktigt i 1 timme vid 20-25 °C på en orbitalskakare vid 40-60 rpm. Ersätt med färsk lösning och ta bort luftbubblor på gelytan genom att försiktigt skrapa ytan med en 200 μL pipettspets. Montera den nedsänkta bildkammaren på ett mikroskopsteg (figur 2C).
4. CLSM-avbildning
- Hämta bilder med hjälp av en CLSM utrustad med en objektivlins med flera nedsänkningar med långt arbetsavstånd (WD) (16x/ 0,60 numerisk bländare [NA], WD = 2,5 mm).
OBS: Objektiv med hög NA-objektiv kan ge hög diffraktionsbegränsad upplösning. - Slå på all relevant bildutrustning (arbetsstation, mikroskop, skanner, lasrar och kvicksilverlampa) och starta en CLSM-bildprogramvara.
- Ställ in korrigeringskragen på objektivlinsen med flera nedsänkningar på 1,47. ScaleS4-lösningen har ett brytningsindex (RI) på cirka 1,47 5,7. Avvikelser som orsakas av RI-matchningsfel kan störa bildbildningen (figur 3).
- Sänk ner objektivlinsen i lösningen och låt den närma sig segmentet långsamt. Ta bort eventuella luftbubblor som fastnat på objektivlinsens spets. Hitta intressanta regioner (ROI) i de rensade vävnaderna med hjälp av epifluorescens.
- Ställ in bildförvärvsparametrar genom att testa lämpliga inställningar.
- Bestäm bitdjupet för bildförvärv. Bildens datastorlek ökar med bitdjupet.
- Ställ in detektionsvåglängden. Justera lämplig grind för detektorn enligt emissionsspektrumet. Se till att detektionsvåglängden inte täcker några laserlinjer.
- Ställ in xy-upplösningen . Större format ger bättre xy-upplösningar , men det tar längre tid att samla in bilderna.
- Ställ in skanningshastigheten. En långsammare skanningshastighet ger ett högt signal-brusförhållande. Men det ökar också pixelns uppehållstid och risken för fotoblekning. Välj därefter.
- Justera pinhålets storlek. Pinhålstorleken styr den optiska sektionstjockleken. En mindre hålstorlek skapar en tunnare optisk sektion, och därmed bättre z-upplösning , men minskar fluorescenssignalen. Att göra hålstorleken större ger en tjockare optisk sektion med starkare fluorescenssignal.
- Ställ in lasereffekten, detektorn / förstärkarens förstärkning och förskjutning. Öka gradvis lasereffekten och förstärkningen av detektorn/förstärkaren tills en lämplig bild erhålls. En hög lasereffekt medför risk för fotoblekning. Justera förskjutningen (kontrasten) på lämpligt sätt för att få ett högt signal-brusförhållande.
- Bestäm det jordbearbetningsområde som behövs baserat på storleken på ROI. Se till att hela roi-längden och bredden fångas.
- Navigera i de rensade vävnaderna i alla plan och ange start- och slutpunkterna för stapeln. Ställ in z-stegsstorleken enligt önskad z-upplösning.
- Samla in bilder när du är nöjd med inställningarna för bildförvärv och spela in tagna bilder. Bearbeta bilderna med hjälp av ett bildanalysprogram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Optisk rensning av en mushjärnskiva med 1 mm tjocklek uppnåddes med hjälp av detta protokoll. Figur 1B representerar överföringsbilder av en mushjärnskiva före och efter rensningsbehandlingen. Vävnadsrensningsmetoden gjorde en 1 mm tjock mushjärnskiva transparent. En liten expansion i slutliga storlekar av hjärnskivor hittades efter inkubationen i clearinglösningen i 12 timmar (linjär expansion: 102,5% ± 1,3%). Bevarandet av fluorescens och strukturell integritet hos vävnaderna bedömdes med riktat EGFP-uttryck i plasmamembranet hos PV-FGL-möss (figur 1C). Hos dessa möss uttrycks somatodendritisk membranriktad EGFP i PV-positiva neuroner9. EGFP-uttryck riktat mot plasmamembranet i den somatodendritiska regionen bibehölls efter behandlingen (figur 1C). Dessutom visar den tidigare EM-studien välbevarad strukturell integritet i hjärnvävnader rensade med ScaleSF (kompletterande figur 1)6.
Avvikelser orsakade avvikelser som orsakades av RI-fel orsakade en märkbar förlust av bildens ljusstyrka och upplösning (bild 3). En 1 mm tjock hjärnskiva av PV-FGL-mus rensades och avbildades under en CLSM utrustad med en objektivlins med flera nedsänkningar med en lång WD. Justering av objektivlinsens korrigeringskrage till vattenpositionen (RI 1.33) hindrade tydlig visualisering av EGFP-positiva neuroner belägna på djupet av 400 μm och 800 μm på grund av låg ljusstyrka och låg kontrast. (Figur 3A,C). Dessa nervceller visualiserades tydligt med samma CLSM, när korrigeringskragen justerades för att matcha ScaleS4-lösningen (RI 1.47; Figur 3B,D). RI-matchning mellan en nedsänkningsvätska och objektivlins är avgörande för exakt 3D-avbildning i optiskt rensade vävnader.
Slutligen användes neokortikala neuroner från musen för att visa genomförbarheten av protokollet. En mushjärna injicerad med AAV2/1-SynTetOff-EGFP-vektor10 i den primära somatosensoriska cortexen (S1) fixerades med 4% PFA i 0,1 M PB. Koronaskivor med 1 mm tjocklek framställdes från hjärnan med en vibrerande vävnadsskivare. Efter rensning och montering på bildkammaren genomfördes neuronal avbildning riktad mot neokortikala neuroner (figur 4). En 3D-rekonstruktion av EGFP-märkta neuroner i den 1 mm tjocka hjärnskivan representeras i figur 4A. En högre förstoringsbild visar enskilda dendritiska arbors dekorerade med dendritiska ryggar (figur 4B). Vi visade vidare axonterminala arboriseringar och axonala boutoner i kontralateral cortex (figur 4C).
Figur 1: Optisk rensning av mushjärnskivor med 1 mm tjocklek. (B) Överföring av bilder av en 1 mm tjock hjärnskiva före (vänster) och efter (höger) behandling. (C) En 3D-volymåtergivning av hjärnbarken hos en PV-FGL-mus som rensas med hjälp av vävnadsrensningsmetoden. (D,E) xy-bilder i (C) på djupet 250 μm (D) och 750 μm (E). (F,G) Förstorad vy av rektanglarna som beskrivs i (D) och (E). Bilder som visas i (C-G) dekonvoluteras före renderingsprocessen. Förkortningar: pia = pia mater, WM = vit substans. Skalstång: 2 mm tum (B), 500 μm i (C), 200 μm i (D,E) och 40 μm i (F,G). Denna siffra har modifierats från Furata m.fl. 20226. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: En anpassningsbar 3D-utskriven bildkammare för visualisering av vävnadsskivor. Bildkammaren består av en kammarram, en bottenöverdrag och mikroskopstegsadaptrar. Rensade vävnadsskivor placeras på bottenlocket och bäddas in i ScaleS4 gel. Kammarramen, bottenkåpan och mikroskopstegsadaptrarna kan anpassas efter vävnadsskivornas storlek och tjocklek. (C) En avbildningsinställning med bildkammaren. Bildkammaren är nedsänkt i ScaleS4-lösning i en petriskål och monterad på en scen av en upprätt CLSM. Denna siffra har modifierats från Furata m.fl. 20226. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Komprometterad djupavbildning orsakad av en RI-bristande överensstämmelse mellan en objektivlins och ScaleS4-lösning.(A-D) xy-bilder av hjärnbarken hos en PV-FGL-mus på 400 μm (A,B) och 800 μm (C,D). Korrigeringen av kragen på en objektivlins med flera nedsänkningar justeras till 1,33 tum (A,C) och 1,47 tum (B,D). Bilder förvärvas med samma parametrar förutom RI för objektivlinsen. Skalstreck: 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Neuronal avbildning i en 1 mm tjock mushjärnskiva rensad med ScaleSF. (A) 3D-volymåtergivning av EGFP-märkta neokortikala nervceller i S1. Neokortikala neuroner är märkta med AAV2/1 SynTetOff-EGFP-vektorn. (B) Dendritiska arbors av EGFP-märkta neokortikala neuroner. En bild av maximal intensitetsprojektion (MIP) från ett djup av 39 μm till 48 μm representeras. Pilspetsar indikerar dendritiska spines. (C) EGFP-märkta axonterminaler i kontralateral cortex. En MIP-bild från ett djup av 481,5 μm till 513 μm representeras. Pilspetsar indikerar axonala boutoner. Bilder som förekommer i (B) och (C) dekonstrueras. Skalstänger: 300 μm i (A) och 10 μm i (C). Stapeln i (C) gäller även för (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1: Ultrastruktur i hjärnskivor rensade med ScaleSF, CUBIC och PACT. (A-C) Transmission EM-bilder av mus hjärnbark rensad med ScaleSF (A), CUBIC (B) och PACT (C). Mushjärnor är fixerade med 4% PFA innehållande 1% glutaraldehyd. Ultratunna sektioner framställs av rensade hjärnskivor. Membranstrukturer skadas allvarligt i hjärnskivor som rensas med CUBIC (B) och PACT (C). Pilspetsar indikerar postsynaptiska membran. Skalstång: 500 nm. Denna siffra har modifierats från Furata m.fl. 20226. Klicka här för att ladda ner den här filen.
| Recipies för ScaleS-lösningar | |
| ScaleS0 lösning | |
| Reagens | Slutlig koncentration |
| D-sorbitol | 20 % (vikt/volym) |
| Glycerol | 5 % (vikt/volym) |
| Metyl-β-cyklodextrin | 1 mM |
| γ-cyklodextrin | 1 mM |
| Dimetylsulfoxid | 3 % (v/v) |
| 10x PBS(–) | 1x |
| ScaleS4-lösning | |
| Reagens | Slutlig koncentration |
| Urea | 4 miljoner |
| D-sorbitol | 40 % (vikt/volym) |
| Glycerol | 10 % (vikt/volym) |
| Triton X-100 | 0,2 % (vikt/volym) |
| Dimetylsulfoxid | 25% (v/v) |
| ScaleS4D25(0)-lösning | |
| Reagens | Slutlig koncentration |
| Urea | 4 miljoner |
| D-sorbitol | 40 % (vikt/volym) |
| Glycerol | 10 % (vikt/volym) |
| Dimetylsulfoxid | 25% (v/v) |
Tabell 1: Sammansättning av de tre ScaleS-lösningarna. Kompositionerna av ScaleS0, ScaleS4 och ScaleS4D25(0) lösningar listas. För en detaljerad procedur för beredning av dessa lösningar, se Miyawaki etal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiska steg inom protokollet
Det finns några kritiska steg i protokollet som bör genomföras med största försiktighet för att få meningsfulla resultat. Enhetlig fixering av prover är absolut nödvändigt för 3D-avbildning i storskaliga vävnader. Objektivlinsen, provet och nedsänkningsvätskan ska ha matchande RI. RI-missmatchning bland dem kommer att leda till mycket störd avbildning av EGFP-uttryckande celler i de rensade hjärnskivorna (figur 3). Korrigeringskragens justering av objektivlinsen till nedsänkningsvätskan minimerar djupinducerade sfäriska avvikelser för att maximera signalen, kontrasten och den rumsliga upplösningen vid 3D-avbildning. RI:erna för de beredda lösningarna kan mätas med hjälp av en refraktometer.
Felsökning av tekniken
Längre lagring av lösningarna kan påverka röjningsförmågan och dess förmåga att bevara fluorescenssignaler och strukturell integritet. Nyberedda lösningar bör användas. Dessa lösningar kan förvaras upp till 1 månad vid 4 °C. Isometricity är avgörande för effektiv och effektiv neuronal avbildning med exakt signalrekonstruktion. Även om en liten expansion i provstorlekar observerades efter inkubation i 12 timmar (figur 1B), kan expansionen kontrolleras genom att minska inkubationsperioden mellan 8-12 timmar. För mer exakt 3D-djupavbildning kan korrigeringskragen behöva justeras vid ett visst plan på grund av djupinducerad sfärisk aberration.
Modifieringar av tekniken
I den aktuella studien använde vi mushjärnvävnader för att demonstrera genomförbarheten av protokollet. Men protokollet som beskrivs här kan också användas för storhjärnade djur, såsom primater. Faktum är att detta protokoll har använts i vanliga marmoset (Callithrix jacchus) hjärnvävnader och lyckats samtidigt visualisera neurala kretsar och subcellulära strukturer i dess kortikosterriatala kretsar6. Mikroskopstegsadaptrarna är utformade för att montera bildkammaren på mikroskopsteg direkt6 (figur 2A, B). Rensade vävnadsskivor kan observeras med hjälp av ett inverterat mikroskop genom bildkammarens nedre täckglas. Efter restaurering av rensade hjärnvävnader med PBS(-) (deScaling)5,11 kan vi förbereda vävnadssektioner med en tjocklek av 20-μm till 50 μm från hjärnvävnader som rensades med ScaleSF (omsektionering)6. Subcellulära strukturer fångade i rensade vävnader kan avbildas igen på omsektioner med en hög NA-objektivlins med en kort WD. Rensning av hjärnskivor perfuserade med fixeringsmedel innehållande glutaraldehyd har uppnåtts med hjälp av detta protokoll, vilket ger överlägsen ultrastrukturkonservering6. ScaleSF uppnår en hög nivå av ultrastrukturkonservering som möjliggör EM-analys i optiskt rensade vävnader6 (kompletterande figur 1). EM-kompatibiliteten för denna metod är särskilt användbar för avbildningsstrukturer med skalorna från makroskopisk till nanoskopisk nivå.
Begränsningar av tekniken
Protokollet som beskrivs här tillåter oss att visualisera neuronala strukturer från krets till subcellulära skalor i hjärnskivor med 1 mm tjocklek. Tre begränsningar kvarstår dock i protokollet. Den första är clearingprotokollets clearingförmåga. ScaleSF är ett rensningsprotokoll för hjärnskivor, inte för hela hjärnan. Även om hjärnskivor med 1 mm tjocklek kan ge god kunskap om dendritiska och lokala axonala arbors12, är information om axonala projektioner som spänner över hela hjärnan fragmentarisk och ofullständig i skivorna 13,14,15,16. Den andra är bildupplösningen. Med hjälp av protokollet som beskrivs här lyckades vi visualisera subcellulära neuronala strukturer, såsom dendritiska ryggar och axonala boutoner, i en optiskt rensad hjärnskiva (Figur 4). Upplösningen av objektivlinsen som används i denna studie, xy-upplösning på 400-750 nm, är emellertid inte tillräcklig för att lösa mer fina strukturer av neuronala celler. Med tanke på att objektiv med hög NA-objektivik vanligtvis är utformade för nedsänkning i olja (RI 1.52), kan RI-bristande överensstämmelse med lösningarna (RI 1.47) förhindra högupplöst avbildning med dessa objektivlinser. Den tredje är fluorescerande proteinmärkning av neuronala celler. Märkningsmetoden begränsar breda tillämpningar av vår bildteknik. Histokemiska och / eller immunohistokemiska tekniker som märker storskaliga vävnader samtidigt som vävnadsintegriteten bibehålls skulle avsevärt främja protokollet som tillhandahålls här.
Betydelse med avseende på befintliga metoder och framtida tillämpningar av tekniken
I den aktuella studien beskriver vi ett detaljprotokoll för neuronal avbildning från mesoskopiska till mikroskopiska strukturer med scaleSF vävnadsrensning. Protokollet som beskrivs här gör det möjligt att visualisera neuronala strukturer från krets till subcellulära nivåer på rimlig tid utan specialutrustning, vilket underlättar förståelsen av neuronala strukturer från krets till komponentskalor. Neuroner utarbetar sprudlande processer av enorm längd och ordnar specialiserade fina strukturer för överföring och mottagning av information. Således kräver neuronal avbildning en vävnadsrensningsmetod som utövar potent clearingförmåga samt en hög nivå av vävnadsbevarande för samtidig visualisering av både stora och småskaliga strukturer. Vävnadsrensningsmetoder med hög clearingförmåga tar dock aggressivt bort lipider och pigment för omfattande vävnadsförtydligande 3,4, vilket äventyrar vävnadsintegriteten 5,6,17 (kompletterande figur 1). Detta står i skarp kontrast till det röjningsprotokoll som används här och som uppnår en hög nivå av strukturbevarande6 (kompletterande figur 1). Därför möjliggör ScaleSF-vävnadsrensning effektiv och effektiv neuronal avbildning som kräver högupplöst 3D-avbildning i flera skalor med exakt signalrekonstruktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar Yoko Ishida (Juntendo University) för AAV-vektorproduktion och Kisara Hoshino (Juntendo University) för tekniskt bistånd. Denna studie stöddes av JSPS KAKENHI (JP20K07231 till K.Y.; JP21H03529 till T.F.; JP20K07743 till M.K.; JP21H02592 till H.H.) och vetenskaplig forskning om innovativt område "Resonansbio" (JP18H04743 till H.H.). Denna studie stöddes också av Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) (JP21dm0207112 till T.F. och H.H.), Moonshot R&D från Japan Science and Technology Agency (JST) (JPMJMS2024 till H.H.), Fusion Oriented Research for disruptive Science and Technology (FOREST) från JST (JPMJFR204D till H.H.), Grants-in-Aid från Research Institute for Diseases of Old Age vid Juntendo University School of Medicine (X2016 till K.Y.; X2001 till H.H.) och Private School Branding Project.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16x multi-immersion objective lens | Leica Microsystems | HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR | |
| Agar | Nacalai Tesque | 01028-85 | |
| Agarose | TaKaRa Bio | L03 | |
| Dimethyl sulfoxide | Nacalai Tesque | 13407-45 | |
| D-Sorbitol | Nacalai Tesque | 06286-55 | |
| γ-cyclodextrin | Wako Pure Chemical Industries | 037-10643 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Huygens Essential | Scientific Volume Imaging | ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b | |
| Imaris | Bitplane | ver. 9.0.0 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | LAS X, ver. 3.5.5.19976 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Tokyo Chemical Industry | M1356 | |
| Paraformaldehyde | Merck Millipore | 1.04005.1000 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x; pH 7.4) | Nacalai Tesque | 27575-31 | 10x PBS(–) |
| Sodium azide | Nacalai Tesque | 31233-55 | |
| Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | N/A | |
| TCS SP8 | Leica Microsystems | N/A | |
| Triton X-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
| Urea | Nacalai Tesque | 35940-65 | |
| Vibrating tissue slicer | Dosaka EM | PRO7N |
References
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: Toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Reviews of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews. Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Furuta, T., et al. Multi-scale light microscopy/electron microscopy neuronal imaging from brain to synapse with a tissue clearing method, ScaleSF. iScience. 25 (1), 103601 (2022).
- Miyawaki, A., et al. Deep imaging of cleared brain by confocal laser-scanning microscopy. Protocol Exchange. , (2016).
- Okamoto, S., et al. Exclusive labeling of direct and indirect pathway neurons in the mouse neostriatum by an adeno-associated virus vector with Cre/lox system. STAR Protocols. 2 (1), 100230 (2021).
- Kameda, H., et al. Parvalbumin-producing cortical interneurons receive inhibitory inputs on proximal portions and cortical excitatory inputs on distal dendrites. The European Journal of Neuroscience. 35 (6), 838-854 (2012).
- Sohn, J., et al. A single vector platform for high-level gene transduction of central neurons: Adeno-associated virus vector equipped with the Tet-off system. PLoS One. 12 (1), 0169611 (2017).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Stepanyants, A., Martinez, L. M., Ferecsko, A. S., Kisvarday, Z. F. The fractions of short- and long-range connections in the visual cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3555-3560 (2009).
- Kuramoto, E., et al. Two types of thalamocortical projections from the motor thalamic nuclei of the rat: a single neuron-tracing study using viral vectors. Cerebral Cortex. 19 (9), New York, N.Y. 2065-2077 (2009).
- Matsuda, W., et al. Single nigrostriatal dopaminergic neurons form widely spread and highly dense axonal arborizations in the neostriatum. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (2), 444-453 (2009).
- Lin, R., et al. Cell-type-specific and projection-specific brain-wide reconstruction of single neurons. Nature Methods. 15 (12), 1033-1036 (2018).
- Winnubst, J., et al. Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain. Cell. 179 (1), 268-281 (2019).
- Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Scientific Reports. 6, 34331 (2016).
