Summary
本协议描述了用于三维（3D）肾脏成像的组织清除方法和全安装免疫荧光染色。这种技术可以为肾脏病理学提供宏观视角，从而带来新的生物学发现。
Abstract
尽管常规病理学提供了大量关于肾脏微观结构的信息，但由于缺乏三维（3D）信息，很难知道肾脏中血管，近端小管，集合管，肾小球和交感神经的精确结构。光学清除是克服这一巨大障碍的好策略。通过结合组织清除和3D成像技术，可以以单细胞分辨率分析整个器官中的多个细胞。然而，用于全器官成像的细胞标记方法仍然不发达。特别是，由于抗体穿透困难，整个安装器官染色具有挑战性。本协议开发了一种全安装小鼠肾脏染色，用于使用CUBIC（透明，无阻碍的脑/身体成像混合物和计算分析）组织清除方法进行3D成像。该方案能够从综合的角度可视化糖尿病肾病早期缺血再灌注损伤和肾小球肿大后的肾交感神经去神经。因此，这种技术可以通过提供宏观视角来导致肾脏研究的新发现。
Introduction
肾脏由各种细胞群组成。虽然常规病理学为我们提供了许多关于肾脏微环境的信息，但需要三维（3D）成像来精确了解肾脏疾病进展过程中的细胞间串扰。过去，全器官3D成像需要进行大量的连续切片和图像重建1。然而，这种方法需要太多的努力，并且在重现性方面存在问题。
光学清除是克服这一障碍的好策略2，3。组织混浊主要是由于光散射和吸收，因为每个器官由各种物质组成，包括水、蛋白质和脂质。因此，组织清除的基本策略是用折射率（RI）匹配试剂代替组织中的水和脂质，这些试剂具有与蛋白质相同的光学特性4。为了观察透明标本，光片荧光显微镜是有用的5。光片从侧面照亮透明标本，激发信号通过位于垂直位置的物镜6采集。该显微镜在单次扫描中获取横截面信息，这与共聚焦或多光子荧光显微镜不同。因此，它可以快速获取具有低光漂白水平的z-stack图像。
清晰、无阻碍的脑/身体成像混合物和计算分析 （CUBIC） 是一种组织清除方法，可通过光片荧光显微镜2，7，8 进行全器官成像。在本研究中优化了立方体和全安装免疫荧光染色，以可视化小鼠肾脏3D结构9，10，11。使用这种全安装染色方法，在糖尿病肾病早期的缺血再灌注损伤 9，10 和肾小球肿大11 以及整个肾脏中的血管、近端小管和集合管9 后，可以看到肾交感神经的改变。
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Protocol
所有实验均获得东京大学机构审查委员会的批准。所有动物程序均根据美国国立卫生研究院指南进行。8周龄的雄性C57BL / 6NJcl小鼠用于本研究。小鼠是从商业来源获得的（见 材料表）。
1. 动物制备和肾脏固定
- 按照以下步骤进行灌注固定。
- 通过吸入异氟醚（3%，2.0L / min）和腹膜内给予盐酸美托咪定（0.3mg / kg），酒石酸布托芬诺（5mg / kg）和咪达唑仑（4mg / kg）麻醉小鼠（参见 材料表）。
- 用 20 mL PBS （pH 7.4） 和 30 mL 4% PFA 磷酸盐缓冲液 （PB） 通过心脏左心室灌注动物12。
- 在灌注固定和肾脏取样后立即进行浸入式固定9.
- 将肾脏浸入4°C的4%PFA中再浸泡16小时，然后用PBS洗涤2小时（三次）9 （图1）。
注意：甲醛和多聚甲醛是有毒刺激物。使用适当的个人防护设备在通风橱中处理试剂。
- 将肾脏浸入4°C的4%PFA中再浸泡16小时，然后用PBS洗涤2小时（三次）9 （图1）。
2.脱色脱脂
- 根据先前发表的报告4，8，9，制备CUBIC-L用于脱色和脱脂，由10wt%的Triton X-100和10wt%的N-丁酰基二乙醇胺组成（见材料表）。
- 按照以下步骤通过CUBIC-L进行脱色和脱脂。
- 将固定肾脏浸入 7 mL 的 50% （v/v） CUBIC-L（水和 CUBIC-L 的 1：1 混合物）中，在 14 mL 圆底管（参见 材料表）中，在室温下轻轻摇动 6 小时（图 2A）。然后，将其浸入7mL的CUBIC-L中，在37°C下轻轻摇动5天。
- 在此过程中每天刷新 CUBIC-L。脱色和脱脂过程后，在室温下用PBS洗涤肾脏2小时（三次）9 （图1）。使用分液勺处理样品（图2B）。
3. 全安装免疫荧光染色
- 准备染色缓冲液。
- 通过将 0.5% （v/v） Triton X-100、0.5% 酪蛋白在 PBS 中和 0.05% 叠氮化钠9 混合来制备一抗染色缓冲液。
- 通过将 0.5% （v/v） Triton X-100、0.1% 酪蛋白在 PBS 中和 0.05% 叠氮化钠9 混合来制备二抗染色缓冲液。
- 用一抗进行染色。
- 在37°C的染色缓冲液中用一抗（1：100或1：200，参见 材料表）对脱脂的肾脏进行免疫染色，轻轻摇动7天。
注意：一个肾脏所需的染色缓冲液量为500-600μL（图2C）。 - 在室温下用0.5%（v / v）Triton X-100在PBS（PBST）中洗涤肾脏1天9 （图1）。
- 在37°C的染色缓冲液中用一抗（1：100或1：200，参见 材料表）对脱脂的肾脏进行免疫染色，轻轻摇动7天。
- 用二抗进行染色。
- 在37°C的染色缓冲液中用二抗（1：100或1：200，参见 材料表）对肾脏进行免疫染色，轻轻摇动7天。在室温下用PBST清洗肾脏1天9 （图1）。
- 固定后9，将肾脏浸入1%甲醛中的PB（37%甲醛和PB的1：36混合物）中3小时，并在室温下用PBS洗涤6小时（图1）。
4. 折射率 （RI） 匹配
- 准备立方体-R+。
- 通过混合45wt%的2，3-二甲基-1-苯基-5-吡唑啉酮/安替比林和30wt%的烟酰胺来制备CUBIC-R（见 材料表）。
- 按照先前发表的报告4，8，9，向 CUBIC-R 中添加 0.5 v% 的 N-丁酰基二乙醇胺，制备用于折射率 （RI） 匹配的 CUBIC-R+。
- 执行 RI 匹配。
- 将肾脏浸入 7 mL 的 50% （v/v） CUBIC-R+（水和 CUBIC-R+ 的 1：1 混合物）中，在 14 mL 圆底管中，在室温下轻轻摇动 1 天。然后，将其浸入 7 mL 的 CUBIC-R+ 中，在室温下轻轻摇动 2 天9 （图 1）。
注意：尽管肾脏在RI匹配开始时漂浮在50%的CUBIC-R +中，但在该过程结束时，肾脏在CUBIC-R +中下沉并变得透明（图2D）。
- 将肾脏浸入 7 mL 的 50% （v/v） CUBIC-R+（水和 CUBIC-R+ 的 1：1 混合物）中，在 14 mL 圆底管中，在室温下轻轻摇动 1 天。然后，将其浸入 7 mL 的 CUBIC-R+ 中，在室温下轻轻摇动 2 天9 （图 1）。
5. 图像采集与重建
- 在图像采集（RI = 1.51）5 （图3）期间，将RI匹配的肾脏浸入硅油（RI = 1.555）和矿物油（RI = 1.467）（55：45）的混合物中。
- 使用定制的9 光片荧光显微镜获取整个肾脏的3D图像（见 材料表）。以 16 位 TIFF 格式收集所有原始图像数据。使用成像分析软件（Imaris，参见 材料表）可视化和捕获 3D 渲染的图像。
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Representative Results
使用这种染色方法，可视化整个肾脏中的交感神经[抗酪氨酸羟化酶（TH）抗体]和动脉[抗α平滑肌肌动蛋白（αSMA）抗体]（图4A，B和视频1）9。缺血/再灌注损伤（IRI）后也可见异常的肾交感神经9，10（图4C）。此外，使用该协议实现了整个脾脏13中的交感神经可视化（图4D）。量化3D免疫荧光数据的一个例子如图5所示。
此外，在整个肾脏9 中可视化集合管[抗水通道蛋白2（AQP2）抗体]，近端小管的S1段[抗钠葡萄糖共转运蛋白2（SGLT2）抗体]和肾小球（抗鬼皮霉素抗体）是成功的（图6A）。使用这种肾小球的3D成像，在糖尿病肾病的早期阶段可视化肾小球肿大（抗鬼皮霉素抗体），通过药物给药抑制11 （图6B）。
图 1：组织清除和全安装免疫荧光染色。立方组织清除是一个两步过程：脱脂（CUBIC-L）和折射率（RI）匹配（CUBIC-R+）。脱脂过程后进行全安装染色。比例尺 = 10 毫米。该图像转载自长谷川等人9。请点击此处查看此图的大图。
图 2：处理过程的图像 。 （A） 将样品浸入 7 mL 的 50% 或 100% CUBIC-L 中，浸入 14 mL 圆底管中。在脱脂过程中，管子保持水平，轻轻摇晃。（B） 分配勺用于样品处理。（C）一个肾脏所需的染色缓冲液量为500-600μL。在染色过程中，管子保持垂直。（D）尽管样品在RI匹配开始时漂浮在50%的CUBIC-R +中，但在过程结束时，它在CUBIC-R +中下沉并变得透明。 请点击此处查看此图的大图。
图3：用于全肾3D成像的光片荧光显微镜。 光片荧光显微镜（LSFM）可实现透明样品的三维（3D）成像。此图像转载自长谷川等人9。数据采集期间使用浸油。两侧的光片照亮样品。激励信号通过位于垂直位置的物镜采集。载物台沿轴向移动，获得z-stack图像。比例尺 = 10 mm。 请点击此处查看此图的大图。
图4.交感神经和动脉的全肾三维成像。（A）交感神经[抗酪氨酸羟化酶（TH）抗体，绿色]和动脉[抗α平滑肌肌动蛋白（αSMA）抗体，洋红色]在整个肾脏中可见。（B）显示（A）的放大x-y平面图像[抗TH抗体，绿色;抗αSMA抗体，洋红色]。（C）肾缺血再灌注损伤（IRI）后的持续性去神经支配可视化。（D）脾脏中的交感神经也通过当前协议在整个脾脏中可视化。此图像转载自长谷川等人9。请点击此处查看此图的大图。
图5：三维免疫荧光染色的定量。显示了量化信号阳性体积与总肾脏体积之比的过程。根据每个阈值执行二进制转换。体积是通过计算感兴趣面积的积分获得的（体素大小：x = 6.45 μm，y = 6.45 μm，z = 7 μm）。该图像转载自长谷川等人9。请点击此处查看此图的大图。
图 6：集合管、近端小管和肾小球的全肾三维成像。 （A）集合管[抗水通道蛋白2（AQP2）抗体]，近端小管的S1段[抗钠葡萄糖共转运蛋白2（SGLT2）抗体]和肾小球（抗鬼皮菌素抗体）分别在整个肾脏中可视化。该图像转载自长谷川等人9。（B）在糖尿病肾病（抗鬼臼素抗体）的早期观察到肾小球肿大，通过药物给药抑制。该图像转载自Hasegawa等人11。请点击此处查看此图的大图。
视频1：肾脏旋转电影。 图4A中肾脏的旋转电影如图 4A 所示。交感神经[抗酪氨酸羟化酶（TH）抗体，绿色]和动脉[抗α平滑肌肌动蛋白（αSMA）抗体，洋红色]可见。 请点击此处下载此视频。
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Discussion
该协议允许对各种结构进行全肾3D成像，例如交感神经，集合管，动脉，近端小管和肾小球9，10，11。这种染色方法提供了宏观观察，并通过可视化缺血再灌注损伤9，10后肾交感神经的改变和糖尿病肾病初始阶段肾小球肿大11，带来了新的生物学发现。
不透明度来源于组织中的光学不均匀性5.各种组织清除方法的共同原理是去除光散射/吸收体，并使用RI匹配试剂满足空间。与基于有机溶剂的方法（例如溶剂清除器官的 3D 成像 （3DISCO/iDISCO）3，14）相比，CUBIC 基于亲水试剂，因此在荧光保存方面具有优势5。CUBIC 的这一特性使研究人员能够观察来自报告小鼠品系2 的荧光信号以及来自全卡口免疫荧光染色的信号，为全面了解 3D 器官结构提供了更多选择。
与以前的小鼠肾脏清除研究相比，目前基于CUBIC的组织清除方案可以实现3D成像的高透明度15。但是，必须注意的是，该清除方案适用于小鼠肾脏。需要更强的脱脂过程来清除人体肾脏。例如，Zhao等人最近提出了一种完整的人体器官映射方法，通过开发名为SHANEL（小胶束介导的人体器官有效清除和标记）的高效组织清除方法16。由于更强的脱脂会损坏样品，研究人员需要根据其目的选择合适的组织清除方法。
由于抗体穿透困难，全安装器官染色具有挑战性;本议定书是经过反复试验后制定的。由于优先考虑染色的稳定性，孵育时间可能比所需的最短时间长。因此，该方案已证明抗体对肾脏进行了高质量的整体安装染色。但是，它可能无法正常工作，具体取决于我们尚未尝试的靶抗原。最近的一项研究表明，在某些情况下，使用一抗和二抗（如当前方案）的两步染色对于小鼠大脑的全安装染色并不是最佳的17。这是因为当靶标量较大时，其一抗会充满样品，使二抗难以深入组织17。因此，如果抗体的渗透效率不高，荧光标记的一抗或一抗和二级Fab片段17的复合物值得尝试。
至于成像过程，研究人员需要根据自己的目的选择合适的显微镜类型和图像分辨率。如果研究人员想要进行本研究中提出的全肾3D成像，最好使用光片荧光显微镜，因为它可以快速获得具有低水平光漂白的宽z堆栈图像。由于3D成像数据的文件大小巨大，图像分辨率应降低到全器官成像可以承受的程度。相比之下，研究人员在狭窄空间内获得高分辨率的3D成像数据时，也可以使用共聚焦或多光子显微镜。
总之，目前的研究已经开发出使用组织清除方法CUBIC进行3D成像的全安装肾脏染色。该协议允许可视化整个肾脏中的3D结构，为肾脏研究提供宏观视角。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作的一部分是通过与Hiroki R. Ueda教授（东京大学），Etsuo A. Susaki教授（顺天堂大学），Tetsuhiro Tanaka教授（东北大学），Masafumi Fukagawa教授，Takehiko Wada博士和Hirotaka Komaba博士（东海大学）合作进行的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube | Falcon | 352059 | Tissue clearing, staining, wash |
| 2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine | Tokyo Chemical Industry | D1876 | CUBIC-R+ |
| 37%-Formaldehyde Solution | Nacalai Tesque | 16223-55 | Post fixation |
| 4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Nacalai Tesque | 09154-85 | Kidney fixation |
| Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG antibody | Invitrogen | A-21436 | Secondary antibody (1:100) |
| Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | A-31573 | Secondary antibody (1:200) |
| Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibody | Abcam | ab199975 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-podocin antibody | Sigma-Aldrich | P0372 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-sodium glucose cotransporter 2 (SGLT2) antibody | Abcam | ab85626 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody | Abcam | ab113 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-α-smooth muscle actin (α-SMA) antibody | Abcam | ab5694 | Primary antibody (1:200) |
| Blocker Casein in PBS | Thermo Fisher Scientific | 37528 | Staining buffer |
| Butorphanol Tartrate | Meiji | 005526 | Anesthetic |
| C57BL/6NJcl | Nippon Bio-Supp.Center | N/A | Mouse strain |
| Imaris | Bitplane | N/A | Imaging analysis software |
| Macro-zoom microscope | OLYMPUS | MVX10 | The observation unit of the custom-built microscope |
| Medetomidine Hydrochloride | Kyoritsu-Seiyaku | 008656 | Anesthetic |
| Midazolam | SANDOZ | 27803229 | Anesthetic |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Immersion oil |
| N-buthyldiethanolamine | Tokyo Chemical Industry | B0725 | CUBIC-L, CUBIC-R+ |
| Nicotinamide | Tokyo Chemical Industry | N0078 | CUBIC-R+ |
| Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | CUBIC-L, PBST |
| Silicon oil HIVAC-F4 | Shin-Etsu Chemical | 50449832 | Immersion oil |
| Sodium azide | Wako | 195-11092 | Staining buffer |
References
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