Summary
本文描述了一种使用精确控制手术和双光子显微镜对小鼠海马CA1中静息小胶质细胞 进行慢性体内 观察的方法。
Abstract
小胶质细胞是唯一驻留在大脑中的免疫细胞，通过修改突触和神经元兴奋性积极参与神经回路维持。最近的研究揭示了小胶质细胞在不同大脑区域的差异基因表达和功能异质性。海马神经网络在学习和记忆中的独特功能可能与小胶质细胞在突触重塑中的活跃作用有关。然而，外科手术引起的炎症反应在海马小胶质细胞的双光子显微镜分析中一直存在问题。在这里，提出了一种方法，该方法能够通过成像窗口在海马CA1的所有层中长期观察小胶质细胞。该方法允许分析小胶质细胞过程中的形态变化超过1个月。静息小胶质细胞的长期高分辨率成像需要微创外科手术、适当的物镜选择和优化的成像技术。海马小胶质细胞的短暂炎症反应可能会在手术后立即阻止成像，但小胶质细胞会在几周内恢复其静止形态。此外，与小胶质细胞同时成像神经元使我们能够分析海马体中多种细胞类型的相互作用。该技术可以提供有关海马体中小胶质细胞功能的基本信息。
Introduction
小胶质细胞是唯一驻留在大脑中的免疫细胞和组织巨噬细胞。除了作为免疫细胞的功能，例如对炎症的快速反应外，它们已被证明在神经回路的维持和重塑中发挥多种生理作用，例如突触修剪，突触可塑性的调节和控制神经元活动1，2，3，4，5 .小胶质细胞和神经元之间的生理相互作用在神经回路发育和疾病神经生物学中越来越受到关注。分析体内小胶质细胞的生理学需要观察小胶质细胞而没有组织损伤和炎症反应的方法。然而，小胶质细胞对炎症敏感，并响应组织损伤而显着改变其形状和功能6，7。
双光子体内成像是捕获小胶质细胞生理动力学的理想工具8。 体内双光子成像的初步应用揭示了成年小鼠皮层中用于环境监测的小胶质细胞过程的动态运动9，10。以下双光子成像研究进一步扩展了小胶质细胞的体内监测，用于分析与神经元的功能和结构相互作用5，11，12，13，14。然而，传统的双光子显微镜的成像深度已被限制在距大脑表面15，16小于1毫米。这种限制解释了先前报告小胶质细胞在大脑深部区域（如海马体）行为的稀缺性。
最近的RNA测序研究揭示了小胶质细胞相当大的区域异质性，提高了不同功能作用的可能性17，18，19，20，21。因此，有必要记录小胶质细胞与各个大脑区域的神经元的相互作用，但技术困难阻碍了此类研究。特别是，据报道，小胶质细胞积极参与突触重塑对于海马神经网络及其记忆相关功能的发展至关重要22，23。然而，目前还没有有效的方法来观察体内未受挑战的海马小胶质细胞。
该协议解释了使用精确控制的手术技术在海马背侧CA1中静息小胶质细胞的慢性体内观察的程序。在小胶质细胞24中表达GFP的CX3CR1-GFP小鼠（CX3CR1 + / GFP）中CA1区域的双光子成像能够以足够的分辨率观察CA1所有层中的分支小胶质细胞。该协议包括成功植入观察窗口和适当成像条件的几个技巧。此外，还介绍了CA1中锥体神经元和小胶质细胞的同时可视化作为应用示例。还讨论了该技术的优点、局限性和潜力。
Protocol
所有动物实验均按照东京大学动物伦理委员会和基因重组实验安全委员会的政策批准和进行。实验中使用了2-4个月的雄性和雌性CX3CR1-GFP小鼠。为了实验人员的安全和无菌条件的维持，所有程序都使用白大褂，口罩和无菌手套进行。所有器械在使用前都经过消毒。
1. 仪器和动物的准备
- 组装玻璃底金属管（图1A）。
- 将一小滴紫外线固化光学粘合剂涂在定制不锈钢管的一端（外径 3.0 毫米、内径 2.8 毫米、高度 1.7 毫米）。将胶水均匀地涂在管子的圆形边缘上。
注意：应使用足够量的粘合剂来覆盖管子的整个边缘。 - 将圆形玻璃盖玻片（直径3.0毫米，厚度0.15±0.02毫米）放在金属管的胶水覆盖端，然后将盖玻片轻轻按压在管子上，使管子和玻璃之间的间隙充满胶水。接下来，调整玻璃的位置以适合金属管的外边缘。
- 用紫外线照射玻璃足够的时间以固化粘合剂。
注意：确保玻璃和管子完全连接。如果粘附力不足，玻璃可能会在手术后脱落，导致成像不成功或脑脊液 （CSF） 泄漏。 - 用70%乙醇消毒组装好的玻璃底金属管，并用无菌盐水洗涤以去除碎屑。
- 将一小滴紫外线固化光学粘合剂涂在定制不锈钢管的一端（外径 3.0 毫米、内径 2.8 毫米、高度 1.7 毫米）。将胶水均匀地涂在管子的圆形边缘上。
- 用干热灭菌器对所有手术器械进行消毒。
- 为窗户植入手术准备小鼠。
注意：小鼠应达到适当的年龄。优选的是，它们经过基因工程改造以表达CA1和齿状回（DG）中的荧光蛋白。这些要点将在讨论部分进一步解释。
2.麻醉和头部固定
- 通过腹膜内注射氯胺酮 - 甲苯噻嗪（100mg / kg氯胺酮和10mg / kg甲苯噻嗪）麻醉小鼠。皮下注射美洛昔康（2mg / kg）用于术前镇痛。确认对疼痛刺激的反应消失，例如尾部捏，以确保足够的麻醉深度。每次麻醉在手术过程中消失时加入半剂量的氯胺酮 - 甲苯噻嗪，通常在初始给药后1小时，此后每30分钟一次。在身体下方使用加热垫提供热支持，并在眼睛上涂抹眼药膏以防止麻醉下干燥。
注意：手术麻醉的选择至关重要。这一点在讨论部分有详细讨论。 - 涂抹脱毛膏去除头皮上的毛发。用聚维酮碘磨砂膏和酒精以圆周运动对头皮进行几次消毒。将鼠标放在用无菌防水垫准备的手术平台上，并应用无菌布以确保手术部位。然后，用手术刀圆形切割并去除头皮，使顶骨和枕骨完全暴露在手术侧。
- 用棉签擦拭皮下结缔组织，同时涂抹无菌盐水以清除出血，从而去除皮下结缔组织。用圆头微型刀轻轻刮擦颅面以去除骨膜，这有助于加强水泥和骨骼之间的粘附（见步骤2.6）。
- 将牙科蚀刻材料涂在整个表面上，等待数十秒，然后用足够的无菌盐水冲洗。
- 使用防水墨水标记要去除的骨骼区域（直径为3.0毫米的圆形区域，中心距后方约2.5毫米，后部约2.5毫米，后侧约2.5毫米）。标记后，彻底擦干颅骨表面。
注意：开颅术的位置取决于海马体的大小，应针对不同的年龄进行优化。下面将介绍开颅术位置的有用指标（见步骤3.4.5，注）。 - 根据制造商的说明，使用牙科树脂水泥将厚度为1.0毫米，中心有一个直径为5.0毫米的孔的矩形铝板连接到头骨上。
- 小心地将板中心的孔与用笔标记的圆形区域对齐（见步骤2.5），使铝板平行于头骨的标记表面（图1B）。确保水泥紧紧密封板和骨头之间的所有间隙。等待约5分钟，使水泥充分硬化。
- 通过附加的板 将 鼠标放在带有角度调节器的头部固定装置上。
3.观察窗的植入
注意：以下外科手术应在体视显微镜下进行。
- 使用直径为3.0毫米的真皮冲头在头骨上做一个圆形凹槽。在步骤 2.5 中对齐圆形凹槽和用笔标记的区域。用轻轻的压力扭转真皮冲头，使凹槽深度逐渐增加。经常检查凹槽深度在整个圆周上是否恒定。
- 当真皮冲头到达颅骨的最内层时，在接触下面的硬脑膜之前，使用 30 G 针轻轻抬起中央骨岛。
注意： 凹槽底部有轻微液体泄漏，表明凹槽靠近硬脑膜。 - 使用硬脑膜拾取器取出硬脑膜。
注意：完全去除颅窗内的硬脑膜是必要的，并且需要使用细镊子小心地切除外围的残余硬脑膜。 - 轻轻吸出组织，通过连接到吸引器的 23 G 或 25 G 钝针暴露海马肺泡。
注：此步骤对于成功映像最为关键。组织抽吸的关键技术要点在讨论部分有详细说明。- 吸出软脑膜和软脑膜血管。
- 从表面吸出皮质组织。在整个颅窗上保持暴露组织表面的深度均匀。逐渐加深抽吸，直到外囊的纤维暴露出来。
- 小心地将吸头放在颅窗前外侧端的侧脑室 （LV） 附近的外囊上。去除沿尾状向前外侧方向运行的外囊表层，然后去除沿中外侧方向运行的内层。
注意：LV附近的外部话筒头可以很容易地从底层结构中移除。 - 通过检查肺泡表面和背海马连合（DHC）的完全暴露来确认整个外部胶囊的去除。
注意：DHC 覆盖 CA1 的尾部。肺泡和DHC可以通过它们的纤维取向与外部胶囊区分开来。也就是说，肺泡内的纤维和DHC沿前内侧到尾外侧方向运行，并且可以与外部胶囊中的纤维区分开来。肺泡和DHC紧紧地附着在CA1上，不应损坏。应去除外部胶囊的所有碎片，因为任何剩余的碎片都会阻止玻璃盖玻片与肺泡的直接接触。 - 确认出血已彻底停止，并用无菌盐水填充孔至颅骨表面的水平。
注意：此处的视野有助于判断孔是否处于适合鼠标特定年龄的位置。理想情况下，肺泡和下面的CA1应占据中心区域的大部分。DHC的一部分在尾状区域可见。左心室的开口可在前外侧边缘检测到（图3A）。
- 将玻璃底金属管（见步骤1.1）垂直插入孔中，同时吸出从管子侧面溢出的多余水，直到玻璃底部轻轻压在肺泡上并部分压平下面的CA1。
注意：此压力需要适当调整。如果太强，CA1会损坏。如果太弱，由于CA1曲率引起的球差将损害深层结构的成像分辨率。 - 使用牙科树脂水泥，将插入管的壁固定在周围的颅骨上（图1C）。确保整个圆周密封严密，没有空气或脑脊液泄漏。等待约5分钟，让水泥硬化。
注意：如果水泥在其粘度低时放置，它可能会通过管子和颅骨之间的间隙泄漏到脑实质中并损害大脑。因此，水泥应在聚合引发后应用，这样可以增加粘度并减少通过间隙的泄漏。 - 用无菌盐水清洗整个板、颅骨和管内以去除碎屑。
4. 手术后立即进行双光子显微镜检查，以检查手术质量
- 将鼠标放在双光子显微镜物镜下的头部固定装置中，并放在电动XY扫描载物台上。使用加热垫进行热支撑。如步骤2.1中所述监测和调整麻醉深度，因为此质量检查可能需要长达30分钟。
注意：建议使用工作距离（WD）大于3 mm且数值孔径（NA）较高的水浸物镜。物镜的校正环可以通过补偿玻璃和生物材料之间的折射率不匹配来提高分辨率。 - 用水填充玻璃和物镜之间的空间，特别注意避免气泡。如有必要，使用可容纳更多水的塑料薄膜扩大金属板的面积，以覆盖物镜的整个前透镜。
- 打开920nm波长的飞秒脉冲激光器以激发大脑中表达的荧光探针并启动图像采集软件。
- 使用电动载物台和电动对焦系统将焦点调整到 CA1。在脉冲激光的连续照明下，在脑实质发出的荧光和金属管边缘的反射光的引导下定位目标结构。
- 通过使用电动对焦系统调整焦点来测量接触玻璃底部的脑实质的深度。比较不同水平位置的深度，以判断玻璃底部和成像平面的对齐情况。
- 通过倾斜头部固定装置来调整鼠标头的角度，直到将玻璃底部设置为平行于成像平面。
- 调整物镜的校正环，以在CA1中目标结构的深度处实现最高分辨率。
- 确认DG上叶片分子层（ML）中的荧光细胞可以在距玻璃底部500μm的深度在整个视野中成像。
注意：此步骤对于判断手术质量很重要。如果CA1受损，局灶性脑水肿会阻止距离表面超过200μm深度的荧光检测。只有当CA1没有损坏，并且CA1层的曲率被上覆的盖玻片适当地压平时，才能在手术后立即检测到DG信号（图2A-D）。代表性结果部分提供了一种确定CA1和DG之间边界的简单方法。
5. 术后护理
- 吸出管内的水并用塑料密封盖住，以防止碎屑进入。
- 保持鼠标温暖并等待从麻醉中恢复。
- 每24小时皮下注射美洛昔康（2mg / kg），只要小鼠表现出疼痛相关行为。
- 在单个外壳中举起术后小鼠数周。
6. 使用 CX3CR1-GFP 小鼠对小胶质细胞进行体内慢性双光子成像
- 诱导麻醉后，用无菌盐水清洗金属管内部以去除碎屑。确保通过玻璃可以看到海马体的白色肺泡（图3A），并且没有术后出血等并发症。
- 按照步骤4.1至4.6将鼠标置于双光子显微镜下。
- 检查通过海马体的双光子激发获得的图像的质量和强度（图3B）。确保术后水肿减少后拍摄的图像与手术当天拍摄的图像相当或更好（图2A，见步骤4.5）。
注意：图像恶化表明大脑内存在组织损伤。 - 确保小胶质细胞已经恢复了其分支形态（图3C）。
注意：小胶质细胞的成像数据表明，小胶质细胞至少需要3-4周才能恢复到基础状态。 - 出于实验的特定目的，在CA1的任何层中进行 体内 成像。
Representative Results
使用这种技术，可以在背侧CA1的所有层内长期观察到分支和静止的小胶质细胞，包括原始层（SO），锥体层（SP），辐射层（SR）和腔隙分子层（SLM），特别是在手术后3-4周炎症消退时。如果手术进行得当，可以在手术后几个月内进行成像。本节包含三个对评估活体成像有用的主题。首先，提供手术后立即和慢性期的样本图像，作为适当的手术和成像程序的参考。其次，描述了小胶质细胞的独特形态、荧光强度和血管在特定海马层中的分布，以帮助读者估计从肺泡到DG的成像深度。第三，提供了一个应用示例，说明了神经元和小胶质细胞的同时成像。
手术后立即在CX3CR1-GFP小鼠中小胶质细胞的代表性图像如图 2所示。如果CA1没有明显损伤，并且CA1层的曲率被上覆的盖玻片适当地压平，则小胶质细胞的双光子成像深度超过整个CA1层，从手术表面达到500μm，其中存在DG的ML或颗粒细胞层（GCL）（图2A;见步骤4.7和 图4E).小胶质细胞的分支略少，特别是在靠近手术表面的层中，与完整海马体中的小胶质细胞相比。然而，它们没有表现出明显的激活，表明适当的外科手术（图2B）。另一方面，由组织损伤引起的CA1水肿会将成像深度限制在200μm（图2C）。组织损伤也会引起异常的小胶质细胞活化，例如向游离组织表面积聚凸起的过程（图2D;与图 2B的上图相比）。这些是不适当手术的迹象。
术后3周以上慢性期小胶质细胞的代表性图像如图3所示。小胶质细胞可以在CA1之外再次成像到DG的更深层，具有更高的荧光强度和分辨率以及更均匀的分布（参见步骤6.3，图3B）。成像质量优于手术后立即（图2A）。这种差异可以通过减少水肿和炎症来解释。所有层中的小胶质细胞已经恢复了其分支形态（图3C），与术后外观不同（图2B）。CA1中小胶质细胞的延时成像揭示了用于监测的固定细胞体和高度运动的过程（视频1-2）。它们的运动行为类似于之前关于皮层9中小胶质细胞过程动力学的报告。
使用在海马神经元25，26，27中表达荧光探针的小鼠，根据神经元的分布和深度指定成像的海马层是很简单的。在没有关于神经元细胞体的位置信息的帮助下，仅来自荧光小胶质细胞的信号就为海马层的识别提供了一些线索（图3B）。肺泡中的小胶质细胞具有细长的细胞体和过程，倾向于沿轴突束延伸（图4A）。其他层中的小胶质细胞可以通过其圆形细胞体和没有首选方向的辐射过程来区分。SP中的小胶质细胞属于密集排列的锥体神经元，可以通过小胶质细胞过程的较低密度来区分。SP上方和下方的层分别标识为SO和SR（图4B）。仅根据小胶质细胞特性无法区分SR和SLM。CA1和DG之间的边界由沿边界运行的厚血管识别（图4C）。通过用腹腔注射的磺酰罗丹明101（SR101;5mM，4μL/g体重）等染料标记血管，可以更好地识别这些血管（图4D）。与覆盖的CA1相比，来自小胶质细胞的荧光信号在DG中急剧下降，可能是由于这些结构的折射率不同。荧光强度的这种差距也可能有助于指定DG和CA1之间的边界。作为应用示例，显示了GFP阳性小胶质细胞和tdTomato标记的锥体神经元的同时成像（图4E）。在该实验中，CX3CR1-GFP小鼠接受注射腺相关病毒（AAV）以在海马锥体神经元中表达tdTomato。神经元标记将有助于了解CA1的确切层结构。
图1：植入观察窗的示意图 。 （A）组装好的玻璃底金属管的横截面图。圆形玻璃盖玻片粘附在圆柱形不锈钢管的一端。（B）附着在头骨上的铝板的横截面图。板应平行于颅骨的标记表面，以免干扰物镜，靠近板放置以进行聚焦。（C）植入管的横截面图。玻璃底部应紧贴海马体的肺泡，以轻轻按压和压平CA1的表面。 请点击此处查看此图的大图。
图2：手术后立即对CX3CR1-GFP小鼠进行小胶质细胞的 体内 成像 。 （A）术后第0天（宽度：511μm，高度：511μm，深度：550μm）对CX3CR1-GFP小鼠的 体内 CA1成像进行代表性3D重建。DG的ML中的荧光小胶质细胞在距离玻璃底部500μm的深度可以通过整个CA1成像。（B） 在 （A） 中获得的典型 GFP 填充小胶质细胞显示为距离玻璃底部 100、300 和 520 μm 深度处厚度为 20 μm 的图像堆栈的最大强度投影 （MIP）。从DG的浅表CA1到ML可检测到小胶质细胞形态，尽管DG的图像明显恶化。小胶质细胞，特别是在靠近手术表面的层中，分支较小，但没有表现出明显的激活。比例尺，50 μm。 （C） 手术损伤的 CA1 的代表性 3D 图像重建。数据是从 POD 0 上的 CX3CR1-GFP 鼠标（宽度：399 μm，高度：399 μm，深度：450 μm）上获取的。小胶质细胞荧光只能在200μm的深度内检测到，而未受损的CA1（A）在500μm的深度检测到荧光小胶质细胞。 （D）（C）中异常活化小胶质细胞的典型图像。在60μm深度处厚度为20μm的GFP图像堆栈的MIP显示了向手术暴露的组织表面延伸的小胶质细胞膨胀过程。整体小胶质细胞形态与（B）所示的图像不同。比例尺，100 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图3：慢性期CX3CR1-GFP小鼠小胶质细胞的 体内 成像 。 （A）慢性期右侧背侧CA1上植入窗口的代表性外观。透过玻璃底，可以清楚地观察到肺泡的白色纤维，没有术后出血。DHC和左心室分别在尾部区域和前外侧边缘部分可见。比例尺，1毫米。 （B）在POD 24上CX3CR1-GFP小鼠 体内慢性 CA1成像的代表性3D重建（宽度：511μm，高度：511μm，深度：670μm）。与手术后立即的图像（图2A）相比，小胶质细胞显示出更均匀的分布，并且由于水肿和炎症的减少，可以在DG的深层更清楚地观察到。（C）来自（B）的小胶质细胞的典型图像具有完全恢复的分支形态，显示为距离手术表面100，280和500μm深度处厚度为20μm的GFP图像堆栈的MIP。比例尺，50 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 4： 在体内 成像过程中识别海马体每一层的线索以及该方法的应用示例。 （A）慢性期CX3CR1-GFP小鼠肺泡中小胶质细胞的典型图像。沿轴突束延伸的小胶质细胞体和过程显示在 GFP 图像堆栈的 MIP 中，厚度为 10 μm，深度为 15 μm。比例尺，50 μm。 （B） 慢性期 SO、SP 和 SR 中小胶质细胞的代表性图像显示为 5 μm 厚度的 GFP 图像堆栈的 MIP。由于SP中密集的锥体神经元，SP中小胶质细胞过程的局部密度低于周围的SO或SR。 比例尺，100 μm。 （C）沿着CA1和DG之间边界运行的厚血管只能通过小胶质细胞荧光识别。显示了在约500 μm深度的慢性期厚度为90 μm的平铺GFP图像堆栈的平均强度投影。GFP信号的空隙对应于厚血管。比例尺，500 μm。 （D） （上） 腹膜内注射SR101后与C相同的视野的图像。比例尺，500 μm。 （下） SR101 注入后平铺图像的 3D 重建（宽度：2.60 毫米，高度：1.73 毫米，深度：0.69 毫米）。沿着CA1和DG之间边界运行的厚血管可以很容易地通过血管内SR101荧光识别。（E）（左）CA1和DG的3D重建（宽度：255μm，高度：255μm，深度：730μm）和（右）由20μm厚的图像堆栈制成的SP中GFP和tdTomato荧光的MIP。在手术前 1 周，将 1.5 μL AAV1-CAG-FLEX-tdTomato （5.0 x 10 12 vg/mL） 和 AAV1-hSyn-Cre （1.0 x10 9 vg/mL） 的混合物注射到 CX3CR1-GFP 小鼠的海马体中以稀疏地标记神经元。在POD 0上进行成像。SP和GCL很容易通过神经元细胞体的位置来识别。比例尺，50 μm。 请点击此处查看此图的大图。
视频1：慢性期SO小胶质细胞的延时成像。 在SO小胶质细胞的延时成像中，GFP图像的MIP以20μm厚度堆叠，动画化，以便在1秒内播放28分钟。比例尺，50 μm。 请点击此处下载此视频。
视频2：慢性期SR小胶质细胞的延时成像。 GFP图像的MIP在SR小胶质细胞的延时成像中以20μm厚度堆叠，动画化，以便在1秒内播放28分钟。比例尺，50 μm。 请点击此处下载此视频。
Discussion
这种方法包含复杂的外科手术，但如果准备得当，它可以在整个CA1上长时间提供高分辨率图像。几只小鼠的实验证实，慢性术后阶段的图像质量优于急性术后成像。更好的图像质量保持了2个多月。失败的最常见原因是手术过程中CA1的意外损坏，这在术后质量检查中确定（见步骤4）。这可能是由于误吸直接伤害、大脑干燥、玻璃压力过大或最后一步牙科水泥的毒性。失败的另一个原因是术后出血，可以在手术后1周内通过玻璃底窗确认（见步骤6.1）。仔细阅读协议并采取一切预防措施以避免此类麻烦。
即使目前在实验室中使用带有GaAsP探测器的双光子显微镜，由于不可忽视的光散射，试图通过皮层对背侧CA1进行成像也会导致分辨率的显着损失。因此，为了获得足够的分辨率来观察CA1中小胶质细胞过程的运动或神经元树突棘的形成，去除覆盖皮层的一部分是不可避免的，就像在这种方法中一样。在保持高图像分辨率的同时减少皮质去除程度的唯一替代方法是嵌入中继透镜，例如梯度折射率（GRIN）透镜。在这种方法中，GRIN透镜被放置在直接植入CA1上方的导管内，用于慢性CA1成像28，29。导管的外径为1.8毫米，小于本文中装置的3.0毫米，同时产生与此处系统相当的高分辨率（NA;0.82）（有效NA;0.88）。然而，使用GRIN镜头的方法具有用于高分辨率观察的窄视野和受GRIN镜头WD限制的短成像深度。因此，以高分辨率在宽视场内对所有海马层进行成像是本文该方法的一个具体优点。
该程序的局限性是皮层的部分去除和炎症可能对海马体产生一些不利影响。但由于被移除的皮层没有直接进入海马体，内嗅皮层没有损伤，海马体本身也没有直接损伤，总体评价是海马体的功能障碍不显著。先前的几项研究已经证实，海马窗口植入后保留了海马功能，包括学习和记忆25，26，27，30，31，32，33，34。因此，这里描述的成像方法有望在足够的术后时间后忠实地报告海马功能。
基于这种成像技术的研究对象的未来方向可能包括通过同时成像小胶质细胞和神经元5检测的突触修剪，学习相关的小胶质细胞与突触的相互作用35，由海马神经活动调节的小胶质细胞运动36，以及小胶质细胞对外周炎症或组织损伤的反应7.这种方法也将有助于阐明神经退行性疾病的进展。例如，在阿尔茨海默病（AD）中，淀粉样蛋白β和tau蛋白与神经元细胞死亡和海马萎缩同时积累，导致认知功能障碍;据报道，小胶质细胞参与了这一过程37，38。使用AD小鼠模型对小胶质细胞和神经元进行体内慢性成像将使我们能够监测AD小鼠模型海马体中小胶质细胞功能与神经元病理学之间的相关性。
本文侧重于小胶质细胞成像，但相同的成像程序适用于CA1中的其他神经元和神经胶质细胞类型。此外，该方案仅限于麻醉小鼠的成像，但该技术也可以扩展到监测清醒小鼠的海马小胶质细胞。由呼吸、心跳和身体运动引起的运动伪影，特别是在远离玻璃窗的深层海马层中，可能存在于清醒小鼠的实验中。因此，可能需要适当的运动校正系统来捕获小胶质细胞形态和动力学。
与《议定书》有关的讨论
建议选择具有适当年龄和遗传修饰的小鼠来表达具有时间和空间特异性的荧光探针（参见步骤1.3）。1个月大的小鼠可用于实验，但2个月以上的小鼠更容易处理，它们的体型较大，抗手术压力。此外，在年轻小鼠中，海马体的外部囊和肺泡更难分离。因此，在年轻小鼠中去除外部胶囊需要手术技巧（参见步骤3.4.3-4）。对于在CA1和DG中可重复且均匀地表达荧光蛋白的小鼠，手术评估和随后的成像将更加直接（参见步骤4.7）。因此，在手术的初始试验中，建议使用具有稀疏标记神经元的转基因小鼠，例如Thy1-YFP或Thy1-GFP小鼠39，或具有标记小胶质细胞的小鼠，例如CX3CR1-GFP小鼠24。
对于成功的手术，麻醉的选择很重要（见步骤2.1）。不同类型的麻醉可引起不同程度的术中脑水肿，影响手术难度、植入金属管的相对位置以及玻璃窗对脑的压迫程度。这些因素也可能影响手术后海马神经元的存活。
在暴露海马体的抽吸过程中（见步骤3.4），应注意以下几点，以尽量减少对大脑的损害，确保成像成功。通过在颅窗一侧放置一个出口，不断将无菌盐水供应到组织表面。防止组织表面在抽吸过程中暴露在空气中。组织抽吸的基本原理是通过液体流入吸头来去除组织表面。应避免吸头与组织直接接触。将施加在吸入管上的负压调整为最小值。逐步吸出组织，并确认每一步出血都得到控制。当出血时间延长时，请等到出血自发停止。保持抽吸距离出血部位较短的距离，并持续流动无菌盐水。吸出组织以创建一个圆柱形空间，其大小适合玻璃底金属管（参见步骤1.1）。选择 23 G 针头吸出厚血管或大组织碎片，选择 25 G 针头吸吮小组织碎片。
Disclosures
作者均无任何利益冲突。
Acknowledgments
我们要感谢M. Kondo和M. Matsuzaki借给我们XLPLN25XSVMP物镜。这项工作得到了日本科学促进会（JSPS）的资助，包括JSPS研究员补助金（18J21331至R.K.）和科学研究补助金（20H00481，20A301，20H05894，20H05895至S.O.），日本医学研究与发展机构（JP19gm1310003和JP17gm5010003至S.O.）以及日本科学技术振兴机构的Moonshot R&D（JPMJMS2024至H.M.）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 23 G blunt needles | NIPRO | 02-166 | Suction tips for aspiration. |
| 25 G blunt needles | NIPRO | 02-167 | Suction tips for aspiration. |
| 3 mm dermal punches (DermaPunch) | Maruho | 213001610 | Tools for craniotomy. |
| 30 G needles | Dentronics | Disposable needle No. 30 | Tools for craniotomy. |
| A femtosecond pulsed laser | Spectra-Physics | MaiTai Deep See | A Ti:Sapphire laser used at 920 nm wavelength. |
| A two-photon microscope | Nikon | A1R MP+ | Microscope for the CA1 imaging. |
| AAV1-CAG-FLEX-tdTomato | Penn Vector Core | AAV for neuronal labeling. | |
| AAV1-hSyn-Cre | Penn Vector Core | AAV for neuronal labeling. | |
| An objective lens for two-photon imaging | Olympus | XLPLN25XSVMP | 25× objective with a long working distance, a high numerical aperture, and a correction collar |
| Aspirators | Shin-ei Industries | KS-500 | Tools for aspiration. |
| Aluminum plates | Narishige | CP-1 | Plates made of alminum for head fixation. |
| Chemical depilatory cream | YANAGIYA | Cream for hair removal around the surgical site. | |
| Circular glass coverslips | Matsunami Glass | 3φ No.1 | Coverslips bonded to stainless steel tubes. |
| CX3CR1-GFP mice | The Jackson Laboratory | 008451 | Transgenic mice for microglial imaging. |
| Cylindrical stainless steel tubes | MORISHITA | Custom-made | Metal tubes to be implanted. Outer diameter 3.0 mm, inner diameter 2.8 mm, height 1.7 mm. |
| Dental etching material | Sun Medical | 204610461 | Used to etch the skull bones. |
| Dental resin cement (Super-Bond C&B) | Sun Medical | 204610555 | Dental cement. |
| Dura pickers (Micro Points) | Fine Science Tools | 10063-15 | Tools for dura removal. |
| Fine forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools | 11252-20 | Surgical tools. |
| Forceps | Bio Research Center | PRI13-3374 | Used to disinfect the surgical site. |
| Head holding device | Narishige | MAG-2 | The head holding device of mice with angle adjusters |
| Heating pad | Bio Research Center | BWT-100A and HB-10 | Tools to provide thermal support for the mouse during surgery. |
| Heating pad | ALA Scientific | HEATINGPAD-1 and Hot-1 | Tools to provide thermal support for the mouse on the head holding device. |
| Ketamine (Ketalar) | Daiichi Sankyo Company | S9-001665 | Anesthesia during surgery. |
| Meloxicam | Tokyo Chemical Industry | M1959 | Analgesia during surgery. |
| Ophthalmic ointment | Sato Pharmaceutical | Used to prevent eye dryness during surgery. | |
| Povidone-iodine scrub solution | Meiji Seika Pharma | 2612701Q1137 | Used to disinfect the surgical site. |
| Round-tipped miniature knives | Surgistar | 4769 | Surgical tools. |
| Scalpel | MURANAKA MEDICAL INSTRUMENTS | 450-098-67 | Disposable surgical tool. |
| Stereo microscopes | Leica Microsystems | S8 APO | Microscopes for surgery. |
| Sterile saline | Otsuka Pharmaceutical Factory | 3311401A2026 | Washing solution during surgery. |
| Sterile waterproof pad | AS ONE | 8-5945-01 | Surgical platform. |
| Sulforhodamine 101 | Sigma-Aldrich | S7635 | A dye for in vivo vessel imaging. |
| Surgical drape | Medline Industries | MP-0606F6T | Perforated drape for surgery. |
| UV light | Toshiba | GL15 | Used to cure the adhesives. |
| UV-curing optical adhesives | Thorlabs | NOA81 | Adhesives for bonding coverslips to stainless steel tubes. |
| Xylazine (Celactal 2%) | Bayer | Anesthesia during surgery. |
References
- Wolf, S. A., Boddeke, H. W. G. M., Kettenmann, H.
- Wake, H., Moorhouse, A. J., Miyamoto, A., Nabekura, J. Microglia: actively surveying and shaping neuronal circuit structure and function. Trends in Neurosciences. 36 (4), 209-217 (2012).
- Wu, Y., Dissing-Olesen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. Microglia: dynamic mediators of synapse development and plasticity. Trends in Immunology. 36 (10), 605-613 (2015).
- Nakayama, H., et al. Microglia permit climbing fiber elimination by promoting GABAergic inhibition in the developing cerebellum. Nature Communications. 9 (1), 2830 (2018).
- Iida, T., Tanaka, S., Okabe, S. Spatial impact of microglial distribution on dynamics of dendritic spines. The European Journal of Neuroscience. 49 (11), 1400-1417 (2019).
- Kettenmann, H., Hanisch, U., Noda, M., Verkhratsky, A.
- Kondo, S., Kohsaka, S., Okabe, S. Long-term changes of spine dynamics and microglia after transient peripheral immune response triggered by LPS in vivo. Molecular Brain. 4 (1), 27 (2011).
- Benninger, R. K. P., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Current Protocols in Cell Biology. 59 (1), 4-11 (2013).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nature Neuroscience. 8 (6), 752-758 (2005).
- Tremblay, M., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biology. 8 (11), 1000527 (2010).
- Miyamoto, A., et al. Microglia contact induces synapse formation in developing somatosensory cortex. Nature Communications. 7, 12540 (2016).
- Akiyoshi, R., et al. Microglia enhance synapse activity to promote local network synchronization. eNeuro. 5 (5), 0088 (2018).
- Favuzzi, E., et al. GABA-receptive microglia selectively sculpt developing inhibitory circuits. Cell. 184 (15), 4048-4063 (2021).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
- Isshiki, M., Okabe, S. Evaluation of cranial window types for in vivo two-photon imaging of brain microstructures. Microscopy. 63 (1), 53-63 (2014).
- Grabert, K., et al. Microglial brain region-dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nature Neuroscience. 19 (3), 504-516 (2016).
- De Biase, L. M., et al. Local cues establish and maintain region-specific phenotypes of basal ganglia microglia. Neuron. 95 (2), 341-356 (2017).
- Ayata, P., et al. Epigenetic regulation of brain region-specific microglia clearance activity. Nature Neuroscience. 21 (8), 1049-1060 (2018).
- Böttcher, C., et al. Human microglia regional heterogeneity and phenotypes determined by multiplexed single-cell mass cytometry. Nature Neuroscience. 22 (1), 78-90 (2019).
- Masuda, T., et al. Spatial and temporal heterogeneity of mouse and human microglia at single-cell resolution. Nature. 566 (7744), 388-392 (2019).
- Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).
- Wang, C., et al. Microglia mediate forgetting via complement-dependent synaptic elimination. Science. 367 (6478), 688-694 (2020).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX3CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Molecular and Cellular Biology. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Gu, L., et al. Long-term in vivo imaging of dendritic spines in the hippocampus reveals structural plasticity. The Journal of Neuroscience. 34 (42), 13948-13953 (2014).
- Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).
- Schmid, L. C., et al. Dysfunction of somatostatin-positive interneurons associated with memory deficits in an Alzheimer's disease model. Neuron. 92 (1), 114-125 (2016).
- Barretto, R. P., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses. Nature Methods. 6 (7), 511-512 (2009).
- Attardo, A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. Impermanence of dendritic spines in live adult CA1 hippocampus. Nature. 523 (7562), 592-596 (2015).
- Sheffield, M. E. J., Dombeck, D. A. Calcium transient prevalence across the dendritic arbour predicts place field properties. Nature. 517 (7533), 200-204 (2015).
- Attardo, A., et al. Long-term consolidation of ensemble neural plasticity patterns in hippocampal area CA1. Cell Reports. 25 (3), 640-650 (2018).
- Kaifosh, P., Lovett-Barron, M., Turi, G. F., Reardon, T. R., Losonczy, A. Septo-hippocampal GABAergic signaling across multiple modalities in awake mice. Nature Neuroscience. 16 (9), 1182-1184 (2013).
- Lovett-Barron, M., et al. Dendritic inhibition in the hippocampus supports fear learning. Science. 343 (6173), 857-863 (2014).
- Hainmueller, T., Bartos, M. Parallel emergence of stable and dynamic memory engrams in the hippocampus. Nature. 558 (7709), 292-296 (2018).
- Parkhurst, C., et al. Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor. Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).
- Merlini, M., et al. Microglial Gi-dependent dynamics regulate brain network hyperexcitability. Nature Neuroscience. 24 (1), 19-23 (2021).
- Sarlus, H., Heneka, M. T.
- Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M.
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
