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Neuroscience

Vivo में माउस हिप्पोकैम्पस में माइक्रोग्लिया की क्रोनिक टू-फोटॉन इमेजिंग

Published: July 6, 2022 doi: 10.3791/64104
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Cellular Neurobiology, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo

Summary

यह पेपर सटीक रूप से नियंत्रित सर्जरी और दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके माउस हिप्पोकैम्पल सीए 1 में आराम करने वाले माइक्रोग्लिया के क्रोनिक इन विवो अवलोकन के लिए एक विधि का वर्णन करता है।

Abstract

माइक्रोग्लिया, मस्तिष्क में रहने वाली एकमात्र प्रतिरक्षा कोशिकाएं, सिनैप्स और न्यूरोनल उत्तेजना को संशोधित करके तंत्रिका सर्किट रखरखाव में सक्रिय रूप से भाग लेती हैं। हाल के अध्ययनों ने विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों में माइक्रोग्लिया की अंतर जीन अभिव्यक्ति और कार्यात्मक विषमता का खुलासा किया है। सीखने और स्मृति में हिप्पोकैम्पल तंत्रिका नेटवर्क के अद्वितीय कार्य सिनैप्स रीमॉडेलिंग में माइक्रोग्लिया की सक्रिय भूमिकाओं से जुड़े हो सकते हैं। हालांकि, सर्जिकल प्रक्रियाओं से प्रेरित भड़काऊ प्रतिक्रियाएं हिप्पोकैम्पल माइक्रोग्लिया के दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपिक विश्लेषण में समस्याग्रस्त रही हैं। यहां, एक विधि प्रस्तुत की गई है जो एक इमेजिंग विंडो के माध्यम से हिप्पोकैम्पल सीए 1 की सभी परतों में माइक्रोग्लिया के पुराने अवलोकन को सक्षम बनाती है। यह विधि 1 महीने से अधिक समय तक माइक्रोग्लियल प्रक्रियाओं में रूपात्मक परिवर्तनों के विश्लेषण की अनुमति देती है। आराम करने वाले माइक्रोग्लिया की दीर्घकालिक और उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए न्यूनतम इनवेसिव सर्जिकल प्रक्रियाओं, उचित उद्देश्य लेंस चयन और अनुकूलित इमेजिंग तकनीकों की आवश्यकता होती है। हिप्पोकैम्पल माइक्रोग्लिया की क्षणिक भड़काऊ प्रतिक्रिया सर्जरी के तुरंत बाद इमेजिंग को रोक सकती है, लेकिन माइक्रोग्लिया कुछ हफ्तों के भीतर अपनी क्वीसेंट आकृति विज्ञान को बहाल करती है। इसके अलावा, माइक्रोग्लिया के साथ एक साथ इमेजिंग न्यूरॉन्स हमें हिप्पोकैम्पस में कई सेल प्रकारों की बातचीत का विश्लेषण करने की अनुमति देता है। यह तकनीक हिप्पोकैम्पस में माइक्रोग्लियल फ़ंक्शन के बारे में आवश्यक जानकारी प्रदान कर सकती है।

Introduction

माइक्रोग्लिया मस्तिष्क में रहने वाली एकमात्र प्रतिरक्षा कोशिकाएं और ऊतक मैक्रोफेज हैं। प्रतिरक्षा कोशिकाओं के रूप में उनके कार्यों के अलावा, जैसे कि सूजन के लिए तेजी से प्रतिक्रिया, उन्हें तंत्रिका सर्किट के रखरखाव और रीमॉडेलिंग में विभिन्न प्रकार की शारीरिक भूमिकाएं निभाने के लिए दिखाया गया है, जैसे कि सिनैप्टिक प्रूनिंग, सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी का विनियमन, और न्यूरोनल गतिविधिका नियंत्रण 1,2,3,4,5 . माइक्रोग्लिया और न्यूरॉन्स के बीच शारीरिक बातचीत तंत्रिका सर्किट विकास और रोग न्यूरोबायोलॉजी दोनों में बढ़ती रुचि है। विवो में माइक्रोग्लिया के शरीर विज्ञान का विश्लेषण करने के लिए ऊतक क्षति और भड़काऊ प्रतिक्रियाओं के बिना माइक्रोग्लिया का निरीक्षण करने के तरीकों की आवश्यकता होती है। हालांकि, माइक्रोग्लिया सूजन के प्रति संवेदनशील हैं और ऊतक क्षति 6,7 के जवाब में नाटकीय रूप से अपने आकार और कार्यों को बदलते हैं।

विवो इमेजिंग में दो-फोटॉन माइक्रोग्लिया8 की शारीरिक गतिशीलता को पकड़ने के लिए एक आदर्श उपकरण है। विवो टू-फोटॉन इमेजिंग के प्रारंभिक अनुप्रयोगों ने वयस्क माउस कॉर्टेक्स 9,10 में पर्यावरण निगरानी के लिए माइक्रोग्लियल प्रक्रियाओं के गतिशील आंदोलन का खुलासा किया। निम्नलिखित दो-फोटॉन इमेजिंग अध्ययनों ने न्यूरॉन्स 5,11,12,13,14 के साथ कार्यात्मक और संरचनात्मक बातचीत के विश्लेषण के लिए माइक्रोग्लिया की विवो निगरानी को आगे बढ़ाया। हालांकि, पारंपरिक दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी की इमेजिंग गहराई मस्तिष्क की सतह 15,16 से1 मिमी से कम तक सीमित है। यह बाधा हिप्पोकैम्पस जैसे गहरे मस्तिष्क क्षेत्रों में माइक्रोग्लिया के व्यवहार की रिपोर्ट करने वाले पिछले अध्ययनों की कमी की व्याख्या करती है।

हाल के आरएनए अनुक्रमण अध्ययनों ने माइक्रोग्लिया की काफी क्षेत्रीय विषमता का खुलासा किया है, जिससे अलग-अलग कार्यात्मक भूमिकाओं की संभावना बढ़ गई है 17,18,19,20,21। इसलिए, विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों में न्यूरॉन्स के साथ माइक्रोग्लियल इंटरैक्शन रिकॉर्ड करना आवश्यक है, लेकिन तकनीकी कठिनाइयों ने ऐसे अध्ययनों में बाधा डाली है। विशेष रूप से, सिनैप्स रीमॉडेलिंग में माइक्रोग्लियल सक्रिय भागीदारी को हिप्पोकैम्पल तंत्रिका नेटवर्क और इसके स्मृति से संबंधित कार्योंके विकास में महत्वपूर्ण बताया गया है। हालांकि, विवो में बिना चुनौती वाले हिप्पोकैम्पल माइक्रोग्लिया को देखने के लिए प्रभावी तरीके उपलब्ध नहीं हैं।

यह प्रोटोकॉल ठीक से नियंत्रित शल्य चिकित्सा तकनीकों का उपयोग करके पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस के सीए 1 में माइक्रोग्लिया को आराम देने के क्रोनिक विवो अवलोकन के लिए प्रक्रियाओं की व्याख्या करता है। सीएक्स 3 सीआर 1-जीएफपी चूहों (सीएक्स 3 सीआर 1 + / जीएफपी) में सीए 1 क्षेत्र की दो-फोटॉन इमेजिंग, जो माइक्रोग्लिया24 में जीएफपी को व्यक्त करती है, ने पर्याप्त रिज़ॉल्यूशन के साथ सीए 1 की सभी परतों में रैमिफाइड माइक्रोग्लिया के अवलोकन को सक्षम किया। प्रोटोकॉल में अवलोकन विंडो और उचित इमेजिंग स्थितियों के सफल आरोपण के लिए कई सुझाव शामिल हैं। इसके अलावा, सीए 1 में पिरामिड न्यूरॉन्स और माइक्रोग्लिया के एक साथ विज़ुअलाइज़ेशन को एक आवेदन उदाहरण के रूप में प्रस्तुत किया गया है। इस तकनीक के फायदे, सीमाएं और क्षमता पर भी चर्चा की गई है।

Protocol

टोक्यो विश्वविद्यालय में पशु नैतिकता समिति और आनुवंशिक पुनः संयोजक प्रयोग सुरक्षा समिति की नीतियों के बाद सभी पशु प्रयोगों को मंजूरी दी गई और किया गया। प्रयोगों में 2-4 महीने की आयु के नर और मादा दोनों सीएक्स 3सीआर 1-जीएफपी चूहों का उपयोग किया गया था। प्रयोगकर्ताओं की सुरक्षा और बाँझ स्थितियों के रखरखाव के लिए, सभी प्रक्रियाओं को सफेद कोट, मास्क और बाँझ दस्ताने के साथ किया गया था। उपयोग से पहले सभी उपकरणों को निष्फल कर दिया गया था।

1. उपकरणों और जानवरों की तैयारी

  1. एक ग्लास-बॉटम धातु ट्यूब को इकट्ठा करें (चित्रा 1 ए)।
    1. कस्टम-निर्मित स्टेनलेस ट्यूब (बाहरी व्यास 3.0 मिमी, आंतरिक व्यास 2.8 मिमी, ऊंचाई 1.7 मिमी) के एक छोर पर यूवी-इलाज ऑप्टिकल चिपकने वाला की एक छोटी बूंद लागू करें। ट्यूब के गोलाकार किनारे पर गोंद को समान रूप से फैलाएं।
      नोट: ट्यूब के पूरे किनारे को कवर करने के लिए चिपकने वाले की पर्याप्त मात्रा का उपयोग किया जाना चाहिए।
    2. धातु ट्यूब के गोंद से ढके छोर पर एक गोलाकार ग्लास कवरस्लिप (3.0 मिमी व्यास, 0.15 ± 0.02 मिमी मोटाई) रखें, और ट्यूब के खिलाफ कवरस्लिप को हल्के से दबाएं ताकि ट्यूब और ग्लास के बीच का अंतर गोंद से भर जाए। इसके बाद, धातु ट्यूब के बाहरी किनारे के भीतर फिट होने के लिए ग्लास की स्थिति को समायोजित करें।
    3. चिपकने वाले को ठीक करने के लिए पर्याप्त समय के लिए यूवी प्रकाश के साथ ग्लास को विकिरणित करें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि ग्लास और ट्यूब पूरी तरह से जुड़े हुए हैं। यदि आसंजन अपर्याप्त है, तो सर्जरी के बाद ग्लास बंद हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) की असफल इमेजिंग या रिसाव हो सकता है।
    4. इकट्ठे ग्लास-बॉटम धातु ट्यूब को 70% इथेनॉल के साथ कीटाणुरहित करें और मलबे को हटाने के लिए बाँझ खारा से धोएं।
  2. सूखी गर्मी स्टरलाइज़र के साथ सभी सर्जिकल उपकरणों को निष्फल करें।
  3. खिड़की आरोपण की सर्जरी के लिए चूहों को तैयार करें।
    नोट: चूहे उचित उम्र के होने चाहिए। यह बेहतर है कि वे आनुवंशिक रूप से सीए 1 और डेंटेट गाइरस (डीजी) में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने के लिए इंजीनियर हैं। इन बिंदुओं को आगे चर्चा अनुभाग में समझाया गया है।

2. एनेस्थीसिया और सिर निर्धारण

  1. केटामाइन-ज़ाइलाज़िन (100 मिलीग्राम / किग्रा केटामाइन और 10 मिलीग्राम / किग्रा ज़ाइलाज़िन) के इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा एक माउस को एनेस्थेटाइज करें। प्री-ऑपरेटिव एनाल्जेसिया के लिए चमड़े के नीचे इंजेक्शन द्वारा मेलोक्सिकैम (2 मिलीग्राम / किग्रा) का प्रशासन करें। एनेस्थीसिया की पर्याप्त गहराई सुनिश्चित करने के लिए दर्दनाक उत्तेजनाओं की प्रतिक्रिया के गायब होने की पुष्टि करें, जैसे कि पूंछ की चुटकी। हर बार जब एनेस्थीसिया सर्जरी के दौरान बंद हो जाता है, तो केटामाइन-ज़ाइलाज़िन की आधी खुराक जोड़ें, आमतौर पर प्रारंभिक प्रशासन के 1 घंटे बाद और उसके बाद हर 30 मिनट। थर्मल सहायता प्रदान करने के लिए शरीर के नीचे एक हीटिंग पैड का उपयोग करें और संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर नेत्र मरहम लागू करें।
    नोट: सर्जरी के लिए संज्ञाहरण का विकल्प आवश्यक है। चर्चा खंड में इस बिंदु पर विस्तार से चर्चा की गई है।
  2. स्कैल्प से बालों को हटाने के लिए डेपिलेटरी क्रीम लगाएं। शराब के बाद पोविडोन-आयोडीन स्क्रब के साथ एक गोलाकार गति में खोपड़ी को कई बार कीटाणुरहित करें। माउस को बाँझ जलरोधक पैड के साथ तैयार सर्जिकल प्लेटफॉर्म पर रखें और सर्जिकल साइट को सुरक्षित करने के लिए बाँझ ड्रेप लागू करें। फिर, खोपड़ी को एक स्केलपेल के साथ गोलाकार काटें और हटा दें ताकि पार्श्विका और ओसीसीपटल हड्डियां पूरी तरह से ऑपरेटिव साइड पर उजागर हों।
  3. रक्तस्राव को साफ करने के लिए बाँझ खारा लगाते समय इसे कपास के फाहे से रगड़कर चमड़े के नीचे संयोजी ऊतक को हटा दें। पेरीओस्टेम को हटाने के लिए एक गोल-टिन वाले लघु चाकू के साथ कपाल की सतह को धीरे से खुरचें, जो सीमेंट और हड्डी के बीच आसंजन को मजबूत करने में मदद करता है (चरण 2.6 देखें)।
  4. दंत नक़्क़ाशी सामग्री को पूरी सतह पर लागू करें, दसियों सेकंड तक प्रतीक्षा करें, और पर्याप्त बाँझ खारा के साथ कुल्ला करें।
  5. जलरोधक स्याही का उपयोग करके, हटाने के लिए हड्डी के क्षेत्र को चिह्नित करें (3.0 मिमी के व्यास के साथ एक गोलाकार क्षेत्र, लगभग 2.5 मिमी पीछे और 2.5 मिमी पार्श्व में ब्रेग्मा)। अंकन के बाद, खोपड़ी की सतह को अच्छी तरह से सुखाएं।
    नोट: क्रानियोटॉमी की स्थिति हिप्पोकैम्पस के आकार पर निर्भर करती है और इसे विभिन्न उम्र के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। क्रैनियोटॉमी की स्थिति के लिए उपयोगी संकेतक नीचे प्रस्तुत किए जाएंगे (चरण 3.4.5, नोट देखें)।
  6. निर्माता के निर्देशों के अनुसार दंत राल सीमेंट का उपयोग करके खोपड़ी में 1.0 मिमी की मोटाई के साथ आयताकार एल्यूमीनियम प्लेट और केंद्र में 5.0 मिमी व्यास के छेद के साथ संलग्न करें।
    1. प्लेट के केंद्र में छेद को पेन से चिह्नित गोलाकार क्षेत्र के साथ सावधानीपूर्वक संरेखित करें (चरण 2.5 देखें) ताकि एल्यूमीनियम प्लेट खोपड़ी की चिह्नित सतह के समानांतर हो (चित्रा 1 बी)। सुनिश्चित करें कि सीमेंट प्लेट और हड्डी के बीच सभी अंतराल को कसकर सील करता है। सीमेंट को पर्याप्त रूप से सख्त होने के लिए लगभग 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
  7. माउस को संलग्न प्लेट के माध्यम से कोण समायोजक के साथ हेड होल्डिंग डिवाइस पर रखें।

3. अवलोकन खिड़की का आरोपण

नोट: निम्नलिखित शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं को स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत किया जाना चाहिए।

  1. 3.0 मिमी के व्यास के साथ एक त्वचीय पंच का उपयोग करके खोपड़ी पर एक गोलाकार नाली बनाएं। चरण 2.5 में एक कलम के साथ चिह्नित गोलाकार नाली और क्षेत्र को संरेखित करें। कोमल दबाव के साथ त्वचीय पंच को मोड़ें ताकि नाली की गहराई धीरे-धीरे बढ़ जाए। अक्सर जांचें कि नाली की गहराई पूरी परिधि पर स्थिर है।
  2. जब त्वचीय पंच क्रैनियम की सबसे भीतरी परत तक पहुंचता है, तो अंतर्निहित ड्यूरा को छूने से पहले, 30 ग्राम सुई का उपयोग करके केंद्रीय हड्डी द्वीप को धीरे से उठाएं।
    नोट: नाली के नीचे से मामूली तरल रिसाव इंगित करता है कि नाली ड्यूरा के करीब है।
  3. ड्यूरा पिकर का उपयोग करके ड्यूरा को हटा दें।
    नोट: कपाल खिड़की के भीतर ड्यूरा को पूरी तरह से हटाना आवश्यक है और इसके लिए ठीक बल का उपयोग करके परिधि पर अवशिष्ट ड्यूरा के सावधानीपूर्वक शोधन की आवश्यकता होगी।
  4. धीरे-धीरे हिप्पोकैम्पस के एल्वस को 23 जी या 25 ग्राम ब्लंट सुइयों द्वारा उजागर करने के लिए ऊतक को एस्पिरेट करें।
    नोट: यह कदम सफल इमेजिंग के लिए सबसे महत्वपूर्ण है। ऊतक आकांक्षा के लिए प्रमुख तकनीकी बिंदुओं को चर्चा अनुभाग में विस्तार से वर्णित किया गया है।
    1. पिया और पियाल वाहिकाओं को एस्पिरेट करें।
    2. सतह से कॉर्टिकल ऊतक को एस्पिरेट करें। पूरे कपाल खिड़की पर उजागर ऊतक की सतह की गहराई को सजातीय रखें। धीरे-धीरे आकांक्षा को गहरा करें जब तक कि बाहरी कैप्सूल के फाइबर उजागर न हों।
    3. कपाल खिड़की के रोस्ट्रोलेटरल छोर पर स्थित पार्श्व वेंट्रिकल (एलवी) के पास बाहरी कैप्सूल के लिए सक्शन टिप को सावधानीपूर्वक रखें। कोडोमेडियल में चलने वाले बाहरी कैप्सूल की सतह की परत को रोस्ट्रोलेटरल दिशा में हटा दें, और फिर मेडियोलेटरल दिशा में चलने वाली आंतरिक परत।
      नोट: एलवी के पास बाहरी कैप्सूल को अंतर्निहित संरचना से आसानी से हटाया जा सकता है।
    4. एल्वस और पृष्ठीय हिप्पोकैम्पल कमिसर (डीएचसी) की सतह के पूर्ण जोखिम की जांच करके पूरे बाहरी कैप्सूल को हटाने की पुष्टि करें।
      नोट: डीएचसी सीए 1 के कॉडोमेडियल हिस्से को कवर करता है। एल्वियस और डीएचसी को उनके फाइबर ओरिएंटेशन द्वारा बाहरी कैप्सूल से अलग किया जा सकता है। अर्थात्, एल्वियस और डीएचसी के भीतर फाइबर रोस्ट्रोमेडियल से कॉडोलेटरल दिशा में चलते हैं, और बाहरी कैप्सूल में फाइबर से अलग किए जा सकते हैं। एल्वियस और डीएचसी सीए 1 से कसकर जुड़े हुए हैं और उन्हें क्षतिग्रस्त नहीं किया जाना चाहिए। बाहरी कैप्सूल के सभी टुकड़ों को हटा दिया जाना चाहिए, क्योंकि कोई भी शेष टुकड़ा ग्लास कवरस्लिप के सीधे संपर्क को एल्वस से रोक देगा।
    5. पुष्टि करें कि रक्तस्राव अच्छी तरह से बंद हो गया है और खोपड़ी की सतह के स्तर तक बाँझ खारा के साथ छेद भरें।
      नोट: यहां दृश्य का क्षेत्र यह तय करने में मदद करता है कि छेद माउस की विशिष्ट आयु के लिए उपयुक्त स्थिति में है या नहीं। आदर्श रूप से, एल्वियस और अंतर्निहित सीए 1 को अधिकांश केंद्रीय क्षेत्र पर कब्जा करना चाहिए। डीएचसी का एक हिस्सा कॉडोमेडियल क्षेत्र में दिखाई देता है। एलवी का उद्घाटन रोस्ट्रोलेटरल किनारे (चित्रा 3 ए) पर पता लगाने योग्य है।
  5. ग्लास-बॉटम धातु ट्यूब (चरण 1.1 देखें) को छेद में लंबवत रूप से डालें, जब तक कि ट्यूब के किनारों से अतिप्रवाह होने वाले अतिरिक्त पानी को तब तक दबाएं जब तक कि ग्लास का तल हल्के से एल्वस के खिलाफ न दबाए और आंशिक रूप से अंतर्निहित सीए 1 को समतल कर दे।
    नोट: इस दबाव को उचित रूप से समायोजित करने की आवश्यकता है। यदि यह बहुत मजबूत है, तो सीए 1 क्षतिग्रस्त हो जाएगा। यदि यह बहुत कमजोर है, तो सीए 1 की वक्रता के कारण गोलाकार विपथन गहरी संरचनाओं में इमेजिंग रिज़ॉल्यूशन को खराब कर देगा।
  6. दंत राल सीमेंट का उपयोग करके, आसपास की खोपड़ी में डाली गई ट्यूब की दीवार को ठीक करें (चित्रा 1 सी)। सुनिश्चित करें कि पूरी परिधि को कसकर सील कर दिया गया है और हवा या सीएसएफ का कोई रिसाव नहीं है। सीमेंट के सख्त होने के लिए लगभग 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
    नोट: यदि सीमेंट को तब रखा जाता है जब इसकी चिपचिपाहट कम होती है, तो यह ट्यूब और खोपड़ी के बीच की खाई के माध्यम से मस्तिष्क पैरेन्काइमा में लीक हो सकता है और मस्तिष्क को नुकसान पहुंचा सकता है। इसलिए, सीमेंट को पोलीमराइजेशन दीक्षा के बाद लागू किया जाना चाहिए, जो चिपचिपाहट को बढ़ाता है और अंतराल के माध्यम से रिसाव को कम करता है।
  7. मलबे को हटाने के लिए बाँझ खारा के साथ पूरी प्लेट, खोपड़ी और ट्यूब के अंदर धोएं।

4. सर्जरी की गुणवत्ता की जांच के लिए सर्जरी के तुरंत बाद दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी

  1. माउस को दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप के उद्देश्य लेंस के तहत और मोटराइज्ड एक्सवाई स्कैनिंग स्टेज पर हेड-होल्डिंग डिवाइस में सेट करें। थर्मल समर्थन के लिए हीटिंग पैड का उपयोग करें। चरण 2.1 में वर्णित संज्ञाहरण की गहराई की निगरानी और समायोजन करें, क्योंकि इस गुणवत्ता की जांच में 30 मिनट तक का समय लग सकता है।
    नोट: 3 मिमी से अधिक कार्य दूरी (डब्ल्यूडी) और उच्च संख्यात्मक एपर्चर (एनए) के साथ पानी-विसर्जन उद्देश्य लेंस की सिफारिश की जाती है। ऑब्जेक्टिव लेंस का एक सुधार कॉलर ग्लास और बायोमैटेरियल्स के बीच अपवर्तक सूचकांक बेमेल की भरपाई करके रिज़ॉल्यूशन में सुधार कर सकता है।
  2. हवा के बुलबुले से बचने के लिए विशेष ध्यान रखते हुए, ग्लास और ऑब्जेक्टिव लेंस के बीच की जगह को पानी से भरें। यदि आवश्यक हो, तो उद्देश्य के पूरे सामने के लेंस को कवर करने के लिए, प्लास्टिक फिल्म का उपयोग करके धातु प्लेट के क्षेत्र का विस्तार करें, जिसमें अधिक पानी होता है।
  3. मस्तिष्क में व्यक्त फ्लोरोसेंट जांच की उत्तेजना के लिए 920 एनएम तरंग दैर्ध्य के एक फेम्टोसेकंड स्पंदित लेजर चालू करें और छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर शुरू करें।
  4. मोटर चालित चरण और मोटर चालित फोकस सिस्टम के उपयोग के साथ सीए 1 पर फोकस समायोजित करें। स्पंदित लेजर द्वारा निरंतर रोशनी के तहत मस्तिष्क पैरेन्काइमा से उत्सर्जित प्रतिदीप्ति और धातु ट्यूब के किनारे से परावर्तित प्रकाश के मार्गदर्शन के साथ लक्ष्य संरचना को रखें।
  5. मोटराइज्ड फोकस सिस्टम के साथ फोकस को समायोजित करके ग्लास के तल को छूने वाले मस्तिष्क पैरेन्काइमा की गहराई को मापें। ग्लास बॉटम और इमेजिंग प्लेन के संरेखण का न्याय करने के लिए विभिन्न क्षैतिज स्थानों पर गहराई की तुलना करें।
    1. हेड होल्डिंग डिवाइस को झुकाकर माउस हेड के कोण को समायोजित करें जब तक कि ग्लास बॉटम इमेजिंग प्लेन के समानांतर सेट न हो जाए।
  6. सीए 1 में लक्ष्य संरचना की गहराई पर उच्चतम रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने के लिए उद्देश्य के सुधार कॉलर को समायोजित करें।
  7. पुष्टि करें कि ग्लास तल से 500 μm की गहराई पर डीजी ऊपरी ब्लेड की आणविक परत (एमएल) में फ्लोरोसेंट कोशिकाओं को पूरे क्षेत्र में चित्रित किया जा सकता है।
    नोट: यह कदम सर्जरी की गुणवत्ता को आंकने में महत्वपूर्ण है। यदि सीए 1 क्षतिग्रस्त है, तो फोकल ब्रेन एडिमा सतह से 200 μm से अधिक की गहराई पर प्रतिदीप्ति का पता लगाने से रोकता है। केवल जब सीए 1 को कोई नुकसान नहीं होता है, और सीए 1 परतों की वक्रता को ओवरलाइंग कवरस्लिप द्वारा ठीक से चपटा किया जाता है, तो डीजी संकेतों को सर्जरी के तुरंत बाद पता लगाया जा सकता है (चित्रा 2 ए-डी)। प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग सीए 1 और डीजी के बीच सीमा निर्धारित करने का एक सरल तरीका प्रदान करता है।

5. पोस्टऑपरेटिव देखभाल

  1. ट्यूब के अंदर पानी को एस्पिरेट करें और मलबे को प्रवेश करने से रोकने के लिए इसे प्लास्टिक की सील से कवर करें।
  2. माउस को गर्म रखें और संज्ञाहरण से वसूली की प्रतीक्षा करें।
  3. जब तक माउस दर्द से संबंधित व्यवहार प्रदर्शित करता है, तब तक हर 24 घंटे में मेलोक्सिकैम (2 मिलीग्राम / किग्रा) को चमड़े के नीचे प्रशासित करें।
  4. कई हफ्तों के लिए व्यक्तिगत आवास में पोस्टऑपरेटिव माउस उठाएं।

6. सीएक्स 3 सीआर 1-जीएफपी चूहों का उपयोग करके माइक्रोग्लिया की पुरानी दो-फोटॉन इमेजिंग में

  1. एनेस्थीसिया के प्रेरण के बाद, मलबे को हटाने के लिए बाँझ खारा के साथ धातु ट्यूब के अंदर धो लें। सुनिश्चित करें कि हिप्पोकैम्पस का सफेद एल्वस ग्लास (चित्रा 3 ए) के माध्यम से दिखाई देता है और पोस्टऑपरेटिव रक्तस्राव जैसी कोई जटिलता नहीं है।
  2. चरण 4.1 से 4.6 के बाद दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप के तहत माउस सेट करें।
  3. हिप्पोकैम्पस के दो-फोटॉन उत्तेजना द्वारा प्राप्त छवियों की गुणवत्ता और तीव्रता की जांच करें (चित्रा 3 बी)। सुनिश्चित करें कि पोस्टऑपरेटिव एडिमा में कमी के बाद ली गई छवियां सर्जरी के दिन ली गई छवियों की तुलना में या बेहतर हैं (चित्रा 2 ए, चरण 4.5 देखें)।
    नोट: छवि गिरावट मस्तिष्क के अंदर ऊतक क्षति की उपस्थिति को इंगित करती है।
  4. सुनिश्चित करें कि माइक्रोग्लिया ने पहले से ही अपनी रामीकृत आकृति विज्ञान (चित्रा 3 सी) को पुनर्प्राप्त कर लिया है।
    नोट: माइक्रोग्लिया का इमेजिंग डेटा इंगित करता है कि माइक्रोग्लिया को अपने बेसल अवस्था में लौटने के लिए कम से कम 3-4 सप्ताह की आवश्यकता होती है।
  5. प्रयोग के विशेष उद्देश्य के लिए सीए 1 की किसी भी परत में विवो इमेजिंग में प्रदर्शन करें।

Representative Results

इस तकनीक का उपयोग करके, पृष्ठीय सीए 1 की सभी परतों के भीतर रामिफाइड और क्विसेंट माइक्रोग्लिया को क्रोनिक रूप से देखा जा सकता है, जिसमें स्ट्रेटम ओरियन्स (एसओ), स्ट्रेटम पिरामिडेल (एसपी), स्ट्रेटम रेडिएटम (एसआर), और स्ट्रेटम लैकुनोसम-आणविक (एसएलएम) शामिल हैं, खासकर सर्जरी के 3-4 सप्ताह बाद जब सूजन कम हो जाती है। यदि सर्जरी उचित रूप से की जाती है, तो सर्जरी के कई महीनों बाद तक इमेजिंग की जा सकती है। इस खंड में इंट्रावाइटल इमेजिंग के मूल्यांकन के लिए उपयोगी तीन विषय शामिल हैं। सबसे पहले, सर्जरी के तुरंत बाद और पुराने चरण में नमूना छवियों को उचित शल्य चिकित्सा और इमेजिंग प्रक्रियाओं के संदर्भ के रूप में प्रदान किया जाता है। दूसरा, माइक्रोग्लिया की विशिष्ट आकृति विज्ञान, उनकी प्रतिदीप्ति तीव्रता, और विशिष्ट हिप्पोकैम्पल परतों में रक्त वाहिका वितरण को पाठकों को एल्वियस से डीजी तक इमेजिंग गहराई का अनुमान लगाने में मदद करने के लिए वर्णित किया गया है। तीसरा, एक आवेदन उदाहरण प्रदान किया गया है जो न्यूरॉन्स और माइक्रोग्लिया की एक साथ इमेजिंग दिखाता है।

सर्जरी के तुरंत बाद सीएक्स 3 सीआर 1-जीएफपी चूहों में माइक्रोग्लिया की प्रतिनिधि छवियां चित्रा 2 में दिखाई गई हैं। यदि सीए 1 को कोई स्पष्ट नुकसान नहीं होता है और सीए 1 परतों की वक्रता को ऊपरी कवरस्लिप द्वारा ठीक से चपटा किया जाता है, तो माइक्रोग्लिया की दो-फोटॉन इमेजिंग गहराई पूरे सीए 1 परतों से अधिक हो जाती है और सर्जिकल सतह से 500 μm तक पहुंच जाती है, जहां डीजी की एमएल या ग्रेन्युल सेल परत (जीसीएल) मौजूद है (चित्रा 2 ए; चरण 4.7 और चित्रा 4 ई देखें)।). माइक्रोग्लिया थोड़ा कम रैमिफाइड होते हैं, खासकर बरकरार हिप्पोकैम्पस की तुलना में सर्जिकल सतह के करीब की परत में। फिर भी, वे उचित शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं का सुझाव देते हुए कोई प्रमुख सक्रियण प्रदर्शित नहीं करते हैं (चित्रा 2 बी)। दूसरी ओर, ऊतक क्षति से प्रेरित सीए 1 में एडिमा इमेजिंग गहराई को 200 μm (चित्रा 2 सी) तक सीमित कर देगी। ऊतक क्षति असामान्य माइक्रोग्लियल सक्रियण को भी प्रेरित करती है, जैसे कि मुक्त ऊतक की सतह की ओर उभरी हुई प्रक्रियाओं का संचय (चित्रा 2 डी; चित्रा 2 बी की ऊपरी छवि की तुलना में)। ये अनुचित सर्जरी के संकेत हैं।

सर्जरी के 3 सप्ताह से अधिक समय बाद क्रोनिक चरण में माइक्रोग्लिया की प्रतिनिधि छवियां चित्रा 3 में दिखाई गई हैं। माइक्रोग्लिया को सीए 1 से परे डीजी की गहरी परतों में उच्च फ्लोरोसेंट तीव्रता और रिज़ॉल्यूशन के साथ और अधिक समरूप वितरण के साथ फिर से चित्रित किया जा सकता है (चरण 6.3, चित्रा 3 बी देखें)। सर्जरी के तुरंत बाद इमेजिंग गुणवत्ता उससे बेहतर है (चित्रा 2 ए)। इस अंतर को कम एडिमा और सूजन द्वारा समझाया जा सकता है। सभी परतों में माइक्रोग्लिया ने पहले से ही अपनी रामीकृत आकृति विज्ञान (चित्रा 3 सी) को बहाल कर दिया है, जो उनकी पोस्टऑपरेटिव उपस्थिति (चित्रा 2 बी) से अलग है। सीए 1 में माइक्रोग्लिया की टाइम-लैप्स इमेजिंग से निगरानी के लिए गतिहीन कोशिका निकायों और अत्यधिक गतिशील प्रक्रियाओं का पता चलता है (वीडियो 1-2)। उनका मोटिव व्यवहार कॉर्टेक्स9 में माइक्रोग्लियल प्रक्रिया गतिशीलता की पिछली रिपोर्ट के समान है।

हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स25,26,27 में फ्लोरोसेंट जांच व्यक्त करने वाले चूहों का उपयोग करके, न्यूरोनल सेल निकायों के वितरण और गहराई के आधार पर चित्रित हिप्पोकैम्पल परतों को निर्दिष्ट करना सरल है। न्यूरॉन सेल निकायों के बारे में स्थितिगत जानकारी की सहायता के बिना, फ्लोरोसेंट माइक्रोग्लिया से संकेत अकेले हिप्पोकैम्पल परतों (चित्रा 3 बी) की पहचान के लिए कुछ सुराग प्रदान करते हैं। एल्वस में माइक्रोग्लिया में लम्बी कोशिका निकाय और प्रक्रियाएं होती हैं जो अक्षीय ट्रैक्ट (चित्रा 4 ए) के साथ फैली होती हैं। अन्य परतों में माइक्रोग्लिया को उनके गोल सेल निकायों और पसंदीदा दिशाओं के बिना विकिरण प्रक्रियाओं द्वारा अलग किया जा सकता है। एसपी में माइक्रोग्लिया घनी पैक पिरामिड न्यूरॉन्स में से हैं और इसे माइक्रोग्लियल प्रक्रियाओं के कम घनत्व से अलग किया जा सकता है। एसपी के ऊपर और नीचे की परतों को क्रमशः एसओ और एसआर के रूप में पहचाना जाता है (चित्रा 4 बी)। अकेले माइक्रोग्लियल गुणों के आधार पर एसआर और एसएलएम के बीच अंतर करना असंभव है। सीए 1 और डीजी के बीच की सीमा को सीमा के साथ चलने वाली मोटी रक्त वाहिकाओं द्वारा पहचाना जाता है (चित्रा 4 सी)। इन वाहिकाओं को सल्फोरोडामाइन 101 (एसआर 101; 5 एमएम, 4 μL / g शरीर के वजन) जैसे रंगों के साथ लेबल करके बेहतर पहचाना जा सकता है। माइक्रोग्लिया से प्रतिदीप्ति संकेत सीए 1 की तुलना में डीजी में तेजी से गिरता है, शायद इन संरचनाओं के अपवर्तक सूचकांक में अंतर के कारण। प्रतिदीप्ति तीव्रता में यह अंतर डीजी और सीए 1 के बीच सीमा को निर्दिष्ट करने में भी मदद कर सकता है। एक आवेदन उदाहरण के रूप में, जीएफपी-पॉजिटिव माइक्रोग्लिया और टीडीटोमेटो-लेबल पिरामिड न्यूरॉन्स की एक साथ इमेजिंग दिखाई गई है (चित्रा 4 ई)। इस प्रयोग में, सीएक्स 3सीआर 1-जीएफपी चूहों को हिप्पोकैम्पल पिरामिड न्यूरॉन्स में टीडीटोमेटो की अभिव्यक्ति के लिए एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) का इंजेक्शन मिला। न्यूरोनल लेबलिंग सीए 1 की सटीक परत संरचनाओं को समझने में मदद करेगी।

Figure 1
चित्र 1: अवलोकन विंडो के आरोपण के लिए योजनाबद्ध चित्र। (A) इकट्ठे ग्लास-बॉटम धातु ट्यूब का क्रॉस-अनुभागीय दृश्य। एक गोलाकार ग्लास कवरस्लिप बेलनाकार स्टेनलेस ट्यूब के एक छोर का पालन करता है। (बी) खोपड़ी से जुड़ी एल्यूमीनियम प्लेट का क्रॉस-अनुभागीय दृश्य। प्लेट खोपड़ी की चिह्नित सतह के समानांतर होनी चाहिए ताकि ध्यान केंद्रित करने के लिए प्लेट के करीब स्थित उद्देश्य लेंस में हस्तक्षेप न हो। (सी) प्रत्यारोपित ट्यूब का क्रॉस-अनुभागीय दृश्य। सीए 1 की सतह को धीरे से दबाने और समतल करने के लिए ग्लास बॉटम को हिप्पोकैम्पस के एल्वस से निकटता से जोड़ा जाना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: सर्जरी के तुरंत बाद CX3CR1-GFP चूहों में माइक्रोग्लिया की विवो इमेजिंग में। (A) पोस्टऑपरेटिव दिन (POD) 0 (चौड़ाई: 511 μm, ऊंचाई: 511 μm, गहराई: 550 μm) पर CX3CR1-GFP माउस के विवो CA1 इमेजिंग से प्रतिनिधि 3D पुनर्निर्माण। ग्लास तल से 500 μm की गहराई पर डीजी के एमएल में फ्लोरोसेंट माइक्रोग्लिया को पूरे सीए 1 के माध्यम से चित्रित किया जा सकता है। (बी) (ए) में प्राप्त विशिष्ट जीएफपी से भरे माइक्रोग्लिया को ग्लास तल से 100, 300 और 520 μm की गहराई पर 20 μm मोटाई के साथ छवि ढेर के अधिकतम तीव्रता अनुमानों (एमआईपी) के रूप में दिखाया गया है। माइक्रोग्लियल आकृति विज्ञान डीजी के सतही सीए 1 से एमएल तक पता लगाने योग्य है, हालांकि डीजी में स्पष्ट छवि गिरावट के साथ। माइक्रोग्लिया विशेष रूप से सर्जिकल सतह के करीब की परत में कम रैमिफाइड होते हैं लेकिन कोई स्पष्ट सक्रियण प्रदर्शित नहीं करते हैं। स्केल बार, 50 μm. (C) शल्य चिकित्सा से क्षतिग्रस्त CA1 के प्रतिनिधि 3 D छवि पुनर्निर्माण। डेटा पीओडी 0 पर एक सीएक्स 3सीआर 1-जीएफपी माउस से प्राप्त किया गया था (चौड़ाई: 399 μm, ऊंचाई: 399 μm, गहराई: 450 μm)। माइक्रोग्लियल फ्लोरेसेंस केवल 200 μm की गहराई तक पता लगाने योग्य है, फ्लोरोसेंट माइक्रोग्लिया के साथ क्षतिग्रस्त CA1 (A) के विपरीत 500 μm की गहराई पर पाया जाता है। जीएफपी छवि स्टैक का एमआईपी 60 μm की गहराई पर 20 μm मोटाई के साथ शल्य चिकित्सा द्वारा उजागर ऊतक सतह की ओर विस्तारित माइक्रोग्लियल उभार प्रक्रियाओं को दर्शाता है। समग्र माइक्रोग्लियल आकृति विज्ञान (बी) में दिखाए गए छवि से अलग है। स्केल बार, 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: क्रोनिक चरण में सीएक्स 3सीआर 1-जीएफपी चूहों में माइक्रोग्लिया की विवो इमेजिंग में। (ए) क्रोनिक चरण में दाहिने पृष्ठीय सीए 1 पर प्रत्यारोपित खिड़की की प्रतिनिधि उपस्थिति। ग्लास बॉटम के माध्यम से, एल्वस के सफेद तंतुओं को पोस्टऑपरेटिव रक्तस्राव के बिना स्पष्ट रूप से देखा जाता है। डीएचसी और एलवी क्रमशः कॉडोमेडियल क्षेत्र और रोस्ट्रोलेटरल किनारे में आंशिक रूप से दिखाई देते हैं। (बी) पीओडी 24 पर सीएक्स 3 सीआर 1-जीएफपी माउस के विवो क्रोनिक सीए 1 इमेजिंग से प्रतिनिधि 3 डी पुनर्निर्माण (चौड़ाई: 511 μm, ऊंचाई: 511 μm, गहराई: 670 μm)। सर्जरी के तुरंत बाद छवियों की तुलना में (चित्रा 2 ए), माइक्रोग्लिया एक अधिक सजातीय वितरण दिखाता है और एडिमा और सूजन की कमी के कारण डीजी की गहरी परतों में अधिक स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है। (सी) पूरी तरह से बहाल रैमिफाइड आकृति विज्ञान के साथ (बी) से माइक्रोग्लिया की विशिष्ट छवियों को सर्जिकल सतह से 100, 280 और 500 μm की गहराई पर 20 μm मोटाई के साथ GFP छवि ढेर के एमआईपी के रूप में दिखाया गया है। स्केल बार, 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: विवो इमेजिंग के दौरान हिप्पोकैम्पस की प्रत्येक परत की पहचान करने के लिए सुराग और इस विधि का एक अनुप्रयोग उदाहरण। (ए) क्रोनिक चरण में सीएक्स 3 सीआर 1-जीएफपी चूहों के एल्वस में माइक्रोग्लिया की विशिष्ट छवि। एक्सोनल ट्रैक्ट्स के साथ विस्तारित माइक्रोग्लियल सेल बॉडी और प्रक्रियाओं को जीएफपी छवि स्टैक के एमआईपी में 15 μm की गहराई पर 10 μm मोटाई के साथ दिखाया गया है। (बी) क्रोनिक चरण में एसओ, एसपी और एसआर में माइक्रोग्लिया की प्रतिनिधि छवियों को 5 μm मोटाई के साथ जीएफपी छवि ढेर के एमआईपी के रूप में दिखाया गया है। एसपी में घनी आबादी वाले पिरामिड न्यूरॉन्स के कारण आसपास के एसओ या एसआर की तुलना में एसपी में माइक्रोग्लियल प्रक्रियाओं का स्थानीय घनत्व कम होता है। स्केल बार, 100 μm. (C) CA1 और DG के बीच की सीमा के साथ चलने वाली मोटी रक्त वाहिकाओं को केवल माइक्रोग्लियल फ्लोरेसेंस द्वारा पहचाना जा सकता है। लगभग 500 μm की गहराई पर क्रोनिक चरण में 90 μm मोटाई के साथ टाइल्ड जीएफपी छवि स्टैक की औसत तीव्रता प्रक्षेपण दिखाया गया है। जीएफपी सिग्नल का शून्य मोटे जहाजों से मेल खाता है। स्केल बार, 500 μm. (D) (ऊपरी) SR101 के इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन के बाद C के समान क्षेत्र की छवि। एसआर 101 इंजेक्शन के बाद टाइलिंग छवियों का 3 डी पुनर्निर्माण (चौड़ाई: 2.60 मिमी, ऊंचाई: 1.73 मिमी, गहराई: 0.69 मिमी)। सीए 1 और डीजी के बीच सीमा के साथ चलने वाले मोटे जहाजों को इंट्रावास्कुलर एसआर 101 फ्लोरेसेंस द्वारा आसानी से पहचाना जा सकता है। (E) (बाएं) CA1 और DG का 3D पुनर्निर्माण (चौड़ाई: 255 μm, ऊंचाई: 255 μm, गहराई: 730 μm) और (दाएं) GFP का MIP और टीडीटोमेटो फ्लोरेसेंस एसपी में 20 μm मोटाई के साथ छवि ढेर से बना है। सर्जरी से 1 सप्ताह पहले, AAV1-CAG-FLEX-tdTomato (5.0 x 1012 vg/mL) और AAV1-hSyn-Cre (1.0 x 109 vg/mL) के मिश्रण के 1.5 μL को CX3CR1-GFP माउस के हिप्पोकैम्पस में इंजेक्ट किया गया था ताकि न्यूरॉन्स को विरल रूप से लेबल किया जा सके। इमेजिंग पीओडी 0 पर किया गया था। एसपी और जीसीएल को न्यूरोनल सेल निकायों की स्थिति से आसानी से पहचाना जाता है। स्केल बार, 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

वीडियो 1: क्रोनिक चरण में एसओ माइक्रोग्लिया की टाइम-लैप्स इमेजिंग। जीएफपी छवि का एमआईपी एसओ माइक्रोग्लिया के टाइम-लैप्स इमेजिंग में 20 μm मोटाई के साथ ढेर है, एनिमेटेड ताकि 1 सेकंड में 28 मिनट खेलें। स्केल बार, 50 μm. कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें.

वीडियो 2: क्रोनिक चरण में एसआर माइक्रोग्लिया की टाइम-लैप्स इमेजिंग। जीएफपी छवि का एमआईपी एसआर माइक्रोग्लिया की टाइम-लैप्स इमेजिंग में 20 μm मोटाई के साथ ढेर है, एनिमेटेड ताकि 1 सेकंड में 28 मिनट खेले जा सके। स्केल बार, 50 μm. कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

इस विधि में विस्तृत शल्य चिकित्सा प्रक्रियाएं शामिल हैं, लेकिन यह ठीक से तैयार होने पर विस्तारित अवधि के लिए पूरे सीए 1 पर उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियां प्रदान कर सकती है। कई चूहों के साथ प्रयोगों ने पुष्टि की कि क्रोनिक पोस्टऑपरेटिव चरण में छवि की गुणवत्ता तीव्र पोस्टऑपरेटिव इमेजिंग की तुलना में बेहतर है। बेहतर छवि गुणवत्ता 2 महीने से अधिक समय तक बनाए रखी गई थी। विफलता का सबसे आम कारण सर्जरी के दौरान सीए 1 को अनजाने में नुकसान है, जिसे पोस्टऑपरेटिव गुणवत्ता जांच में पहचाना जाता है (चरण 4 देखें)। यह आकांक्षा से सीधी चोट, मस्तिष्क के सूखने, कांच द्वारा अत्यधिक दबाव, या अंतिम चरण में दंत सीमेंट से विषाक्तता के कारण हो सकता है। विफलता का एक अन्य कारण पोस्टऑपरेटिव रक्तस्राव है, जिसे सर्जरी के बाद 1 सप्ताह के भीतर ग्लास-बॉटम विंडो के माध्यम से पुष्टि की जा सकती है (चरण 6.1 देखें)। प्रोटोकॉल को ध्यान से पढ़ें और ऐसी परेशानियों से बचने के लिए सभी सावधानियां बरतें।

प्रयोगशाला में GAAsP डिटेक्टरों के साथ दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप के वर्तमान सेटअप के साथ भी, कॉर्टेक्स के माध्यम से पृष्ठीय CA1 को चित्रित करने के प्रयास के परिणामस्वरूप प्रकाश के गैर-नगण्य प्रकीर्णन के कारण संकल्प का महत्वपूर्ण नुकसान होता है। इसलिए, माइक्रोग्लियल प्रक्रियाओं के आंदोलन या सीए 1 में न्यूरॉन्स के डेंड्राइटिक स्पाइन के गठन का निरीक्षण करने के लिए पर्याप्त संकल्प प्राप्त करने के लिए, वर्तमान विधि की तरह ओवरलाइंग कॉर्टेक्स के एक हिस्से को हटाना अपरिहार्य है। उच्च छवि रिज़ॉल्यूशन बनाए रखते हुए कॉर्टिकल हटाने की सीमा को कम करने का एकमात्र वैकल्पिक तरीका रिले लेंस को एम्बेड करना है, जैसे कि ग्रेडिएंट अपवर्तक सूचकांक (ग्रिन) लेंस। इस दृष्टिकोण में, क्रोनिक सीए 1 इमेजिंग28,29 के लिए सीए 1 के ऊपर सीधे प्रत्यारोपित एक गाइड ट्यूब के अंदर एक जीआरआईएन लेंस रखा गया है। गाइड ट्यूब का बाहरी व्यास 1.8 मिमी था, जो इस पेपर में डिवाइस के 3.0 मिमी से छोटा है, जबकि उच्च रिज़ॉल्यूशन (एनए; 0.82) का उत्पादन यहां सिस्टम (प्रभावी एनए; 0.88) के बराबर है। हालांकि, एक ग्रिन लेंस का उपयोग करने वाले दृष्टिकोण में उच्च-रिज़ॉल्यूशन अवलोकन के लिए दृश्य का एक संकीर्ण क्षेत्र है और ग्रिन लेंस के डब्ल्यूडी द्वारा सीमित एक छोटी इमेजिंग गहराई है। इसलिए, उच्च रिज़ॉल्यूशन के साथ दृश्य के एक विस्तृत क्षेत्र में सभी हिप्पोकैम्पल परतों की इमेजिंग इस पेपर में विधि का एक विशिष्ट लाभ है।

इस प्रक्रिया की एक सीमा यह है कि कॉर्टेक्स और सूजन को आंशिक रूप से हटाने से हिप्पोकैम्पस पर कुछ हानिकारक प्रभाव पड़ सकते हैं। हालांकि, क्योंकि हटाए गए कॉर्टेक्स का हिप्पोकैम्पस के लिए कोई प्रत्यक्ष इनपुट नहीं है, एंटोरिनल कॉर्टेक्स क्षतिग्रस्त नहीं है, और हिप्पोकैम्पस स्वयं सीधे घायल नहीं होता है, समग्र मूल्यांकन यह है कि हिप्पोकैम्पस की कार्यात्मक हानि महत्वपूर्ण नहीं है। पिछले कई अध्ययनों ने पुष्टि की है कि हिप्पोकैम्पल विंडो प्रत्यारोपण 25,26,27,30,31,32,33,34 के बाद सीखने और स्मृति सहित हिप्पोकैम्पल कार्य संरक्षित हैं। इसलिए, यहां वर्णित इमेजिंग दृष्टिकोण से पर्याप्त पोस्टऑपरेटिव अवधि के बाद हिप्पोकैम्पल कार्यों की ईमानदारी से रिपोर्ट करने की उम्मीद है।

इस इमेजिंग तकनीक के आधार पर अनुसंधान विषयों की भविष्य की दिशाओं में माइक्रोग्लिया और न्यूरॉन्स5 की एक साथ इमेजिंग द्वारा पता लगाया गया सिनैप्टिक प्रूनिंग, सिनैप्स35 के साथ सीखने से संबंधित माइक्रोग्लियल इंटरैक्शन, हिप्पोकैम्पल तंत्रिका गतिविधि36 द्वारा विनियमित माइक्रोग्लियल गतिशीलता और परिधीय सूजन या ऊतक क्षति के लिए माइक्रोग्लियल प्रतिक्रियाएं शामिल हो सकतीहैं।. यह विधि न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों की प्रगति को स्पष्ट करने में भी मदद करेगी। उदाहरण के लिए, अल्जाइमर रोग (एडी) में, अमाइलॉइड β और ताऊ प्रोटीन न्यूरोनल सेल मौतों और हिप्पोकैम्पल शोष के समानांतर जमा होते हैं, जिससे संज्ञानात्मक शिथिलता होती है; माइक्रोग्लिया को इस प्रक्रिया में शामिल होने की सूचना मिली है37,38. एडी माउस मॉडल का उपयोग करके माइक्रोग्लिया और न्यूरॉन्स की विवो क्रोनिक इमेजिंग में हमें एडी माउस मॉडल के हिप्पोकैम्पस में माइक्रोग्लियल कार्यों और न्यूरोनल पैथोलॉजी के बीच सहसंबंध की निगरानी करने में सक्षम करेगा।

यह पेपर माइक्रोग्लियल इमेजिंग पर केंद्रित है, लेकिन सीए 1 में अन्य न्यूरोनल और ग्लियल सेल प्रकारों पर एक ही इमेजिंग प्रक्रिया लागू होती है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल एनेस्थेटाइज्ड चूहों की इमेजिंग तक सीमित है, लेकिन तकनीक को जागृत चूहों में हिप्पोकैम्पल माइक्रोग्लिया की निगरानी के लिए भी बढ़ाया जा सकता है। श्वसन, दिल की धड़कन और शरीर के आंदोलनों से प्रेरित गति कलाकृतियां, विशेष रूप से कांच की खिड़की से दूर गहरी हिप्पोकैम्पल परतों में, जागृत चूहों के साथ प्रयोगों में मौजूद हो सकती हैं। इसलिए, माइक्रोग्लियल आकृति विज्ञान और गतिशीलता को पकड़ने के लिए एक उपयुक्त गति सुधार प्रणाली की आवश्यकता हो सकती है।

प्रोटोकॉल से संबंधित चर्चा
अस्थायी और स्थानिक विशिष्टता के साथ फ्लोरोसेंट जांच की अभिव्यक्ति के लिए उपयुक्त आयु और आनुवंशिक संशोधनों के चूहों का चयन करना उचित है (चरण 1.3 देखें)। 1 महीने की उम्र में चूहों का उपयोग प्रयोगों के लिए किया जा सकता है, लेकिन 2 महीने से अधिक उम्र के चूहों को संभालना आसान होता है, उनके बड़े शरीर के आकार और सर्जिकल तनाव के प्रतिरोध के साथ। इसके अलावा, बाहरी कैप्सूल और हिप्पोकैम्पस के एल्वस को युवा चूहों में अलग करना अधिक कठिन है। इसलिए, युवा चूहों में बाहरी कैप्सूल को हटाने के लिए सर्जिकल कौशल की आवश्यकता होती है (चरण 3.4.3-4 देखें)। सर्जरी और बाद की इमेजिंग का आकलन चूहों के साथ अधिक सरल होगा जो फ्लोरोसेंट प्रोटीन को सीए 1 और डीजी में समान रूप से व्यक्त करते हैं (चरण 4.7 देखें)। इसलिए, सर्जरी के प्रारंभिक परीक्षणों में, ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करने की सलाह दी जाती है, जैसे कि थाई 1-वाईएफपी या थाई 1-जीएफपी चूहे39, या लेबल माइक्रोग्लिया वाले चूहे, जैसे कि सीएक्स 3 सीआर 1-जीएफपी चूहे24।

सफल सर्जरी के लिए, संज्ञाहरण का विकल्प महत्वपूर्ण है (चरण 2.1 देखें)। विभिन्न प्रकार के संज्ञाहरण इंट्राऑपरेटिव मस्तिष्क एडिमा के विभिन्न डिग्री का कारण बन सकते हैं, जो सर्जरी की कठिनाई, प्रत्यारोपित धातु ट्यूब की सापेक्ष स्थिति और ग्लास विंडो द्वारा मस्तिष्क संपीड़न की सीमा को प्रभावित करते हैं। ये कारक सर्जरी के बाद हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स के अस्तित्व को भी प्रभावित कर सकते हैं।

हिप्पोकैम्पस को उजागर करने की आकांक्षा प्रक्रिया में (चरण 3.4 देखें), मस्तिष्क को नुकसान को कम करने और सफल इमेजिंग सुनिश्चित करने के लिए निम्नलिखित बिंदुओं पर ध्यान दिया जाना चाहिए। कपाल खिड़की के किनारे एक आउटलेट की स्थिति में ऊतक की सतह पर बाँझ खारा लगातार आपूर्ति करें। आकांक्षा के दौरान ऊतक की सतह को हवा के संपर्क से रोकें। ऊतक आकांक्षा का मूल सिद्धांत सक्शन टिप में तरल प्रवाह द्वारा ऊतक की सतह को हटाना है। ऊतक के लिए सक्शन टिप के सीधे संपर्क से बचा जाना चाहिए। सक्शन ट्यूब पर लागू नकारात्मक दबाव को न्यूनतम होने के लिए समायोजित करें। चरण-दर-चरण ऊतक को एस्पिरेट करें और पुष्टि करें कि प्रत्येक चरण में रक्तस्राव नियंत्रित है। जब रक्तस्राव लंबे समय तक होता है, तो तब तक प्रतीक्षा करें जब तक रक्तस्राव अनायास बंद न हो जाए। बाँझ लवण के निरंतर प्रवाह के साथ रक्तस्राव वाले स्थान से थोड़ी दूरी से आकांक्षा रखें। ग्लास-बॉटम धातु ट्यूब में फिट होने वाले अपने आकार के साथ एक बेलनाकार स्थान बनाने के लिए ऊतक को एस्पिरेटेड करें (चरण 1.1 देखें)। मोटे पियाल वाहिकाओं या बड़े ऊतक के टुकड़ों को एस्पिरेट करने के लिए 23 जी सुइयों और छोटे ऊतक मलबे को चूसने के लिए 25 ग्राम सुइयों का चयन करें।

Disclosures

लेखकों में से किसी के भी हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम एम कोंडो और एम मात्सुजाकी को हमें एक्सएलपीएलएन 25एक्सएसवीएमपी उद्देश्य लेंस देने के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। इस कार्य को जापान सोसाइटी फॉर द प्रमोशन ऑफ साइंस (जेएसपीएस) से जेएसपीएस रिसर्च फेलो (18जे21331 से आरके) के लिए सहायता अनुदान और वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए सहायता अनुदान (20एच00481, 20ए301, 20एच05894, 20एच05895 से एसओ) द्वारा वित्तीय रूप से सहायता प्रदान की गई थी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
23 G blunt needles NIPRO 02-166 Suction tips for aspiration.
25 G blunt needles NIPRO 02-167 Suction tips for aspiration.
3 mm dermal punches (DermaPunch) Maruho 213001610 Tools for craniotomy.
30 G needles Dentronics Disposable needle No. 30 Tools for craniotomy.
A femtosecond pulsed laser Spectra-Physics MaiTai Deep See A Ti:Sapphire laser used at 920 nm wavelength.
A two-photon microscope Nikon A1R MP+ Microscope for the CA1 imaging.
AAV1-CAG-FLEX-tdTomato Penn Vector Core AAV for neuronal labeling.
AAV1-hSyn-Cre Penn Vector Core AAV for neuronal labeling.
An objective lens for two-photon imaging Olympus XLPLN25XSVMP 25× objective with a long working distance, a high numerical aperture, and a correction collar
Aspirators Shin-ei Industries KS-500 Tools for aspiration.
Aluminum plates Narishige CP-1 Plates made of alminum for head fixation.
Chemical depilatory cream YANAGIYA Cream for hair removal around the surgical site.
Circular glass coverslips Matsunami Glass 3φ No.1 Coverslips bonded to stainless steel tubes.
CX3CR1-GFP mice The Jackson Laboratory 008451 Transgenic mice for microglial imaging.
Cylindrical stainless steel tubes MORISHITA Custom-made Metal tubes to be implanted. Outer diameter 3.0 mm, inner diameter 2.8 mm, height 1.7 mm.
Dental etching material Sun Medical 204610461 Used to etch the skull bones.
Dental resin cement (Super-Bond C&B) Sun Medical 204610555 Dental cement.
Dura pickers (Micro Points) Fine Science Tools 10063-15 Tools for dura removal.
Fine forceps (Dumont #5) Fine Science Tools 11252-20 Surgical tools.
Forceps Bio Research Center PRI13-3374 Used to disinfect the surgical site.
Head holding device Narishige MAG-2 The head holding device of mice with angle adjusters
Heating pad Bio Research Center BWT-100A and HB-10 Tools to provide thermal support for the mouse during surgery.
Heating pad ALA Scientific HEATINGPAD-1 and Hot-1 Tools to provide thermal support for the mouse on the head holding device.
Ketamine (Ketalar) Daiichi Sankyo Company S9-001665 Anesthesia during surgery.
Meloxicam Tokyo Chemical Industry M1959 Analgesia during surgery.
Ophthalmic ointment Sato Pharmaceutical Used to prevent eye dryness during surgery.
Povidone-iodine scrub solution Meiji Seika Pharma 2612701Q1137 Used to disinfect the surgical site.
Round-tipped miniature knives Surgistar 4769 Surgical tools.
Scalpel MURANAKA MEDICAL INSTRUMENTS 450-098-67 Disposable surgical tool.
Stereo microscopes Leica Microsystems S8 APO Microscopes for surgery.
Sterile saline Otsuka Pharmaceutical Factory 3311401A2026 Washing solution during surgery.
Sterile waterproof pad AS ONE 8-5945-01 Surgical platform.
Sulforhodamine 101 Sigma-Aldrich S7635 A dye for in vivo vessel imaging.
Surgical drape Medline Industries MP-0606F6T Perforated drape for surgery.
UV light Toshiba GL15 Used to cure the adhesives.
UV-curing optical adhesives Thorlabs NOA81 Adhesives for bonding coverslips to stainless steel tubes.
Xylazine (Celactal 2%) Bayer Anesthesia during surgery.

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References

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<i>Vivo में</i> माउस हिप्पोकैम्पस में माइक्रोग्लिया की क्रोनिक टू-फोटॉन इमेजिंग
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Kamei, R., Urata, S., Maruoka, H., Okabe, S. In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus. J. Vis. Exp. (185), e64104, doi:10.3791/64104 (2022).

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