Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

जागृत चूहों में माइक्रोग्लियल डायनामिक्स और न्यूरोनल गतिविधि की एक साथ इमेजिंग

Published: August 23, 2022 doi: 10.3791/64111
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Cellular Neurobiology, Graduate School of Medicine and Faculty of Medicine, The University of Tokyo

Summary

यहां, हम जागृत चूहों में माइक्रोग्लियल गतिशीलता और न्यूरोनल गतिविधि की एक साथ इमेजिंग के लिए कपाल खिड़की प्रत्यारोपण के साथ एडेनो से जुड़े वायरस इंजेक्शन के संयोजन वाले प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।

Abstract

चूंकि मस्तिष्क के कार्य परिधीय ऊतकों से प्राप्त संकेतों के निरंतर प्रभाव में होते हैं, इसलिए यह स्पष्ट करना महत्वपूर्ण है कि मस्तिष्क में ग्लियल कोशिकाएं परिधि में विभिन्न जैविक स्थितियों को कैसे महसूस करती हैं और न्यूरॉन्स को संकेत प्रेषित करती हैं। माइक्रोग्लिया, मस्तिष्क में प्रतिरक्षा कोशिकाएं, सिनैप्टिक विकास और प्लास्टिसिटी में शामिल हैं। इसलिए, शरीर की आंतरिक स्थिति के जवाब में तंत्रिका सर्किट निर्माण में माइक्रोग्लिया के योगदान को माइक्रोग्लियल गतिशीलता और न्यूरोनल गतिविधि के बीच संबंधों के इंट्रावाइटल इमेजिंग द्वारा गंभीर रूप से परीक्षण किया जाना चाहिए।

यहां, हम जागृत चूहों में माइक्रोग्लियल गतिशीलता और न्यूरोनल गतिविधि की एक साथ इमेजिंग के लिए एक तकनीक का वर्णन करते हैं। एडेनो से जुड़े वायरस एन्कोडिंग आर-सीएएमपी, लाल प्रतिदीप्ति प्रोटीन का एक जीन-एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक, को माइक्रोग्लिया में ईजीएफपी व्यक्त करने वाले सीएक्स 3सीआर 1-ईजीएफपी ट्रांसजेनिक चूहों में प्राथमिक दृश्य कॉर्टेक्स की परत 2/3 में इंजेक्ट किया गया था। वायरल इंजेक्शन के बाद, इंजेक्शन क्षेत्र के मस्तिष्क की सतह पर एक कपाल खिड़की स्थापित की गई थी। सर्जरी के 4 सप्ताह बाद जागृत चूहों में विवो टू-फोटॉन इमेजिंग में दिखाया गया कि तंत्रिका गतिविधि और माइक्रोग्लियल गतिशीलता को उप-सेकंड अस्थायी संकल्प पर एक साथ दर्ज किया जा सकता है। यह तकनीक माइक्रोग्लियल गतिशीलता और न्यूरोनल गतिविधि के बीच समन्वय को उजागर कर सकती है, जिसमें पूर्व परिधीय प्रतिरक्षात्मक अवस्थाओं का जवाब देता है और बाद में आंतरिक मस्तिष्क राज्यों को एन्कोडिंग करता है।

Introduction

इस बात के प्रमाण बढ़ रहे हैं कि शरीर की आंतरिक स्थिति लगातार जानवरों में मस्तिष्क के कार्यों को प्रभावित करती है 1,2,3,4,5। तदनुसार, मस्तिष्क के कार्यों की गहरी समझ हासिल करने के लिए, यह स्पष्ट करना महत्वपूर्ण है कि मस्तिष्क में ग्लियल कोशिकाएं परिधि में जैविक स्थितियों की निगरानी कैसे करती हैं और न्यूरॉन्स को जानकारी रिले करती हैं।

माइक्रोग्लिया, मस्तिष्क में प्रतिरक्षा कोशिकाएं, सिनैप्टिक विकास और प्लास्टिसिटी में शामिल हैं,जो मस्तिष्क में तंत्रिका सर्किट की विशेषताओं को 6,7,8,9 बनाती हैं। उदाहरण के लिए, वेक एट अल द्वारा अग्रणी काम से पता चला है कि माइक्रोग्लियल प्रक्रियाएं माउस नियोकॉर्टेक्स में न्यूरोनल गतिविधि-निर्भर तरीके से सिनैप्स के साथ संपर्क करती हैं और कृत्रिम इस्किमिया माइक्रोग्लिया10 के साथ लंबे समय तक संपर्क के बाद सिनैप्स हानि को प्रेरित करता है। ट्रेम्बले एट अल ने पाया कि दृश्य अनुभव में परिवर्तन सिनैप्स के साथ माइक्रोग्लियल इंटरैक्शन के तौर-तरीकों को बदलता है। महत्वपूर्ण अवधि के दौरान जब प्राथमिक दृश्य कॉर्टेक्स (वी 1) में डेंड्राइटिक स्पाइन टर्नओवर दूरबीन अभाव से बढ़ जाता है, तो अंधेरे अनुकूलन माइक्रोग्लियल प्रक्रियाओं की गतिशीलता को कम कर देता है और सिनैप्टिक फांकों के साथ उनकी संपर्क आवृत्ति और माइक्रोग्लिया11 में सेलुलर समावेशन की संख्या दोनों को बढ़ाता है। इन परिणामों से पता चलता है कि माइक्रोग्लियल प्रक्रियाएं तंत्रिका सर्किट को फिर से तैयार करने के लिए तंत्रिका गतिविधि और उनके आसपास के वातावरण को समझती हैं। इसके अलावा, हाल के एक अध्ययन में बताया गया है कि माइक्रोग्लियल निगरानी जागृत और एनेस्थेटाइज्ड स्थितियों के बीच भिन्न होती है, जोशारीरिक स्थितियों के तहत न्यूरॉन-माइक्रोग्लिया संचार की जांच के लिए जागृत चूहों का उपयोग करके प्रयोगों के महत्व का सुझाव देती है।

विवो में दो-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग कैल्शियम गतिशीलता की रिकॉर्डिंग के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है, जो एक जीवित जानवर 13,14,15 में एक साथ सैकड़ों न्यूरॉन्स में चल रहे न्यूरोनल फायरिंग को दर्शाता है। न्यूरॉन्स में कैल्शियम इमेजिंग को आमतौर पर तेजी से न्यूरोनल प्रतिक्रियाओं को ट्रैक करने के लिए कुछ हर्ट्ज से अधिक के अस्थायी रिज़ॉल्यूशन की आवश्यकता होतीहै16,17। इसके विपरीत, माइक्रोग्लियल डायनामिक्स को ट्रैक करने वाले पिछले अध्ययनों ने 0.1 हर्ट्ज 18,19,20 से कम के अपेक्षाकृत कम अस्थायी रिज़ॉल्यूशन पर माइक्रोग्लियल संरचनाओं का नमूना लिया है। एक हालिया अध्ययन ने न्यूरॉन-माइक्रोग्लिया संचार21 को समझने के लिए एक साथ दो-फोटॉन इमेजिंग लागू की। हालांकि, यह अभी भी स्पष्ट नहीं है कि गतिशील माइक्रोग्लियल प्रक्रियाएं जागृत चूहों में कुछ हर्ट्ज से अधिक के अस्थायी संकल्प पर आसपास की तंत्रिका गतिविधि का जवाब कैसे देती हैं। इस मुद्दे को हल करने के लिए, हम जागृत चूहों में 1 हर्ट्ज से अधिक अस्थायी रिज़ॉल्यूशन के साथ तंत्रिका गतिविधि और माइक्रोग्लियल गतिशीलता की विवो दो-फोटॉन इमेजिंग विधि में एक साथ वर्णन करते हैं। यह विधि हमें उच्च फ्रेम दर (अधिकतम, 512 x 512 पिक्सेल के पिक्सेल फ्रेम आकार के साथ अधिकतम, 30 हर्ट्ज) पर जागृत चूहों में स्थिर इमेजिंग प्राप्त करने की अनुमति देती है और माइक्रोग्लिया के निगरानी व्यवहार या जागृत चूहों में न्यूरोनल गतिविधि के साथ उनकी बातचीत की जांच करने के लिए अधिक अनुकूल तरीका प्रदान करती है।

Protocol

सभी प्रयोगों को पशु नैतिकता समिति और ग्रेजुएट स्कूल ऑफ मेडिसिन और फैकल्टी ऑफ मेडिसिन, टोक्यो विश्वविद्यालय की आनुवंशिक पुनः संयोजक प्रयोग सुरक्षा समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था, और उनके दिशानिर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया था।

1. तैयारी

  1. ऑटोक्लेव या 70% इथेनॉल का उपयोग करके सर्जरी के लिए आवश्यक सभी उपकरणों और उपकरणों को निष्फल करें।
  2. ग्लास पिपेट तैयारी।
    1. माइक्रोपिपेट पुलर के धारक के लिए 75 μL कैलिब्रेटेड केशिका को मजबूती से ठीक करें। पी (दबाव) = 500, हीट = 680, पुल = 30, वीईएल = 60, समय = 180 के रूप में अनुशंसित मापदंडों के साथ पुलर को प्रोग्राम पर सेट करें।
    2. कार्यक्रम (आमतौर पर 4.5 से 5 एस) को समाप्त करने के बाद, केशिका को टेपरिंग पूंछ के साथ दो ग्लास पिपेट में विभाजित किया जाता है। फिर, टिप व्यास को 30-50 μm के भीतर रखने के लिए चिमटी के साथ पूंछ के बाहर के हिस्से को तोड़ें। इसके लिए पूंछ को 1 सेमी दूर के हिस्से के अंत तक तोड़ दें।
  3. क्रानियोटॉमी के लिए, यूवी लाइट क्योरिंग अभिकर्मक (चित्रा 2 ए) का उपयोग करके, एक बड़ी बाहरी ग्लास डिस्क, व्यास में 4 मिमी, 0.15 ± 0.02 मिमी मोटाई, एक छोटी आंतरिक ग्लास डिस्क ± 2 मिमी व्यास, 0.525 0.075 मिमी मोटाई को चिपकाकर एक कपाल खिड़की तैयार करें।

2. एएवी इंजेक्शन

  1. इंजेक्शन उपकरण की तैयारी
    1. एक स्टीरियोटैक्सिक उपकरण के पिपेट धारक पर एक ट्यूब के माध्यम से 26 ग्राम हैमिल्टन सिरिंज से जुड़ा एक ग्लास पिपेट रखें, और फिर पिपेट धारक को ऊर्ध्वाधर अक्ष से 60 डिग्री पूर्वकाल में झुकाएं (चित्रा 1 ए, बी)।
    2. ग्लास पिपेट, सिरिंज और कनेक्टिंग ट्यूब को तरल पैराफिन से भरें। सिरिंज को माइक्रोइंजेक्टर पर रखें।
  2. शल्य चिकित्सा प्रक्रिया
    नोट: एक निष्फल बूथ में निम्नलिखित सर्जरी की गई थी। यदि आवश्यक हो तो सर्जरी के लिए एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग किया गया था।
    1. गैस-तंग कक्ष में 3% आइसोफ्लुरेन के साथ 7 से 8 सप्ताह (बॉडीवेट 22-26 ग्राम) पर एक पुरुष सीएक्स 3सीआर 1-ईजीएफपी माउस ( सामग्री की तालिका में विस्तृत जानकारी) को एनेस्थेटाइज करें। 3 मिनट के बाद, माउस को कक्ष से बाहर निकालें जब यह सांस लेने के अलावा स्वैच्छिक आंदोलन खो देता है, और फिर 2% आइसोफ्लुरेन के साथ नाक ट्यूब द्वारा निरंतर संज्ञाहरण पर स्विच करें।
      नोट: आइसोफ्लुरेन माइक्रोग्लिया को सक्रिय करने के लिए जाना जाता है। हालांकि, क्योंकि सर्जरी के 4 सप्ताह बाद इमेजिंग की जाती है, इमेजिंग के दौरान चूहों पर आइसोफ्लुरेन का कोई प्रभाव नहीं पड़ता है। यद्यपि आइसोफ्लुरेन संज्ञाहरण का उपयोग कुछ मिनटों के लिए किया जाता है जब चूहों को इमेजिंग (चरण 4.2.1) से पहले स्टीरियोटेक्सिक उपकरण में रखा जाता है, हमने पाया कि इस लघु संज्ञाहरण का प्रभाव नगण्य है।
    2. सर्जरी के दौरान, हाइपोथर्मिया को रोकने के लिए माउस को 37 डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग पैड के साथ गर्म रखें। कॉर्नियल सूखापन को रोकने के लिए दोनों आंखों पर आंखों का मरहम लगाएं और चमड़े के नीचे (5 मिलीग्राम / किग्रा) मेलोक्सिकैम इंजेक्शन का प्रशासन करें। माउस को एक सहायक कान बार में संलग्न करें, और फिर माउस को स्टीरियोटैक्सिक उपकरण पर उसके पृष्ठीय पक्ष के साथ ठीक करें।
    3. सांस और हृदय गति की निगरानी करते हुए सर्जरी के दौरान आइसोफ्लुरेन एकाग्रता को उचित प्रतिशत (1% -2%) में समायोजित करें। डिपिलेटरी क्रीम का उपयोग करके बालों को निकालें और आयोडीन-आधारित या क्लोरहेक्सिडाइन-आधारित स्क्रब और अल्कोहल दोनों के साथ परिपत्र गति में सिर को कई बार कीटाणुरहित करें। फिर, 1% लिडोकेन के 0.1 एमएल को चमड़े के नीचे इंजेक्ट करें और सर्जिकल साइट को सुरक्षित करने के लिए बाँझ ड्रेप लागू करें।
    4. कैंची के साथ मध्य रेखा के साथ खोपड़ी को खोलें और चीरा को लगभग 2 सेमी लंबा बनाएं, ताकि दाहिने प्राथमिक दृश्य प्रांतस्था के ऊपर खोपड़ी का अच्छा प्रदर्शन सुनिश्चित हो सके। खोपड़ी के चीरे के बाद, उजागर खोपड़ी और मस्तिष्क को सूखने से रोकने के लिए पूरी प्रक्रिया के दौरान सिर को नमकीन से सींचना करें।
    5. फोर्सप्स का उपयोग करके उजागर खोपड़ी पर पेरीओस्टेम को हटा दें। लगभग 0.5 मिमी व्यास के साथ एक छोटा छेद बनाने के लिए, स्टीरियोटैक्सिक निर्देशांक पर खोपड़ी को ड्रिल करें: मध्य रेखा के 3 मिमी पार्श्व, लैम्ब्डा लाइन के 0.5 मिमी पूर्वकाल। यदि आवश्यक हो, तो ड्रिल बिट से रक्त और ऊतक मलबे को धो लें।
    6. 8.3 x 1012 वेक्टर जीनोम /एमएल22 के टिटर पर निम्नलिखित प्रक्रिया का उपयोग करके 1 μL rAAV2/1-hSyn-R-CaMP1.07 के साथ ग्लास पिपेट भरें।
      1. ग्लास पिपेट से तरल पैराफिन के 1 μL को बाहर निकालने के लिए सिरिंज को आगे बढ़ाएं। माउस की उजागर खोपड़ी पर पारदर्शी फिल्म का एक टुकड़ा, लगभग 2 सेमी x 2 सेमी, रखें और एक पिप्टर का उपयोग करके फिल्म पर एएवी समाधान के 1 μL की एक बूंद को निष्कासित करें।
      2. ग्लास पिपेट टिप को फिल्म पर एएवी समाधान की बूंद में रखें और एएवी समाधान को एस्पिरेट करने के लिए धीरे से सिरिंज खींचें। इजेक्शन के बाद, ट्यूब और ग्लास पिपेट के अंदर दबाव छोड़ने के लिए टी-शेप स्टॉपकॉक को चालू करें।
    7. चरण 2.2.5 में बनाए गए छेद के माध्यम से मस्तिष्क की सतह से 500 μm की गहराई तक ग्लास पिपेट डालें, और फिर माइक्रोइंजेक्टर (चित्रा 1 सी) का उपयोग करके एएवी समाधान के 0.5 μL इंजेक्ट करें। 2.0 μL / h की इंजेक्शन मात्रा प्रवाह दर का उपयोग करें; 0.5 μL का एक इंजेक्शन 15 मिनट लेता है, और फिर बाद में 5 मिनट तक प्रतीक्षा करता है।
    8. इंजेक्शन के बाद, धीरे से ग्लास पिपेट को वापस ले लें और मस्तिष्क की सतह को नमकीन से कुल्ला करें।

3. कपाल खिड़की प्रत्यारोपण

नोट: क्रेनियल विंडो इम्प्लांटेशन उसी दिन एएवी इंजेक्शन का अनुसरण करता है।

  1. खोपड़ी पर 2.5 मिमी व्यास का चक्र चिह्नित करें, जो लैम्ब्डा से 3 मिमी पार्श्व रूप से केंद्रित है। ड्रिलिंग द्वारा खोपड़ी पर निशान के साथ एक गोलाकार नाली बनाएं। मलबे को साफ करें क्योंकि यह खोपड़ी की दृश्यता पर प्रतिकूल प्रभाव डाल सकता है और हीटिंग को रोकने के लिए ड्रिलिंग प्रक्रिया के दौरान खारा लागू कर सकता है।
  2. यह जांचने के लिए कि क्या गोलाकार नाली में ड्रिलिंग गहराई केंद्रीय खोपड़ी के टुकड़े को हटाने के लिए पर्याप्त है, धीरे से केंद्रीय खोपड़ी को बल के साथ दबाएं। यदि यह थोड़ा प्रतिरोध के साथ लंबवत रूप से चलता है, तो ड्रिलिंग गहराई पर्याप्त है।
  3. जब नाली पर्याप्त गहराई तक पहुंच जाती है, तो केंद्रीय खोपड़ी के टुकड़े के तल में बल की नोक डालें और मस्तिष्क की सतह को उजागर करने के लिए धीरे से इसे उठाएं और हटा दें (चित्रा 1 डी)।
  4. 27 ग्राम सुई का उपयोग करके, उजागर मस्तिष्क की सतह के किनारे पर ड्यूरा को चुभाएं और फाड़ें। ड्यूरा के किनारे पर बने छेद के माध्यम से बल की नोक डालें। मस्तिष्क की सतह को उजागर करने के लिए ड्यूरा को पकड़ें और इसे छील लें।
    नोट: यदि रक्तस्राव होता है, तो मस्तिष्क की सतह को नमकीन से कुल्ला करें जब तक कि रक्तस्राव बंद न हो जाए।
  5. बल का उपयोग करके, हेमोस्टैटिक फाइबर को एक-एक करके 3.5 मिमी डिश में नमकीन में फैलाएं, और फिर हेमोस्टैटिक फाइबर को छेद के किनारे पर रखें जिसमें सही ड्यूरा मौजूद है।
  6. उजागर मस्तिष्क की सतह पर चरण 1.3 में तैयार एक कपाल खिड़की रखें, और फिर खिड़की को धीरे से दबाते हुए इसे तत्काल गोंद के साथ खोपड़ी से चिपकाएं ताकि खिड़की खोपड़ी के साथ निकट संपर्क में हो।
  7. बाद में, पूरी उजागर खोपड़ी पर तत्काल गोंद लागू करें, और फिर खोपड़ी पर एक हेड-प्लेट को ध्यान से संलग्न करें ताकि खिड़की हेड-प्लेट के चौकोर छेद के केंद्र में स्थित हो (चित्रा 2 सी)। सुनिश्चित करें कि हेड प्लेट की सतह कांच की खिड़की की सतह के समानांतर है।
  8. गोंद पर्याप्त रूप से कठोर हो जाने के बाद, सिर और हेड-प्लेट के बीच लगाव को मजबूत करने के लिए उजागर खोपड़ी पर दंत सीमेंट लागू करें (चित्रा 2)।
    नोट: यदि प्रयोगों में चूहों को दृश्य उत्तेजनाओं की प्रस्तुति शामिल है, तो इमेजिंग क्षेत्र में आवारा प्रकाश से बचा जाना चाहिए। प्रकाश प्रतिबिंब की कमी के लिए सीमेंट को सक्रिय चारकोल के साथ मिलाकर काला करने की सलाह दी जाती है।
  9. सीमेंट के पर्याप्त रूप से कठोर होने के बाद माउस को संज्ञाहरण से हटा दें (लगभग 20 मिनट)। फिर, माउस को अकेले ठीक करने के लिए एक नए पिंजरे में डाल दें।
  10. अपनी चेतना और स्वैच्छिक आंदोलन की पुष्टि करने के बाद, पूर्ण वसूली का संकेत देते हुए, माउस को वापस घर के पिंजरे में डाल दें। वसूली के दौरान, यदि आवश्यक हो, तो एक दूसरी, या अधिक मेलोक्सिकैम खुराक (1-3 दिनों के लिए हर 24 घंटे में एक बार) का प्रशासन करें यदि स्पष्ट दर्द-संकेत देने वाले व्यवहार होते हैं।

4. माइक्रोग्लिया और न्यूरोनल कैल्शियम गतिशीलता के विवो दो-फोटॉन इमेजिंग में।

  1. माइक्रोस्कोप उपकरण के लिए चूहों की आदत।
    1. सर्जरी के तीन सप्ताह बाद, माउस में 3% आइसोफ्लुरेन के साथ संज्ञाहरण को प्रेरित करें, और कस्टम-निर्मित स्टीरियोटैक्सिक उपकरण (चित्रा 3 सी) का उपयोग करके दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप के 25 x उद्देश्य लेंस के तहत माउस सेट करें। यहां सेटअप के लिए, माउस को ट्रेडमिल के शीर्ष पर सेट किया गया है और स्वतंत्र रूप से चलने की अनुमति दी गई है।
    2. लगभग 10 मिनट बाद, माइक्रोस्कोप चरण से माउस निकालें और इसे घर के पिंजरे में वापस कर दें। दो-फोटॉन छवि अधिग्रहण से पहले हर वैकल्पिक दिन में कम से कम 3 बार आदत दोहराएं।
  2. दो-फोटॉन छवि अधिग्रहण
    नोट: हम सर्जरी के 4 सप्ताह से अधिक समय बाद छवि अधिग्रहण करने की सलाह देते हैं, क्योंकि माइक्रोग्लियल सक्रियण धीरे-धीरे बेसल स्तर पर वापस आ जाता है।
    1. चरण 4.1 के रूप में, माउस में 3% आइसोफ्लुरेन के साथ संज्ञाहरण को प्रेरित करें और माउस को कस्टम-निर्मित स्टीरियोटैक्सिक उपकरण का उपयोग करके दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप के उद्देश्य लेंस के नीचे सेट करें।
    2. नीचे वर्णित दृश्य उत्तेजना के लिए कस्टम-निर्मित छायांकन डिवाइस और एक एलसीडी मॉनिटर स्थापित करें (चित्रा 3 डी)।
      1. मस्तिष्क की सतह पर ध्यान केंद्रित करने के लिए लेंस रखें, और फिर इस लेंस की स्थिति को मूल जेड-स्थिति के रूप में सेट करें। एक्स-वाई निर्देशांक को स्थिर रखें और उद्देश्य लेंस को ऊंचा करें; ऑब्जेक्टिव लेंस और ट्रेडमिल से माउस और स्टीरियोटैक्सिक इंस्ट्रूमेंट को हटा दें।
      2. सिलिकॉन का उपयोग करके हेड प्लेट के शीर्ष पर एक छायांकन उपकरण संलग्न करें, जिसे चारकोल पाउडर के साथ मिलाकर काला किया जाता है, और सुनिश्चित करें कि हेड प्लेट और छायांकन डिवाइस के बीच की जगह अच्छी तरह से सील है।
      3. आसुत पानी के साथ छायांकन डिवाइस भरें, और फिर माउस और स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम को उद्देश्य के तहत और ट्रेडमिल पर फिर से ठीक करें। मस्तिष्क की सतह पर फोकल प्लेन को ध्यान से रीसेट करें, उद्देश्य लेंस की गहराई की जांच करें।
        नोट: उद्देश्य लेंस को नुकसान पहुंचाने के जोखिम से बचने के लिए, पहले xyz निर्देशांक सेट करें, और फिर उद्देश्य लेंस के छायांकन डिवाइस को लागू करें। पहले कवर स्थापित करना और फिर निर्देशांक को समायोजित करना भी उचित है, लेकिन इस विकल्प के लिए सावधानीपूर्वक हैंडलिंग आवश्यक है।
      4. उद्देश्य लेंस (चित्रा 3 डी) के माध्यम से दृश्य उत्तेजना के लिए उपयोग किए जाने वाले एलसीडी मॉनिटर से प्रकाश संदूषण से बचने के लिए उद्देश्य लेंस को काले एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर करें। दृश्य उत्तेजनाओं (चित्रा 3 डी) को प्रस्तुत करने के लिए माउस की आंखों के सामने 12.5 सेमी पर 10 इंच का एलसीडी मॉनिटर सेट करें।
    3. प्रतिदीप्ति उत्सर्जन संग्रह फिल्टर को ईजीएफपी प्रतिदीप्ति (525/50 एनएम उत्सर्जन फिल्टर) और आर-सीएएमपी फ्लोरेसेंस (593/46 एनएम उत्सर्जन फिल्टर) और उत्तेजना तरंग दैर्ध्य को 1,000 एनएम तक कॉन्फ़िगर करें। 25x 1.1 NA उद्देश्य और GAASP PMT का उपयोग करके 0.25 μm/pixel के स्थानिक रिज़ॉल्यूशन के साथ चित्र प्राप्त करें।
    4. उस इमेजिंग क्षेत्र का पता लगाएं जिसमें आर-सीएएमपी (+) न्यूरॉन्स और ईजीएफपी (+) माइक्रोग्लिया को एक साथ परत 2/3 में चित्रित किया जा सकता है। इस सेटअप के लिए, चित्रा 4 और वीडियो 1 में प्राप्त डेटा एक लाइव छवि पूर्वावलोकन का उपयोग करके पियाल सतह से 100 μm की गहराई पर थे। इमेजिंग क्षेत्र में बढ़े हुए स्थानीय तापमान के कारण फोटो-ब्लीचिंग और क्षति से बचने के लिए उत्तेजना लेजर की शक्ति को यथासंभव कम रखें।
    5. छवि अधिग्रहण के साथ-साथ, माउस17 के 30° चरणों में 0° से 150° तक 6 दिशाओं में 12 दिशाओं में 100% विपरीत, 1.5 हर्ट्ज, 0.04 चक्र प्रति डिग्री पर एक बहती हुई झंझरी दृश्य उत्तेजना प्रस्तुत करें।
    6. छवि अधिग्रहण के बाद, माउस को माइक्रोस्कोप चरण से हटा दें, माउस से छायांकन डिवाइस और स्टीरियोटेक्सिक उपकरण को अलग करें, और माउस को उसके घर के पिंजरे में वापस कर दें।
  3. डेटा पंजीकरण
    1. फिजी या माइक्रोस्कोप के साथ प्रदान किए गए सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके, प्रत्येक रंग चैनल के लिए टिफ़ छवि फ़ाइलों की एक श्रृंखला के रूप में अधिग्रहित छवि डेटा (इस मामले में एनडी 2 प्रारूप) को परिवर्तित और सहेजें।
    2. मोड = अनुवाद के साथ पंजीकरण करने के लिए फिजी के एक प्लगइन टर्बोरेग लागू करें। ईजीएफपी चैनल की टिफ छवि फ़ाइलों के साथ संदर्भ छवि के रूप में औसत छवि का उपयोग करें।
    3. MATLAB का उपयोग कर प्रत्येक फ़्रेम के लिए निम्न प्रसंस्करण निष्पादित करें।
      नोट: यद्यपि MATLAB का उपयोग निम्नलिखित प्रसंस्करण में किया जाता है, विवरण मुख्य रूप से प्रत्येक चरण के इरादे पर केंद्रित है ताकि पायथन जैसे अन्य प्रोग्रामिंग सॉफ़्टवेयर द्वारा डेटा का विश्लेषण किया जा सके।
      1. क्रमशः एक ही फ्रेम के पंजीकरण से पहले और बाद में दो ईजीएफपी टिफ छवियों को पढ़ने के लिए अपठन फ़ंक्शन का उपयोग करें। एक ही फ्रेम की R-CaMP tiff छवि को पढ़ने के लिए imreadफ़ंक्शन का उपयोग करें।
      2. चरण 4.3.3.1 में पढ़े गए दो जीएफपी छवियों के वेक्टरकृत चर के बीच सहसंबंध फ़ंक्शन की गणना करने के लिए normcorr2 फ़ंक्शन का उपयोग करें।
      3. सहसंबंध फ़ंक्शन के उच्चतम क्रॉस-सहसंबंध के साथ रैखिक सूचकांक का पता लगाने के लिए अधिकतम फ़ंक्शन का उपयोग करें, और फिर अपनी मूल छवि से पंजीकृत छवि की आंदोलन स्थिति की गणना करने के लिए ind2sub फ़ंक्शन का उपयोग करें।
      4. चरण 4.3.3.3 में परिकलित स्थिति में R-CaMP छवि का अनुवाद करने के लिए imwarp फ़ंक्शन का उपयोग करें, और उसके बाद R-CaMP की पंजीकृत छवि को सहेजने के लिए इम्राइट फ़ंक्शन का उपयोग करें।
  4. कैल्शियम के निशान का उत्पादन
    1. MATLAB का उपयोग कर के निम्न प्रसंस्करण निष्पादित करें। चरण 4.3.3.4 में उत्पन्न सभी पंजीकृत R-CaMP tiff छवियों को पढ़ने के लिए imreade फ़ंक्शन का उपयोग करें। यदि पंजीकृत छवियाँ पहले से ही कार्यस्थान में एक चर के रूप में लोड की जा चुकी हैं, तो इस चरण को छोड़ दें।
    2. समय-प्रक्षेपण छवि उत्पन्न करने के लिए माध्य फ़ंक्शन का उपयोग करें। औसत छवि को एक आंकड़े के रूप में दिखाने के लिए imshow फ़ंक्शन का उपयोग करें; लक्ष्य संरचना (इस डेटा में डेंड्राइटिक रीढ़) के बाइनरी आरओआई मास्क उत्पन्न करने के लिए रोइपोली फ़ंक्शन का उपयोग करें।
    3. इनपुट चर के रूप में प्रत्येक फ्रेम की छवियों के साथ बाइनरी मास्क को गुणा करके प्राप्त छवियों के साथ माध्य फ़ंक्शन का उपयोग करके, प्रत्येक फ्रेम के लिए आरओआई के भीतर औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता की गणना करें।
    4. जैसा कि पहले17 में वर्णित है, चरण 4.4.3 में प्राप्त चर के लिए, उच्च आवृत्ति शोर को काटने के लिए कटऑफ = 1.6 एस पर मक्खन मूल्य आवृत्ति फ़िल्टर लागू करें, और फिर कम आवृत्ति शोर को काटने के लिए समय विंडो = 200 एस पर स्लाइडिंग मीडियन फ़िल्टर लागू करें।

Representative Results

हमने इस प्रोटोकॉल में वर्णित 8 सप्ताह के सीएक्स 3एक्सआर 1-ईजीएफपी ट्रांसजेनिक माउस के वी 1 में एएवी इंजेक्शन और कपाल खिड़की प्रत्यारोपण किया। सर्जरी के चार सप्ताह बाद, हमने V1 (चित्रा 4 और वीडियो 1) की परत 2/3 में R-CaMP-आधारित तंत्रिका गतिविधि और माइक्रोग्लियल गतिशीलता के विवो दो-फोटॉन इमेजिंग में एक साथ प्रदर्शन किया। इमेजिंग के दौरान, माउस को ट्रेडमिल पर रखा गया था और स्वतंत्र रूप से चलने की अनुमति दी गई थी। छवियों को 25x, 1.1 NA उद्देश्य और GAASP PMT का उपयोग करके 0.25 μm/ पिक्सेल के स्थानिक रिज़ॉल्यूशन के साथ 30 हर्ट्ज की फ्रेम दर पर प्राप्त किया गया था। ईजीएफपी और आर-सीएएमपी दोनों 1,000 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर उत्साहित थे, और ईजीएफपी फ्लोरेसेंस (525/50 एनएम उत्सर्जन फिल्टर) और आर-सीएएमपी फ्लोरेसेंस (593/46 एनएम उत्सर्जन फिल्टर) एक साथ एकत्र किए गए थे। गति कलाकृतियों को कम करने के लिए अधिग्रहित डेटा के पंजीकरण के बाद, पृष्ठभूमि शोर को कम करने के लिए हर चार फ्रेम को एक फ्रेम में औसत किया गया था। माउस को झंझरी दृश्य उत्तेजनाएं प्रस्तुत की गईं, और न्यूरॉन्स और व्यक्तिगत डेंड्राइटिक स्पाइन की दृश्य प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण किया गया (चित्रा 4 डी)। माइक्रोग्लियल प्रक्रियाओं ने तेजी से गतिशीलता दिखाई और 10 सेकंड के भीतर अपनी आकृति विज्ञान को बदल दिया (चित्रा 4 ई और वीडियो 1)। जैसा कि चर्चा अनुभाग में विस्तृत है, जब एएवी इंजेक्शन विफल हो गया, तो आर-सीएएमपी की अभिव्यक्ति का पता नहीं लगाया जा सका। यदि सर्जरी सफल नहीं थी, तो ईजीएफपी और आर-सीएएमपी के संकेतों को नहीं देखा जा सकता था।

Figure 1
चित्र 1: एएवी इंजेक्शन । (ए) एक ग्लास पिपेट को सिलिकॉन ट्यूब का उपयोग करके 26 ग्राम हैमिल्टन सिरिंज से जोड़ा गया था। (बी) एएवी इंजेक्शन के लिए सेट-अप। (सी) एएवी समाधान को ऊर्ध्वाधर अक्ष से 60 डिग्री पूर्वकाल में झुके हुए ग्लास पिपेट के माध्यम से इंजेक्ट किया गया था। (डी) खुली खोपड़ी की प्रक्रिया का योजनाबद्ध आरेख (चरण 3.3 में वर्णित)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: कपाल खिड़की और हेड-प्लेट । (ए) कपाल खिड़की आरोपण का योजनाबद्ध आरेख। (बी) कस्टम-निर्मित हेड-प्लेटों का उपयोग किया गया था। दाहिने गोलार्ध में इमेजिंग के लिए, दाईं ओर छोटे हाथ का उपयोग किया जाना चाहिए। (सी) कपाल खिड़की और एक प्रत्यारोपित सिर प्लेट के साथ माउस का पृष्ठीय दृश्य। (डी) चित्र 2 सी में दिखाए गए कपाल खिड़की का उच्च आवर्धन दृश्य। (ई) कस्टम-निर्मित स्टीरियोटैक्सिक उपकरण के साथ तय किए गए माउस का पृष्ठीय दृश्य। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: विवो टू-फोटॉन इमेजिंग में सेट-अप। (ए) छायांकन उपकरण का पृष्ठीय दृश्य। (बी) छायांकन डिवाइस का साइड व्यू। (सी) उद्देश्य लेंस के तहत हेड प्लेट पर छायांकन डिवाइस के साथ माउस का दृश्य। माउस ट्रेडमिल पर रखा गया है। (डी) दो-फोटॉन उत्तेजना माइक्रोस्कोप के तहत दृश्य। दृश्य उत्तेजनाओं को प्रस्तुत करने वाला एक मॉनिटर आकृति के दाईं ओर रखा गया है। ऑब्जेक्टिव लेंस को छायांकन डिवाइस और काले एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर किया गया है ताकि मॉनिटर से ऑब्जेक्टिव लेंस तक प्रकाश से बचा जा सके। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एक डेंड्राइटिक रीढ़ में माइक्रोग्लियल गतिशीलता और दृश्य प्रतिक्रियाएं। (ए-सी) 12 सप्ताह पुराने सीएक्स 3एक्सआर 1-ईजीएफपी ट्रांसजेनिक माउस में वी 1 की परत 2/3 में ईजीएफपी (+) माइक्रोग्लिया और आर-सीएएमपी (+) न्यूरॉन्स की समय-औसत छवियां। प्रत्येक चैनल में सिग्नल की तीव्रता को स्वतंत्र रूप से सामान्यीकृत किया गया था। (डी) डेंड्राइटिक रीढ़ में दृश्य प्रतिक्रियाएं। काले तीर ों के साथ पट्टी आरेख ग्रे कॉलम द्वारा इंगित समय में प्रस्तुत झंझरी उत्तेजनाओं की दिशा को इंगित करते हैं। कैल्शियम के निशान में, ग्रे रेखाएं व्यक्तिगत प्रतिक्रियाओं को इंगित करती हैं, और एक काली रेखा उनके औसत को इंगित करती है। दाएं इनसेट में, एक पीला तीर डेंड्राइटिक रीढ़ को इंगित करता है जिसमें कैल्शियम के निशान प्राप्त करने के लिए रुचि का क्षेत्र (आरओआई) उत्पन्न हुआ था। (ई) माइक्रोग्लियल प्रक्रिया (सियान एरोहेड) ने 10 सेकंड में तेजी से वापसी दिखाई। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो 1: न्यूरोनल गतिविधि और माइक्रोग्लियल गतिशीलता की दो-फोटॉन इमेजिंग। 12 सप्ताह पुराने सीएक्स 3 एक्सआर 1-ईजीएफपी ट्रांसजेनिक माउस में वी 1 की परत 2/3 में ईजीएफपी (+) माइक्रोग्लिया और आर-सीएएमपी (+) न्यूरॉन्स का इमेजिंग डेटा। फिल्म के बाईं ओर, मैजेंटा न्यूरॉन्स में आर-सीएएमपी को इंगित करता है, और हरा माइक्रोग्लिया में ईजीएफपी को इंगित करता है। फिल्म का केंद्र ईजीएफपी सिग्नल से मेल खाता है, और दाईं ओर आर-सीएएमपी सिग्नल से मेल खाती है। प्रत्येक चैनल में सिग्नल की तीव्रता को स्वतंत्र रूप से सामान्यीकृत किया गया था। फिल्म का फ्रेम रेट वास्तविक दर से 40 गुना तेज है। स्केल बार = 10 μm कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

हम जागृत चूहों में माइक्रोग्लियल गतिशीलता और न्यूरोनल गतिविधि के साथ-साथ डेटा प्रोसेसिंग की एक साथ इमेजिंग के लिए एएवी इंजेक्शन और क्रैनियोटॉमी के प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। यह तकनीक माइक्रोग्लियल गतिशीलता और न्यूरोनल गतिविधि के बीच समन्वय को उप-सेकंड से लेकर दसियों सेकंड तक के समय के पैमाने पर उजागर कर सकती है।

सर्जरी प्रोटोकॉल में कई तकनीकी रूप से मांग वाले कदम शामिल हैं। एएवी इंजेक्शन महत्वपूर्ण चरणों में से एक है। असफल एएवी इंजेक्शन आर-सीएएमपी की अभिव्यक्ति में महत्वपूर्ण कमी का कारण बन सकता है। दो मुख्य कारण हैं: भरा हुआ ग्लास पिपेट और ऊतक क्षति। ग्लास पिपेट का बंद होना एएवी समाधान के इजेक्शन को कम या पूरी तरह से अवरुद्ध करता है। एएवी समाधान को डाई जैसे तेज हरे रंग से रंगकर और इंजेक्शन की सफलता की पुष्टि करके इस स्थिति से बचा जा सकता है। एएवी इंजेक्शन के कारण ऊतक क्षति इंजेक्शन साइट के केंद्र के पास बहिर्जात जीन अभिव्यक्ति को रोकती है। एएवी इंजेक्शन द्वारा प्रेरित क्षति पिपेट के अंदर दबाव के संचय के बाद ग्लास पिपेट की नोक से प्रवाह में अचानक वृद्धि के कारण होने की संभावना है। इसलिए, इंजेक्शन के दौरान ग्लास पिपेट से एएवी समाधान का बहिर्वाह स्थिर होना चाहिए। उनकी युक्तियों पर थोड़ा व्यापक व्यास के साथ ग्लास पिपेट का चयन करने से यह समस्या हल हो जाएगी। कपाल खिड़की प्रत्यारोपण में, सर्जरी की गति महत्वपूर्ण है। यदि सर्जरी में बहुत लंबा समय लगता है, तो मस्तिष्क के ऊतक गंभीर रूप से क्षतिग्रस्त हो सकते हैं। तदनुसार, सर्जरी की गति और चिकनाई सुनिश्चित करने के लिए बार-बार अभ्यास आवश्यक है। इसके अलावा, सर्जरी से इमेजिंग तक 4 सप्ताह के दौरान, पारंपरिक विधि17 द्वारा कपाल खिड़की और मस्तिष्क के ऊतकों के बीच ऊतक पुनर्जनन द्वारा इमेजिंग की गुणवत्ता को कम किया जा सकता है। यहां विधि ऊतक पुनर्जनन को रोकने और खिड़की को स्पष्ट रखने के लिए कपाल खिड़कियों की आंतरिक ग्लास डिस्क के लिए मोटे चश्मे लगाकर इस मुद्दे को दूर करती है। यहां वर्णित प्रणाली में, यह प्रभाव 0.525 ± 0.075 μm की मोटाई के साथ एक आंतरिक ग्लास डिस्क का उपयोग करके स्पष्ट था।

विधि को 4 सप्ताह से अधिक उम्र के चूहों पर सफलतापूर्वक लागू किया जा सकता है, लेकिन छोटे चूहों के लिए आवेदन समस्याग्रस्त हो सकता है। किशोर चूहों में, खोपड़ी तेजी से और प्रमुख विकास दिखाती है, जो कपाल की हड्डी और कांच की खिड़की के बीच एक बेमेल को प्रेरित करती है।

कुछ अत्याधुनिक अध्ययनों में, विवो में दो-फोटॉन इमेजिंग का उपयोग माइक्रोग्लिया-न्यूरॉन इंटरैक्शन12,21,23 का अध्ययन करने के लिए किया गया था। विशेष रूप से मर्लिन एट अल द्वारा अग्रणी काम में, उन्होंनेकोशिका निकायों के भीतर माइक्रोग्लियल गतिशीलता और तंत्रिका गतिविधि के विवो इमेजिंग में एक साथ प्रदर्शन किया। इस विधि में, कपाल खिड़कियों के लिए मोटे आंतरिक चश्मे का उपयोग करके, हम गहराई अभिविन्यास में गति कलाकृतियों को दबा सकते हैं और डेंड्राइटिक स्पाइन जैसे माइक्रोस्ट्रक्चर में न्यूरोनल गतिविधि के स्थिर माप को प्राप्त कर सकते हैं। यह विधि जागृत चूहों में सिनैप्स-माइक्रोग्लियल प्रक्रिया इंटरैक्शन की जांच करने में मदद करेगी।

हाल ही में, इन विट्रो अध्ययन से पता चला है कि पतली फिलोपोडिया जैसी माइक्रोग्लियल प्रक्रियाओं में मोटी प्रक्रियाओं की तुलना में तेजी से गतिशीलता होती है,जो निगरानी में उनकी तेज गतिशीलता के महत्व का सुझाव देती है। यहां की प्रणाली पतली माइक्रोग्लियल प्रक्रियाओं की गतिशीलता को एक उप-सेकंड से कुछ दसियों सेकंड तक अस्थायी रिज़ॉल्यूशन के साथ ट्रैक कर सकती है। यह गुण विवो में निगरानी के लिए उनकी गतिशीलता के कार्यात्मक महत्व को स्पष्ट करने में मदद करता है।

भविष्य में, स्थानीय तंत्रिका सर्किट या अंतर-क्षेत्रीय तंत्रिका कनेक्शन पर लागू ऑप्टोजेनेटिक्स24 या केमोजेनेटिक्स25 जैसे हस्तक्षेपों के साथ इस इमेजिंग तकनीक का संयोजन सिनैप्टिक विकास और प्लास्टिसिटी में नए माइक्रोग्लियल कार्यों पर प्रकाश डालेगा जो तंत्रिका सर्किट की विशेषताओं को गढ़ते हैं। इसके अलावा, इमेजिंग, हस्तक्षेप और व्यवहार संबंधी कार्यों का आगे एकीकरण विशिष्ट व्यवहारों को अंतर्निहित माइक्रोग्लिया और न्यूरॉन्स के समन्वय को प्रकट करने में योगदान देगा।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम वायरस वैक्टर प्रदान करने के लिए डॉ मासाशी कोंडो और डॉ मासानोरी मात्सुजाकी को धन्यवाद देते हैं। इस कार्य को वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए सहायता अनुदान (20H00481, 20A301, 20H05894, 20H05895 से S.O.), जापान एजेंसी फॉर मेडिकल रिसर्च एंड डेवलपमेंट (JP19gm1310003 और JP17gm5010003 से S.O. और JP19dm0207003 से H.M. ब्रेन साइंस फाउंडेशन (एचएम के लिए)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10-inch LCD monitor EIZO DuraVision FDX1003 For presenting grating visual stimuli
26G Hamilton syringe Hamilton 701N
27G needle Terumo NN-2719S
AAV-hSyn-R-CAMP1.07 N/A N/A Kindly gifted from Prof. Matsuzaki's laboratory 
Activated charcoal powder Nacalai tesque 07909-65
Black aluminum foil THORLABS BKF12
CX3CR1-EGFP mouse Jackson laboratory IMSR_JAX: 005582 CX3CR-1EGFP/+ knock-in/knock-out mice expressing EGFP in microglia in the brain under the control of the endogenous Cx3cr1 locus.
DENT SILICONE-V Shofu Inc N/A For the attachment of a shading device to a head-plate
Dental cement (quick resin, liquid) Shofu Inc N/A AB
Dental cement(quick resin, powder) Shofu Inc N/A B Color 3
Drill Toyo Associates HP-200
Glass capillary pipette Drummond Scientific Company 2-000-075
Glass disc (large) Matsunami N/A 4mm in diameter, 0.15±0.02mm in thickness
Glass disc (small) Matsunami N/A 2mm in diameter, 0.525±0.075mm in thickness
Head-plate Customized N/A Material: SUS304, thickness: 0.5mm, see Figure2B for the shape
Hemostatic fiber Davol Inc 1010090
ImageJ Fiji software Free software For data registration
Instant glue (Aron alpha) Daiichi Sankyo N/A
Isoflurane Pfizer N/A
Lidocaine Astrazeneca N/A
MATLAB 2017b MathWorks N/A For data registration and processing
Meloxicam Tokyo Chemical Industry M1959
Microinjector KD Scientific KDS-100
Micropipette puller Sutter Instrument Company P-97
Multi-photon excitation microscope NIKON N/A The commercial name is "A1MP+".
Objective lens NIKON N/A The commercial name is "CFI75 apochromat 25xC W".
Paraffin Liquid Nacalai tesque 26132-35
Psychtoolbox Free software For presenting grating visual stimuli
Shading device Customized N/A
Stereomicroscope Leica M165 FC
Stereotaxic instrument Narishige Scientific Instrument SR-611 For the surgery
Stereotaxic instrument Customized N/A For fixing mice under the two-photon microscope
Stopcock ISIS VXB1079
Surgical silk Ethicon K881H
Treadmill Customized N/A
UV light curing agent Norland Products Inc NOA 65
Vaporizer Penlon Sigma Delta Anesthetic machine

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Andoh, M., et al. Exercise reverses behavioral and synaptic abnormalities after maternal inflammation. Cell Reports. 27 (10), 2817-2825 (2019).
  2. Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews. Neuroscience. 19 (3), 138-152 (2018).
  3. Clasadonte, J., Scemes, E., Wang, Z., Boison, D., Haydon, P. G. Connexin 43-mediates astroglial metabolic networks contribute to the regulation of the sleep-wake cycle. Neuron. 95 (6), 1365-1380 (2017).
  4. Taylor, A. M. W., et al. Microglia disrupt mesolimbic reward circuitry in chronic pain. Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).
  5. Kondo, S., Kohsaka, S., Okabe, S. Long-term changes of spine dynamics and microglia after transient peripheral immune response triggered by LPS in vivo. Molecular Brain. 4, 27 (2011).
  6. Wu, Y., Dissing-Olsen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. Microglia: Dynamic mediators of synapse development and plasticity. Trends in Immunology. 36 (10), 605-613 (2015).
  7. Andoh, M., Koyama, R. Microglia regulate synaptic development and plasticity. Developmental Neurobiology. 81 (5), 568-590 (2020).
  8. Iida, T., Tanaka, S., Okabe, S. Spatial impact of microglial distribution on dynamics of dendritic spines. European Journal of Neuroscience. 49 (11), 1400-1417 (2019).
  9. Nakayama, H., et al. Microglia permit climbing fiber elimination by promoting GABAergic inhibition in the developing cerebellum. Nature Communications. 9 (1), 2830 (2018).
  10. Wake, H., Moorhouse, A. J., Jinno, S., Kohsaka, S., Nabekura, J. Resting microglia directly monitor the functional state of synapses in vivo and determine the fate of ischemic terminals. Journal of Neuroscience. 29 (13), 3974-3980 (2009).
  11. Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biology. 8 (11), 10000527 (2010).
  12. Liu, Y. U., et al. Neuronal network activity controls microglial process surveillance in awake mice via norepinephrine signaling. Nature Neuroscience. 22 (11), 1771-1781 (2019).
  13. Kim, T. H., Schnitzer, M. J. Fluorescence imaging of large-scale neural ensemble dynamics. Cell. 185 (1), 9-41 (2022).
  14. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  15. Isshiki, M., Okabe, S. Evaluation of cranial window types for in vivo two-photon imaging of brain microstructures. Microscopy (Oxf). 63 (1), 53-63 (2014).
  16. Ohtsuki, G., et al. Similarity of visual selectivity among clonally related neurons in visual cortex. Neuron. 75 (1), 65-72 (2012).
  17. Maruoka, H., et al. Lattice system of functionally distinct cell types in the neocortex. Science. 358 (6363), 610-615 (2017).
  18. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  19. Bernier, L. P., et al. Nanoscale surveillance of the brain by microglia via cAMP-regulated filopodia. Cell Reports. 27 (10), 2895 (2019).
  20. Sun, W., et al. In vivo two-photon imaging of anesthesia-specific alterations in microglial surveillance and photodamage-directed motility in mouse cortex. Frontiers in Neuroscience. 13, 421 (2019).
  21. Merlini, M., et al. Microglial Gi-dependent dynamics regulate brain network hyperexcitability. Nature Neuroscience. 24 (1), 19-23 (2021).
  22. Kondo, M., Kobayashi, K., Ohkura, M., Nakai, J., Matsuzaki, M. Two-photon calcium imaging of the medial prefrontal cortex and hippocampus without cortical invasion. eLife. 6, 26839 (2017).
  23. Badimon, A., et al. Negative feedback control of neuronal activity by microglia. Nature. 586 (7829), 417-423 (2020).
  24. Rajasethupathy, P., Ferenczi, E., Deisseroth, K. Targeting neural circuits. Cell. 165 (3), 524-534 (2016).
  25. Roth, B. L. DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).

Tags

वापसी अंक 186
जागृत चूहों में माइक्रोग्लियल डायनामिक्स और न्यूरोनल गतिविधि की एक साथ इमेजिंग
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maruoka, H., Kamei, R., Mizutani,… More

Maruoka, H., Kamei, R., Mizutani, S., Liu, Q., Okabe, S. Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice. J. Vis. Exp. (186), e64111, doi:10.3791/64111 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter