Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Samtidig avbildning av mikroglialdynamikk og nevronaktivitet hos våkne mus

Published: August 23, 2022 doi: 10.3791/64111
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Cellular Neurobiology, Graduate School of Medicine and Faculty of Medicine, The University of Tokyo

Summary

Her beskriver vi en protokoll som kombinerer adenoassosiert virusinjeksjon med kranialvinduimplantasjon for samtidig avbildning av mikrogliadynamikk og nevronaktivitet hos våkne mus.

Abstract

Siden hjernefunksjoner er under kontinuerlig påvirkning av signalene fra perifert vev, er det viktig å belyse hvordan gliaceller i hjernen sanser ulike biologiske forhold i periferien og overfører signalene til nevroner. Mikroglia, immunceller i hjernen, er involvert i synaptisk utvikling og plastisitet. Derfor bør mikroglias bidrag til nevralkretskonstruksjon som respons på kroppens indre tilstand testes kritisk ved intravital avbildning av forholdet mellom mikroglialdynamikk og nevronaktivitet.

Her beskriver vi en teknikk for samtidig avbildning av mikroglialdynamikk og nevronaktivitet hos våkne mus. Adenoassosiert virus som koder for R-CaMP, en genkodet kalsiumindikator for rødt fluorescensprotein, ble injisert i lag 2/3 av den primære visuelle cortex i CX3CR1-EGFP transgene mus som uttrykker EGFP i mikroglia. Etter virusinjeksjon ble et kranialvindu installert på hjerneoverflaten av det injiserte området. In vivo to-foton avbildning i våkne mus 4 uker etter operasjonen viste at nevral aktivitet og mikrogliadynamikk kunne registreres samtidig ved sub-sekund temporal oppløsning. Denne teknikken kan avdekke koordinasjonen mellom mikroglialdynamikk og nevronaktivitet, med førstnevnte som reagerer på perifere immunologiske tilstander og sistnevnte koder for de indre hjernetilstandene.

Introduction

Det er økende bevis på at kroppens indre tilstand hele tiden påvirker hjernefunksjonene hos dyr 1,2,3,4,5. For å få en dypere forståelse av hjernens funksjoner er det derfor avgjørende å belyse hvordan gliaceller i hjernen overvåker biologiske forhold i periferien og videresender informasjonen til nevroner.

Mikroglia, immunceller i hjernen, er involvert i synaptisk utvikling og plastisitet, som skulpturerer egenskaper av nevrale kretser i hjernen 6,7,8,9. For eksempel viste pionerarbeidet til Wake et al. at mikrogliaprosesser kommer i kontakt med synapser på en nevronaktivitetsavhengig måte i museneocortex, og at kunstig iskemi induserer synapsetap etter langvarig kontakt med mikroglia10. Tremblay et al. fant at endring av visuell opplevelse endrer modaliteten til mikroglial interaksjon med synapser. I den kritiske perioden når dendritisk ryggradsomsetning i den primære visuelle cortex (V1) økes ved kikkertmangel, reduserer mørk tilpasning motiliteten til mikroglialprosesser og øker både kontaktfrekvensen med synaptiske spalter og antall cellulære inneslutninger i mikroglia11. Disse resultatene tyder på at mikrogliaprosesser sanser nevral aktivitet og deres omgivelser for å ombygge nevrale kretser. Videre rapporterte en nylig studie at mikroglialovervåking er forskjellig mellom våkne og bedøvede forhold, noe som tyder på viktigheten av eksperimenter med våkne mus for å undersøke nevron-mikroglia-kommunikasjon under fysiologiske forhold12.

In vivo to-foton kalsiumavbildning er et kraftig verktøy for opptak av kalsiumdynamikk, som reflekterer pågående nevronavfyring, i hundrevis av nevroner samtidig i et levende dyr13,14,15. Kalsiumavbildning i nevroner krever generelt en tidsmessig oppløsning på mer enn noen få Hz for å spore raske nevronresponser16,17. I motsetning til dette har tidligere studier som sporer mikroglialdynamikk samplet mikrogliastrukturer ved en relativt lav temporal oppløsning på mindre enn 0.1 Hz18,19,20. En nylig studie brukte samtidig to-foton avbildning for å forstå nevron-mikroglia kommunikasjon21. Imidlertid er det fortsatt uklart hvordan dynamiske mikrogliaprosesser reagerer på den omkringliggende nevrale aktiviteten ved en tidsmessig oppløsning på mer enn noen få Hz i våkne mus. For å løse dette problemet beskriver vi en samtidig in vivo to-foton avbildningsmetode for nevral aktivitet og mikroglialdynamikk med en tidsoppløsning høyere enn 1 Hz hos våkne mus. Denne metoden lar oss oppnå stabil avbildning i våkne mus med høyere bildefrekvens (maksimum, 30 Hz med pikselrammestørrelsen på 512 x 512 piksler) og gir en gunstigere måte å undersøke overvåkingsoppførselen til mikroglia eller deres interaksjon med nevronaktivitet i våkne mus.

Protocol

Alle eksperimenter ble godkjent av Animal Ethics Committee og Genetic Recombinant Experiment Safety Committee of Graduate School of Medicine og Det medisinske fakultet, University of Tokyo, og utført i henhold til deres retningslinjer.

1. Forberedelse

  1. Steriliser alle instrumenter og apparater som er nødvendige for operasjonen ved bruk av autoklav eller 70% etanol.
  2. Glass pipette forberedelse.
    1. Fest en kalibrert kapillær på 75 μL til holderen på mikropipettetrekkeren. Sett avtrekkeren til programmet med de anbefalte parametrene som P (trykk) = 500, VARME = 680, PULL = 30, VEL = 60, TID = 180.
    2. Etter å ha fullført programmet (vanligvis 4,5 til 5 s), er kapillæren delt inn i to glasspipetter med avsmalnende haler. Bryt deretter den distale delen av halene med pinsett for å holde spissdiameteren innen 30-50 μm. For dette, bryte haler 1 cm distalt til enden av den skråstilte delen.
  3. For kraniotomi, klargjør et kranialvindu ved å lime en større ytre glassplate, 4 mm i diameter, 0,15 ± 0,02 mm i tykkelse, til en mindre indre glassplate, 2 mm i diameter, 0,525 ± 0,075 mm i tykkelse, ved bruk av et UV-lysherdende reagens (figur 2A).

2. AAV-injeksjon

  1. Klargjøring av injeksjonsapparat
    1. Plasser en glasspipette koblet til en 26 G Hamilton sprøyte gjennom et rør på en pipetteholder på et stereotaktisk instrument, og vipp deretter pipetteholderen 60° anteriort fra den vertikale aksen (figur 1A, B).
    2. Fyll glasspipetten, sprøyten og tilkoblingsrøret med flytende parafin. Plasser sprøyten på en mikroinjektor.
  2. Kirurgisk prosedyre
    MERK: Følgende operasjon ble utført i en sterilisert bås. Et stereomikroskop ble brukt til operasjonen om nødvendig.
    1. Bedøv en mannlig CX3CR1-EGFP-mus (detaljert informasjon i materialfortegnelsen) ved 7 til 8 uker gammel (kroppsvekt 22-26 g) med 3% isofluran i et gasstett kammer. Etter 3 min, ta musen ut av kammeret når den mister frivillig bevegelse unntatt pust, og bytt deretter til kontinuerlig anestesi med et neserør med 2% isofluran.
      MERK: Isofluran er kjent for å aktivere mikroglia. Fordi bildediagnostikk utføres 4 uker etter operasjonen, er det imidlertid ingen effekt av isofluran på musene under avbildning. Selv om isoflurananestesi brukes i noen minutter når mus plasseres i det stereotaktiske instrumentet før avbildning (trinn 4.2.1), fant vi at effekten av denne korte anestesien er ubetydelig.
    2. Under operasjonen, hold musen varm med en varmepute ved 37 °C for å forhindre hypotermi. Påfør øyesalve på begge øynene for å forhindre tørrhet i hornhinnen og administrer en meloksikam injeksjon, subkutant (5 mg / kg). Fest musen til en ekstra ørestang, og fest deretter musen på det stereotaksale instrumentet med dorsalsiden opp.
    3. Juster isofluran konsentrasjonen til en passende prosentandel (1%-2%) under operasjonen mens du overvåker pust og hjertefrekvens. Fjern håret ved hjelp av hårfjerningskrem og desinfiser hodet flere ganger i en sirkulær bevegelse med både en jodbasert eller klorhexidinbasert skrubb og alkohol. Injiser deretter 0,1 ml 1% lidokain subkutant og påfør sterile gardiner for å sikre operasjonsstedet.
    4. Snitt hodebunnen åpen langs midtlinjen med saks og gjør snittet ca 2 cm langt, for å sikre en god eksponering av skallen over høyre primære visuelle cortex. Etter snittet i hodebunnen, skyll hodet med saltvann gjennom hele prosedyren for å forhindre at den eksponerte skallen og hjernen tørker.
    5. Fjern periosteum på den eksponerte skallen ved hjelp av tang. Bor skallen på de stereotaktiske koordinatene: 3 mm lateralt til midtlinjen, 0,5 mm foran lambdalinjen, for å lage et lite hull med ca. 0,5 mm diameter. Skyll av blod og vevsrester fra borekronen, om nødvendig.
    6. Fyll glasspipetten med 1 μL rAAV2/1-hSyn-R-CaMP1.07 ved hjelp av følgende fremgangsmåte ved en titer på 8,3 x 1012 vektorgenomer/ml22.
      1. Løft sprøyten for å ta ut 1 μL flytende parafin fra glasspipetten. Plasser et stykke gjennomsiktig film, ca. 2 cm x 2 cm, på den eksponerte skallen til musen og fjern en dråpe med 1 μl AAV-oppløsning på filmen ved hjelp av en pipettor.
      2. Plasser glasspipettespissen i dråpen med AAV-oppløsning på filmen og trekk forsiktig i sprøyten for å aspirere AAV-oppløsningen. Etter utkastet, vri den T-formede stoppekranen for å frigjøre trykket inne i røret og glasspipetten.
    7. Sett glasspipetten inn i en dybde på 500 μm fra hjerneoverflaten gjennom hullet opprettet i trinn 2.2.5, og injiser deretter 0,5 μL AAV-oppløsning ved hjelp av mikroinjektoren (figur 1C). Bruk injeksjonsvolumstrømningshastigheten på 2,0 μL/time; en injeksjon på 0,5 μL tar 15 minutter, og vent deretter i 5 minutter.
    8. Etter injeksjonen, trekk forsiktig glasspipetten og skyll hjerneoverflaten med saltvann.

3. Implantasjon av kraniale vinduer

MERK: Kranialvinduimplantasjon følger AAV-injeksjonen samme dag.

  1. Merk en sirkel på 2,5 mm diameter på skallen, sentrert 3 mm lateralt fra lambdaen. Lag et sirkulært spor langs merket på skallen ved å bore. Rengjør rusk, da det kan påvirke synligheten av skallen negativt og påfør saltvann under boreprosessen for å forhindre oppvarming.
  2. For å sjekke om boredybden i det sirkulære sporet er tilstrekkelig til å fjerne det sentrale skallefragmentet, trykk forsiktig på den sentrale skallen med tang. Hvis den beveger seg vertikalt med liten motstand, er boredybden tilstrekkelig.
  3. Når sporet når nok dybde, setter du spissen av tangen inn i bunnen av det sentrale skallefragmentet og løfter og fjerner den forsiktig for å eksponere hjerneoverflaten (figur 1D).
  4. Bruk en 27 G kanyle, stikk og riv dura på kanten av den eksponerte hjerneoverflaten. Sett spissen av tangen gjennom hullet som er laget på kanten av duraen. Hold dura og skrell den av for å eksponere hjerneoverflaten.
    MERK: Hvis blødning oppstår, skyll hjerneoverflaten med saltvann til blødningen stopper.
  5. Bruk tang, spre hemostatiske fibre en etter en i saltvann i en 3,5 mm tallerken, og plasser deretter de hemostatiske fibrene langs kantene av hullet der den transekterte dura er tilstede.
  6. Plasser et kranialvindu forberedt i trinn 1.3 på den eksponerte hjerneoverflaten, og fest det deretter til skallen med øyeblikkelig lim mens du forsiktig trykker på vinduet slik at vinduet er i nær kontakt med skallen.
  7. Etterpå påfører du øyeblikkelig lim på hele den eksponerte skallen, og fest deretter forsiktig en hodeplate på skallen slik at vinduet finner seg i midten av det firkantede hullet på hodeplaten (figur 2C). Forsikre deg om at overflaten på hodeplaten er parallell med overflaten av glassvinduet.
  8. Etter at limet har herdet tilstrekkelig, påfør tannsement på den eksponerte skallen for å forsterke festet mellom hodet og hodeplaten (figur 2).
    MERK: Hvis forsøkene inkluderer presentasjon av visuelle stimuli til mus, bør strølys til bildeområdet unngås. Det anbefales å sverte sementen ved å blande den med aktivt kull for å redusere lysrefleksjon.
  9. Trekk musen ut av anestesien etter at sementen har herdet tilstrekkelig (ca. 20 min). Sett deretter musen inn i et nytt bur for å komme deg alene.
  10. Etter å ha bekreftet sin bevissthet og frivillige bevegelse, noe som indikerer full gjenoppretting, legg musen tilbake i hjemmeburet. Under utvinningen, administrer en andre eller mer om nødvendig meloksikam dose (en gang hver 24. time i 1-3 dager) hvis åpenbar smerteindikerende atferd oppstår.

4. In vivo to-foton avbildning av mikroglia og neuronal kalsiumdynamikk

  1. Habituation av mus til mikroskopapparatet
    1. Tre uker etter operasjonen, indusere anestesi i musen med 3% isofluran, og sett musen under 25x objektivlinsen til et to-foton mikroskop ved hjelp av et skreddersydd stereotaksisk instrument (figur 3C). For oppsettet her er musen satt på toppen av en tredemølle og får løpe fritt.
    2. Omtrent 10 minutter senere, fjern musen fra mikroskopstadiet og sett den tilbake til hjemmeburet. Gjenta tilvenningen minst 3 ganger annenhver dag før to-foton bildeopptak.
  2. To-foton bildeoppkjøp
    MERK: Vi anbefaler å utføre bildeopptaket mer enn 4 uker etter operasjonen, da mikrogliaaktivering gradvis går tilbake til basalnivået.
    1. Som i trinn 4.1, indusere anestesi i musen med 3% isofluran og sett musen under objektivlinsen til to-foton mikroskopet ved hjelp av et skreddersydd stereotaktisk instrument.
    2. Installer den skreddersydde skyggeenheten og en LCD-skjerm for visuell stimulering som beskrevet nedenfor (figur 3D).
      1. Plasser linsen for å fokusere på hjerneoverflaten, og sett deretter denne linseposisjonen som den opprinnelige Z-posisjonen. Hold x-y-koordinatene konstante og hev objektivlinsen; Fjern musen og det stereotaktiske instrumentet fra objektivlinsen og tredemøllen.
      2. Fest en skyggeanordning på toppen av hodeplaten ved hjelp av silikon, som er svertet ved å blande med kullpulver, og sørg for at mellomrommet mellom hodeplaten og skyggeanordningen er godt forseglet.
      3. Fyll skyggeanordningen med destillert vann, og fest deretter musen og den stereotaktiske rammen igjen under målet og på tredemøllen. Tilbakestill forsiktig fokalplanet på hjerneoverflaten, kontroller dybden på objektivlinsen.
        MERK: For å unngå risikoen for å skade objektivlinsen, still inn xyz-koordinatene først, og bruk deretter skyggeanordningen til objektivlinsen. Det er også rimelig å installere dekselet først, og deretter justere koordinatene, men forsiktig håndtering er nødvendig for dette alternativet.
      4. Dekk objektivlinsen med svart aluminiumsfolie for å unngå lysforurensning fra LCD-skjermen som brukes til visuell stimulering gjennom objektivlinsen (figur 3D). Sett en 10-tommers LCD-skjerm på 12,5 cm foran musens øyne for å presentere visuelle stimuli (figur 3D).
    3. Konfigurer fluorescensutslippsfiltrene til EGFP-fluorescens (525/50 nm utslippsfilter) og R-CaMP-fluorescens (593/46 nm utslippsfilter) og eksitasjonsbølgelengden til 1,000 nm. Skaff bilder med den romlige oppløsningen på 0,25 μm / piksel ved hjelp av et 25x 1.1 NA-mål og GaAsP PMT-er.
    4. Finn avbildningsområdet der R-CaMP(+)-nevroner og EGFP(+) mikroglia kan avbildes samtidig i lag 2/3. For dette oppsettet var data oppnådd i figur 4 og Video 1 på en dybde på 100 μm fra pialoverflaten, ved hjelp av en forhåndsvisning av levende bilder. Hold kraften til eksitasjonslaseren så lav som mulig for å unngå fotobleking og skade forårsaket av økt lokal temperatur i bildeområdet.
    5. Skaff bilder med bildefrekvens på 30 Hz. Samtidig med bildeopptaket, presenter en drivende rist visuell stimuli ved 100% kontrast, 1.5 Hz, 0.04 sykluser per grad i 12 retninger ved 6 retninger fra 0 ° til 150 ° i 30 ° trinn til musen17.
    6. Etter bildeoppkjøpet, fjern musen fra mikroskopstadiet, løsne skyggeanordningen og det stereotaksiske instrumentet fra musen, og returner musen til hjemmeburet.
  3. Registrering av data
    1. Konverter og lagre de innhentede bildedataene (nd2-format i dette tilfellet) som en serie tiff-bildefiler for hver fargekanal, ved hjelp av Fiji eller programvaren som følger med mikroskopet.
    2. Bruk Turboreg, et plugin fra Fiji, for å utføre registrering med modus = oversettelse. Bruk gjennomsnittlig bilde som referansebilde med tiff-bildefilene til EGFP-kanalen.
    3. Utfør følgende behandling for hvert delbilde ved hjelp av MATLAB.
      MERK: Selv om MATLAB brukes i følgende behandling, fokuserer beskrivelsen hovedsakelig på intensjonen med hvert trinn, slik at data kan analyseres av annen programmeringsprogramvare som Python.
      1. Bruk imread-funksjonen til å lese to EGFP tiff-bilder før og etter registrering av samme ramme, henholdsvis. Bruk imread-funksjonen til å lese R-CaMP tiff-bildet av samme bilde.
      2. Bruk normcorr2-funksjonen til å beregne korrelasjonsfunksjonen mellom de vektoriserte variablene i de to GFP-bildene som leses i trinn 4.3.3.1.
      3. Bruk maks-funksjonen til å finne den lineære indeksen med høyest krysskorrelasjon for korrelasjonsfunksjonen, og bruk deretter ind2sub-funksjonen til å beregne bevegelsesposisjonen til det registrerte bildet fra det opprinnelige bildet.
      4. Bruk imwarp-funksjonen til å oversette R-CaMP-bildet til posisjonen som ble beregnet i trinn 4.3.3.3, og bruk deretter imwrite-funksjonen til å lagre det registrerte bildet av R-CaMP.
  4. Generering av kalsiumspor
    1. Utfør følgende behandling ved hjelp av MATLAB. Bruk imread-funksjonen til å lese alle registrerte R-CaMP tiff-bilder generert i trinn 4.3.3.4. Hvis de registrerte bildene allerede er lastet inn som en variabel i arbeidsområdet, utelater du dette trinnet.
    2. Bruk gjennomsnittsfunksjonen til å generere et tidsprojeksjonsbilde. Bruk imshow-funksjonen til å vise det gjennomsnittlige bildet som en figur; Bruk roipoly-funksjonen til å generere en binær ROI-maske av målstrukturen (dendrittisk ryggrad i disse dataene).
    3. Ved å bruke gjennomsnittsfunksjonen med bildene som er oppnådd ved å multiplisere den binære masken med bilder av hver ramme som inngangsvariabler, beregner du gjennomsnittlig fluorescensintensitet innenfor avkastningen for hver ramme.
    4. Som beskrevet tidligere17, til variabelen oppnådd i trinn 4.4.3, bruk smørverdifrekvensfilteret ved cutoff = 1,6 s, for å kutte høyfrekvent støy, og bruk deretter glidemedianfilteret ved tidsvinduet = 200 s, for å kutte lavfrekvent støy.

Representative Results

Vi utførte AAV-injeksjon og kranialvinduimplantasjon i V1 av en 8 uker gammel CX3XR1-EGFP transgen mus som beskrevet i denne protokollen. Fire uker etter operasjonen utførte vi simultan in vivo tofotonavbildning av R-CaMP-basert nevral aktivitet og mikrogliadynamikk i lag 2/3 av V1 (figur 4 og video 1). Under avbildningen ble musen plassert på en tredemølle og fikk løpe fritt. Bilder ble tatt med bildefrekvens på 30 Hz med romlig oppløsning på 0,25 μm / piksel ved hjelp av et 25x, 1.1 NA objektiv og GaAsP PMTs. Både EGFP og R-CaMP ble eksitert ved en bølgelengde på 1000 nm, og EGFP-fluorescens (525/50 nm utslippsfilter) og R-CaMP-fluorescens (593/46 nm utslippsfilter) ble samlet samtidig. Etter registrering av innsamlede data for å minimere bevegelsesartefakter, ble hver fjerde ramme gjennomsnittet til en ramme for å redusere bakgrunnsstøy. Gitter visuelle stimuli ble presentert for musen, og de visuelle responsene til nevroner og individuelle dendritiske pigger ble analysert (figur 4D). Mikrogliaprosesser viste rask dynamikk og endret morfologi innen 10 s (figur 4E og Video 1). Som beskrevet i diskusjonsdelen kunne ikke uttrykket av R-CaMP oppdages når AAV-injeksjonen mislyktes. Hvis operasjonen ikke var vellykket, kunne signalene fra EGFP og R-CaMP ikke observeres.

Figure 1
Figur 1: AAV-injeksjon . (A) En glasspipette ble koblet til en 26 G Hamilton sprøyte ved hjelp av et silisiumrør. (B) Oppsettet for AAV-injeksjon. (C) AAV-oppløsningen ble injisert via glasspipetten vippet 60° anteriort fra den vertikale aksen. (D) Skjematisk diagram over prosedyren for åpen hodeskalle (beskrevet i trinn 3.3). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Kranialvindu og hodeplate . (A) Skjematisk diagram over kranialvinduimplantasjon. (B) Skreddersydde hodeplater ble brukt. For avbildning i høyre halvkule, bør den kortere armen brukes på høyre side. (C) Dorsal visning av en mus med et kranialvindu og en implantert hodeplate. (D) Høyt forstørrelsesbilde av kranialvinduet vist i figur 2C. (E) Dorsal visning av en mus festet med det skreddersydde stereotaksiske instrumentet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Oppsettet for in vivo to-foton avbildning. (A) Dorsal visning av skyggeinnretning. (B) Sidevisning av skyggeanordning. (C) Visning av en mus med skyggeanordningen på hodeplaten under objektivlinsen. Musen er plassert på tredemøllen. (D) Vis under to-foton eksitasjonsmikroskopet. En skjerm som presenterer visuelle stimuli er plassert på høyre side av figuren. Objektivlinsen er dekket med skyggeanordningen og svart aluminiumsfolie for å unngå lys fra skjermen til objektivlinsen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Mikrogliadynamikk og visuelle responser i dendrittisk ryggrad. (A-C) Tidsgjennomsnittlige bilder av EGFP(+) mikroglia og R-CaMP(+)-nevroner i lag 2/3 av V1 i en 12 uker gammel CX3XR1-EGFP transgen mus. Signalintensiteten i hver kanal ble normalisert uavhengig. (D) Visuelle responser i en dendritisk ryggrad. Stripediagrammer med svarte piler indikerer retningen til gitterstimuliene som presenteres i timingen som er angitt med grå kolonner. I kalsiumspor indikerer grå linjer individuelle responser, og en svart linje indikerer gjennomsnittet. I høyre innfelt indikerer en gul pilspiss den dendrittiske ryggraden der interesseområdet (ROI) ble generert for å skaffe kalsiumsporene. (E) Mikrogliaprosessen (cyan pilspiss) viste rask tilbaketrekning i 10 s. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Video 1: To-foton avbildning av nevronaktivitet og mikroglialdynamikk. Avbildningsdata av EGFP (+) mikroglia og R-CaMP (+) nevroner i lag 2/3 av V1 i en 12 uker gammel CX3XR1-EGFP transgen mus. På venstre side av filmen indikerer magenta R-CaMP i nevroner, og grønt indikerer EGFP i mikroglia. Midten av filmen tilsvarer EGFP-signalet, og høyre side tilsvarer R-CaMP-signalet. Signalintensiteten i hver kanal ble normalisert uavhengig. Bildefrekvensen til filmen er 40 ganger raskere enn den faktiske hastigheten. Skala bar = 10 μm Klikk her for å laste ned denne videoen.

Discussion

Vi beskriver protokollen for AAV-injeksjon og kraniotomi for simultan avbildning av mikrogliadynamikk og nevronaktivitet hos våkne mus samt databehandling. Denne teknikken kan avdekke koordinasjonen mellom mikroglialdynamikk og nevronaktivitet på tidsskalaer fra sub-sekund til titalls sekunder.

Operasjonsprotokollen innebærer flere teknisk krevende trinn. AAV-injeksjon er et av de kritiske trinnene. Mislykket AAV-injeksjon kan føre til en signifikant reduksjon i uttrykket av R-CaMP. Det er to hovedårsaker: tette glasspipetter og vevskader. Tilstopping av glasspipetter reduserer eller blokkerer helt utstøtingen av AAV-oppløsningen. Denne situasjonen kan unngås ved å fargelegge AAV-løsningen med et fargestoff som raskt grønt og visuelt bekrefte injeksjonens suksess. Vevsskade forårsaket av AAV-injeksjon forhindrer eksogent genuttrykk nær midten av injeksjonsstedet. Skaden forårsaket av AAV-injeksjon skyldes sannsynligvis en plutselig økning i utstrømningen fra spissen av glasspipetten etter akkumulering av trykket inne i pipetten. Derfor bør utstrømningen av AAV-oppløsning fra glasspipetten være konstant under injeksjonen. Å velge glasspipetter med litt bredere diameter på spissene ville løse dette problemet. Ved kranialvinduimplantasjon er operasjonshastigheten kritisk. Hvis operasjonen tar for lang tid, kan hjernevevet bli alvorlig skadet. Følgelig er gjentatt praksis nødvendig for å sikre hastigheten og jevnheten i operasjonen. I tillegg kan kvaliteten på bildediagnostikken i løpet av de 4 ukene fra operasjon til avbildning reduseres ved vevsregenerering mellom kranialvinduet og hjernevevet ved konvensjonell metode17. Metoden her overvinner dette problemet ved å bruke tykke briller for den indre glassplaten i kranialvinduene for å hemme vevregenerering og holde vinduet klart. I systemet beskrevet her var denne effekten tydelig ved å bruke en indre glassskive med en tykkelse på 0,525 ± 0,075 μm.

Metoden kan brukes med hell på mus eldre enn 4 uker, men søknaden til yngre mus kan være problematisk. Hos unge mus viser skallen rask og fremtredende vekst, noe som induserer et misforhold mellom kranialbenet og glassvinduet.

I noen banebrytende studier ble in vivo to-foton avbildning brukt til å studere mikroglia-nevron-interaksjoner 12,21,23. Spesielt i pionerarbeidet til Merlini et al. utførte de samtidig in vivo-avbildning av mikroglialdynamikk og nevral aktivitet i cellelegemene21. I denne metoden, ved å bruke tykkere indre briller for kraniale vinduer, kunne vi undertrykke bevegelsesartefakter i dybdeorienteringen og oppnå stabil måling av nevronaktivitet i mikrostrukturer, for eksempel dendritiske pigger. Denne metoden vil bidra til å undersøke synapse-mikroglial prosessinteraksjoner i våkne mus.

Nylig viste in vitro-studier at tynne filopodia-lignende mikrogliaprosesser har raskere motilitet enn tykke prosesser, noe som tyder på viktigheten av deres raskere motilitet i overvåking19. Systemet her kan spore motiliteten til tynne mikroglialprosesser med en tidsmessig oppløsning fra et undersekund til noen få titalls sekunder. Denne egenskapen bidrar til å belyse den funksjonelle betydningen av deres motilitet for overvåking in vivo.

I fremtiden vil kombinasjonen av denne bildebehandlingsteknikken med intervensjoner, som optogenetikk24 eller kjemogenetikk25, anvendt på lokale nevrale kretser eller interregionale nevrale forbindelser, kaste lys over nye mikroglialfunksjoner i synaptisk utvikling og plastisitet som skulpturerer egenskaper av nevrale kretser. Videre integrering av bildebehandling, intervensjon og atferdsoppgaver vil også bidra til å avsløre koordineringen av mikroglia og nevroner som ligger til grunn for spesifikk atferd.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Masashi Kondo og Dr. Masanori Matsuzaki for å gi virusvektorer. Dette arbeidet ble støttet av Grants-in-Aid for Scientific Research (20H00481, 20A301, 20H05894, 20H05895 til SO), Japan Agency for Medical Research and Development (JP19gm1310003 og JP17gm5010003 til SO og JP19dm0207082 til HM), UTokyo Center for Integrative Science of Human Behavior (CiSHuB), Japan Science and Technology Agency Moonshot R & D (JPMJMS2024 til HM), Brain Science Foundation (til H. M.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10-inch LCD monitor EIZO DuraVision FDX1003 For presenting grating visual stimuli
26G Hamilton syringe Hamilton 701N
27G needle Terumo NN-2719S
AAV-hSyn-R-CAMP1.07 N/A N/A Kindly gifted from Prof. Matsuzaki's laboratory 
Activated charcoal powder Nacalai tesque 07909-65
Black aluminum foil THORLABS BKF12
CX3CR1-EGFP mouse Jackson laboratory IMSR_JAX: 005582 CX3CR-1EGFP/+ knock-in/knock-out mice expressing EGFP in microglia in the brain under the control of the endogenous Cx3cr1 locus.
DENT SILICONE-V Shofu Inc N/A For the attachment of a shading device to a head-plate
Dental cement (quick resin, liquid) Shofu Inc N/A AB
Dental cement(quick resin, powder) Shofu Inc N/A B Color 3
Drill Toyo Associates HP-200
Glass capillary pipette Drummond Scientific Company 2-000-075
Glass disc (large) Matsunami N/A 4mm in diameter, 0.15±0.02mm in thickness
Glass disc (small) Matsunami N/A 2mm in diameter, 0.525±0.075mm in thickness
Head-plate Customized N/A Material: SUS304, thickness: 0.5mm, see Figure2B for the shape
Hemostatic fiber Davol Inc 1010090
ImageJ Fiji software Free software For data registration
Instant glue (Aron alpha) Daiichi Sankyo N/A
Isoflurane Pfizer N/A
Lidocaine Astrazeneca N/A
MATLAB 2017b MathWorks N/A For data registration and processing
Meloxicam Tokyo Chemical Industry M1959
Microinjector KD Scientific KDS-100
Micropipette puller Sutter Instrument Company P-97
Multi-photon excitation microscope NIKON N/A The commercial name is "A1MP+".
Objective lens NIKON N/A The commercial name is "CFI75 apochromat 25xC W".
Paraffin Liquid Nacalai tesque 26132-35
Psychtoolbox Free software For presenting grating visual stimuli
Shading device Customized N/A
Stereomicroscope Leica M165 FC
Stereotaxic instrument Narishige Scientific Instrument SR-611 For the surgery
Stereotaxic instrument Customized N/A For fixing mice under the two-photon microscope
Stopcock ISIS VXB1079
Surgical silk Ethicon K881H
Treadmill Customized N/A
UV light curing agent Norland Products Inc NOA 65
Vaporizer Penlon Sigma Delta Anesthetic machine

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Andoh, M., et al. Exercise reverses behavioral and synaptic abnormalities after maternal inflammation. Cell Reports. 27 (10), 2817-2825 (2019).
  2. Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews. Neuroscience. 19 (3), 138-152 (2018).
  3. Clasadonte, J., Scemes, E., Wang, Z., Boison, D., Haydon, P. G. Connexin 43-mediates astroglial metabolic networks contribute to the regulation of the sleep-wake cycle. Neuron. 95 (6), 1365-1380 (2017).
  4. Taylor, A. M. W., et al. Microglia disrupt mesolimbic reward circuitry in chronic pain. Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).
  5. Kondo, S., Kohsaka, S., Okabe, S. Long-term changes of spine dynamics and microglia after transient peripheral immune response triggered by LPS in vivo. Molecular Brain. 4, 27 (2011).
  6. Wu, Y., Dissing-Olsen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. Microglia: Dynamic mediators of synapse development and plasticity. Trends in Immunology. 36 (10), 605-613 (2015).
  7. Andoh, M., Koyama, R. Microglia regulate synaptic development and plasticity. Developmental Neurobiology. 81 (5), 568-590 (2020).
  8. Iida, T., Tanaka, S., Okabe, S. Spatial impact of microglial distribution on dynamics of dendritic spines. European Journal of Neuroscience. 49 (11), 1400-1417 (2019).
  9. Nakayama, H., et al. Microglia permit climbing fiber elimination by promoting GABAergic inhibition in the developing cerebellum. Nature Communications. 9 (1), 2830 (2018).
  10. Wake, H., Moorhouse, A. J., Jinno, S., Kohsaka, S., Nabekura, J. Resting microglia directly monitor the functional state of synapses in vivo and determine the fate of ischemic terminals. Journal of Neuroscience. 29 (13), 3974-3980 (2009).
  11. Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biology. 8 (11), 10000527 (2010).
  12. Liu, Y. U., et al. Neuronal network activity controls microglial process surveillance in awake mice via norepinephrine signaling. Nature Neuroscience. 22 (11), 1771-1781 (2019).
  13. Kim, T. H., Schnitzer, M. J. Fluorescence imaging of large-scale neural ensemble dynamics. Cell. 185 (1), 9-41 (2022).
  14. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  15. Isshiki, M., Okabe, S. Evaluation of cranial window types for in vivo two-photon imaging of brain microstructures. Microscopy (Oxf). 63 (1), 53-63 (2014).
  16. Ohtsuki, G., et al. Similarity of visual selectivity among clonally related neurons in visual cortex. Neuron. 75 (1), 65-72 (2012).
  17. Maruoka, H., et al. Lattice system of functionally distinct cell types in the neocortex. Science. 358 (6363), 610-615 (2017).
  18. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  19. Bernier, L. P., et al. Nanoscale surveillance of the brain by microglia via cAMP-regulated filopodia. Cell Reports. 27 (10), 2895 (2019).
  20. Sun, W., et al. In vivo two-photon imaging of anesthesia-specific alterations in microglial surveillance and photodamage-directed motility in mouse cortex. Frontiers in Neuroscience. 13, 421 (2019).
  21. Merlini, M., et al. Microglial Gi-dependent dynamics regulate brain network hyperexcitability. Nature Neuroscience. 24 (1), 19-23 (2021).
  22. Kondo, M., Kobayashi, K., Ohkura, M., Nakai, J., Matsuzaki, M. Two-photon calcium imaging of the medial prefrontal cortex and hippocampus without cortical invasion. eLife. 6, 26839 (2017).
  23. Badimon, A., et al. Negative feedback control of neuronal activity by microglia. Nature. 586 (7829), 417-423 (2020).
  24. Rajasethupathy, P., Ferenczi, E., Deisseroth, K. Targeting neural circuits. Cell. 165 (3), 524-534 (2016).
  25. Roth, B. L. DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).

Tags

Tilbaketrekking utgave 186
Samtidig avbildning av mikroglialdynamikk og nevronaktivitet hos våkne mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maruoka, H., Kamei, R., Mizutani,… More

Maruoka, H., Kamei, R., Mizutani, S., Liu, Q., Okabe, S. Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice. J. Vis. Exp. (186), e64111, doi:10.3791/64111 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter