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Developmental Biology

Hybridation fluorescente in situ et marquage de la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine pour les cellules souches de la méduse hydrozoaire Cladonema pacificum

Published: August 3, 2022 doi: 10.3791/64285
Automatic Translation
1, 1, 2, 2
1Graduate School of Life Sciences, Tohoku University, 2Graduate School of Pharmaceutical Sciences, The University of Tokyo

Summary

Ici, nous décrivons un protocole pour visualiser les cellules proliférantes de type souche dans la méduse Cladonema. L’hybridation in situ fluorescente à montage entier avec un marqueur de cellules souches permet la détection de cellules souches, et le marquage de la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine permet l’identification des cellules proliférantes. Ensemble, des cellules souches proliférant activement peuvent être détectées.

Abstract

Les cnidaires, y compris les anémones de mer, les coraux et les méduses, présentent une morphologie et des modes de vie variés qui se manifestent par des polypes sessiles et des méduses nageant librement. Comme l’illustrent les modèles établis tels que Hydra et Nematostella, les cellules souches et/ou les cellules prolifératives contribuent au développement et à la régénération des polypes cnidaires. Cependant, les mécanismes cellulaires sous-jacents chez la plupart des méduses, en particulier au stade de la méduse, sont largement flous et, par conséquent, le développement d’une méthode robuste pour identifier des types cellulaires spécifiques est essentiel. Cet article décrit un protocole pour visualiser les cellules proliférantes de type souche chez la méduse hydrozoaire Cladonema pacificum. Cladonema medusae possède des tentacules ramifiés qui se développent continuellement et maintiennent une capacité de régénération tout au long de leur stade adulte, fournissant une plate-forme unique pour étudier les mécanismes cellulaires orchestrés par la prolifération et / ou les cellules souches. L’hybridation in situ fluorescente à montage entier (FISH) à l’aide d’un marqueur de cellules souches permet la détection de cellules de type souches, tandis que le marquage par impulsions avec la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EdU), un marqueur de phase S, permet l’identification des cellules proliférantes. En combinant à la fois l’étiquetage FISH et EdU, nous pouvons détecter la prolifération active de cellules souches sur des animaux fixes, et cette technique peut être largement appliquée à d’autres animaux, y compris des espèces de méduses non modèles.

Introduction

Cnidaria est considéré comme un phylum métazoaire à ramification basale contenant des animaux dotés de nerfs et de muscles, les plaçant dans une position unique pour comprendre l’évolution du développement et de la physiologie des animaux 1,2. Les cnidaires sont classés en deux groupes principaux: les anthozoaires (par exemple, les anémones de mer et les coraux) ne possèdent que des larves de planula et des stades de polypes sessiles, tandis que les méduses (membres des hydrozoaires, des staurozoaires, des scyphozoaires et des cubozoa) prennent généralement la forme de méduses nageant librement, ou méduses, ainsi que de larves et de polypes planula. Les Cnidaires présentent généralement une capacité de régénération élevée, et leurs mécanismes cellulaires sous-jacents, en particulier leur possession de cellules souches adultes et de cellules prolifératives, ont attiré beaucoup d’attention 3,4. Initialement identifiées dans Hydra, les cellules souches hydrozoaires sont situées dans les espaces interstitiels entre les cellules épithéliales ectodermiques et sont communément appelées cellules interstitielles ou cellules i3.

Les cellules i hydrozoaires partagent des caractéristiques communes qui comprennent la multipotence, l’expression de marqueurs de cellules souches largement conservés (par exemple, Nanos, Piwi, Vasa) et le potentiel de migration 3,5,6,7,8. En tant que cellules souches fonctionnelles, les i-cellules sont largement impliquées dans le développement, la physiologie et les réponses environnementales des animaux hydrozoaires, ce qui atteste de leur capacité de régénération élevée et de leur plasticité3. Alors que les cellules souches, similaires aux cellules i, n’ont pas été identifiées en dehors des hydrozoaires, même chez l’espèce modèle établie Nematostella, les cellules prolifératives sont toujours impliquées dans le maintien et la régénération du tissu somatique, ainsi que dans la lignée germinale9. Comme les études sur le développement et la régénération des cnidaires ont été principalement menées sur des animaux de type polype tels que Hydra, Hydractinia et Nematostella, la dynamique cellulaire et les fonctions des cellules souches chez les espèces de méduses restent largement ignorées.

La méduse hydrozoaire Clytia hemisphaerica , une espèce de méduse cosmopolite avec différents habitats à travers le monde, y compris la mer Méditerranée et l’Amérique du Nord, a été utilisée comme animal modèle expérimental dans plusieurs études développementales et évolutives10. Avec sa petite taille, sa manipulation facile et ses œufs volumineux, Clytia convient à l’entretien en laboratoire, ainsi qu’à l’introduction d’outils génétiques tels que les méthodes de transgénèse et d’élimination11 récemment établies, ouvrant la voie à une analyse détaillée des mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à la biologie des méduses. Dans le tentacule de Clytia medusa, les cellules i sont localisées dans la région proximale, appelée bulbe, et les progéniteurs tels que les nématoblastes migrent vers l’extrémité distale tout en se différenciant en types cellulaires distincts, y compris les nématocytes12.

Lors de la régénération du Clytia manubrium, l’organe buccal des méduses, les cellules Nanos1+ i présentes dans les gonades migrent vers la région où le manubrium est perdu en réponse à des dommages et participent à la régénération du manubrium7. Ces résultats soutiennent l’idée que les cellules i de Clytia se comportent également comme des cellules souches fonctionnelles impliquées dans la morphogenèse et la régénération. Cependant, étant donné que les propriétés des cellules i diffèrent parmi les animaux représentatifs de type polype tels que Hydra et Hydractinia3, il est possible que les caractéristiques et les fonctions des cellules souches soient diversifiées parmi les espèces de méduses. De plus, à l’exception de Clytia, les techniques expérimentales ont été limitées pour les autres méduses, et la dynamique détaillée des cellules prolifératives et des cellules souches est inconnue13.

La méduse hydrozoaire Cladonema pacificum est un organisme modèle émergent qui peut être conservé dans un environnement de laboratoire sans pompe à eau ni système de filtration. Le Cladonema medusa a des tentacules ramifiés, une caractéristique commune dans la famille des Cladonematidae, et un organe photorécepteur appelé ocelle sur la couche ectodermique près du bulbe14. Le processus de ramification du tentacule se produit à un nouveau site de ramification qui apparaît le long du côté adaxial du tentacule. Au fil du temps, les tentacules continuent de s’allonger et de se ramifier, les branches les plus anciennes étant poussées vers la pointe15. De plus, les tentacules du cladonème peuvent se régénérer quelques jours après l’amputation. Des études récentes ont suggéré le rôle des cellules proliférantes et des cellules souches dans la ramification et la régénération des tentacules chez Cladonema16,17. Cependant, alors que l’hybridation in situ conventionnelle (ISH) a été utilisée pour visualiser l’expression génique dans Cladonema, en raison de sa faible résolution, il est actuellement difficile d’observer en détail la dynamique des cellules souches au niveau cellulaire.

Cet article décrit une méthode de visualisation de cellules souches dans Cladonema par FISH et de co-coloration avec EdU, un marqueur de prolifération cellulaire18. Nous visualisons le modèle d’expression de Nanos1, un marqueur de cellules souches 5,17, par FISH, qui permet l’identification de la distribution des cellules souches au niveau de la cellule unique. De plus, la co-coloration de l’expression de Nanos1 avec le marquage EdU permet de distinguer les cellules souches qui prolifèrent activement. Cette méthode de surveillance des cellules souches et des cellules prolifératives peut être appliquée à un large éventail de domaines d’investigation, y compris la ramification des tentacules, l’homéostasie tissulaire et la régénération des organes chez Cladonema, et une approche similaire peut être appliquée à d’autres espèces de méduses.

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Protocol

REMARQUE : Consultez le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs et équipements utilisés dans ce protocole.

1. Synthèse de sonde

  1. Extraction d’ARN
    1. Placez trois Cladonema medusae vivants cultivés dans de l’eau de mer artificielle (ASW) dans un tube de 1,5 mL à l’aide d’une pipette de transfert de 3,1 mL avec l’embout coupé, et retirez autant d’ASW que possible.
      NOTE: ASW est préparé en dissolvant un mélange de sels minéraux dans l’eau du robinet avec un neutralisant de chlore; la densité finale (S.G.) est de 1,018 ou les parties pour mille (ppt) sont ~27.
    2. Congeler les tubes de 1,5 mL dans de l’azote liquide pour inhiber l’activité de la RNase. Ajouter 30 μL de tampon de lyse à partir du kit d’isolement d’ARN total dans lequel du 2-mercaptoéthanol (1 μL/100 μL de tampon de lyse) a été ajouté et homogénéiser les échantillons dans le tampon de lyse à l’aide d’un homogénéisateur.
      REMARQUE: Pour éviter le débordement du tampon et de l’échantillon des tubes, l’homogénéisation avec une petite quantité de tampon de lyse est recommandée.
    3. Ajouter 570 μL de tampon de lyse et extraire l’ARN total en suivant le protocole du kit d’isolement de l’ARN total (Figure 1).
    4. Mesurer la concentration de l’ARN extrait à l’aide d’un spectrophotomètre et conserver à −80 °C jusqu’à utilisation.
  2. Synthèse de l’ADNc
    1. À l’aide d’un kit, synthétiser l’ADNc en utilisant l’ARN total extrait des méduses comme matrice (Figure 1 et Tableau 1).
    2. Incuber à 65 °C pendant 5 min.
    3. Refroidir rapidement sur la glace.
    4. Effectuer la synthèse de l’ADNc avec le mélange de l’étape 1.2.1 (Tableau 1). Bien mélanger par pipetage et incuber à 42 °C pendant 60 min.
    5. Incuber à 95 °C pendant 5 min.
    6. Refroidir rapidement sur la glace.
    7. Mesurer la concentration de l’ADNc synthétisé à l’aide d’un spectrophotomètre et conserver à −20 °C ou moins jusqu’à utilisation.
  3. Synthèse de produits PCR
    1. Pour créer un modèle de PCR, concevez l’amorce spécifique à l’aide de Primer-BLAST. Source de la séquence de référence à partir des données NCBI ou des données RNA-seq.
      REMARQUE : Voir le tableau des matériaux pour les amorces utilisées dans ce protocole.
    2. Pour amplifier la séquence cible, effectuez le clonage TA, qui ne nécessite pas l’utilisation d’enzymes de restriction. Pour obtenir un produit PCR dans lequel une adénine est ajoutée à l’extrémité 3', utilisez les réglages suivants : 98 °C pendant 2 min ; 35 cycles de 98 °C pendant 10 s, 55-60 °C pendant 30 s, 72 °C pendant 1 min. Utiliser Taq ADN polymérase pour les réactions (tableau 1).
      REMARQUE: Pour déterminer les conditions de PCR, suivez le protocole qui accompagne l’ADN polymérase à utiliser, qui fournit généralement une température de recuit recommandée et un temps de prolongation.
    3. Passez le produit PCR dans un gel d’agarose à 1% et découpez la bande d’intérêt. Extraire les produits PCR des gels coupés à l’aide d’un kit d’extraction de gel.
  4. Ligature
    1. Litérer le produit de PCR sur le vecteur avec des surplombs de thymine 3' en mélangeant les réactifs (tableau 1) et en incubant à 37 °C pendant 30 min (Figure 1).
      NOTE: Le rapport moléculaire du vecteur:PCR devrait être de 1:>3. La taille du vecteur pTA2 est d’environ 3 kb. Si le produit PCR (insert) est A (kb) et B (ng/μL), le volume de l’insert (X dans le tableau 1) à prélever peut être calculé par ([50 ng de vecteur × A kb d’insert])/(vecteur 3 kb × [ 1/3]) = 50· Un ng d’insert. Si la concentration de l’insert est de B ng/μL, le volume prélevé est de 50· A/B μL d’insert.
  5. Transformation et placage
    1. Pour la transformation, décongeler les cellules compétentes sur de la glace et les distribuer en aliquotes de 20 μL chacune. Ajouter 1 μL des plasmides contenant le produit de PCR (moins de 5% du volume cellulaire compétent) et vortex pendant 1 s. Incuber sur glace pendant 5 min, puis incuber à 42 °C pendant 45 s et vortex pendant 1 s.
    2. Ajouter 180 μL de bouillon Super Optimal avec milieu de répression des catabolites (SOC) (un milieu de culture bactérienne riche sur le plan nutritionnel) aux cellules compétentes et incuber à 37 °C pendant 30 min. Après 30 min, étaler les cellules compétentes sur une plaque de gélose contenant de l’ampicilline, du 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-bêta-D-galacto-pyranoside (X-gal) et de l’isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG), et incuber à 37 °C pendant 12-16 h (Figure 1).
      REMARQUE: X-gal et IPTG sont utilisés pour sélectionner les colonies bleues et blanches.
  6. Culture liquide
    1. Choisissez une colonie blanche parmi les colonies blanches et bleues de l’assiette. Ajoutez-le à 3-5 mL de milieu LB avec de l’ampicilline et incuber sur un agitateur pendant 12-16 h à 37 °C (Figure 1).
  7. Miniprep
    1. Extraire le plasmide du milieu LB à l’aide d’une miniprep plasmidique (Figure 1).
    2. Quantifier la concentration plasmidique à l’aide d’un spectrophotomètre.
  8. Lisez la séquence.
    1. Pour lire la séquence d’ADN du plasmide, envoyez le plasmide pour le séquençage de Sanger, puis utilisez un logiciel pour l’aligner avec la séquence génome/transcriptome afin de confirmer si la séquence cible est correctement synthétisée et d’évaluer dans quelle direction la séquence cible est insérée dans le plasmide (5' à 3' ou 3' à 5').
      REMARQUE: Si la séquence cible est insérée dans le plasmide dans la direction 5' à 3' à partir du site de liaison de l’ARN polymérase près de l’extrémité 3', une sonde antisens peut être générée par transcription in vitro . Si la séquence cible est insérée dans la direction inverse de 3' à 5', une sonde de détection (contrôle négatif) peut être générée. Si vous utilisez des vecteurs tels que pTA2, deux sites de liaison à la transcription peuvent être utilisés en fonction de l’objectif.
  9. Transcription in vitro
    1. Préparer la matrice d’ADN à partir du plasmide créé en effectuant une PCR à l’aide d’amorces à l’extérieur du site de liaison de l’ARN polymérase (p. ex. sites de liaison T7/T3) dans le plasmide (Figure 1).
      REMARQUE: Les amorces universelles telles que l’amorce directe M13-20 et l’amorce inversée M13 peuvent être utilisées pour préparer un modèle d’ADN qui comprend des sites de liaison à l’ARN polymérase.
    2. Purifiez le gabarit après amplification PCR à l’aide d’un kit d’extraction gel/PCR.
    3. Mélanger les réactifs illustrés ci-dessous et effectuer la réaction de transcription à 37 °C pendant 3 h (Figure 1 et Tableau 1).
    4. Ajouter 1,5 μL de DNase et incuber à 37 °C pendant 30 min.
    5. Ajouter 10 μL d’eau exempte de RNase et purifier la sonde de la solution de réaction de transcription à l’aide d’une colonne de nettoyage.
    6. Vérifiez la taille de l’ARN synthétisé en chargeant 1 μL sur un gel d’agarose à 1% et déterminez la concentration à l’aide d’un spectrophotomètre.
      REMARQUE : Les sondes à ARN synthétisées doivent avoir une concentration d’au moins 100 ng/μL.
    7. Ajouter 30 μL de formamide pour stockage à une température égale ou inférieure à −20 °C.

2. Incorporation et fixation d’EdU

  1. Placer Cladonema medusae (5 à 10 animaux par tube) dans des tubes de 1,5 mL à l’aide d’une pipette de transfert de 3,5 mL et ajouter l’ASW jusqu’à un volume total de 500 μL. Ajouter 7,5 μL de solution mère d’EdU à 10 mM et incuber les échantillons pendant 1 h à 22 °C (figure 2). La concentration finale d’EdU est de 150 μM.
    REMARQUE : Utilisez des méduses âgées de 5 à 7 jours pour surveiller la formation de la troisième branche (figure 3A). Le jour où les méduses se détachent du polype est compté comme jour 1, et le jour 5, les méduses commencent généralement à présenter une troisième branche sur leurs tentacules principaux.
  2. Après 1 h, enlever autant d’ASW contenant de l’EdU que possible.
  3. Pour anesthésier les méduses, ajouter 7% de MgCl2dans H2Oet incuber pendant 5 min.
  4. Prélever le MgCl2 à 7 % dansH2Oet fixer les méduses pendant une nuit (O.N.) à 4 °C avec 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans de l’ASW (Figure 2).
    REMARQUE : Lors de l’exécution de FISH sans incorporation d’EdU, les échantillons peuvent être fixés de la même manière que ceux traités avec EdU après anesthésie (étapes 2.3-2.4).

3. Hybridation fluorescente in situ

  1. Traitement protéinase et post-fixation
    1. Retirer le PFA et laver les échantillons avec du PBS contenant 0,1 % de Tween-20 (PBST) pendant 3 x 10 min. Utilisez 300-500 μL de PBST par lavage.
      NOTE: De cette étape à la fin de l’hybridation, l’expérience doit être réalisée dans un environnement sans RNase, en portant des gants et un masque. Le 1x PBS dans cette étape doit être fabriqué avec de l’eau traitée DEPC. Après hybridation, 1x PBS fabriqué avec de l’eau sans traitement DEPC peut être utilisé. Certains protocoles ISH et FISH déshydratent les échantillons en utilisant des étapes de méthanol, ce qui permet de conserver les échantillons fixés à -20 ° C jusqu’à utilisation. Pour éviter un travail superflu, le processus de déshydratation est omis de ce protocole, d’autant plus que les échantillons peuvent être conservés dans PBST jusqu’à quelques jours.
    2. Après la fixation, placer l’échantillon dans des tubes de 1,5 mL sur un agitateur, à l’exception de l’étape d’incubation de l’anticorps anti-DIG-POD O.N. (étape 3.4.2). Après le lavage, ajouter 10 mg/mL de solution mère de protéinase K dans du PBST et incuber les méduses avec la protéinase K (concentration finale : 10 μg/mL) à 37 °C pendant 10 min.
    3. Prélever la solution de protéinase K et laver les échantillons pendant 2 x 1 min avec du PBST.
    4. Pour postfixer les méduses, ajouter 4% PFA dans 1x PBS et incuber à 37 °C pendant 15 min.
    5. Retirer la solution de PFA et laver les échantillons pendant 2 x 10 min avec du PBST.
      REMARQUE: Si le gène cible est fortement exprimé avec un faible signal de fond, les étapes 3.1.2-3.1.5 peuvent être ignorées.
  2. Hybridation
    1. Supprimez le PBST et ajoutez le tampon d’hybridation (tampon HB, tableau 1). Incuber les échantillons dans HB Buffer pendant 15 min à température ambiante (RT). Utilisez 300 à 400 μL de tampon HB, qui fournit suffisamment de volume pour une hybridation réussie.
      REMARQUE: HB Buffer, Wash Buffer 1 et Wash Buffer 2 sont préparés avec 20x SSC stock. HB Buffer est conservé à une température égale ou inférieure à −20 °C et doit être apporté à RT avant utilisation.
    2. Retirez la mémoire tampon HB et ajoutez une nouvelle mémoire tampon HB. Préhybrider à 55 °C pendant au moins 2 h dans un incubateur d’hybridation.
    3. Retirer le tampon HB et incuber avec le tampon HB contenant les sondes stockées à l’étape 1.9.7 (concentration finale de la sonde : 0,5-1 ng/μL dans le tampon HB). Hybrider à 55 °C pendant 18-24 h (Figure 2) dans un incubateur d’hybridation.
      REMARQUE: L’intensité et la spécificité du signal FISH peuvent varier en fonction de l’expression du gène cible, ainsi que de la longueur et de la spécificité de la sonde. Pour augmenter l’intensité, des paramètres tels que la durée d’hybridation (18-72 h) et la température (50-65 °C) peuvent être ajustés et différentes sondes peuvent être testées. Pour éviter les signaux non spécifiques, le traitement par la protéinase K (concentration et durée) peut être modifié19.
  3. Retrait de la sonde
    1. Retirez le tampon HB contenant les sondes, puis ajoutez le tampon de lavage 1 (Tableau 1). Laver les échantillons avec le Wash Buffer 1 pendant 2 x 15 min à 55 °C. Utilisez 300-400 μL de tampon de lavage.
      REMARQUE: Les sondes contenant HB Buffer peuvent être utilisées à plusieurs reprises, jusqu’à environ dix fois. Au lieu de les jeter, entreposer le tampon HB usagé contenant des sondes à une température inférieure ou égale à −20 °C. Préchauffer le tampon de lavage 1, le tampon de lavage 2, 2x SSC et PBST à 55 °C avant utilisation.
    2. Retirez la mémoire tampon de lavage 1, puis ajoutez la mémoire tampon de lavage 2 (Tableau 1). Laver les échantillons avec le Wash Buffer 2 pendant 2 x 15 min à 55 °C.
    3. Retirez Wash Buffer 2, puis ajoutez 2x SSC. Laver les échantillons avec 2x SSC pendant 2 x 15 min à 55 °C.
    4. Retirez 2x SSC, puis ajoutez PBST préchauffé. Lavez les échantillons pendant 1 x 15 min avec PBST at RT.
  4. Incubation d’anticorps anti-DIG
    1. Supprimez PBST, puis ajoutez un tampon bloquant de 1 %. Incuber les échantillons pendant au moins 1 h à TA tout en agitant lentement sur une bascule.
      REMARQUE : Préparer fraîchement le tampon de blocage à 1 % en diluant le stock de tampon de blocage à 5 % (Tableau 1). Vérifiez les échantillons avant la prochaine réaction d’anticorps, car l’échantillon a tendance à coller à l’arrière du couvercle ou de la paroi à la suite de secousses.
    2. Après le blocage, retirer le tampon bloquant à 1 %, ajouter une solution anti-DIG-POD (1:500, dans un tampon bloquant à 1 %) et incuber les échantillons O.N. à 4 °C (Figure 2).
      REMARQUE: Veillez à maintenir le temps d’incubation dans les 12-16 heures pour éviter la détection de signaux non spécifiques.
  5. Détection de sonde marquée DIG
    1. Retirez la solution anti-DIG-POD, puis ajoutez le tampon Tris-NaCl-Tween (TNT, Tableau 1). Laver les échantillons avec du TNT pendant 3 x 10 min à TA.
      REMARQUE: L’utilisation de la technique d’amplification du signal tyramide (TSA) fournit une meilleure résolution d’image contre les réactifs marqués à la peroxydase de raifort (par exemple, anti-DIG-POD).
    2. Diluer la solution mère de tyramide (Cy5-tyramide) conjugué à un colorant fluorescent (1:50) dans le tampon de diluant d’amplification pour obtenir la solution active de Cy5-tyramide (Figure 2).
    3. Retirez autant de TNT que possible, puis ajoutez la solution active de Cy5-tyrmide. Incuber les échantillons pendant 10 min dans l’obscurité.
    4. Laver les échantillons avec PBST pendant 3 x 10 min dans l’obscurité.
  6. Détection d’EdU
    REMARQUE : Le kit EdU détecte les signaux fluorescents EdU incorporés (Figure 2).
    1. Pour préparer le cocktail de détection EdU, mélangez les composants comme indiqué dans le tableau 1. Utilisez 100 μL de cocktail de détection EdU pour chaque échantillon.
      REMARQUE: Préparez 1x additif tampon de réaction en diluant 10x additif tampon de réaction avec de l’eau ultrapure.
    2. Supprimez PBST, puis ajoutez le cocktail de détection EdU. Incuber dans le noir pendant 30 min.
    3. Laver avec PBST pendant 3 x 10 min dans l’obscurité.
  7. Coloration de l’ADN
    1. Diluer Hoechst 33342 (1:500) dans PBST pour préparer la solution de Hoechst. Supprimez le PBST, puis ajoutez la solution Hoechst. Incuber les échantillons pendant 30 min dans l’obscurité (Figure 2).
    2. Lavez les échantillons avec du PBST pendant 3-4 x 10 min dans l’obscurité.
  8. Montage
    1. Faites une banque sur la lame de verre pour éviter que l’échantillon ne soit écrasé. Appliquez du ruban vinyle sur la lame de verre et creusez le centre.
    2. Transférer les méduses à la banque sur le verre coulissant à l’aide d’une pipette de transfert de 3,1 ml avec l’embout coupé.
      REMARQUE: Veillez à ne pas laisser les tentacules se chevaucher.
    3. Retirez tout PBST à l’aide d’une pipette P200, puis ajoutez lentement 70 % de glycérol comme support de montage (Figure 2).
      REMARQUE: Au lieu de 70% de glycérol, un support de montage anti-décoloration peut être utilisé pour empêcher la fluorescence de s’estomper.
    4. Placez délicatement un couvercle sur la méduse à l’aide d’une pince et scellez le côté du couvercle avec du vernis à ongles transparent.
    5. Gardez les lames à 4 °C dans l’obscurité si vous n’effectuez pas immédiatement une observation microscopique.
  9. Imagerie
    1. Utilisez un microscope confocal à balayage laser pour acquérir des images. Pour une résolution à cellule unique, utilisez une lentille à huile 40x ou une lentille pour un grossissement plus élevé.
    2. Après l’acquisition de l’image, ouvrez les images à l’aide du logiciel ImageJ/FIJI et comptez les cellules positives pour EdU+ et/ou Nanos1+ par l’outil multipoint20.

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Representative Results

Les tentacules du cladonème ont été utilisés comme modèle pour étudier les processus cellulaires de morphogenèse et de régénération15,16,17. La structure du tentacule est composée d’un tube épithélial où des cellules de type souche, ou cellules i, sont situées dans la région proximale, appelée bulbe tentacule, et de nouvelles branches sont ajoutées séquentiellement à l’arrière de la région distale du bulbe le long du côté adaxial (Figure 3A)15. Des rapports antérieurs ont indiqué que la prolifération cellulaire est active à la fois dans le bulbe tentacule et sur les nouveaux sites de ramification en utilisant le marquage EdU ou BrdU16,17. Cependant, en raison de la résolution de l’hybridation in situ, il n’est pas clair si les cellules souches sont vraiment prolifératives ou non. Pour visualiser simultanément les cellules souches et prolifératives au niveau cellulaire, nous avons effectué FISH pour les marqueurs de cellules souches (Nanos1 ou Piwi) et le marquage EdU pour les cellules de phase S dans les mêmes échantillons.

À la résolution cellulaire de FISH, l’expression de Nanos1 a été localisée au niveau du bulbe tentacule et du nouveau site de ramification (Figure 3B). Piwi a également été exprimé dans le bulbe tentacule et au nouveau site de ramification selon un schéma similaire à celui de Nanos1 (Figure 3C). Ces résultats étaient cohérents avec les observations de l’hybridation in situ à montage entier dans un rapport précédent17, où la branche bourgeonnante d’une méduse âgée de 7 jours était presque uniformément marquée par Nanos1 et Piwi. Pour visualiser le début de l’accumulation de cellules souches, nous avons surveillé le nouveau site de ramification d’une méduse vieille de 5 jours. Le co-marquage de l’expression de Nanos1 et des cellules EdU-positives a révélé le schéma spatial des cellules souches et des cellules prolifératives dans le tentacule (Figure 4A). Bien que les distributions brutes des cellules EdU+ et Nanos1+ concordaient avec les rapports précédents16,17, les cellules EdU+ étaient plus largement réparties dans tout le bulbe tentacule, du moins au début de la ramification, tandis que les cellules Nanos1+ s’accumulaient plus localement au niveau du bulbe tentacule et du nouveau site de ramification (Figure 4A et Figure 4E ). Ces observations suggèrent que des distributions distinctes de cellules souches et de cellules proliférantes sont détectées en fonction du moment du développement et des différents stades.

Une vue plus détaillée du bulbe et du nouveau site de ramification a révélé que les signaux EdU fusionnent avec la coloration nucléaire, tandis que l’expression de Nanos1 est limitée au cytoplasme entourant le noyau, ce qui correspond à un rapport précédent5 (Figure 4B,C). Une fraction (19,79 %) des cellules présentaient un comarquage d’EdU et de Nanos1 (EdU+ Nanos1+; Figure 4B, C, pointes de flèches jaunes et Figure 4D), ce qui suggère que ces cellules constituent une population de cellules souches qui prolifère activement. Curieusement, 14,46% des cellules se sont avérées être EdU+ Nanos1− au milieu du bulbe et au nouveau site de ramification, suggérant la présence de cellules prolifératives non souches (Figure 4B, C, flèches blanches et Figure 4D). En revanche, 26,32 % des cellules ont été observées comme étant EdU− Nanos1+ à la base du bulbe et au nouveau site de ramification, ce qui indique la présence d’une population de cellules souches à cycle lent ou au repos, dont aucune n’est détectée par le marquage des impulsions EdU (Figure 4B, C, flèches jaunes et Figure 4D).

Figure 1
Figure 1 : Schéma de synthèse de la sonde pour l’hybridation in situ. Extraction de l’ARN total des méduses et synthèse de l’ADNc à partir de l’ARN total. Les produits de PCR spécifiques à Nanos1 ont été synthétisés à partir de l’ADNc. Les produits PCR ont été ligaturés dans les vecteurs, et les vecteurs amplifiés ont été collectés par culture cellulaire compétente. Les produits PCR avec des sites de liaison à l’ARN polymérase ont été synthétisés en utilisant les plasmides comme modèles. Les sondes d’ARN marquées au DIG ont été synthétisées par transcription in vitro. Abréviations : DIG = digoxigénine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Schéma de co-coloration de l’EdU et de l’hybridation fluorescente in situ. Les méduses ont été incubées avec 150 μM d’EdU pendant 1 h. Par la suite, les méduses ont été anesthésiées (pour détendre le tissu) avec 7% de MgCl2 dansH2O et fixées avec 4% de PFA O.N. à 4 °C. Après fixation, les échantillons ont été hybridés avec HB Buffer avec une sonde pendant 20-24 h à 55 °C. Après la réaction d’hybridation, les échantillons ont été lavés et incubés avec une solution anti-DIG-POD O.N. à 4 °C. Les méduses ont été colorées avec une solution de Cy5-tyramide pendant 10 min, suivies de la détection d’EdU pendant 30 min et de la coloration avec Hoechst 33342 pendant 30 min. Après avoir terminé tous les processus de coloration, les méduses ont été montées sur la lame de verre et les images ont été obtenues avec un microscope confocal. Abréviations : EdU = 5-éthynyl-2'-désoxyuridine; FISH = hybridation fluorescente in situ; PFA = paraformaldéhyde; O.N. = nuitée; HB = hybridation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Profils d’expression Nanos1 et Piwi sur la face adaxiale proximale du tentacule de Cladonema medusa. (A) Schéma d’un Cladonema medusa et d’un tentacule. La face adaxiale du tentacule : le bulbe tentacule (la région la plus proximale) avec de nouvelles branches formées séquentiellement sur le nouveau site de ramification. L’encart (carré pointillé) indique la zone capturée par l’image confocale. (B) Images FISH de l’expression du gène Nanos1 à partir de la face proximale et adaxiale du tentacule d’une méduse de Cladonema âgée de 7 jours. (C) Images FISH de l’expression du gène Piwi à partir de la face proximale et adaxiale du tentacule d’une méduse de Cladonema âgée de 7 jours. ADN : vert, Nanos1 : magenta. B'-C’pour les images Nanos1 FISH uniquement. Barres d’échelle = 100 μm (B,C). Abréviation : FISH = hybridation fluorescente in situ. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Profils d’expression d’EdU et de Nanos1 sur la face proximale et adaxiale du tentacule de Cladonema medusa. (A-C) Images de la face adaxiale proximale du tentacule de Cladonema medusa comarquée avec l’expression de Nanos1 et EdU; Des méduses âgées de 5 jours ont été utilisées. (A) Un aperçu du tentacule. Les carrés pointillés jaunes indiquent les zones de B et C. (B) Grossissement du bulbe à tentacules. (C) Agrandissement d’un nouveau site d’embranchement. Les pointes de flèches jaunes indiquent les cellules positives pour EdU et Nanos1. Les flèches jaunes indiquent les cellules qui ne sont positives que pour Nanos1. Les flèches blanches indiquent que les cellules ne sont positives que pour EdU. Les panneaux A-C sont des images fusionnées pour l’ADN (bleu), EdU (vert) et Nanos1 (magenta). A'-C’sont des panneaux pour les images EdU uniquement; A''-C'' sont pour les images Nanos1 FISH uniquement. Barres d’échelle = 100 μm (A), 50 μm (B, C). (D) La quantification des cellules EdU- et/ou Nanos1-positives dans la face basale du tentacule (zone de quantification = 30,10 μm2 carré, n = 6, soit un total de 249 cellules). cellules EdU+ Nanos1−, 14,46 % ; cellules EdU+ Nanos1+, 19,79 %; cellules EdU− Nanos1+, 26,32 %; Cellules EdU− Nanos1−, 39,44%. (E) Schéma d’un tentacule de Cladonema medusa du côté adaxial. La distribution globale des cellules EdU+ et des cellules Nanos1+ est indiquée respectivement en E et E'. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Composition des différentes réactions et tampons de PCR dans ce protocole. Pour calculer le volume du produit PCR (X μL) dans la réaction de ligature, voir la note après l’étape 1.4 du protocole. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

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Discussion

Les cellules proliférantes et les cellules souches sont des sources cellulaires importantes dans divers processus tels que la morphogenèse, la croissance et la régénération21,22. Cet article décrit une méthode de co-coloration du marqueur de cellules souches Nanos1 par marquage FISH et EdU chez Cladonema medusae. Des travaux antérieurs utilisant le marquage EdU ou BrdU ont suggéré que les cellules prolifératives se localisent aux bulbes tentacules16,17, mais leurs caractéristiques moléculaires n’étaient pas claires. La présente étude montre la détermination simultanée de la distribution des cellules prolifératives et la localisation des cellules souches Nanos1+ (Figure 4). Les résultats ont montré que certaines cellules prolifératives exprimaient Nanos1, mais d’autres cellules n’étaient marquées qu’avec EdU et n’exprimaient pas Nanos1, suggérant l’existence d’une hétérogénéité de cellules souches ou, potentiellement, d’autres cellules prolifératives. Il sera intéressant de disséquer la distribution détaillée des cellules souches au cours de différents processus dans Cladonema, y compris la ramification des tentacules, l’homéostasie tissulaire, la régénération des organes et le maintien des cellules germinales.

Le principal goulot d’étranglement pour la visualisation des cellules souches chez les animaux est l’identification initiale des marqueurs de cellules souches. Chez les cnidaires, les marqueurs de cellules souches n’ont pas été identifiés chez les non-hydrozoaires3, et donc, à ce stade, l’application directe de FISH pour les marqueurs de cellules souches reste limitée aux hydrozoaires. Néanmoins, FISH permet la détection de l’expression génique spécifique au niveau cellulaire, et donc, en changeant de sondes, cette méthode peut être étendue pour observer en détail les modèles d’expression spatiale de tous les gènes d’intérêt. Par exemple, en utilisant des marqueurs de cellules progénitrices et de cellules différenciées, nous pouvons vérifier la distribution de types cellulaires spécifiques dans les tentacules du cladonème. En guise de mise en garde, le protocole actuel pourrait devoir être modifié en fonction des gènes d’intérêt en raison des différences dans les niveaux d’expression et la stabilité de l’ARNm. En particulier, les signaux non spécifiques et les signaux faibles sont des problèmes courants associés à FISH. La modification du temps et de la température d’hybridation, l’utilisation de réactifs de blanchiment (formamide ou méthanol) et l’ajustement d’autres paramètres (temps de réaction TSA, traitement à la protéinase K, lavage après hybridation) peuvent donner des signaux plus clairs et moins de signaux non spécifiques23,24. Il est également important de choisir un protocole FISH approprié au modèle animal utilisé, car un protocole FISH peut ne pas être applicable à d’autres espèces, même au sein du même taxon 7,25,26.

Le marquage EdU est généralement utilisé pour détecter les cellules prolifératives, mais pourrait être utilisé à différentes fins expérimentales en faisant varier la concentration et le temps d’incubation27. Pour détecter les cellules proliférantes, il est essentiel de déterminer une durée et une concentration réussies pour l’incorporation d’EdU. Dans le marquage par impulsions utilisé dans ce travail, seules les cellules prolifératives qui ont traversé la phase S pendant une courte période de temps ont été marquées, et des méthodes d’incubation courtes similaires ont été utilisées pour détecter les cellules proliférantes chez d’autres cnidaires 6,28,29. En revanche, la combinaison de l’incorporation prolongée d’EdU et de Nanos1 FISH peut révéler la présence de cellules souches à cycle lent ou quiescentes27. Il est également possible de marquer non seulement les cellules prolifératives, mais aussi les cellules endocycliques qui ont subi une synthèse d’ADN sans division. De plus, en suivant les cellules marquées EdU pendant une plus longue durée, nous pouvons déterminer la capacité cellulaire de migration et de différenciation associée aux cellules prolifératives et à leur lignée cellulaire 6,30.

Bien que la combinaison de coloration FISH et EdU ou BrdU ait été utilisée 7,31, la méthode établie ici peut facilement être appliquée à d’autres invertébrés marins et à des animaux non modèles, y compris différentes espèces de méduses. La coloration EdU est plus simple et plus sensible que la coloration BrdU18, et avec sa courte incubation, elle permet la détection de cellules proliférantes, contrairement à l’étude précédente qui utilisait EdU pour le marquage cellulaire à long terme7. Au cours des dernières années, avec l’avancement des technologies de séquençage de nouvelle génération, l’information sur le génome et l’expression génique est devenue disponible pour de nombreuses espèces. L’identification des cellules souches et des cellules prolifératives continuera d’être une approche efficace pour comprendre l’hétérogénéité et la diversité des cellules souches et fournir des informations sur la dynamique cellulaire sous-jacente aux différents phénomènes biologiques.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par AMED sous le numéro de subvention JP22gm6110025 (à Y.N.) et par le numéro de subvention JSPS KAKENHI 22H02762 (à Y.N.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol  Wako 137-06862
3.1 mL transfer pipette Thermo Scientific 233-20S
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) Wako 029-15043
anti-DIG-POD Roche 11207733910
Cladonema pacificum Nanos1 forward primer 5’-AAGAGACACAGTCATTATCAAGC
GA-3’
Cladonema pacificum Nanos1 reverse primer 5’-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3’
Cladonema pacificum Piwi forward primer 5’- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA
AGGC -3’
Cladonema pacificum Piwi reverse primer 5’- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA
CTGGC -3’
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye Invitrogen  C10337 EdU kit
Coroline off GEX Co. ltd N/A chlorine neutralizer
DIG Nucleic Acid Detection Kit Blocking Reagent Roche 11175041910 blocking buffer 
DIG RNA labeling mix  Roche 11277073910
DTT  Promega P117B
ECOS competent cell DH5α NIPPON GENE 316-06233 competent cell
Fast gene Gel/PCR Extraction kit Fast gene FG-91302 gel extraction kit
Fast gene plasmid mini kit Fast gene FG-90502 plasmid miniprep
Formamide Wako  068-00426
Heparin sodium salt from porcine SIGMA-ALDRICH  H3393-10KU
Isopropyl-β-D(-)-thiogalactopyranoside (IPTG) Wako 096-05143
LB Agar Invitrogen 22700-025 agar plate
LB Broth Base Invitrogen 12780-052 LB medium
Maleic acid Wako 134-00495
mini Quick spin RNA columns Roche 11814427001 clean-up column
NaCl Wako  191-01665
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi Thermo Scientific ND-ONEC-W spectrophotometer
Polyoxyethlene (20) Sorbitan Monolaurate (Tween-20) Wako  166-21115
PowerMasher 2 nippi  891300 homogenizer
Proteinase K Nacarai Tesque  29442-14
RNase Inhibitor TaKaRa 2313A
RNeasy Mini kit Qiagen  74004 total RNA isolation kit
RQ1 RNase-Free Dnase Promega M6101
Saline Sodium Citrate Buffer 20x powder (20x SSC) TaKaRa T9172
SEA LIFE Marin Tech N/A mixture of mineral salts
T3 RNA polymerase  Roche 11031163001
T7 RNA polymerase  Roche 10881767001
TAITEC HB-100 TAITEC 0040534-000 Hybridization incuvator
TaKaRa Ex Taq  TaKaRa RR001A Taq DNA polymerase
TaKaRa PrimeScript 2 1st strand cDNA Synthesis Kit TaKaRa 6210A cDNA synthesis kit
Target Clone TOYOBO  TAK101 pTA2 Vector
tRNA Roche 10109541001
TSA Plus Cyanine 5 AKOYA Biosciences NEL745001KT tyramide signal amplification (TSA) technique
Zeiss LSM 880 ZEISS N/A laser scanning confocal microscope

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References

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Developmental Biology FISH EdU méduse méduse Cladonema pacificum cellules souches prolifération cellulaire
Hybridation <em>fluorescente in situ</em> et marquage de la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine pour les cellules souches de la méduse hydrozoaire <em>Cladonema pacificum</em>
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Fujita, S., Kuranaga, E., Miura, M., Nakajima, Y. i. Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum. J. Vis. Exp. (186), e64285, doi:10.3791/64285 (2022).

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