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Developmental Biology

Hibridização In Situ fluorescente e marcação de 5-etil-2'-desoxiuridina para células-tronco em águas-vivas hidrozoárias Cladonema pacificum

Published: August 3, 2022 doi: 10.3791/64285
Automatic Translation
1, 1, 2, 2
1Graduate School of Life Sciences, Tohoku University, 2Graduate School of Pharmaceutical Sciences, The University of Tokyo

Summary

Aqui, descrevemos um protocolo para visualização de células-tronco proliferantes na água-viva Cladonema. A hibridização in situ fluorescente de montagem completa com um marcador de células-tronco permite a detecção de células-tronco, e a marcação de 5-etil-2'-desoxiuridina permite a identificação de células em proliferação. Juntas, células-tronco em proliferação ativa podem ser detectadas.

Abstract

Os cnidários, incluindo anêmonas do mar, corais e águas-vivas, exibem morfologia e estilos de vida diversos que se manifestam em pólipos sésseis e medusas de natação livre. Como exemplificado em modelos estabelecidos, como Hydra e Nematostella, as células-tronco e/ou células proliferativas contribuem para o desenvolvimento e regeneração de pólipos cnidários. No entanto, os mecanismos celulares subjacentes na maioria das águas-vivas, particularmente no estágio de medusa, são em grande parte obscuros e, portanto, o desenvolvimento de um método robusto para identificar tipos específicos de células é crítico. Este trabalho descreve um protocolo para a visualização de células-tronco proliferantes na água-viva hidrozoária Cladonema pacificum. Cladonema medusae possuem tentáculos ramificados que crescem continuamente e mantêm a capacidade regenerativa durante toda a sua fase adulta, fornecendo uma plataforma única com a qual estudar os mecanismos celulares orquestrados por células proliferantes e / ou semelhantes a troncos. A hibridização in situ fluorescente de montagem completa (FISH) usando um marcador de células-tronco permite a detecção de células-tronco, enquanto a marcação de pulso com 5-etil-2'-desoxiuridina (EdU), um marcador de fase S, permite a identificação de células em proliferação. Combinando a rotulagem FISH e EdU, podemos detectar células-tronco em proliferação ativa em animais fixos, e essa técnica pode ser amplamente aplicada a outros animais, incluindo espécies de águas-vivas não modelo.

Introduction

Cnidaria é considerado um filo de metazoários basalmente ramificado contendo animais com nervos e músculos, colocando-os em uma posição única para a compreensão da evolução do desenvolvimento e fisiologia animal 1,2. Os cnidários são categorizados em dois grupos principais: Anthozoa (por exemplo, anêmonas do mar e corais) possuem apenas larvas de plânula e estágios sésseis, enquanto Medusozoa (membros de Hydrozoa, Staurozoa, Scyphozoa e Cubozoa) normalmente assumem a forma de medusas de natação livre, ou águas-vivas, bem como larvas de plânula e pólipos. Os cnidários comumente exibem alta capacidade regenerativa, e seus mecanismos celulares subjacentes, particularmente sua posse de células-tronco adultas e células proliferativas, têm atraído muita atenção 3,4. Inicialmente identificadas na Hydra, as células-tronco hidrozoárias estão localizadas nos espaços intersticiais entre as células epiteliais ectodérmicas e são comumente referidas como células intersticiais ou i-células3.

As células i hidrozoárias compartilham características comuns que incluem multipotência, expressão de marcadores de células-tronco amplamente conservadas (por exemplo, Nanos, Piwi, Vasa) e potencial de migração 3,5,6,7,8. Como células-tronco funcionais, as células i estão amplamente envolvidas no desenvolvimento, fisiologia e respostas ambientais de animais hidrozoários, o que atesta sua alta capacidade regenerativa e plasticidade3. Embora as células-tronco, semelhantes às células i, não tenham sido identificadas fora dos hidrozoários, mesmo na espécie modelo estabelecida Nematostella, as células proliferativas ainda estão envolvidas na manutenção e regeneração do tecido somático, bem como da linha germinativa9. Como os estudos sobre desenvolvimento e regeneração cnidária têm sido predominantemente conduzidos em animais do tipo pólipo, como Hydra, Hydractinia e Nematostella, a dinâmica celular e as funções das células-tronco em espécies de águas-vivas permanecem em grande parte sem solução.

A água-viva hidrozoária Clytia hemisphaerica , uma espécie cosmopolita de águas-vivas com diferentes habitats ao redor do mundo, incluindo o Mar Mediterrâneo e a América do Norte, tem sido utilizada como animal modelo experimental em diversos estudos evolutivos e de desenvolvimento10. Com seu tamanho pequeno, fácil manuseio e ovos grandes, o Clytia é adequado para manutenção em laboratório, bem como para a introdução de ferramentas genéticas, como os métodos de transgênese e knockout recentemente estabelecidos11, abrindo a oportunidade para uma análise detalhada dos mecanismos celulares e moleculares subjacentes à biologia das águas-vivas. No tentáculo de Clytia medusa, as células i estão localizadas na região proximal, chamada bulbo, e progenitores como os nematoblastos migram para a ponta distal, diferenciando-se em tipos celulares distintos, incluindo os nematócitos12.

Durante a regeneração da Clytia manubrium, órgão oral das águas-vivas, as células i Nanos1+ presentes nas gônadas migram para a região onde o manúbrio é perdido em resposta a danos e participam da regeneração do manúbrio7. Essas descobertas apoiam a ideia de que as células i em Clytia também se comportam como células-tronco funcionais que estão envolvidas na morfogênese e regeneração. No entanto, dado que as propriedades das células i diferem entre os animais representativos do tipo pólipo, como Hydra e Hydractinia3, é possível que as características e funções das células-tronco sejam diversificadas entre as espécies de águas-vivas. Além disso, com exceção de Clytia, as técnicas experimentais têm sido limitadas para outras águas-vivas, e a dinâmica detalhada das células proliferativas e células-tronco é desconhecida13.

A água-viva hidrozoária Cladonema pacificum é um organismo modelo emergente que pode ser mantido em um ambiente de laboratório sem uma bomba de água ou sistema de filtração. A Cladonema medusa possui tentáculos ramificados, característica comum na família Cladonematidae, e um órgão fotorreceptor chamado ocellus na camada ectodérmica próxima ao bulbo14. O processo de ramificação do tentáculo ocorre em um novo local de ramificação que aparece ao longo do lado adaxial do tentáculo. Com o tempo, os tentáculos continuam a se alongar e se ramificar, com os galhos mais antigos sendo empurrados para fora em direção à ponta15. Além disso, os tentáculos de Cladonema podem se regenerar dentro de alguns dias após a amputação. Estudos recentes têm sugerido o papel das células proliferantes e células-tronco na ramificação e regeneração de tentáculos em Cladonema16,17. No entanto, embora a hibridização in situ convencional (ISH) tenha sido utilizada para visualizar a expressão gênica no Cladonema, devido à sua baixa resolução, atualmente é difícil observar a dinâmica das células-tronco no nível celular em detalhes.

Este trabalho descreve um método de visualização de células-tronco em Cladonema por FISH e cocoloração com EdU, um marcador de proliferação celular18. Visualizamos o padrão de expressão de Nanos1, um marcador de células-tronco 5,17, pelo FISH, que permite a identificação da distribuição de células-tronco no nível de célula única. Além disso, a co-coloração da expressão de Nanos1 com a marcação EdU permite distinguir células-tronco em proliferação ativa. Este método para monitorar células-tronco e células proliferativas pode ser aplicado a uma ampla gama de áreas de investigação, incluindo ramificação de tentáculos, homeostase tecidual e regeneração de órgãos em Cladonema, e uma abordagem semelhante pode ser aplicada a outras espécies de águas-vivas.

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Protocol

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, reagentes e equipamentos usados neste protocolo.

1. Síntese da sonda

  1. Extração de RNA
    1. Coloque três medusas de Cladonema vivas que são cultivadas em água do mar artificial (ASW) em um tubo de 1,5 mL usando uma pipeta de transferência de 3,1 mL com a ponta cortada e remova o máximo de ASW possível.
      NOTA: ASW é preparado pela dissolução de uma mistura de sais minerais em água da torneira com neutralizador de cloro; a gravidade específica final (S.G.) é 1.018 ou as partes por mil (ppt) são ~27.
    2. Congele os tubos de 1,5 mL em nitrogênio líquido para inibir a atividade da RNase. Adicionar 30 μL de tampão de lise do kit de isolamento de RNA total no qual foi adicionado 2-mercaptoetanol (1 μL/100 μL de tampão de lise) e homogeneizar as amostras no tampão de lise usando um homogeneizador.
      NOTA: Para evitar o estouro do tampão e da amostra dos tubos, recomenda-se a homogeneização com uma pequena quantidade de tampão de lise.
    3. Adicionar 570 μL de tampão de lise e extrair o RNA total seguindo o protocolo do kit de isolamento de RNA total (Figura 1).
    4. Medir a concentração do ARN extraído utilizando um espectrofotómetro e conservar a -80 °C até à sua utilização.
  2. cSíntese de cDNA
    1. Usando um kit, sintetizar cDNA usando o RNA total extraído das medusas como molde (Figura 1 e Tabela 1).
    2. Incubar a 65 °C durante 5 min.
    3. Esfrie rapidamente no gelo.
    4. Efectuar a síntese de cDNA com a mistura a partir do passo 1.2.1 (Tabela 1). Misturar bem por pipetagem e incubar a 42 °C durante 60 min.
    5. Incubar a 95 °C durante 5 min.
    6. Esfrie rapidamente no gelo.
    7. Medir a concentração do cDNA sintetizado usando um espectrofotômetro e armazenar a -20 °C ou abaixo dele até o uso.
  3. Síntese do produto de PCR
    1. Para criar um modelo de PCR, projete o primer específico usando Primer-BLAST. Fonte da sequência de referência a partir de dados NCBI ou dados de RNA-seq.
      NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para os primers utilizados neste protocolo.
    2. Para amplificar a sequência alvo, execute a clonagem de TA, que não requer o uso de enzimas de restrição. Para obter um produto de PCR em que é adicionada uma adenina na extremidade 3', utilize as seguintes definições: 98 °C durante 2 min; 35 ciclos de 98 °C por 10 s, 55-60 °C por 30 s, 72 °C por 1 min. Use Taq DNA polimerase para as reações (Tabela 1).
      NOTA: Para determinar as condições de PCR, siga o protocolo que acompanha a DNA polimerase a ser usada, que geralmente fornece uma temperatura de recozimento recomendada e tempo de extensão.
    3. Execute o produto PCR através de um gel de agarose a 1% e corte a faixa de interesse. Extraia os produtos de PCR dos géis cortados usando um kit de extração de gel.
  4. Ligadura
    1. Ligue o produto da PCR ao vetor com saliências de timina 3' misturando os reagentes (Tabela 1) e incubando a 37 °C por 30 min (Figura 1).
      NOTA: A razão molecular do vetor:PCR deve ser 1:>3. O tamanho do vetor pTA2 é de aproximadamente 3 kb. Se o produto de PCR (inserção) for A (kb) e B (ng/μL), o volume da inserção (X no quadro 1) a tomar pode ser calculado por ([50 ng de vector × A kb de inserção])/(3 kb vector × [ 1/3]) = 50· Um ng de inserção. Se a concentração da inserção for B ng/μL, então o volume tomado é de 50· A/B μL de inserção.
  5. Transformação e chapeamento
    1. Para a transformação, descongele as células competentes no gelo e distribua-as em alíquotas de 20 μL cada. Adicionar 1 μL dos plasmídeos que contêm o produto de PCR (menos de 5% do volume celular competente) e vórtice por 1 s. Incubar no gelo durante 5 min, e depois incubar a 42 °C durante 45 s e vórtice durante 1 s.
    2. Adicionar 180 μL de caldo Super Optimal com meio de compressão de cataabolita (SOC) (um meio de cultura bacteriana nutricionalmente rico) às células competentes e incubar a 37 °C durante 30 minutos. Após 30 min, espalhar as células competentes sobre uma placa de ágar contendo ampicilina, 5-bromo-4-cloro-3-indolyl-beta-D-galacto-piranóssido (X-gal) e isopropil-β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG), e incubar a 37 °C durante 12-16 h (Figura 1).
      NOTA: X-gal e IPTG são usados para selecionar colônias azuis e brancas.
  6. Cultura líquida
    1. Escolha uma colônia branca entre as colônias brancas e azuis no prato. Adicionar a 3-5 mL de meio LB com ampicilina e incubar em agitador por 12-16 h a 37 °C (Figura 1).
  7. Miniprep
    1. Extrair o plasmídeo do meio LB utilizando um miniprep plasmídico (Figura 1).
    2. Quantifique a concentração plasmídica usando um espectrofotômetro.
  8. Leia a sequência.
    1. Para ler a sequência de DNA do plasmídeo, envie o plasmídeo para o sequenciamento de Sanger e, em seguida, use um software para alinhá-lo com a sequência genoma/transcriptoma para confirmar se a sequência alvo é sintetizada adequadamente e avaliar em que direção a sequência alvo é inserida no plasmídeo (5' a 3' ou 3' a 5').
      NOTA: Se a sequência alvo for inserida no plasmídeo na direção de 5' a 3' do local de ligação da RNA polimerase perto da extremidade 3', uma sonda antisense pode ser gerada por transcrição in vitro . Se a sequência de destino for inserida na direção inversa de 3' a 5', uma sonda de detecção (controle negativo) pode ser gerada. Se estiver usando vetores como pTA2, dois sites de ligação de transcrição podem ser usados, dependendo da finalidade.
  9. Transcrição in vitro
    1. Prepare o molde de DNA a partir do plasmídeo criado realizando a reação em cadeia da polimerase usando primers fora do local de ligação da RNA polimerase (por exemplo, locais de ligação T7/T3) no plasmídeo (Figura 1).
      NOTA: Iniciadores universais como o primer avançado M13-20 e o primer reverso M13 podem ser usados para preparar um molde de DNA que inclua locais de ligação à RNA polimerase.
    2. Purifice o modelo após a amplificação por PCR usando um kit de extração de gel/PCR.
    3. Misture os reagentes mostrados abaixo e execute a reação de transcrição a 37 °C por 3 h (Figura 1 e Tabela 1).
    4. Adicionar 1,5 μL de DNase e incubar a 37 °C durante 30 min.
    5. Adicionar 10 μL de água isenta de RNase e purificar a sonda da solução de reação de transcrição usando uma coluna de limpeza.
    6. Verifique o tamanho do RNA sintetizado carregando 1 μL em um gel de agarose a 1% e determine a concentração usando um espectrofotômetro.
      NOTA: As sondas de RNA sintetizadas devem ter uma concentração de pelo menos 100 ng/μL.
    7. Adicionar 30 μL de formamida para armazenamento a uma temperatura igual ou inferior a −20 °C.

2. Incorporação e fixação de EdU

  1. Colocar Cladonema medusae (5-10 animais por tubo) em tubos de 1,5 mL usando uma pipeta de transferência de 3,5 mL e adicionar ASW até um volume total de 500 μL. Adicionar 7,5 μL de solução estoque de EdU de 10 mM e incubar as amostras por 1 h a 22 °C (Figura 2). A concentração final de EdU é de 150 μM.
    NOTA: Use medusas de 5 a 7 dias de idade para monitorar a formação do terceiro ramo (Figura 3A). O dia em que as medusas se desprendem do pólipo é contado como dia 1 e, no dia 5, as medusas normalmente começam a exibir um terceiro ramo em seus tentáculos principais.
  2. Após 1 h, remova o máximo possível de ASW contendo EdU.
  3. Para anestesiar as medusas, adicionar 7% de MgCl 2 em H2 O e incubar por5 min.
  4. Retirar o MgCl 2 a 7% em H 2 O efixar as medusas durante a noite (O.N.) a 4 °C com paraformaldeído (PFA) a 4% em ASW (Figura 2).
    NOTA: Ao executar o FISH sem incorporação de EdU, as amostras podem ser fixadas de forma semelhante àquelas tratadas com EdU após a anestesiação (etapas 2.3-2.4).

3. Hibridização in situ fluorescente

  1. Tratamento da proteinase e pós-fixação
    1. Remova o PFA e lave as amostras com PBS contendo 0,1% de Tween-20 (PBST) por 3 x 10 min. Use 300-500 μL de PBST por lavagem.
      NOTA: A partir desta etapa até o final da hibridização, o experimento deve ser realizado em ambiente livre de RNase, usando luvas e máscara. O PBS 1x nesta etapa deve ser feito com água tratada com DEPC. Após a hibridização, 1x PBS feitos com água sem tratamento DEPC podem ser usados. Alguns protocolos ISH e FISH desidratam as amostras usando etapas de metanol, o que torna possível salvar as amostras fixas a -20 °C até o uso. Para evitar trabalhos supérfluos, o processo de desidratação é omitido deste protocolo, particularmente porque as amostras podem ser mantidas em PBST por até alguns dias.
    2. Após a fixação, colocar a amostra em tubos de 1,5 ml sobre um agitador, com exceção da etapa de incubação do anticorpo anti-DIG-POD O.N. (etapa 3.4.2). Após a lavagem, adicionar 10 mg/ml de solução de reserva de proteinase K em PBST e incubar as medusas com proteinase K (concentração final: 10 μg/ml) a 37 °C durante 10 min.
    3. Retire a solução de proteinase K e lave as amostras durante 2 x 1 min com PBST.
    4. Para pós-fixação das medusas, adicionar 4% de PFA em 1x PBS e incubar a 37 °C por 15 min.
    5. Retire a solução de PFA e lave as amostras por 2 x 10 min com PBST.
      NOTA: Se o gene alvo for altamente expresso com baixo sinal de fundo, as etapas 3.1.2-3.1.5 podem ser ignoradas.
  2. Hibridização
    1. Remova o PBST e adicione o buffer de hibridização (buffer HB, Tabela 1). Incubar as amostras em tampão HB por 15 min à temperatura ambiente (RT). Use 300-400 μL de buffer HB, que fornece volume suficiente para uma hibridização bem-sucedida.
      NOTA: O HB Buffer, o Wash Buffer 1 e o Wash Buffer 2 são preparados com 20x estoque SSC. O HB Buffer é armazenado a uma temperatura igual ou inferior a −20 °C e deve ser levado a RT antes da utilização.
    2. Remova o buffer HB e adicione um novo buffer HB. Pré-hibridizar a 55 °C durante, pelo menos, 2 h numa incubadora de hibridização.
    3. Remova o tampão HB e incube com o tampão HB contendo as sondas que foram armazenadas na etapa 1.9.7 (concentração final da sonda: 0,5-1 ng/μL no buffer HB). Hibridizar a 55 °C por 18-24 h (Figura 2) em incubadora de hibridização.
      NOTA: A intensidade e a especificidade do sinal FISH podem variar devido à expressão gênica alvo, bem como ao comprimento e especificidade da sonda. Para aumentar a intensidade, parâmetros como duração da hibridização (18-72 h) e temperatura (50-65 °C) podem ser ajustados e diferentes sondas podem ser testadas. Para evitar sinais inespecíficos, o tratamento com proteinase K (concentração e duração) pode ser modificado19.
  3. Remoção da sonda
    1. Remova o buffer HB que contém as sondas e, em seguida, adicione o buffer de lavagem 1 (Tabela 1). Lavar as amostras com tampão de lavagem 1 durante 2 x 15 min a 55 °C. Use 300-400 μL de tampão de lavagem.
      NOTA: HB Buffer contendo sondas pode ser usado repetidamente, até cerca de dez vezes. Em vez de descartar, armazene o HB Buffer usado contendo sondas a -20 °C ou abaixo. Pré-aqueça o buffer de lavagem 1, o buffer de lavagem 2, 2x SSC e PBST a 55 °C antes do uso.
    2. Remova o Buffer de Lavagem 1 e, em seguida, adicione o Buffer de Lavagem 2 (Tabela 1). Lavar as amostras com tampão de lavagem 2 durante 2 x 15 min a 55 °C.
    3. Remova o Wash Buffer 2 e adicione 2x SSC. Lavar as amostras com 2x SSC durante 2 x 15 min a 55 °C.
    4. Remova 2x SSC e adicione PBST pré-aquecido. Lave as amostras por 1 x 15 min com PBST no RT.
  4. Incubação de anticorpos anti-DIG
    1. Remova o PBST e adicione 1% de buffer de bloqueio. Incubar as amostras durante, pelo menos, 1 h a RT enquanto agita lentamente sobre um balancim.
      NOTA: Preparar o tampão de bloqueio de 1% na hora, diluindo 5% do depósito regulador de bloqueio (Tabela 1). Verifique as amostras antes da próxima reação de anticorpos, porque a amostra tende a grudar na parte de trás da tampa ou na parede como resultado da agitação.
    2. Após o bloqueio, remova o tampão de bloqueio a 1%, adicione a solução anti-DIG-POD (1:500, em tampão de bloqueio a 1%) e incube as amostras O.N. a 4 °C (Figura 2).
      NOTA: Tenha cuidado para manter o tempo de incubação dentro de 12-16 h para evitar a detecção de sinais não específicos.
  5. Detecção de sonda marcada com DIG
    1. Remova a solução anti-DIG-POD e adicione Tris-NaCl-Tween Buffer (TNT, Tabela 1). Lave as amostras com TNT por 3 x 10 min no RT.
      NOTA: O uso da técnica de amplificação de sinal de tiramida (TSA) fornece uma imagem de melhor resolução contra reagentes marcados com peroxidase de rábano (por exemplo, anti-DIG-POD).
    2. Diluir a solução-mãe de tiramida conjugada com corante fluorescente (Cy5-tiramida) (1:50) no tampão diluente de amplificação para formar a solução activa de Cy5-tiramida (Figura 2).
    3. Remova o máximo de TNT possível e, em seguida, adicione a solução ativa de Cy5-tiramida. Incubar as amostras por 10 min no escuro.
    4. Lave as amostras com PBST por 3 x 10 min no escuro.
  6. Detecção de EdU
    NOTA: O kit EdU detecta EdU incorporados como sinais fluorescentes (Figura 2).
    1. Para preparar o coquetel de detecção de EdU, misture os componentes conforme mostrado na Tabela 1. Use 100 μL de coquetel de detecção de EdU para cada amostra.
      NOTA: Prepare o aditivo 1x Reaction Buffer diluindo o aditivo 10x Reaction Buffer com água ultrapura.
    2. Remova o PBST e adicione o coquetel de detecção de EdU. Incubar no escuro por 30 min.
    3. Lave com PBST por 3 x 10 min no escuro.
  7. Coloração de DNA
    1. Diluir a Hoechst 33342 (1:500) em PBST para preparar a solução Hoechst. Remova o PBST e, em seguida, adicione a solução Hoechst. Incubar as amostras por 30 min no escuro (Figura 2).
    2. Lave as amostras com PBST por 3-4 x 10 min no escuro.
  8. Montagem
    1. Faça um banco na lâmina de vidro para evitar que a amostra seja esmagada. Aplique fita de vinil na lâmina de vidro e esvazie o centro.
    2. Transfira as medusas para o banco no vidro deslizante usando uma pipeta de transferência de 3,1 mL com a ponta cortada.
      NOTA: Tenha cuidado para não deixar os tentáculos se sobreporem.
    3. Remova qualquer PBST com uma pipeta P200 e, em seguida, adicione lentamente 70% de glicerol como meio de montagem (Figura 2).
      NOTA: Em vez de glicerol a 70%, o meio de montagem antidesbotamento pode ser usado para evitar que a fluorescência desbote.
    4. Coloque suavemente uma tampa na medusa com pinça e sele o lado da tampa com esmalte claro.
    5. Manter as lâminas a 4 °C no escuro se não efectuar imediatamente a observação microscópica.
  9. Imagiologia
    1. Use um microscópio confocal de varredura a laser para adquirir imagens. Para uma resolução de célula única, use uma lente de óleo 40x ou uma lente para maior ampliação.
    2. Após a aquisição da imagem, abra as imagens usando o software ImageJ/FIJI e conte as células positivas para EdU+ e/ou Nanos1+ pela ferramenta multiponto20.

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Representative Results

Os tentáculos de Cladonema têm sido utilizados como modelo para estudar os processos celulares de morfogênese e regeneração15,16,17. A estrutura do tentáculo é composta por um tubo epitelial onde as células-tronco, ou células i, estão localizadas na região proximal, denominada bulbo tentáculo, e novos ramos são adicionados sequencialmente à parte posterior da região distal do bulbo ao longo do lado adaxial (Figura 3A)15. Relatos anteriores indicaram que a proliferação celular está ativa tanto no bulbo do tentáculo quanto nos novos locais de ramificação usando a marcação EdU ou BrdU16,17. No entanto, devido à resolução da hibridização in situ, não está claro se as células-tronco são verdadeiramente proliferativas ou não. Para visualizar células-tronco e proliferativas simultaneamente no nível celular, realizamos a marcação FISH para marcadores de células-tronco (Nanos1 ou Piwi) e EdU para células de fase S nas mesmas amostras.

Na resolução celular pelo FISH, a expressão de Nanos1 foi localizada no bulbo do tentáculo e no novo local de ramificação (Figura 3B). Piwi também foi expresso no bulbo do tentáculo e no novo local de ramificação em um padrão semelhante ao de Nanos1 (Figura 3C). Esses resultados foram consistentes com as observações da hibridização in situ de montagem inteira em um relatório anterior17, onde o ramo em brotamento de uma medusa de 7 dias de idade foi quase uniformemente rotulado por Nanos1 e Piwi. Para visualizar o início do acúmulo de células-tronco, monitoramos o novo local de ramificação de uma medusa de 5 dias de idade. A co-marcação da expressão de Nanos1 e das células EdU-positivas revelou o padrão espacial de células-tronco e células proliferativas no tentáculo (Figura 4A). Embora as distribuições macroscópicas das células EdU+ e Nanos1+ tenham sido consistentes com relatos anteriores16,17, as células EdU+ foram mais amplamente distribuídas por todo o bulbo tentáculo, pelo menos no início da ramificação, enquanto as células Nanos1+ se acumularam mais localmente no bulbo do tentáculo e no novo local de ramificação (Figura 4A e Figura 4E ). Essas observações sugerem que distribuições distintas de células-tronco e células em proliferação são detectadas dependendo do tempo de desenvolvimento e dos diferentes estágios.

Uma visão mais detalhada do bulbo e do novo local de ramificação revelou que os sinais de EdU se fundem com a coloração nuclear, enquanto a expressão de Nanos1 é restrita ao citoplasma ao redor do núcleo, consistente com um relato anterior5 (Figura 4B,C). Uma fração (19,79%) das células apresentou co-marcação de EdU e Nanos1 (EdU+ Nanos1+; Figura 4B,C, pontas de seta amarelas e Figura 4D), sugerindo que essas células são uma população de células-tronco em proliferação ativa. Curiosamente, 14,46% das células foram encontradas como sendo EdU+ Nanos1− no meio do bulbo e no novo local de ramificação, sugerindo a presença de células proliferativas não semelhantes a caules (Figura 4B,C, setas brancas e Figura 4D). Em contraste, observou-se que 26,32% das células eram EdU− Nanos1+ na base do bulbo e no novo local de ramificação, indicando a presença de uma população de células-tronco de ciclo lento ou quiescente, nenhuma das quais é detectada pela marcação de pulso EdU (Figura 4B, C, setas amarelas e Figura 4D).

Figure 1
Figura 1: Esquema da síntese da sonda para hibridização in situ . Extração de RNA total de medusas e síntese de cDNA de RNA total. Produtos de PCR específicos de Nanos1 foram sintetizados a partir do cDNA. Os produtos de PCR foram ligados aos vetores e os vetores amplificados foram coletados por meio de cultura celular competente. Os produtos de PCR com sítios de ligação à RNA polimerase foram sintetizados utilizando os plasmídeos como moldes. Sondas de RNA marcadas com DIG foram sintetizadas por transcrição in vitro . Abreviaturas: DIG = digoxigenina. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Esquema de EdU e cocoloração de hibridização in situ fluorescente. Medusas foram incubadas com 150 μM de EdU por 1 h. Posteriormente, as medusas foram anestesiadas (para relaxar o tecido) com 7% de MgCl 2 em H2 O e fixadas com 4% de PFA O.N. a 4 °C. Após a fixação, as amostras foram hibridizadas com tampão HB com sonda por 20-24 h a 55 °C. Após a reação de hibridização, as amostras foram lavadas e incubadas com solução anti-DIG-POD O.N. a 4 °C. As medusas foram coradas com solução de Cy5-tiramida por 10 min, seguidas pela detecção de EdU por 30 min e coloração com Hoechst 33342 por 30 min. Após a conclusão de todos os processos de coloração, as medusas foram montadas na lâmina de vidro e as imagens foram obtidas com microscópio confocal. Abreviaturas: EdU = 5-etil-2'-desoxiuridina; FISH = hibridização in situ fluorescente; PFA = paraformaldeído; O.N. = overnight; HB = hibridização. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Padrões de expressão de Nanos1 e Piwi no lado adaxial proximal do tentáculo de Cladonema medusa. (A) Esquema de uma medusa e tentáculo de Cladonema. O lado adaxial do tentáculo: o bulbo do tentáculo (a região mais proximal) com novos ramos formados sequencialmente no novo local de ramificação. A inserção (quadrado tracejado) indica a área capturada pela imagem confocal. (B) Imagens FISH da expressão gênica de Nanos1 do lado proximal e adaxial do tentáculo de uma Cladonema medusa de 7 dias de idade. (C) Imagens FISH da expressão gênica de Piwi do lado proximal e adaxial do tentáculo de uma Cladonema medusa de 7 dias de idade. DNA: verde, Nanos1: magenta. B'-C' para Nanos1 FISH apenas imagens. Barras de escala = 100 μm (B,C). Abreviação: FISH = hibridização in situ fluorescente. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Padrões de expressão de EdU e Nanos1 no lado proximal e adaxial do tentáculo de Cladonema medusa. (A-C) Imagens do lado adaxial proximal do tentáculo de Cladonema medusa co-marcado com expressão de Nanos1 e EdU; Foram utilizadas medusas de 5 dias de idade. (A) Uma visão geral do tentáculo. Quadrados tracejados amarelos indicam as áreas de B e C. (B) Ampliação do bulbo do tentáculo. (C) Ampliação de um novo local de ramificação. As pontas de seta amarelas indicam as células positivas para EdU e Nanos1. Setas amarelas indicam as células que só são positivas para Nanos1. Setas brancas indicam células positivas apenas para EdU. Os painéis A-C são imagens mescladas para DNA (azul), EdU (verde) e Nanos1 (magenta). A'-C' são painéis apenas para imagens EdU; A''-C'' são apenas para Nanos1 FISH imagens. Barras de escala = 100 μm (A), 50 μm (B, C). (D) A quantificação de células positivas para EdU e/ou Nanos1 no lado basal do tentáculo (área de quantificação = 30,10 μm2 quadrados, n = 6, um total de 249 células). Células EdU+ Nanos1−, 14,46%; células EdU+ Nanos1+, 19,79%; células EdU− Nanos1+, 26,32%; Células EdU− Nanos1−, 39,44%. (E) Esquema de um tentáculo de Cladonema medusa do lado adaxial. A distribuição global das células EdU+ e das células Nanos1+ é mostrada em E e E', respectivamente. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Composição de diferentes reações de PCR e buffers neste protocolo. Para calcular o volume do produto de PCR (X μL) na reação de ligadura, ver a nota após o passo 1.4 do protocolo. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

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Discussion

Células proliferantes e células-tronco são importantes fontes celulares em diversos processos, como morfogênese, crescimento e regeneração21,22. Este trabalho descreve um método de cocoloração do marcador de células-tronco Nanos1 por marcação FISH e EdU em Cladonema medusae. Trabalhos anteriores utilizando a marcação EdU ou BrdU sugeriram que as células proliferativas se localizam nos bulbos dos tentáculos16,17, mas suas características moleculares não eram claras. O presente estudo mostra a determinação simultânea da distribuição das células proliferativas e a localização das células-tronco Nanos1+ (Figura 4). Os resultados mostraram que algumas células proliferativas expressaram Nanos1, mas outras células foram marcadas apenas com EdU e não expressaram Nanos1, sugerindo a existência de heterogeneidade de células-tronco ou, potencialmente, de outras células proliferativas. Será interessante dissecar a distribuição detalhada das células-tronco durante diferentes processos em Cladonema, incluindo a ramificação dos tentáculos, a homeostase dos tecidos, a regeneração de órgãos e a manutenção das células germinativas.

O principal gargalo para a visualização de células-tronco em animais é a identificação inicial de marcadores de células-tronco. Em cnidários, os marcadores de células-tronco não foram identificados em não-hidrozoários3 e, portanto, nesta fase, a aplicação direta do FISH para marcadores de células-tronco permanece limitada aos hidrozoários. No entanto, o FISH permite a detecção de expressão gênica específica no nível celular e, assim, alterando as sondas, esse método pode ser estendido para observar os padrões de expressão espacial de quaisquer genes de interesse em detalhes. Por exemplo, usando marcadores de células progenitoras e células diferenciadas, podemos verificar a distribuição de tipos específicos de células nos tentáculos de Cladonema. Como advertência, o presente protocolo pode ter que ser modificado dependendo dos genes de interesse devido a diferenças nos níveis de expressão e estabilidade do mRNA. Em particular, sinais não específicos e sinais fracos são problemas comuns associados ao FISH. Alterar o tempo e a temperatura de hibridização, utilizar reagentes clareadores (formamida ou metanol) e ajustar outros parâmetros (tempo de reação da TSA, tratamento com proteinase K, lavagem após hibridização) podem produzir sinais mais claros e menos sinais inespecíficos23,24. Também é importante selecionar um protocolo FISH adequado ao modelo animal que está sendo utilizado, uma vez que um protocolo FISH pode não ser aplicável a outras espécies, mesmo dentro do mesmo táxon 7,25,26.

A marcação EdU é geralmente usada para detectar células proliferativas, mas pode ser usada para diferentes fins experimentais, variando a concentração e o tempo de incubação27. Para detectar células em proliferação, é fundamental determinar uma duração e concentração bem-sucedidas para a incorporação de EdU. Na marcação de pulso utilizada neste trabalho, apenas células proliferativas que passaram pela fase S por um curto período de tempo foram marcadas, e métodos similares de incubação curta têm sido utilizados para detectar células proliferantes em outros cnidários 6,28,29. Por outro lado, a combinação de incorporação prolongada de EdU e Nanos1 FISH pode revelar a presença de células-tronco de ciclo lento ou quiescentes27. Também é possível marcar não apenas células proliferativas, mas também células de endociclagem que sofreram síntese de DNA sem divisão. Além disso, rastreando células marcadas com EdU por um período mais longo, podemos determinar a capacidade celular de migração e diferenciação associada a células proliferativas e sua linhagem celular 6,30.

Embora a combinação de coloração FISH e EdU ou BrdU tenha sido utilizada 7,31, o método aqui estabelecido pode ser facilmente aplicado a outros invertebrados marinhos e animais não modelo, incluindo diferentes espécies de águas-vivas. A coloração EdU é mais simples e mais sensível que a coloração BrdU18 e, com seu curto tempo de incubação, permite a detecção de células proliferantes, ao contrário do estudo anterior que utilizou a EdU para marcação celular de longo prazo7. Nos últimos anos, com o avanço das tecnologias de sequenciamento de próxima geração, as informações sobre genoma e expressão gênica tornaram-se disponíveis para muitas espécies. A identificação de células-tronco e células proliferativas continuará a ser uma abordagem eficaz para entender a heterogeneidade e a diversidade de células-tronco e fornecer insights sobre a dinâmica celular subjacente a diferentes fenômenos biológicos.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pela AMED sob o número de concessão JP22gm6110025 (para Y.N.) e pelo JSPS KAKENHI Grant Number 22H02762 (para Y.N.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol  Wako 137-06862
3.1 mL transfer pipette Thermo Scientific 233-20S
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) Wako 029-15043
anti-DIG-POD Roche 11207733910
Cladonema pacificum Nanos1 forward primer 5’-AAGAGACACAGTCATTATCAAGC
GA-3’
Cladonema pacificum Nanos1 reverse primer 5’-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3’
Cladonema pacificum Piwi forward primer 5’- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA
AGGC -3’
Cladonema pacificum Piwi reverse primer 5’- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA
CTGGC -3’
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye Invitrogen  C10337 EdU kit
Coroline off GEX Co. ltd N/A chlorine neutralizer
DIG Nucleic Acid Detection Kit Blocking Reagent Roche 11175041910 blocking buffer 
DIG RNA labeling mix  Roche 11277073910
DTT  Promega P117B
ECOS competent cell DH5α NIPPON GENE 316-06233 competent cell
Fast gene Gel/PCR Extraction kit Fast gene FG-91302 gel extraction kit
Fast gene plasmid mini kit Fast gene FG-90502 plasmid miniprep
Formamide Wako  068-00426
Heparin sodium salt from porcine SIGMA-ALDRICH  H3393-10KU
Isopropyl-β-D(-)-thiogalactopyranoside (IPTG) Wako 096-05143
LB Agar Invitrogen 22700-025 agar plate
LB Broth Base Invitrogen 12780-052 LB medium
Maleic acid Wako 134-00495
mini Quick spin RNA columns Roche 11814427001 clean-up column
NaCl Wako  191-01665
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi Thermo Scientific ND-ONEC-W spectrophotometer
Polyoxyethlene (20) Sorbitan Monolaurate (Tween-20) Wako  166-21115
PowerMasher 2 nippi  891300 homogenizer
Proteinase K Nacarai Tesque  29442-14
RNase Inhibitor TaKaRa 2313A
RNeasy Mini kit Qiagen  74004 total RNA isolation kit
RQ1 RNase-Free Dnase Promega M6101
Saline Sodium Citrate Buffer 20x powder (20x SSC) TaKaRa T9172
SEA LIFE Marin Tech N/A mixture of mineral salts
T3 RNA polymerase  Roche 11031163001
T7 RNA polymerase  Roche 10881767001
TAITEC HB-100 TAITEC 0040534-000 Hybridization incuvator
TaKaRa Ex Taq  TaKaRa RR001A Taq DNA polymerase
TaKaRa PrimeScript 2 1st strand cDNA Synthesis Kit TaKaRa 6210A cDNA synthesis kit
Target Clone TOYOBO  TAK101 pTA2 Vector
tRNA Roche 10109541001
TSA Plus Cyanine 5 AKOYA Biosciences NEL745001KT tyramide signal amplification (TSA) technique
Zeiss LSM 880 ZEISS N/A laser scanning confocal microscope

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References

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Hibridização <em>In Situ</em> fluorescente e marcação de 5-etil-2'-desoxiuridina para células-tronco em águas-vivas hidrozoárias <em>Cladonema pacificum</em>
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Fujita, S., Kuranaga, E., Miura, M., Nakajima, Y. i. Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum. J. Vis. Exp. (186), e64285, doi:10.3791/64285 (2022).

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