Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Sperm Collection og dataassistert Sperm analyse i Teleost Model japansk Medaka (Oryzias latipes)

Published: October 6, 2022 doi: 10.3791/64326
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Preclinical Sciences and Pathology, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences, 2Department of Production Animal Clinical Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences

Summary

Denne artikkelen beskriver to raske og effektive metoder for innsamling av sæd fra den lille modellen fiskemedaka (Oryzias latipes), samt en protokoll for pålitelig vurdering av sædkvalitet ved hjelp av dataassistert sædanalyse (CASA).

Abstract

Japansk medaka (Oryzias latipes) er en teleostfisk og en fremvoksende virveldyrmodell for økotoksikologi, utviklings-, genetikk- og fysiologiforskning. Medaka brukes også mye til å undersøke reproduksjon av virveldyr, noe som er en viktig biologisk funksjon, da det tillater en art å fortsette. Spermkvalitet er en viktig indikator på mannlig fruktbarhet og dermed reproduksjonssuksess. Teknikker for utvinning av sæd- og sædanalyse er godt dokumentert for mange arter, inkludert teleostfisk. Innsamling av sæd er relativt enkelt i større fisk, men kan være mer komplisert i små modellfisk da de produserer mindre sæd og er mer delikate. Denne artikkelen beskriver derfor to metoder for sædinnsamling i den lille modellfisken, japansk medaka: testikler disseksjon og magemassasje. Denne artikkelen viser at begge tilnærmingene er gjennomførbare for medaka og viser at magemassasje kan utføres gjentatte ganger ettersom fisken raskt kommer seg etter inngrepet. Denne artikkelen beskriver også en protokoll for dataassistert sædanalyse i medaka for objektivt å vurdere flere viktige indikatorer på medaka-sædkvalitet (motilitet, progressivitet, varighet av motilitet, relativ konsentrasjon). Disse prosedyrene, spesifisert for denne nyttige lille teleostmodellen, vil i stor grad øke forståelsen av miljømessige, fysiologiske og genetiske faktorer som påvirker fruktbarheten hos virveldyrhanner.

Introduction

Japansk medaka er en liten, eggleggende ferskvanns teleostfisk hjemmehørende i Øst-Asia. Medaka har blitt et utmerket virveldyrmodellsystem for økotoksikologi, utviklingsgenetikk, genomikk og evolusjonsbiologi og fysiologistudier 1,2. I likhet med den populære sebrafisken er de relativt enkle å avle og svært motstandsdyktige mot mange vanlige fiskesykdommer 1,2. Det er flere fordeler med å bruke medaka som modell, inkludert kort generasjonstid, gjennomsiktige embryoer 1,2 og et sekvensert genom3. I motsetning til sebrafisk har medaka et kjønnsbestemmende gen 4 samt høy temperatur (fra4-40 °C) og saltholdighet (euryhalinarter) toleranse5. Også mange genetiske og anatomiske verktøy, samt protokoller 6,7,8,9,10,11,12, har blitt utviklet i medaka for å lette studiet av biologien.

Reproduksjon er en viktig fysiologisk funksjon, da den tillater en art å fortsette. Vertebrat reproduksjon krever et mylder av nøyaktig orkestrerte hendelser, inkludert produksjon av oocytter hos kvinner og produksjon av sæd hos menn. Sperm er unike celler, produsert gjennom den komplekse prosessen med spermatogenese, der det er en rekke kontrollpunkter på plass for å garantere levering av et høykvalitetsprodukt13. Gametekvalitet har blitt et fokus i akvakultur og fiskepopulasjonsstudier på grunn av dens innvirkning på gjødslingssuksess og larveoverlevelse. Sædkvalitet er derfor en viktig indikator på mannlig fruktbarhet hos vertebrater.

Tre nyttige faktorer for å vurdere fiskens sædkvalitet er motilitet, progressivitet og lang levetid. Prosent motilitet og progressiv motilitet er vanlige indikatorer på sædkvalitet som progressiv bevegelse er nødvendig for og korrelerer sterkt med befruktningssuksess14,15. Bevegelsesvarighet er også en viktig indikator hos fisk, da sædceller forblir fullt motile i mindre enn 2 minutter hos de fleste teleostarter, og spermens bane er generelt mindre lineær enn hos pattedyr15. Imidlertid stolte mange studier som vurderte sædmotilitet tidligere på subjektive eller semikvantitative metoder for å analysere sæd15,16. For eksempel har sædmotilitet i medaka blitt estimert tidligere visuelt under et mikroskop17. Det har også blitt estimert ved å registrere sædbevegelse og bruke bildebehandlingsprogramvare for å slå sammen rammer og måle svømmebane og hastighet18,19,20. Slike tilnærminger mangler ofte robusthet, og gir forskjellige resultater i henhold til personen som utfører analysen15,21.

Dataassistert sædanalyse (CASA) ble opprinnelig utviklet for pattedyr. CASA er en rask kvantitativ metode for å vurdere sædkvalitet ved å registrere og måle hastighet og bane på en automatisert måte15. I fisk har det blitt brukt i forskjellige arter for å overvåke effekten av flere vannforurensninger på sædkvaliteten, for å identifisere interessante forfedre for å forbedre stamfisk, for å forbedre effektiviteten av kryopreservering og lagring, og for å optimalisere forholdene for befruktning15. Derfor er det et kraftig verktøy for pålitelig vurdering av sædkvalitet hos forskjellige virveldyrarter. På grunn av det viktige mangfoldet i reproduktive strategier mellom fisk, er sæden til teleostfisk forskjellig fra pattedyr og fra en fiskeart til en annen. Teleostfisk, som primært befrukter egg eksternt ved å slippe ut kjønnsceller i vann, har svært konsentrert sæd som er relativt enkle i struktur uten akrosom, i motsetning til pattedyr, som befruktes internt og derfor ikke trenger å kompensere for fortynning i vann, men må tåle mer viskøse væsker14. I tillegg beveger sæd fra de fleste fisk seg raskt, men er fullt bevegelig i mindre enn 2 minutter etter aktivering, selv om det er flere unntak15,22. Fordi motiliteten kan avta raskt hos de fleste fisk, bør det utvises ekstrem forsiktighet med tidspunktet for analyse etter aktivering når man bestemmer en sædanalyseprotokoll for fisk.

Reproduksjon er et av feltene i biologi der teleosts og medaka har blitt mye brukt som modellorganismer. Faktisk viser medaka-hanner interessant reproduktiv og sosial atferd, for eksempel kompis som vokter23,24. I tillegg finnes det flere transgene linjer for å studere den nevroendokrine kontrollen av reproduksjon hos denne arten25,26,27. Sperm prøvetaking, en prosedyre som er relativt enkel i større fisk, kan være mer komplisert i små modell fisk som de produserer mindre sperm og er mer delikat. Av denne grunn er de fleste studier som involverer sædprøvetaking i medaka-ekstrakt melke (fiskesæd) ved å knuse dissekerte testikler 17,28,29,30. Noen få studier bruker også en modifisert magemassasje for å uttrykke melken direkte til aktiveringsmedium18,19,20; Men med denne metoden er det vanskelig å visualisere mengden og fargen på melke ekstrahert. I sebrafisk brukes abdominal massasje ofte til å uttrykke milt, som umiddelbart samles i et kapillærrør31,32,33. Denne metoden muliggjør estimering av melkevolumet, samt observasjon av ejakulatfarge, som er en rask og enkel indikator på sædkvalitet32,33. Derfor mangler en klar og godt beskrevet protokoll for sædinnsamling og analyse for medaka.

Denne artikkelen beskriver derfor to metoder for sædinnsamling i den lille modellen fisk japansk medaka: testikler disseksjon og abdominal massasje med kapillærrør. Det viser at begge tilnærmingene er gjennomførbare for medaka og viser at magemassasje kan utføres et gjentatt antall ganger ettersom fisken raskt gjenoppretter fra prosedyren. Den beskriver også en protokoll for dataassistert sædanalyse i medaka for pålitelig å måle flere viktige indikatorer på medaka-sædkvalitet (motilitet, progressivitet, lang levetid og relativ sædkonsentrasjon). Disse prosedyrene, spesifisert for denne nyttige lille teleostmodellen, vil i stor grad øke forståelsen av miljømessige, fysiologiske og genetiske faktorer som påvirker fruktbarheten hos virveldyrhanner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle forsøk og dyrehåndtering ble gjennomført i henhold til anbefalingene om dyrevelferd ved Norges miljø- og biovitenskapelige universitet (NMBU). Forsøkene ble utført med voksen (6-9 måneder gammel) mannlig japansk medaka (Hd-rR-stamme) oppvokst ved NMBU (Ås, Norge). Metodene ble også kort testet i 9 måneder gammel mannlig japansk medaka (CAB-stamme) oppvokst ved National Research Institute for Agriculture, Food, and the Environment (INRAE, Rennes, Frankrike).

1. Instrument- og løsningsklargjøring

  1. Forbered bedøvelsesmiddeloppløsning (0,6% Tricaine).
    1. Fortynn 0,6 g trikain (MS-222) i 100 ml 10x fosfatbuffersaltvann (PBS).
    2. Aliquot 2 ml av bedøvelsesmiddeloppløsningen i 50 2 ml plastrør og oppbevares ved -20 °C til bruk for anestesi eller eutanasi.
  2. Forbered gjenvinningsvann (0,9% natriumklorid [NaCl] oppløsning).
    1. Tilsett 27 g NaCl i 3 liter akvariumvann.
    2. Oppbevar oppløsningen ved romtemperatur (RT) til bruk.
  3. Juster aktiveringsmediet om nødvendig (Hanks balanserte saltløsning [HBSS]).
    MERK: HBSS kan kjøpes kommersielt eller lages i laboratoriet (Table of Materials).
    1. Mål pH i HBSS ved hjelp av en pH-meter. Juster pH om nødvendig, bruk saltsyre eller natriumhydroksyd, så den endelige pH er 7,1-7,3.
    2. Mål osmolaliteten til HBSS ved hjelp av et osmometer for fremtidig rapportering.
      MERK: Utvalget på det kommersielle produktet er 266-294 mOsmol / kg; i denne studien var osmolaliteten 287 mOsmol/kg. Det kan fortynnes med destillert vann for å redusere osmolaliteten om ønskelig, men dette er ikke nødvendig da det ikke er stor forskjell i aktiveringen av medakasperm i 150-300 mOsmol / kg HBSS.
    3. Oppbevar løsningen på RT til bruk.
  4. Forbered holdesvampen.
    1. Skjær en myk svamp for å passe godt i en petriskål.
    2. Klipp en rett linje i midten av svampen som er lang nok til å motta fisken (3-4 cm) og ca 1 cm dyp (figur 1A). Denne spalten i svampen vil holde fisken ventral side opp for å eksponere cloaca.

2. Sperm samling

MERK: Sperm samling kan oppnås ved to forskjellige metoder: abdominal massasje eller testikler disseksjon.

  1. Sperm samling av abdominal massasje
    1. Forbered 0,03% bedøvelsesløsning ved å fortynne ett rør av Tricaine-lager (0,6%) i 38 ml akvariumvann i en 100 ml glassbeholder.
    2. Forbered instrumentene, inkludert stump ende glatte tang og en 10 μL engangskalibrert glassmikropipette og aspiratorrørmontering (figur 1A). Fukt holdesvampen tilberedt i trinn 1.4 med bedøvelsesløsningen.
    3. Klargjør rør med 36 μL av aktiveringsløsningen for umiddelbar analyse. Forvarm aktiveringsløsningen i et vannbad eller en inkubator satt til 27 °C i minst 5 minutter.
      MERK: Selv om prøver kan analyseres fra individuelle fisk, kan individuell variasjon reduseres ved å samle prøver fra flere hanner i samme aktiverende løsning. Når du samler prøver fra flere fisk, bruk 36 μL aktiveringsløsning per fisk. Denne fortynningen må kanskje justeres avhengig av belastningen eller oppdrettsforholdene til medakaen som brukes, da disse faktorene kan påvirke sædkonsentrasjonen og volumet. CASA-programmet vil indikere om konsentrasjonen er for høy til å identifisere sædceller.
    4. Bedøv fisken ved å sette den i bedøvelsesløsning i 30-90 s.
      MERK: Anestesiens varighet må tilpasses da den varierer i henhold til fiskens størrelse. For å sikre at fisken er fullt bedøvet, klem forsiktig den kaudale peduncle med tang. Hvis fisken ikke reagerer, kan massasjen startes.
    5. Ta fisken ut av bedøvelsesløsningen og bruk et papirhåndkle eller tørk forsiktig for å tørke fiskens underliv. Plasser fisken i bunnen av den fuktige holdesvampen ventral side opp slik at gjellene blir utsatt for bedøvelsesløsningen i svampen (figur 1B).
    6. Hvis området rundt cloaca er vått, tørk forsiktig undersiden av fisken med en engangsvevsserviett.
    7. Legg fisken i holdesvampen under et dissekeringsmikroskop og legg mikropipetten med et aspiratorrør festet mot fiskens cloaca (figur 1C).
    8. Masser fiskens underliv ved å klemme forsiktig med stump ende glatte tang i en rostral til kaudal bevegelse samtidig som du suger for å samle den utviste melken i pipetten (figur 1D).
    9. Slipp fisken fra svampen i gjenopprettingsvannet. La dem komme seg i løsningen i minst 15 minutter før du returnerer dem til akvariesystemet.
    10. Overfør melken til et forberedt rør med forvarmet aktiveringsløsning og pipette opp og ned flere ganger ved å suge og blåse på aspiratorrørenheten.
    11. Homogeniser den fortynnede sæden forsiktig ved å bla gjennom rørene før analyse.
      MERK: For best resultat, analyser prøver umiddelbart (f.eks. 5 s) etter aktivering. I medaka kan analysen bli forsinket, om nødvendig, da sædceller forblir motile i flere timer, men tiden bør forbli konsistent mellom prøvene ettersom motiliteten avtar med tiden.
  2. Sperm samling av testiklene disseksjon
    1. Forbered 0,08% eutanasiløsning ved å fortynne to rør av Tricaine-lager (0,6%) i 26 ml akvariumvann i en 100 ml glassbeholder.
    2. Klargjør disseksjonsverktøy, inkludert butt og fin tang og liten dissekeringssaks (figur 1E).
    3. Forbered et rør for hver prøve med 120 μL aktiveringsløsning for umiddelbar analyse. Forvarm aktiveringsløsningen i et vannbad eller en inkubator satt til 27 °C i minst 5 minutter.
      MERK: Selv om prøver kan analyseres fra individuelle fisk, kan individuell variasjon reduseres ved å samle prøver fra flere hanner i samme aktiverende løsning. For å samle prøver fra flere fisk, bruk 120 μL aktiveringsløsning per fisk. Denne fortynningen må kanskje justeres avhengig av belastningen eller oppdrettsforholdene til medakaen som brukes, da disse faktorene kan påvirke sædkonsentrasjonen og volumet. CASA-programmet vil indikere om konsentrasjonen er for høy til å identifisere sædceller.
    4. Avliv fisken ved å sette den i 0,08% bedøvelsesløsningen i 30-90 s.
      MERK: Varigheten avhenger av størrelsen på fisken. For å sikre at fisken blir avlivet, vent til operculumbevegelsene opphører. Fisken skal ikke reagere på berøring av tang.
    5. Fjern fisken fra eutanasioppløsningen og tørk fisken forsiktig med et papirhåndkle eller tørk forsiktig.
      MERK: På dette trinnet kan fisken veies for senere å beregne gonadosomatisk indeks (GSI, gonadal vekt / kroppsvekt).
    6. Plasser fisken under et dissekeringsmikroskop med venstre sideside vendt opp (figur 1F).
    7. Bruk en liten dissekeringssaks, klipp en klaff dorsalt fra cloaca, og deretter over ribbeina til gjellene for å eksponere de indre organene (figur 1G).
    8. Finn testiklene, klipp festet i begge ender med fine tang, og fjern testiklene (figur 1H).
      MERK: For å beregne GSI, kan testiklene veies på dette trinnet. Arbeid raskt for å unngå tørking av vevet.
    9. Overfør testiklene til et forberedt rør med forvarmet aktiveringsløsning.
    10. Bruk tang til å knuse testiklene flere ganger mot siden av røret for å frigjøre sædcellene. Sædfrigivelse kan vanligvis visualiseres og vil gjøre løsningen litt overskyet.
    11. Homogeniser den fortynnede sæden forsiktig ved å bla gjennom rørene før analyse.
      MERK: For best resultat, analyser prøver umiddelbart (f.eks. 5 s) etter aktivering. I medaka kan analysen bli forsinket, om nødvendig, da sædceller forblir motile i flere timer, men tiden bør forbli konsistent mellom prøvene ettersom motiliteten avtar med tiden.

Figure 1
Figur 1: Melkesamling ved magemassasje (A-D) og testiklerdisseksjon (E-H). (A) Instrumenter for magemassasje: holdesvamp, stump glatt tang og 10 μL engangskalibrert glassmikropipette med aspiratorrørmontering; (B) Plassering av fisk i holdesvampen, med gjeller utsatt for anestesi i svampen og cloaca vendt opp; (C) Plassering av stumpe glatte tang på magen og mikropipette mot cloaca; (D) Milt i mikropipette etter forsiktig massasje og suging. (E) Instrumenter for testikler disseksjon: stump tang, fin tang og liten dissekeringssaks; (F) Plassering av fisk for testikler disseksjon; (G) Lateral visning av indre organer; (H) Fjern testiklene ved å kutte festet i begge ender med fine tang. Vektstang: 2 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

3. Sædanalyse med CASA-system

  1. CASA-systemet (SCA Evolution) skal settes opp i henhold til manualen med et mikroskop ved hjelp av et grønt filter og 10x mål med fasekontrast.
  2. Forbered disponibel 20 μm tellekammersklier ved forvarming på en varmeplate eller i en inkubator satt til 27 °C i minst 5 minutter.
  3. Åpne sædanalyseprogramvaren og velg motilitetsmodulen.
  4. Angi konfigurasjonen for medaka som vist i figur 2B.
  5. Plasser en forvarmet disponibel 20 μm tellekammersklie under mikroskopet på en oppvarmet scene satt til 27 °C.
  6. Pipette prøven inn i kammeret på lysbildet til den fyller kammeret uten overfylling. Tørk forsiktig bort overflødige prøver fra inngangen til kammeret med en bomullsspiss eller tørk forsiktig for å forhindre flytende celler.
  7. Velg Analyser for å se på prøven under mikroskopet.
    MERK: Hvis mikroskopikonet er rødt, må mikroskopbelysningen justeres for at programmet skal spore sædceller nøyaktig. Juster lysstyrken på mikroskopet, slik at halens bevegelse av sæden er tydelig sett. Ikonet skal være blått.
  8. Forsikre deg om at mikroskopet er fokusert, og velg Analyser igjen for å registrere sædcellene i feltet. Flytt lysbildet slik at et nytt område av prøven er i rammen, og gjenta for å ta bilde for 3–5 forskjellige synsfelt. Unngå felt med luftbobler, cellemasser eller artefakter.
  9. Velg Resultater for å vise resultatene.
    MERK: Hvis feltene på resultatsiden er beskrevet i rødt, følger du instruksjonene i systemet for å slette feltene som varierer for mye i konsentrasjon eller motilitet.
  10. Dobbeltklikk på et felt for å se resultatene for det enkelte feltet eller for å manuelt se etter eventuelle feilmerkede eller ikke-sporede spermatozoer. Høyreklikk på individuelle spermatozoer for å merke motiliteten på nytt, om nødvendig (figur 2A).

Figure 2
Figur 2: Skjermbilde av SCA Evolution-programvare . (A) Sædsporingsresultater for ett felt. Se feltdata på høyre side og dobbeltklikk spermatozoa for å se individuelle data; (B) Resultatsammendrag for alle felt med konfigurasjonsmeny åpen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Type data innhentet
Spermmotilitetsanalyse fra SCA Evolution-programvaren gir data om motilitet (prosentandel av motile og immotile sædceller), samt progressivitet (prosentandel av progressiv og ikke-progressiv sæd) og hastighet (prosentandel av rask, middels og saktegående sæd). Den kombinerer også progressivitet og hastighet (rask progressiv, middels progressiv, ikke-progressiv). Disse etikettene er basert på målinger (figur 3A) og beregninger (figure 3B) av spermatozonbevegelse, som er gitt av programmet (tilleggstabell 1). For medaka ble følgende terskler tilpasset ut fra anbefalte sebrafiskparametere basert på tidligere litteratur 19,34,35 og fordeling av medakadata fra18 individer. Motilitet er basert på krøllete hastighet (VCL) med immotile < 10 μm/s ≤ langsom < 20 μm/s ≤ medium ≤ 40 μm/s < rask. Sperm anses å være progressiv hvis retthetsindeksen (STR) er > 68%.

SCA Evolution beregner også konsentrasjonen av sædceller hvis gitt volumet av prøven og fortynningen. Mens magemassasjemetoden er nyttig for å visualisere fargen og bekrefte tilstedeværelsen av melken, er volumet som samles inn for lite til å måles nøyaktig. Hvis melkevolumet forbedres ved oppdrettsforhold eller ved å bruke en annen belastning og kan måles, kan programmet brukes til å beregne konsentrasjonen. Relativ konsentrasjon kan imidlertid også beregnes for å sammenligne fisk eller behandlingsgrupper for prøver tatt ved testiklerdisseksjon, så lenge hele testiklene dissekeres og fortynnes i samme væskevolum.

Figure 3
Figur 3: Analyse av spermatozonbevegelse. (A) Data registrert av CASA-systemet inkluderer krøllete hastighet (VCL, hastighet beregnet ved hjelp av avstanden langs den faktiske banen), gjennomsnittlig banehastighet (VAP, hastighet beregnet ved hjelp av avstanden til gjennomsnittsbanen), rett linjehastighet (VSL, hastighet beregnet ved hjelp av avstanden mellom starten og slutten av sædsporet), amplitude av lateral hodeforskyvning (ALH, størrelsen på lateral forskyvning av et sædhode om sin gjennomsnittlige bane), slå kryssfrekvens (BCF, hastighet hvor den krøllete banen krysser gjennomsnittsbanen); (B) Beregnede verdier fra CASA-systemet inkluderer retthetsindeks (STR, linearitet av gjennomsnittlig bane), linearitetsindeks (LIN, linearitet av den krøllete banen) og slingring (WOB, svingning av den faktiske banen om gjennomsnittsbanen). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Evaluering av sædmotilitet: Ulike aktiveringsløsninger
Overraskende nok var sæd samplet ved både magemassasje og testikler disseksjon immotile i akvarievann (16 mOsmol / kg) (figur 4A) og i akvarievann justert med NaCl-løsning til 34 mOsmol / kg. Det var heller ingen motilitet i avionisert vann (-1 mOsmol/kg), eller avionisert vann justert til 23 mOsmol/kg. Spermier var bevegelige i HBSS (287 mOsmol/kg) (figur 4B), samt i HBSS fortynnet med avionisert vann til 36 mOsmol/kg og 113 mOsmol/kg, selv om prosentvis motilitet var signifikant redusert ved 36 mOsmol/kg (figur 4C).

Figure 4
Figur 4: Motilitet ved osmolalitet av aktiveringsløsning. Sperm samplet ved testikler disseksjon i (A) akvarium vann (16 mOsmol / kg) og (B) ujustert HBSS (287 mOsmol / kg). Gule sirkler merker immotile sædceller og fargede linjer indikerer sædbevegelse: rød (rask progressiv), grønn (middels progressiv), blå (ikke-progressiv). Skala bar: 100 μm. (C) Spermmotilitet aktivert med HBSS ved 36, 113 og 287 mOsmol / kg H2O. For 36 og 113 er n = 4 med to fisk samlet per prøve. For 287, n = 9 med to fisk samlet per prøve. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av en ANOVA med Tukey post-hoc test og signifikante forskjeller er indikert med forskjellige bokstaver. Dataene er representert som gjennomsnittlig ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Prøvetakingsmetoder: Abdominal massasje versus testikler disseksjon
Sædprøver tatt med testiklerdisseksjon er signifikant mer bevegelig sammenlignet med magemassasjeprøver fra samme fisk (figur 5A). Av den motile sæden er en høyere prosentandel også progressiv og middels eller rask bevegelse. I sædceller samplet av abdominal massasje, er mer motile sædceller saktegående og ikke-progressive (figur 5B-C). Imidlertid kan forskjellige resultater oppnås ved å bruke en annen belastning av medaka (CAB) eller alternative oppdrettsforhold (tilleggstabell 2).

Figure 5
Figur 5: Abdominal massasje versus testikler disseksjon. Prosentandel av (A) immotile og motile sperm samplet ved abdominal massasje eller testikler disseksjon. Prosentandel av motile sædceller som er (B) ikke-progressive og progressive sædceller, og (C) langsomme, middels og raskt bevegelige. Alle sædprøver ble aktivert i HBSS (287 mOsmol/kg H2O). Statistiske analyser ble utført ved hjelp av en Mann-Whitney U-test, og signifikante forskjeller indikeres av stjerner. Dataene er representert som gjennomsnittlig ± SEM, n = 9. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Motilitetsvarighet i henhold til lagringstilstand
Sperm samplet ved testikler disseksjon og opprettholdt ved 27 ° C hadde en 50% reduksjon i motilitet i de første 30 minuttene etter aktivering. Etter 2,5 timer var mindre enn 5% av sædcellene bevegelige. Ved oppbevaring ved 4 °C ble motiliteten redusert med bare 14 % i løpet av de første 30 minuttene, og det tok 5 timer å se en 50 % reduksjon fra den opprinnelige motiliteten. Is hadde en lignende forlengende effekt, men var mindre effektiv, med en motilitetsreduksjon på 26% de første 30 minuttene (figur 6A). Progressiviteten falt også med 52 % i løpet av de første 30 minuttene på is, sammenlignet med 65 % ved 27 °C og 33 % ved 4 °C (figur 6B). Både på is og ved 4 °C beveget noen sædceller (<3 %) seg fortsatt 42 timer etter aktivering.

Figure 6
Figur 6: Spermens levetid i henhold til lagringstilstand. Prosent (A) motilitet og (B) progressivitet over tid for prøver aktivert med HBSS (287 mOsmol/kg H2O) og lagret ved 27 °C, 4 °C eller på is. Datapunktene er gjennomsnittlige ± SEM, n = ≥4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Betydningen av miljø- og boligforholdene
Hanner som var sammen med hunnene ble samplet av testikler disseksjon om morgenen før de fikk mulighet til å gyte (før lysene ble slått på) eller etter at lysene ble slått på og hunnene i tanken hadde egg. Det var ingen signifikant forskjell i sædmotilitet. Det ble også tatt prøver av menn uten hunner i en måned, og selv om det var en trend med høyere motilitet, var forskjellen heller ikke signifikant (figur 7).

Men da CAB-stammemedaka ble oppdrettet i et annet anlegg med menn skilt fra kvinner i minst en måned, var fisken større og 5-7 μL melke ble samlet inn ved magemassasje. Prøver tatt fra fem fisk ved magemassasje hadde en motilitet på 68,34 % ved aktivering med 300 mOsmol/kg HBSS. Når det ble holdt under de samme forholdene, men med kvinner, var volumet av melke samlet ca. 2 μL, og gjennomsnittlig motilitet var 46,2% fra tre menn (tilleggstabell 2).

Figure 7
Figur 7. Effekt av miljøforhold på sædmotilitet. Prosent motilitet av sædceller samplet før (n = 5) og etter (n = 4) gyting fra menn som var samhuset med kvinner, og sæd fra menn plassert uten kvinner (n = 6). Alle prøvene ble tatt prøver av testikler disseksjon og aktivert med HBSS (287 mOsmol/kg H2O). Statistiske analyser ble utført med t-tester og forskjellene var ikke signifikante. Dataene er vist som gjennomsnittlig ± SEM med sirkler som representerer enkeltfisk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplerende tabell 1: Beregning av gjennomsnittlig hastighet og bevegelse for sædceller tatt prøver av ved magemassasje og testiklerdisseksjon (n = 9). Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende tabell 2: Sædanalysedata fra CAB-stamme (også kalt Carbio) medaka oppdrettet ved INRAE i Rennes, Frankrike. Alle prøvene ble aktivert i 300 mOsmol/kg HBSS. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Osmolalitet er en viktig faktor i aktiveringen av fiskesperm36,37. Generelt er sædceller immotile i testiklene og blir motile i medier som er hyperosmotiske i forhold til sædvæske for marine fisk, og hypo-osmotisk i forhold til sædvæske for ferskvannsfisk37. I likhet med blod er sædplasma i ferskvannsfisk vanligvis lavere enn for marine fisk (ca. 300 mOsmol / kg sammenlignet med 400 mOsmol / kg) 22,37. Dermed aktiveres fiskesperm vanligvis ved kontakt med vannet de lever i, og dette vannet fungerer som det beste og mest biologiske aktiveringsmediet for sædanalyse. Imidlertid var medaka sperm samplet ved abdominal massasje og testikler disseksjon ikke motil i akvariet vann (figur 4A) i Hd-rR eller CAB stamme medaka oppvokst i to forskjellige laboratorier. I tillegg var motiliteten høyere i 287 mOsmol/kg HBSS enn i 36 mOsmol/kg HBSS (figur 4C), noe som er uvanlig for en ferskvannsfisk.

De fleste tidligere studier som involverte sædanalyse i medaka brukte HBSS 28,29,38 eller Yamamoto-løsning 18,19 som aktiverende medier for medaka-sæd uten å diskutere osmolalitet. Mens HBSS er et godt aktiverende medium for medaka-sæd, kan variasjon i osmolalitet påvirke motiliteten. Det er derfor viktig for sædanalysestudier å avsløre osmolaliteten til deres aktiverende løsning for sammenligning mellom eksperimenter. En studie som undersøkte den ideelle osmolaliteten til aktiveringsmedium, fant at medaka-sæd er motil i avionisert vann (25 mOsmol / kg) og HBSS med osmolalitetsverdier < 686 mOsmol / kg, med høyest motilitet mellom 25 og 227 mOsmol / kg17. Men i den nåværende studien var sædceller heller ikke motile i avionisert vann. Som en euryhalinfisk er medaka svært tilpasningsdyktig til forskjellige miljøer og kan til og med leve og reprodusere i saltvann39, så det er mulig at forskjellige oppdrettsforhold er ansvarlige for denne uoverensstemmelsen. Interessant nok har ingen andre studier rapportert testing av medaka spermmotilitet i akvarievann (eller lignende, for eksempel alderen vann fra springen), selv om det er standard sædaktiveringsmedium for ferskvannsfisk.

En mulig forklaring på denne atypiske sædaktiveringen i medaka er interaksjon med ovarievæsken. Mens fiskesperm vanligvis aktiveres i det omkringliggende vannet, øker eller forlenger eggstokkvæsken varigheten av sædmotilitet hos mange arter40,41. Selv om medaka er eksternt gjødsling ferskvannsfisk, deres gyteadferd, som inkluderer fininnpakning og dirrende, setter dem i mye nærmere nærhet enn kringkastingsgytere23. Siden osmolaliteten av eggstokkvæske i ferskvannsfisk (ca. 300 mOsmol / kg) er nær HBSS40, er det mulig at væske frigjort av kvinnen aktiverer sæden, ikke akvariet vann. Siden osmolaliteten av sæd- og ovarieplasma er lik, er det mulig at den ioniske sammensetningen av medaka ovarievæske spiller en viktig rolle40,42. Rollen til ovarievæske og ioner i aktivering av medaka-sæd garanterer videre undersøkelser.

I tidligere studier har medaka-sæd bare blitt samlet inn ved å knuse dissekerte testikler 17,28,29,30 eller ved magemassasje for å uttrykke melken direkte til aktiveringsmedium 18,19,20; Ingen studier har rapportert data med sæd samlet inn ved abdominal massasje i et kapillærrør, selv om det er en vanlig praksis hos sebrafisk og andre teleostfisk 33,43,44. Denne metoden er også mulig i medaka. Milt er lett visualisert i kapillærrøret, og selv om volumet er for lite til å måles nøyaktig, muliggjør denne metoden bekreftelse på vellykket innsamling og analyse av farge som en rask indikator på kvalitet32. Unngåelse av fekal forurensning er også lettere med oppsamling i et kapillærrør sammenlignet med i medium. Selv om sædprøver tatt ved testiklerdisseksjon har bedre motilitet i medaka enn prøver tatt ved magemassasje (figur 5) og dermed er å foretrekke for forsøk der fisken kan ofres, er magemassasje en minimal invasiv prosedyre som ikke krever eutanasi og kan gjentas hos samme fisk. Derfor er det nyttig for forsøk som følger samme fisk over tid. Også prøver samlet med magemassasje inneholder bare modne celler utgitt med sædplasma44, mens prøver fra testikler disseksjon kan omfatte umodne sædceller og annet rusk. CASA-systemet rabatterer runde celler og rusk som er større enn det maksimale området, men hvis denne parameteren er satt for høyt, kan motilitetsresultatene påvirkes.

På grunn av den lave mengden sæd samlet med magemassasjeteknikken i disse medakaene, var det umulig å måle sædvolumet i kapillæren nøyaktig og dermed beregne sædkonsentrasjoner ved hjelp av vanlige tilnærminger. For prøver tatt ved testikler disseksjon, ved å holde volumet av aktiveringsmedium konsistent og veie testiklene, kan imidlertid en relativ konsentrasjon beregnes basert på sædkonsentrasjon gitt av CASA-systemet for å sammenligne mellom individer eller behandlingsgrupper. I tillegg til kvalitetsanalyse er relativ konsentrasjon også nyttig for å bestemme optimale prøvefortynninger for kryopreservering. Hvis volumet samlet ved magemassasje forbedres ved oppdrettsforhold eller ved bruk av en annen belastning, kan volumet beregnes ved å måle miltens høyde i kapillærrøret og legges inn i programmet for å beregne konsentrasjonen. I disse tilfellene, hvor flere mikroliter kan oppnås, kan motiliteten være høyere ved magemassasje enn testikler disseksjon (tilleggstabell 2). Når lave volumer samles inn, er prøvene mer utsatt for forurensning, noe som kan påvirke motiliteten, selv om disse effektene ser ut til å være konsistente når volumene er like, slik at sammenligninger fortsatt kan gjøres mellom behandlingsgrupper. Sammenligninger bør imidlertid ikke gjøres mellom prøver som varierer sterkt i volum eller farge av melke.

Det lave volumet av melke oppnådd fra medaka ved bruk av magemassasje kan være en begrensning for eksperimenter som krever et stort volum milt. I slike tilfeller kan testiklerdisseksjon være å foretrekke, som vist i en studie som samlet melke fra sebrafisk og grønn sverdhale ved både disseksjon og massasje, men bare ved disseksjon i medaka på grunn av lavt volum30. Testikler disseksjon er vanligvis bedre for sammenligninger med andre arter av samme grunn. Det begrensede volumet ved magemassasje sammenlignet med andre, like store fisk kan skyldes mindre testikler (1,9 ± 0,6 mg i medaka sammenlignet med 7,0 ± 2,5 mg i sebrafisk 45) og mindre spermier produsert (2,0 ± 0,4 x 10 6 sædceller/mg testikler i medaka sammenlignet med 7,7 ± 2,0 x 106 sædceller/mg testikler i sebrafisk46), eller til andre ukjente biologiske faktorer som begrenser teknikken, som foreslått i klekkeri-hevet afrikansk steinbit47. Forskjellen kan være fysiologisk, i henhold til belastning eller miljøforhold, eller anatomisk, som i motsetning til sebrafisk, er medaka testikler smeltet sammen og plassert mer medialt, og kan derfor være vanskeligere å få tilgang til ved magemassasje, selv om det også finnes andre fisk med smeltede testikler.

For noen arter, som sebrafisk, er det best å ta prøver av sæd før fisken har mulighet til å gyte om morgenen48 eller å isolere hannene i individuelle tanker kvelden før for å hindre gyting32. Med Hd-rR medaka fra denne studien hadde miljøforhold som tidspunkt for prøvetaking (før eller etter gyting) og boligforhold (med eller uten hunner i 1 måned) ingen signifikant effekt på sædmotilitet (figur 7). Det er mulig at en større prøvestørrelse eller isolering av menn fra kvinner i lengre tid kan gi høyere sædmengde og / eller motilitet. I CAB-stammemedaka fra et annet anlegg ble det sett en lignende trend med bedre sædkvalitet og volum fra hanner som var plassert alene sammenlignet med hanner som var plassert hos kvinner (for få fisk ble testet for å trekke statistiske konklusjoner). Det var også mulig med disse fiskene å samle relativt høye mengder melke ved magemassasje (tilleggstabell 2), selv om svært små mengder melke ble oppnådd ved bruk av Hd-rR-stammemedaka, og andre har rapportert små volumer også ved samme teknikk i CAB-stammemedaka30. Men om disse forskjellene skyldes belastningen (som er en kommersiell stamme i stedet for innavlet) eller på grunn av oppdrettsforskjeller (det er mange mellom anlegg), er fortsatt uklart. I disse fiskene kan flere mikroliter melke samles opp, noe som begrenser forurensning og forbedrer kvaliteten. Men for eksperimenter der det er viktig å leve sammen begge kjønn, synes det ikke nødvendig å skille dem for å gi resultater. Det synes heller ikke nødvendig å ta prøver av hanner om gangen før gyting.

Selv om det er nødvendig med ytterligere studier for å bestemme nøyaktig hvordan medaka-sæd er forskjellig i henhold til populasjons- og miljøfaktorer, bør belastnings- og oppdrettsforholdene likevel tas i betraktning ved utformingen av det eksperimentelle oppsettet, og forsiktighet bør brukes til å sammenligne mellom populasjoner som produserer forskjellige mengder sædceller. Hvis større melkevolumer oppnås, bør fortynningen av aktiveringsoppløsningen justeres (f.eks. 1:60, selv om den foretrukne konsentrasjonen kan variere med CASA-systemet). På samme måte, hvis de dissekerte testiklene er mye større enn typisk (2 mg) på grunn av belastningen eller oppdrettsforholdene, må fortynningen økes slik at CASA-programmet nøyaktig kan merke alle sædceller.

Metoder for sædanalyse varierer mye for medaka og er ofte subjektive, noe som gjør resultatene vanskelige å sammenligne mellom studier. En studie som sammenlignet subjektive og objektive metoder som brukes av teknikere med varierende kompetansenivå, fant at svært erfarne teknikere kan estimere fiskespermmotilitet innen 10 prosentpoeng av dataene fra et CASA-motilitetsprogram, mens teknikere med middels og lav erfaring overvurderer CASA-motilitetsverdiene med amplituder opp til 30 prosentpoeng21 . Imidlertid kan mangel på standardisering for parametrene som bestemmer motilitet i medaka også føre til variasjon mellom de som bruker mer objektive metoder. For eksempel hadde en studie som registrerte sæd ved 33 bilder per sekund (fps), analyserte 30 rammer og betraktet sædceller som beveger seg raskere enn 2 μm / s motil, en gjennomsnittlig hastighet på ca. 60 μm / s og motilitet på ca. 70% for deres kontrollfisk18. En annen studie som brukte samme protokoll hadde en gjennomsnittlig hastighet på 40 μm / s for kontrollsperm og en prosent motilitet over 80% 19. En annen gruppe, som analyserte 200 bilder med 47 fps, hadde en gjennomsnittlig VCL over 100 um/s for kontrollfisk, men en gjennomsnittlig motilitet under 50%. De avslørte ikke hvilke parametere som bestemte motilitet. Så i denne protokollen brukes datamaskinassistert sædanalyseprogramvare til å analysere sæd objektivt, raskt og pålitelig basert på et sett med parametere som er tilpasset egenskapene til medaka-sædceller. Siden det er avgjørende for motilitetsparametere å være konsistente for sammenligninger på tvers av laboratorier, er den komplette konfigurasjonen som brukes i denne studien tilgjengelig (figur 2B), slik at denne protokollen kan replikeres pålitelig i et annet laboratorium av forskjellige forskere.

Teleostfisk viser et bredt mangfold av sædegenskaper, så selv om denne protokollen opprinnelig ble testet ved hjelp av de anbefalte sebrafiskparametrene for SCA Evolution-programvaren, var det tydelig at parametrene måtte justeres for medaka-sæden med lavere hastighet og større levetid. Så sebrafiskparametere ble tilpasset medaka ved hjelp av litteratur fra medaka og andre arter som rapporterte lignende sædegenskaper 19,34,35 og valgte tersklene som best passer til fordelingen av 17,580 analyserte sædspor fra18 individer. Motilitet er basert på krøllete hastighet (VCL) med immotile < 10 μm/s ≤ langsom < 20 μm/s ≤ medium ≤ 40 μm/s < rask. Sperm anses å være progressiv hvis retthetsindeksen (STR) er > 68%. Terskelen som definerte motilitet ble holdt på 10 μm / s i stedet for 2 μm / s, som brukt i noen litteratur18,19, da mange sædceller som manglet flagellær bevegelse ble feilmerket som motile med denne innstillingen. Andre fiskearter med sædhoder av tilsvarende størrelse (~2 μm) brukte også 10 μm/s for å definere motile sædceller 35,43. Det maksimale arealet ble redusert fra sebrafiskinnstillingen på 90 μm 2 til 20 μm2, slik at store cellulære rusk fra testikler disseksjon ville bli ignorert.

Varigheten av motilitet ser ut til å være avhengig av mengden ATP lagret før aktivering, da flagellær bevegelse krever et raskt forbruk av energi. Sannsynligvis på grunn av denne raske utmattelsen er det en sammenheng mellom sædceller med høy innledende hastighet og en kortere varighet av motilitet49. Mens et osmotisk sjokk vanligvis er nødvendig for å aktivere fiskesperm, kan det også føre til membranskader i motilitetsperioden, noe som også kan påvirke levetiden. Denne effekten er mer kritisk i ferskvannsarter49, noe som kan forklare hvorfor marine sædceller er i stand til lengre motilitetsvarighet (ca. 550 s i gjennomsnitt sammenlignet med ca. 150 s for ferskvannsarter), til tross for at de viser en lignende gjennomsnittshastighet og motilitet som ferskvannssperm 14,22. Motilitetsvarighet lengre enn 30 min er ikke vanlig, men det er rapportert hos flere marine arter22,49. Til tross for at det er en ferskvannsfisk, passer resultatene med medaka profilen til sædceller som har lavere hastighet og lengre varighet fra marine arter. Dette kan være relatert til aktiveringen i medium som ligner på sædplasma - uten et osmotisk sjokk, har medaka-sæd sannsynligvis ikke membranskader som ligner på andre ferskvannsfisk.

En ikke-aktiverende løsning og veldig rask, konsekvent tidsbestemt analyse etter aktivering er ofte nødvendig for analyse av sædceller som bare er bevegelige i minutter. Imidlertid varer medaka spermmotilitet naturlig flere timer, og høyere motilitet kan bevares ved lagring ved 4 ° C eller på is (figur 6). For eksperimenter der umiddelbar analyse ikke er mulig, kan protokollen endres slik at for eksempel testikler lagres i aktiveringsløsning på is i en time, så lenge innsamlingstiden registreres slik at analysen kan forbli konsistent. Men for optimale resultater er umiddelbar analyse fortsatt det beste alternativet. Mens motiliteten fortsatt reduseres, fordi den er gradvis, er resultatene mindre påvirket av mindre forskjeller i analysetid etter aktivering. Likevel er det viktig å rapportere både lagringstemperaturen til prøver og tidspunktet for analysen etter aktivering, slik at data kan sammenlignes og reproduseres.

Det er også typisk svært viktig hos fisk å unngå kontaminering av melke med urin under prøvetaking, da dette kan endre osmolaliteten og aktivere sæden16,50 for tidlig. Dette er imidlertid mindre bekymringsfullt i medaka (på grunn av lengre varighet av motilitet) og med denne protokollen, da prøven umiddelbart plasseres i aktiveringsmedium. Lave mengder melke er utsatt for urinforurensning, så noe misfarging kan forventes med magemassasje fra medaka når lave volumer anskaffes. Men hvis dette er konsistent i befolkningen, kan det fortsatt gjøres sammenligninger mellom behandlingsgruppene. Forsiktighet bør utvises ved sammenligning av populasjoner av medaka som varierer i volum eller farge av melke.

Siden sædanalyseresultatene er svært avhengige av metodene som brukes, er detaljerte og pålitelige metoder som lett kan gjentas i forskjellige laboratorier, fordelaktige. Det er også viktig for papirer å avsløre detaljer om deres metoder for å muliggjøre repeterbarhet. Med medaka som i økende grad brukes som modell for reproduksjonsforskning, mangler informasjonsgrunnlaget om vurdering av sædkvalitet. De to forskjellige metodene beskrevet i dette papiret for sædprøvetaking kan være gunstige for forskjellige eksperimenter. Testikler disseksjon vanligvis gir høyere motilitet sperm og gir mulighet for relativ konsentrasjon beregninger, mens abdominal massasje kan gjøres gjentatte ganger på samme fisk og er en mer ren, biologisk representasjon av en gytehendelse. Dette manuskriptet gir derfor parametrene for CASA, som er en pålitelig, objektiv teknikk som gir rikelig med data om sædbevegelse, inkludert motilitet, progressivitet, hastighet og andre kinematiske parametere. Disse protokollene vil dermed være nyttige for en rekke studier i medaka, inkludert toksikologi, økologi, reproduksjon og fysiologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet er finansiert av Norges miljø- og biovitenskapelige universitet og det amerikanske Fulbright-programmet. Forfatterne takker Anthony Peltier og Lourdes Carreon G Tan ved NMBU for vedlikehold av fiskeanlegg og Guillaume Gourmelin fra ISC LPGP ved INRAE (Frankrike) for å gi fisk og labplass for videre testing av disse metodene.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL tubes Axygen MCT-150-C Any standard brand can be used
10 µL disposable calibrated glass micropipette and aspirator tube assembly Drummond 2-000-010
10x objective with phase contrast Nikon MRP90100
2 mL tubes Axygen MCT-200-c-s Any standard brand can be used
Blunt forceps Fine Science Tools 11000-12
Blunt smooth forceps Millipore XX6200006P
Disposable 20 micron counting chamber slide Microptic 20.2.25  Leja 2 chamber slides
Dissecting microscope Olympus SZX7 Any standard brand can be used
Fine forceps Fine Science Tools 11253-20
HBSS Sigmaaldrich H8264-1L
Holding sponge self-made
Inverted microscope Nikon Eclipse Ts2R
SCA Evolution Microptic
Small dissecting scissors Fine Science Tools 14090-09
Sodium Chloride (NaCl) Sigmaaldrich S9888
Tabletop vortex Labnet C1301B
Tricaine Sigmaaldrich A5040

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shima, A., Mitani, H. Medaka as a research organism: past, present and future. Mechanisms of Development. 121 (7-8), 599-604 (2004).
  2. Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka - a model organism from the far east. Nature Reviews Genetics. 3 (1), 53-64 (2001).
  3. Kasahara, M., et al. The medaka draft genome and insights into vertebrate genome evolution. Nature. 447 (7145), 714-719 (2007).
  4. Matsuda, M., et al. DMY is a Y-specific DM-domain gene required for male development in the medaka fish. Nature. 417 (6888), 559-563 (2002).
  5. Sakamoto, T., Kozaka, T., Takahashi, A., Kawauchi, H., Ando, M. Medaka (Oryzias latipes) as a model for hypoosmoregulation of euryhaline fishes. Aquaculture. 193 (3-4), 347-354 (2001).
  6. Royan, M. R., et al. 3D atlas of the pituitary gland of the model fish medaka (Oryzias latipes). Frontiers in Endocrinology. 12, 719843 (2021).
  7. Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. Healthy brain-pituitary slices for electrophysiological investigations of pituitary cells in teleost fish. Journal of Visualized Experiments. (138), e57790 (2018).
  8. Fontaine, R., Weltzien, F. -A. Labeling of blood vessels in the teleost brain and pituitary using cardiac perfusion with a dii-fixative. Journal of Visualized Experiments. (148), e59768 (2019).
  9. Ager-Wick, E., et al. Preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries. Journal of Visualized Experiments. (138), e58159 (2018).
  10. Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. Journal of Visualized Experiments. (46), e1937 (2010).
  11. Wiley-Blackwell. Medaka: Biology, Management, and Experimental Protocols. , Wiley-Blackwell. (2019).
  12. Royan, M. R., et al. Gonadectomy and blood sampling procedures in the small size teleost model japanese medaka (Oryzias latipes). Journal of Visualized Experiments. (166), e62006 (2020).
  13. Bhat, I. A., et al. Testicular development and spermatogenesis in fish: insights into molecular aspects and regulation of gene expression by different exogenous factors. Reviews in Aquaculture. 13 (4), 2142-2168 (2021).
  14. vander Horst, G., Garcia Alvarez, O., Garde, J. J., Soler, A. J., Jones, D. Status of sperm functionality assessment in wildlife species: From fish to primates. Animals. 11 (6), 1491 (2021).
  15. Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 130 (4), 425-433 (2001).
  16. Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture. 234 (1-4), 1-28 (2004).
  17. Yang, H., Tiersch, T. R. Sperm motility initiation and duration in a euryhaline fish, medaka (Oryzias latipes). Theriogenology. 72 (3), 386-392 (2009).
  18. Hashimoto, S., et al. Effects of ethinylestradiol on medaka (Oryzias latipes) as measured by sperm motility and fertilization success. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 56 (2), 253-259 (2009).
  19. Hara, Y., Strüssmann, C. A., Hashimoto, S. Assessment of short-term exposure to nonylphenol in Japanese medaka using sperm velocity and frequency of motile sperm. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 53 (3), 406-410 (2007).
  20. Kawana, R., Strüssmann, C. A., Hashimoto, S. Effect of p-Nonylphenol on sperm motility in Japanese medaka (Oryzias latipes). Fish Physiology and Biochemistry. 28, 213-214 (2003).
  21. Gallego, V., Herranz-Jusdado, J. G., Rozenfeld, C., Pérez, L., Asturiano, J. F. Subjective and objective assessment of fish sperm motility: when the technique and technicians matter. Fish Physiology and Biochemistry. 44 (6), 1457-1467 (2018).
  22. Browne, R. K., et al. Sperm motility of externally fertilizing fish and amphibians. Theriogenology. 83 (1), 1-13 (2015).
  23. Arias Padilla, L. F., et al. Cystic proliferation of germline stem cells is necessary to reproductive success and normal mating behavior in medaka. eLife. 10, 62757 (2021).
  24. Okuyama, T., Yokoi, S., Takeuchi, H. Molecular basis of social competence in medaka fish. Development, Growth, and Differentiation. 59 (4), 211-218 (2017).
  25. Okubo, K., et al. Forebrain Gonadotropin-releasing hormone neuronal development: Insights from transgenic medaka and the relevance to X-linked Kallmann syndrome. Endocrinology. 147 (3), 1076-1084 (2006).
  26. Hodne, K., Fontaine, R., Ager-Wick, E., Weltzien, F. A. Gnrh1-induced responses are indirect in female Medaka Fsh cells, generated through cellular networks. Endocrinology. 160 (12), 3018-3032 (2019).
  27. Karigo, T., et al. Whole brain-pituitary in vitro preparation of the transgenic Medaka (Oryzias latipes) as a tool for analyzing the differential regulatory mechanisms of LH and FSH release. Endocrinology. 155 (2), 536-547 (2014).
  28. Kowalska, A., Kowalski, R., Zakęś, Z. The effect of selective cyclooxygenase (COX) inhibitors on japanese medaka (Oryzias latipes) reproduction parameters. World Academy of Science, Engineering and Technology. 77, 19-23 (2011).
  29. Kowalska, A., Siwicki, A. K., Kowalski, R. K. Dietary resveratrol improves immunity but reduces reproduction of broodstock medaka Oryzias latipes (Temminck & Schlegel). Fish Physiology and Biochemistry. 43 (1), 27-37 (2007).
  30. Tan, E., Yang, H., Tiersch, T. R. Determination of sperm concentration for small-bodied biomedical model fishes by use of microspectrophotometry. Zebrafish. 7 (2), 233-240 (2010).
  31. Harvey, B., Kelley, R. N., Ashwood-Smith, M. J. Cryopreservation of zebra fish spermatozoa using methanol. Canadian Journal of Zoology. 60 (8), 1867-1870 (1982).
  32. Wasden, M. B., Roberts, R. L., DeLaurier, A. Optimizing sperm collection procedures in Zebrafish. Journal of the South Carolina Academy of Science. 15 (2), 7 (2017).
  33. Draper, B. W., Moens, C. B. A High-throughput method for Zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments. (29), e1395 (2009).
  34. Castellini, C., Dal Bosco, A., Ruggeri, S., Collodel, G. What is the best frame rate for evaluation of sperm motility in different species by computer-assisted sperm analysis. Fertility and Sterility. 96 (1), 24-27 (2011).
  35. Acosta, I. B., et al. Effects of exposure to cadmium in sperm cells of zebrafish, Danio rerio. Toxicology Reports. 3, 696-700 (2016).
  36. Wilson-Leedy, J. G., Kanuga, M. K., Ingermann, R. L. Influence of osmolality and ions on the activation and characteristics of zebrafish sperm motility. Theriogenology. 71 (7), 1054-1062 (2009).
  37. Alavi, S. M. H., Cosson, J. Sperm motility in fishes. (II) Effects of ions and osmolality: A review. Cell Biology International. 30 (1), 1-14 (2006).
  38. Kowalska, A., Kamaszews ki, M., Czarnowska-Kujawska, M., Podlasz, P., Kowalski, R. K. Dietary ARA improves COX activity in broodstock and offspring survival fitness of a model organism (Medaka Oryzias latipes). Animals. 10 (11), 2174 (2020).
  39. Inoue, K., Takei, Y. Asian medaka fishes offer new models for studying mechanisms of seawater adaptation. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 136 (4), 635-645 (2003).
  40. Zadmajid, V., Myers, J. N., Sørensen, S. R., Ernest Butts, I. A. Ovarian fluid and its impacts on spermatozoa performance in fish: A review. Theriogenology. 132, 144-152 (2019).
  41. Poli, F., Immler, S., Gasparini, C. Effects of ovarian fluid on sperm traits and its implications for cryptic female choice in zebrafish. Behavioral Ecology. 30 (5), 1298-1305 (2019).
  42. Cosson, J., Groison, A. L., Suquet, M., Fauvel, C., Dreanno, C., Billard, R. Studying sperm motility in marine fish: An overview on the state of the art. Journal of Applied Ichthyology. 24 (4), 460-486 (2008).
  43. Beirão, J., Soares, F., Herráez, M. P., Dinis, M. T., Cabrita, E. Sperm quality evaluation in Solea senegalensis during the reproductive season at cellular level. Theriogenology. 72 (9), 1251-1261 (2009).
  44. Beirão, J., et al. Sperm handling in aquatic animals for artificial reproduction. Theriogenology. 133, 161-178 (2019).
  45. Yang, H., Tiersch, T. R. Current status of sperm cryopreservation in biomedical research fish models: Zebrafish, medaka, and Xiphophorus. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 149 (2), 224-232 (2009).
  46. Yang, H., Tiersch, T. R. Sperm cryopreservation in biomedical research fish models. Cryopreservation in Aquatic Species. 2, 439-454 (2011).
  47. Viveiros, A., Fessehaye, Y., ter Veld, M., Schulz, R., Komen, H. Hand-stripping of semen and semen quality after maturational hormone treatments, in African catfish Clarias gariepinus. Aquaculture. 213 (1-4), 373-386 (2002).
  48. Ransom, D. G., Zon, L. I. Appendix 3 collection, storage, and use of Zebrafish sperm. Methods in Cell Biology. 60, 365-372 (1998).
  49. Cosson, J. Frenetic activation of fish spermatozoa flagella entails short-term motility, portending their precocious decadence. Journal of Fish Biology. 76 (1), 240-279 (2010).
  50. Kowalski, R. K., Cejko, B. I. Sperm quality in fish: Determinants and affecting factors. Theriogenology. 135, 94-108 (2019).

Tags

Biologi gonader sperm milt testis medaka fisk reproduksjon casa
Sperm Collection og dataassistert Sperm analyse i Teleost Model japansk Medaka (<em>Oryzias latipes</em>)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Closs, L., Sayyari, A., Fontaine, R. … More

Closs, L., Sayyari, A., Fontaine, R. Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes). J. Vis. Exp. (188), e64326, doi:10.3791/64326 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter