Summary
Bu makalede, küçük model balık medakasından (Oryzias latipes) sperm toplamak için iki hızlı ve etkili yöntemin yanı sıra, bilgisayar destekli sperm analizi (CASA) kullanarak sperm kalitesini güvenilir bir şekilde değerlendirmek için bir protokol açıklanmaktadır.
Abstract
Japon medaka (Oryzias latipes) bir teleost balığı ve ekotoksikoloji, gelişimsel, genetik ve fizyoloji araştırmaları için ortaya çıkan bir omurgalı modelidir. Medaka ayrıca, bir türün devam etmesine izin verdiği için önemli bir biyolojik işlev olan omurgalı üremesini araştırmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Sperm kalitesi, erkek doğurganlığının ve dolayısıyla üreme başarısının önemli bir göstergesidir. Sperm ve sperm analizi çıkarma teknikleri, teleost balıkları da dahil olmak üzere birçok tür için iyi belgelenmiştir. Sperm toplamak büyük balıklarda nispeten basittir, ancak daha az sperm ürettikleri ve daha hassas oldukları için küçük model balıklarda daha karmaşık olabilir. Bu nedenle, bu makalede, küçük model balıklarda, Japon medakasında iki sperm toplama yöntemi açıklanmaktadır: testisler diseksiyonu ve karın masajı. Bu makale, her iki yaklaşımın da medaka için uygulanabilir olduğunu ve balıklar prosedürden hızla iyileştikçe karın masajının tekrarlanan sayıda yapılabileceğini göstermektedir. Bu makalede ayrıca, medakada sperm kalitesinin birkaç önemli göstergesini (motilite, progresiflik, motilitenin süresi, bağıl konsantrasyon) objektif olarak değerlendirmek için medakada bilgisayar destekli sperm analizi için bir protokol açıklanmaktadır. Bu yararlı küçük teleost modeli için belirtilen bu prosedürler, omurgalı erkeklerde doğurganlığı etkileyen çevresel, fizyolojik ve genetik faktörlerin anlaşılmasını büyük ölçüde artıracaktır.
Introduction
Japon medaka, Doğu Asya'ya özgü küçük, yumurtlayan bir tatlı su teleost balığıdır. Medaka, ekotoksikoloji, gelişimsel genetik, genomik ve evrimsel biyoloji ve fizyoloji çalışmaları için mükemmel bir omurgalı model sistemi haline gelmiştir 1,2. Popüler zebra balıklarına benzer şekilde, üremeleri nispeten kolaydır ve birçok yaygın balık hastalığına karşı oldukça dirençlidirler 1,2. Medaka'yı model olarak kullanmanın kısa bir üretim süresi, şeffaf embriyolar 1,2 ve sıralı bir genom3 dahil olmak üzere birçok avantajı vardır. Zebra balıklarının aksine, medaka, cinsiyet belirleyici bir gen 4'ün yanı sıra yüksek sıcaklık (4-40 ° C'den) ve tuzluluk (euryhaline türleri) toleransınasahiptir 5. Ayrıca, birçok genetik ve anatomik aracın yanı sıra 6,7,8,9,10,11,12 protokolleri, biyolojisinin incelenmesini kolaylaştırmak için Medaka'da geliştirilmiştir.
Üreme, bir türün devam etmesine izin verdiği için önemli bir fizyolojik işlevdir. Omurgalı üremesi, kadınlarda oosit üretimi ve erkeklerde sperm üretimi de dahil olmak üzere çok sayıda hassas şekilde düzenlenmiş olay gerektirir. Sperm, yüksek kaliteli bir ürünün teslimini garanti altına almak için bir dizi kontrol noktasının bulunduğu karmaşık spermatogenez süreci yoluyla üretilen benzersiz hücrelerdir13. Gamet kalitesi, döllenme başarısı ve larva sağkalımı üzerindeki etkisi nedeniyle su ürünleri yetiştiriciliği ve balık popülasyonu çalışmalarında odak noktası haline gelmiştir. Bu nedenle sperm kalitesi, omurgalılarda erkek fertilitesinin önemli bir göstergesidir.
Balık sperm kalitesini değerlendirmek için üç yararlı faktör hareketlilik, progresiflik ve uzun ömürlüdür. Yüzde motilitesi ve progresif motilite, sperm kalitesinin yaygın göstergeleridir, çünkü progresif hareket için gereklidir ve döllenme başarısı ile güçlü bir şekilde ilişkilidir14,15. Hareket süresi de balıklarda önemli bir göstergedir, çünkü sperm çoğu teleost türünde 2 dakikadan daha az bir süre boyunca tamamen hareketli kalır ve spermin yörüngesi genellikle memelilerden daha az lineerdir15. Bununla birlikte, geçmişte sperm motilitesini değerlendiren birçok çalışma, sperm analizinde öznel veya yarı kantitatif yöntemlere dayanıyordu15,16. Örneğin, medakadaki sperm hareketliliği geçmişte mikroskop altında görsel olarak tahmin edilmiştir17. Ayrıca sperm hareketini kaydederek ve çerçeveleri birleştirmek ve yüzme yolunu ve hızını ölçmek için görüntüleme yazılımı kullanılarak tahmin edilmiştir18,19,20. Bu tür yaklaşımlar genellikle sağlamlıktan yoksundur ve analizi yapan kişiye göre farklı sonuçlar verir15,21.
Bilgisayar destekli sperm analizi (CASA) başlangıçta memeliler için geliştirilmiştir. CASA, hızı ve yörüngeyi otomatik bir şekilde kaydederek ve ölçerek sperm kalitesini değerlendirmek için hızlı bir nicel yöntemdir15. Balıklarda, çeşitli su kirleticilerinin sperm kalitesi üzerindeki etkilerini izlemek, kuluçka stokunu iyileştirmek, kriyoprezervasyon ve depolama verimliliğini artırmak ve döllenme koşullarını optimize etmek için ilginç progenitörleri tanımlamak için farklı türlerde kullanılmıştır15. Bu nedenle, farklı omurgalı türlerinde sperm kalitesini güvenilir bir şekilde değerlendirmek için güçlü bir araçtır. Bununla birlikte, balıklar arasındaki üreme stratejilerindeki önemli çeşitlilik nedeniyle, teleost balıklarının spermleri memelilerinkinden ve bir balık türünden diğerine farklılık gösterir. Gametleri suya bırakarak yumurtaları öncelikle dışarıdan dölleyen teleost balıkları, dahili olarak döllenen ve bu nedenle sudaki seyreltmeyi telafi etmek zorunda kalmayan, ancak daha viskoz sıvılara dayanmak zorunda kalan memelilerin aksine, akrozomsuz yapıda nispeten basit olan oldukça konsantre spermlere sahiptir14. Ek olarak, çoğu balıktan elde edilen sperm hızla hareket eder, ancak aktivasyondan sonra 2 dakikadan daha kısa bir süre boyunca tamamen hareketlidir, ancak birkaç istisna vardır15,22. Çoğu balıkta hareketlilik hızla azalabileceğinden, balıklar için bir sperm analiz protokolü belirlenirken aktivasyondan sonra analizin zamanlamasına çok dikkat edilmelidir.
Üreme, biyolojide teleostların ve medakaların model organizmalar olarak yaygın olarak kullanıldığı alanlardan biridir. Gerçekten de, medaka erkekleri,eş koruma 23,24 gibi ilginç üreme ve sosyal davranışlar göstermektedir. Ek olarak, bu türdeki üremenin nöroendokrin kontrolünü incelemek için birkaç transgenik çizgi vardır25,26,27. Büyük balıklarda nispeten basit olan bir prosedür olan sperm örneklemesi, daha az sperm ürettikleri ve daha hassas oldukları için küçük model balıklarda daha karmaşık olabilir. Bu nedenle medakada sperm örneklemesi içeren çalışmaların çoğunda disseke testislerin ezilmesi suretiyle süt (balık menisi) ekstrakte edilmesi 17,28,29,30. Birkaç çalışma, sütü doğrudan aktive edici ortama 18,19,20 olarak ifade etmek için modifiye edilmiş bir karın masajı da kullanmaktadır; Bununla birlikte, bu yöntemle, ekstrakte edilen sütün miktarını ve rengini görselleştirmek zordur. Zebra balığında, karın masajı, hemen kılcal bir tüp31,32,33'te toplanan sütü ifade etmek için yaygın olarak kullanılır. Bu yöntem, süt hacminin tahmin edilmesini ve sperm kalitesinin hızlı ve basit bir göstergesi olan ejakülat renginin gözlemlenmesini sağlar32,33. Bu nedenle, medaka için sperm toplama ve analizi için açık ve iyi tanımlanmış bir protokol yoktur.
Bu nedenle bu makalede, küçük model balıklar Japon medakasında sperm toplamanın iki yöntemi açıklanmaktadır: testisler diseksiyonu ve kılcal tüplerle karın masajı. Her iki yaklaşımın da medaka için uygulanabilir olduğunu ve balıklar işlemden hızla iyileştikçe karın masajının tekrarlanan sayıda yapılabileceğini göstermektedir. Ayrıca, medaka'da bilgisayar destekli sperm analizi için medaka sperm kalitesinin birkaç önemli göstergesini (hareketlilik, progresiflik, uzun ömürlülük ve göreceli sperm konsantrasyonu) güvenilir bir şekilde ölçmek için bir protokol açıklar. Bu yararlı küçük teleost modeli için belirtilen bu prosedürler, omurgalı erkeklerde doğurganlığı etkileyen çevresel, fizyolojik ve genetik faktörlerin anlaşılmasını büyük ölçüde artıracaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneyler ve hayvan elleçleme, Norveç Yaşam Bilimleri Üniversitesi'ndeki (NMBU) deneysel hayvan refahı ile ilgili tavsiyelere uygun olarak gerçekleştirildi. Deneyler, NMBU'da (Ås, Norveç) yetiştirilen yetişkin (6-9 aylık) erkek Japon medaka (Hd-rR suşu) kullanılarak gerçekleştirildi. Yöntemler ayrıca Ulusal Tarım, Gıda ve Çevre Araştırma Enstitüsü'nde (INRAE, Rennes, Fransa) yetiştirilen 9 aylık erkek Japon medakasında (CAB suşu) kısaca test edildi.
1. Cihaz ve çözelti hazırlama
- Anestezik stok çözeltisi hazırlayın (% 0.6 Trikain).
- 0.6 g Trikain (MS-222) 100 mL'lik 10x Fosfat Tampon Salin (PBS) içinde seyreltin.
- Aliquot 2 mL anestezik stok çözeltisi 50 2 mL plastik tüplere ve anestezi veya ötenazi için kullanılıncaya kadar -20 ° C'de saklayın.
- Geri kazanım suyu hazırlayın (% 0.9 sodyum klorür [NaCl] çözeltisi).
- 3 L akvaryum suyuna 27 g NaCl ekleyin.
- Çözeltiyi kullanana kadar oda sıcaklığında (RT) saklayın.
- Gerekirse aktivasyon ortamını ayarlayın (Hank'in dengeli tuz çözeltisi [HBSS]).
NOT: HBSS ticari olarak satın alınabilir veya laboratuvarda yapılabilir (Malzeme Tablosu).- Bir pH metre kullanarak HBSS'nin pH'ını ölçün. Gerekirse hidroklorik asit veya sodyum hidroksit kullanarak pH'ı ayarlayın, böylece nihai pH 7.1-7.3 olur.
- HBSS'nin ozmolalitesini gelecekteki raporlama için bir ozmometre kullanarak ölçün.
NOT: Ticari ürün yelpazesi 266-294 mOsmol/kg'dır; Bu çalışmada ozmolalite 287 mOsmol/kg idi. İstenirse ozmolaliteyi azaltmak için damıtılmış su ile seyreltilebilir, ancak 150-300 mOsmol / kg HBSS'de medaka sperminin aktivasyonunda büyük bir fark olmadığı için bu gerekli değildir. - Çözümü kullanana kadar RT'de saklayın.
- Tutma süngerini hazırlayın.
- Petri kabına sıkıca oturması için yumuşak bir sünger kesin.
- Süngerin ortasında, balıkları alacak kadar uzun (3-4 cm) ve yaklaşık 1 cm derinliğinde (Şekil 1A) düz bir çizgi kesin. Süngerdeki bu yarık, kloakayı açığa çıkarmak için balık ventral tarafını yukarı doğru tutacaktır.
2. Sperm toplama
NOT: Sperm toplanması iki farklı yöntemle sağlanabilir: karın masajı veya testis diseksiyonu.
- Karın masajı ile sperm toplama
- 100 mL'lik bir cam kapta 38 mL akvaryum suyunda bir tüp Trikain stoğunu (% 0.6) seyrelterek% 0.03 anestezik çözelti hazırlayın.
- Künt uçlu pürüzsüz forseps ve 10 μL tek kullanımlık kalibre edilmiş cam mikropipet ve aspiratör tüpü tertibatı dahil olmak üzere aletleri hazırlayın (Şekil 1A). Adım 1.4'te hazırlanan tutma süngerini anestezik solüsyonla nemlendirin.
- Anında analiz için 36 μL aktive edici çözelti içeren tüpler hazırlayın. Aktive edici çözeltiyi en az 5 dakika boyunca 27 ° C'ye ayarlanmış bir su banyosunda veya inkübatörde önceden ısıtın.
NOT: Her ne kadar numuneler tek tek balıklardan analiz edilebilse de, birden fazla erkekten alınan numunelerin aynı aktive edici çözeltide toplanmasıyla bireysel varyasyon azaltılabilir. Birden fazla balıktan alınan örnekleri bir araya getirirken, balık başına 36 μL aktive edici çözelti kullanın. Bu seyreltmenin, kullanılan medakanın gerilme veya yetiştirme koşullarına bağlı olarak ayarlanması gerekebilir, çünkü bu faktörler sperm konsantrasyonunu ve hacmini etkileyebilir. CASA programı, konsantrasyonun spermi tanımlamak için çok yüksek olup olmadığını gösterecektir. - Balıkları 30-90 sn için anestezik çözeltiye koyarak anestezi yapın.
NOT: Anestezi süresi, balığın büyüklüğüne göre değiştiği için uyarlanmalıdır. Balığın tamamen uyuşturulmasını sağlamak için, kaudal pedinkülü forseps ile hafifçe sıkıştırın. Balık tepki vermezse, masaj başlatılabilir. - Balıkları anestezik solüsyondan çıkarın ve bir kağıt havlu kullanın veya balığın karnını kurutmak için hafifçe silin. Balıkları nemli tutan sünger ventral tarafının oluğuna yerleştirin, böylece solungaçları süngerdeki anestezik çözeltiye maruz kalır (Şekil 1B).
- Kloak etrafındaki alan ıslaksa, balığın alt tarafını tek kullanımlık bir mendil ile hafifçe kurulayın.
- Balıkları disseksiyon mikroskobu altında tutma süngerine yerleştirin ve mikropipeti balığın kloakına tutturulmuş bir aspiratör tüpü ile yerleştirin (Şekil 1C).
- Balığın karnına, künt uçlu pürüzsüz forsepslerle hafifçe sıkarak masaj yapın ve aynı anda dışarı atılan sütü pipete toplamak için emerken (Şekil 1D).
- Balıkları süngerden geri kazanım suyuna bırakın. Akvaryum sistemine geri göndermeden önce çözeltide en az 15 dakika iyileşmelerine izin verin.
- Süt, aspiratör tüp tertibatı üzerinde emerek ve üfleyerek önceden ısıtılmış aktivasyon çözeltisi ve pipeti ile hazırlanmış bir tüpe birkaç kez yukarı ve aşağı aktarın.
- Seyreltilmiş spermi, analizden önce tüpleri hafifçe sallayarak homojenize edin.
NOT: En iyi sonuçlar için, etkinleştirmeden hemen sonra numuneleri analiz edin (örneğin, 5 sn). Medaka'da, sperm birkaç saat boyunca hareketli kaldığı için gerekirse analiz gecikebilir, ancak motilitesi zamanla azaldıkça zaman örnekler arasında tutarlı kalmalıdır.
- Testislerin diseksiyonu ile sperm toplanması
- 100 mL'lik bir cam kapta 26 mL akvaryum suyunda iki tüp Trikain stoğunu (% 0.6) seyrelterek% 0.08 ötenazi çözeltisi hazırlayın.
- Künt ve ince forseps ve küçük diseksiyon makasları dahil olmak üzere diseksiyon aletleri hazırlayın (Şekil 1E).
- Anında analiz için her numune için 120 μL aktive edici çözelti içeren bir tüp hazırlayın. Aktive edici çözeltiyi en az 5 dakika boyunca 27 ° C'ye ayarlanmış bir su banyosunda veya inkübatörde önceden ısıtın.
NOT: Her ne kadar numuneler tek tek balıklardan analiz edilebilse de, birden fazla erkekten alınan numunelerin aynı aktive edici çözeltide toplanmasıyla bireysel varyasyon azaltılabilir. Birden fazla balıktan alınan numunelerin havuzlanması için, balık başına 120 μL aktive edici çözelti kullanın. Bu seyreltmenin, kullanılan medakanın gerilme veya yetiştirme koşullarına bağlı olarak ayarlanması gerekebilir, çünkü bu faktörler sperm konsantrasyonunu ve hacmini etkileyebilir. CASA programı, konsantrasyonun spermi tanımlamak için çok yüksek olup olmadığını gösterecektir. - Balıkları 30-90 s'de% 0.08 anestezik çözeltiye koyarak ötenazileştirin.
NOT: Süre, balığın büyüklüğüne bağlıdır. Balığın ötenazi yapılmasını sağlamak için, operkulum hareketlerinin durmasını bekleyin. Balık, forsepslerin dokunuşuna tepki vermemelidir. - Balıkları ötenazi çözeltisinden çıkarın ve balıkları bir kağıt havluyla hafifçe kurutun veya hafifçe silin.
NOT: Bu adımda, balıklar daha sonra gonadosomatik indeksi (GSI, gonadal ağırlık / vücut ağırlığı) hesaplamak için tartılabilir. - Balıkları, sol yanal tarafı yukarı bakacak şekilde diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin (Şekil 1F).
- Küçük diseksiyon makası kullanarak, kloaktan dorsal olarak bir flep kesin ve daha sonra iç organları açığa çıkarmak için kaburgalardan solungaçlara doğru (Şekil 1G).
- Testisleri bulun, her iki uçtaki eki ince forsepslerle kesin ve testisleri çıkarın (Şekil 1H).
NOT: GSI'yı hesaplamak için, testisler bu adımda tartılabilir. Dokunun kurumasını önlemek için hızlı çalışın. - Testisleri, önceden ısıtılmış aktivasyon çözeltisi ile hazırlanmış bir tüpe aktarın.
- Spermi serbest bırakmak için testisleri tüpün yan tarafına karşı birkaç kez ezmek için forseps kullanın. Sperm salınımı genellikle görselleştirilebilir ve çözeltiyi biraz bulanık hale getirir.
- Seyreltilmiş spermi, analizden önce tüpleri hafifçe sallayarak homojenize edin.
NOT: En iyi sonuçlar için, etkinleştirmeden hemen sonra numuneleri analiz edin (örneğin, 5 sn). Medaka'da, sperm birkaç saat boyunca hareketli kaldığı için gerekirse analiz gecikebilir, ancak motilitesi zamanla azaldıkça zaman örnekler arasında tutarlı kalmalıdır.
Şekil 1: Karın masajı (A-D) ve testisler diseksiyonu (E-H) ile süt toplanması. (A) Karın masajı için aletler: aspiratör tüp tertibatı ile sünger, künt pürüzsüz forseps ve 10 μL tek kullanımlık kalibre edilmiş cam mikropipet tutma; (B) Sünger ve kloakta anesteziye maruz kalan solungaçlar yukarı bakacak şekilde, tutma süngerinde balığın konumu; (C) Künt pürüzsüz forsepslerin karın ve mikropipet üzerinde kloaca karşı pozisyonu; (D) Nazik masaj ve emme işleminden sonra mikropipette süt. (E) Testislerin diseksiyonu için aletler: künt forsepsler, ince forsepsler ve küçük diseksiyon makasları; (F) Testislerin diseksiyonu için balığın konumu; (G) İç organların yanal görünümü; (H) Her iki uçtaki ataşmanı ince forsepslerle keserek testisleri çıkarın. Ölçek çubuğu: 2 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
3. CASA sistemi ile sperm analizi
- CASA sistemi (SCA Evolution), yeşil bir filtre ve faz kontrastlı 10x objektif kullanılarak mikroskopla kılavuza göre kurulmalıdır.
- Tek kullanımlık 20 μm sayım odası kızaklarını, bir ısıtma plakası üzerinde veya en az 5 dakika boyunca 27 ° C'ye ayarlanmış bir inkübatörde önceden ısıtarak hazırlayın.
- Sperm analiz yazılımını açın ve hareketlilik modülünü seçin.
- Medakanın yapılandırmasını Şekil 2B'de gösterildiği gibi ayarlayın.
- Önceden ısıtılmış tek kullanımlık 20 μm sayım odası sürgüsünü, 27 ° C'ye ayarlanmış ısıtılmış bir aşamaya mikroskop altına yerleştirin.
- Numuneyi, odayı aşırı doldurmadan doldurana kadar slayttaki hazneye pipetleyin. Odanın girişindeki fazla numuneleri pamuklu bir uçla dikkatlice silin veya yüzen hücreleri önlemek için hafifçe silin.
- Örneğe mikroskop altında bakmak için Analiz Et'i seçin.
NOT: Mikroskop simgesi kırmızıysa, programın spermi doğru bir şekilde izlemesi için mikroskop aydınlatmasının ayarlanması gerekir. Mikroskobun parlaklığını ayarlayın, böylece spermin kuyruk hareketi açıkça görülür. Simge mavi olmalıdır. - Mikroskobun odaklandığından emin olun ve spermi sahaya kaydetmek için tekrar Analiz Et'i seçin. Slaytı, numunenin yeni bir alanı çerçevede olacak şekilde hareket ettirin ve 3-5 farklı görüş alanı yakalamak için bu işlemi tekrarlayın. Hava kabarcıkları, hücre kütleleri veya yapıtlar içeren alanlardan kaçının.
- Sonuçları görüntülemek için Sonuçlar'ı seçin.
NOT: Sonuç sayfasındaki alanlar kırmızı renkle özetlenmişse, konsantrasyon veya hareketlilik bakımından çok fazla değişiklik gösteren alanları silmek için sistemin istemlerini izleyin. - Tek tek alanın sonuçlarını görüntülemek veya yanlış etiketlenmiş veya izlenmemiş spermatozoa olup olmadığını manuel olarak kontrol etmek için bir alana çift tıklayın. Gerekirse hareketliliği yeniden etiketlemek için bireysel spermatozoaya sağ tıklayın (Şekil 2A).
Şekil 2: SCA Evolution yazılımı ekran görüntüsü . (A) Bir alan için sperm izleme sonuçları. Alan verilerini sağ tarafta görüntüleyin ve tek tek verileri görüntülemek için spermatozoaya çift tıklayın; (B) Yapılandırma menüsü açık olan tüm alanlar için sonuç özeti. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Elde edilen verilerin türü
SCA Evolution yazılımından sperm motilitesi analizi, motilitenin (hareketli ve hareketsiz sperm yüzdesi), progresivites (ilerleyici ve progresif olmayan sperm yüzdesi) ve hız (hızlı, orta ve yavaş hareket eden sperm yüzdesi) hakkında veri sağlar. Aynı zamanda ilericiliği ve hızı birleştirir (hızlı ilerici, orta ilerici, ilerici olmayan). Bu etiketler, program tarafından sağlanan spermatozoon hareketinin ölçümlerine (Şekil 3A) ve hesaplamalarına (Şekil3B) dayanmaktadır (Ek Tablo 1). Medaka için aşağıdaki eşikler, önceki literatür19,34,35'e ve 18 kişiden medaka verilerinin dağılımına dayanarak önerilen zebra balığı parametrelerinden uyarlanmıştır. Motilite, hareketsiz < 10 μm / s ≤ 20 μm / s < orta ≤ 40 μm / s ≤ hızlı < eğrisel hıza (VCL) dayanır. Düzlük indeksi (STR)% 68 > ise sperm ilerleyici olarak kabul edilir.
SCA Evolution ayrıca, numunenin hacmi ve seyreltme sağlandığında sperm konsantrasyonunu da hesaplar. Karın masajı yöntemi, renklenmeyi görselleştirmek ve sütün varlığını doğrulamak için yararlı olsa da, toplanan hacim doğru bir şekilde ölçülemeyecek kadar küçüktür. Süt hacmi yetiştirme koşulları veya farklı bir gerinim kullanılarak iyileştirilirse ve ölçülebilirse, program konsantrasyonu hesaplamak için kullanılabilir. Bununla birlikte, nispi konsantrasyon, testislerin diseksiyonu ile alınan numuneler için balık veya tedavi gruplarını karşılaştırmak için de hesaplanabilir, ancak tüm testis aynı miktarda sıvı içinde diseke edildiği ve seyreltildiği sürece.
Şekil 3: Spermatozoon hareketinin analizi. (A) CASA sistemi tarafından kaydedilen veriler arasında eğrisel hız (VCL, gerçek yol boyunca mesafe kullanılarak hesaplanan hız), ortalama yol hızı (VAP, ortalama yolun mesafesi kullanılarak hesaplanan hız), düz çizgi hızı (VSL, sperm izinin başlangıcı ve bitişi arasındaki mesafe kullanılarak hesaplanan hız), lateral kafa yer değiştirmesinin genliği (ALH, bir sperm başının ortalama yolu hakkında yanal yer değiştirmesinin büyüklüğü), çapraz frekansı (BCF, eğrisel yolun ortalama yolu geçtiği hız); (B) CASA sisteminden hesaplanan değerler arasında düzlük indeksi (STR, ortalama yolun doğrusallığı), doğrusallık indeksi (LIN, eğrisel yolun doğrusallığı) ve yalpalama (WOB, gerçek yolun ortalama yol hakkındaki salınımları) bulunur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Sperm motilitesinin değerlendirilmesi: Farklı aktive edici çözümler
Şaşırtıcı bir şekilde, hem karın masajı hem de testis diseksiyonu ile örneklenen sperm, akvaryum suyunda (16 mOsmol / kg) (Şekil 4A) ve NaCl çözeltisi ile 34 mOsmol / kg'a ayarlanmış akvaryum suyunda hareketsizdi. Ayrıca deiyonize suda (-1 mOsmol / kg) veya 23 mOsmol / kg'a ayarlanmış deiyonize suda hareketlilik yoktu. Spermler HBSS'de (287 mOsmol/kg) ve ayrıca deiyonize su ile seyreltilmiş HBSS'de 36 mOsmol/kg ve 113 mOsmol/kg'a kadar hareketliydi, ancak yüzde motilitesi 36 mOsmol/kg'da anlamlı derecede azaldı (Şekil 4C).
Şekil 4: Aktive edici çözeltinin ozmolalitesi ile motilite. (A) akvaryum suyunda (16 mOsmol / kg) ve (B) ayarlanmamış HBSS'de (287 mOsmol / kg) testislerin diseksiyonu ile örneklenen sperm. Sarı daireler hareketsiz spermi etiketler ve renkli çizgiler sperm hareketini gösterir: kırmızı (hızlı progresif), yeşil (orta progresif), mavi (progresif olmayan). Ölçek çubuğu: 100 μm. (C)HBSS ile 36, 113 ve 287 mOsmol/kg H2O'da aktive edilen sperm motilitesi. 36 ve 113 için, n = 4, numune başına iki balık havuzlanır. 287 için, n = 9, numune başına iki balık havuzlanır. İstatistiksel analizler Tukey post-hoc testi ile ANOVA kullanılarak yapıldı ve anlamlı farklılıklar farklı harflerle belirtildi. Veriler SEM ± ortalama olarak gösterilmektedir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Örnekleme yöntemleri: Karın masajına karşı testis diseksiyonu
Testislerin diseksiyonu ile örneklenen spermler, aynı balıktan alınan karın masajı örneklerine kıyasla anlamlı derecede daha hareketlidir (Şekil 5A). Hareketli spermlerin daha yüksek bir yüzdesi de ilerleyici ve orta veya hızlı hareket eder. Karın masajı ile örneklenen spermlerde, daha hareketli spermler yavaş hareket eder ve ilerleyici değildir (Şekil 5B-C). Bununla birlikte, farklı bir medaka suşu (CAB) veya alternatif yetiştirme koşulları kullanılarak farklı sonuçlar elde edilebilir (Ek Tablo 2).
Şekil 5: Karın masajına karşı testislerin diseksiyonu. Karın masajı veya testis diseksiyonu ile örneklenen (A) hareketsiz ve hareketli sperm yüzdesi. (B) ilerleyici olmayan ve ilerleyici sperm ve (C) yavaş, orta ve hızlı hareket eden hareketli sperm yüzdesi. Tüm sperm örnekleri HBSS'de aktive edildi (287 mOsmol / kg H2O). İstatistiksel analizler Mann-Whitney U testi kullanılarak yapıldı ve anlamlı farklılıklar yıldız işaretleri ile belirtildi. Veriler ortalama ± SEM, n = 9 olarak temsil edilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Depolama durumuna göre hareket süresi
Testislerin diseksiyonu ile örneklenen ve 27 ° C'de tutulan spermler, aktivasyondan sonraki ilk 30 dakika içinde hareketlilikte% 50'lik bir azalmaya sahipti. 2.5 saat sonra, spermlerin% 5'inden azı hareketliydi. 4 °C'de depolandığında, hareketlilik ilk 30 dakikada sadece% 14 oranında azaltıldı ve ilk hareketlilikten % 50'lik bir azalma görmek 5 saat sürdü. Buz benzer bir genişleme etkisine sahipti, ancak ilk 30 dakikada% 26'lık bir hareketlilik azalması ile daha az etkiliydi (Şekil 6A). Progresiflik ayrıca buzda ilk 30 dakikada% 52 düştü, 27 ° C'de% 65 ve 4 ° C'de% 33 (Şekil 6B). Hem buzda hem de 4 ° C'de, bazı spermler (<% 3) aktivasyondan 42 saat sonra hala hareket ediyordu.
Şekil 6: Depolama durumuna göre sperm ömrü. HBSS (287 mOsmol/kg H 2O) ile aktive edilen ve 27 °C, 4 °C veya buz üzerinde saklanan numuneler için zaman içinde yüzde (A) hareketlilik ve (B) progresyonu. Veri noktaları ortalama SEM ±, n = ≥4'tür. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Çevre ve barınma koşullarının önemi
Dişilerle birlikte barındırılan erkekler, sabahları yumurtlama fırsatına sahip olmadan önce (ışıklar açılmadan önce) veya ışıklar yandıktan ve tanktaki dişilerin yumurtaları olduktan sonra testis diseksiyonu ile örneklendi. Sperm motilitesinde anlamlı fark yoktu. Bir ay boyunca kadınsız kalan erkekler de örneklendi ve daha yüksek hareketlilik eğilimi olsa da, fark da anlamlı değildi (Şekil 7).
Bununla birlikte, CAB suşu medaka en az bir ay boyunca dişilerden ayrılan erkeklerle farklı bir tesiste yetiştirildiğinde, balıklar daha büyüktü ve karın masajı ile 5-7 μL süt toplandı. Karın masajı ile beş balıktan toplanan örnekler, 300 mOsmol / kg HBSS ile aktive edildiğinde% 68.34 hareketliliğe sahipti. Aynı koşullarda ancak dişilerle birlikte tutulduğunda, toplanan süt hacmi yaklaşık 2 μL idi ve ortalama motilite, üç erkekten% 46.2 idi (Ek Tablo 2).
Şekil 7. Çevresel koşulların sperm motilitesi üzerine etkisi. Dişilerle birlikte barındırılan erkeklerden yumurtlamadan önce (n = 5) ve sonra (n = 4) örneklenen spermlerin yüzde hareketliliği ve dişiler olmadan barındırılan erkeklerden sperm (n = 6). Tüm örnekler testislerin diseksiyonu ile örneklendi ve HBSS (287 mOsmol/kg H2O) ile aktive edildi. İstatistiksel analizler t-testleri kullanılarak yapıldı ve farklılıklar anlamlı değildi. Veriler, tek tek balıkları temsil eden dairelerle ortalama ± SEM olarak gösterilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo 1: Karın masajı ve testis diseksiyonu ile örneklenen sperm için ortalama hız ve hareket hesaplamaları (n=9). Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Tablo 2: Rennes, Fransa'daki INRAE'de yetiştirilen CAB suşu (Carbio olarak da adlandırılır) medakasından sperm analizi verileri. Tüm örnekler 300 mOsmol/kg HBSS'de aktive edildi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ozmolalite, balık sperminin aktivasyonunda önemli bir faktördür36,37. Genel olarak, sperm testislerde hareketsizdir ve deniz balıkları için seminal sıvıya göre hiperozmotik ve tatlı su balıkları için seminal sıvıya göre hipo-ozmotik olan ortamlarda hareketli hale gelir37. Kana benzer şekilde, tatlı su balıklarında seminal plazma tipik olarak deniz balıklarından daha düşüktür (400 mOsmol / kg'a kıyasla yaklaşık 300 mOsmol / kg) 22,37. Bu nedenle, balık spermi genellikle içinde yaşadıkları suyla temas ettiğinde aktive edilir ve bu su sperm analizi için en iyi ve en biyolojik aktivasyon ortamı olarak hizmet eder. Bununla birlikte, karın masajı ve testis diseksiyonu ile örneklenen medaka spermi, iki farklı laboratuvarda yetiştirilen Hd-rR veya CAB suşu medakasında akvaryum suyunda hareketli değildi (Şekil 4A). Ek olarak, 287 mOsmol / kg HBSS'de hareketlilik, tatlı su balıkları için alışılmadık olan 36 mOsmol / kg HBSS'den (Şekil 4C) daha yüksekti.
Medaka'da sperm analizini içeren önceki çalışmaların çoğu, ozmolaliteyi tartışmadan medaka spermi için aktive edici ortamlar olarak HBSS 28,29,38 veya Yamamoto çözeltisi 18,19'u kullanmıştır. HBSS, medaka spermi için iyi bir aktive edici ortam olsa da, ozmolalitedeki varyasyon motiliteyi etkileyebilir. Bu nedenle, sperm analizi çalışmalarının, deneyler arasında karşılaştırma için aktive edici çözeltilerinin ozmolalitesini ortaya koyması esastır. Aktive edici ortamın ideal ozmolalitesini araştıran bir çalışmada, medaka sperminin deiyonize suda (25 mOsmol / kg) ve HBSS'de hareketli olduğu ve ozmolalite değerleri 686 mOsmol / kg'< ve en yüksek motilitenin 25 ila 227 mOsmol / kg17 arasında olduğu bulunmuştur. Bununla birlikte, mevcut çalışmada, sperm deiyonize suda da hareketli değildi. Bir euryhaline balığı olarak, medaka farklı ortamlara çok adapte olabilir ve hatta tuzlu suda yaşayabilir ve çoğalabilir39, bu nedenle bu tutarsızlıktan farklı yetiştirme koşullarının sorumlu olması mümkündür. İlginçtir ki, başka hiçbir çalışma, tatlı su balıkları için standart sperm aktivasyon ortamı olmasına rağmen, akvaryum suyunda (veya yaşlı musluk suyu gibi benzeri) medaka sperm motilitesini test etmeyi bildirmemiştir.
Medakadaki bu atipik sperm aktivasyonunun olası bir açıklaması, yumurtalık sıvısı ile etkileşimdir. Balık spermi genellikle çevredeki suda aktive edilirken, yumurtalık sıvısı birçok türde sperm hareketliliğinin süresini arttırır veya uzatır40,41. Medaka, tatlı su balıklarını dışarıdan gübrelemesine rağmen, yüzgeç sarma ve titremeyi içeren yumurtlama davranışları, onları yayın yumurtlayıcılarından çok daha yakın bir yere koyar23. Tatlı su balıklarında yumurtalık sıvısının ozmolalitesi (yaklaşık 300 mOsmol / kg) HBSS40'a yakın olduğundan, dişi tarafından salınan sıvının akvaryum suyunu değil, spermi aktive etmesi mümkündür. Seminal ve over plazmasının ozmolalitesi benzer olduğundan, medaka over sıvısının iyonik bileşiminin önemli bir rol oynaması mümkündür40,42. Yumurtalık sıvısının ve iyonlarının medaka spermini aktive etmedeki rolü daha fazla araştırmayı gerektirmektedir.
Önceki çalışmalarda, medaka spermi sadece disseke testisler 17,28,29,30 ezerek veya sütü doğrudan aktive edici ortama 18,19,20 olarak ifade etmek için karın masajı ile toplanmıştır; Hiçbir çalışma, karın masajı ile kılcal bir tüpe toplanan spermle ilgili verileri bildirmemiştir, ancak zebra balığı ve diğer teleost balıklarında yaygın bir uygulamadır33,43,44. Bu yöntem medakada da uygulanabilir. Süt, kılcal boruda kolayca görselleştirilir ve hacim doğru bir şekilde ölçülemeyecek kadar küçük olmasına rağmen, bu yöntem, kalitenin hızlı bir göstergesi olarak rengin başarılı bir şekilde toplanmasının ve analizinin doğrulanmasını sağlar32. Fekal kontaminasyonun önlenmesi, kılcal bir tüpte toplanmasıyla ortama kıyasla daha kolaydır. Her ne kadar testislerin diseksiyonu ile toplanan sperm örnekleri medakada karın masajı ile toplanan örneklerden daha iyi hareketliliğe sahip olsa da (Şekil 5) ve bu nedenle balığın kurban edilebileceği deneyler için tercih edilse de, karın masajı ötenazi gerektirmeyen ve aynı balıkta tekrarlanabilen minimal invaziv bir prosedürdür. Bu nedenle, zaman içinde aynı balığı takip eden deneyler için yararlıdır. Ayrıca, karın masajı ile toplanan örnekler sadece seminal plazma44 ile salınan olgun hücreleri içerirken, testis diseksiyonundan alınan örnekler olgunlaşmamış sperm hücrelerini ve diğer kalıntıları içerebilir. CASA sistemi, maksimum alandan daha büyük yuvarlak hücreleri ve kalıntıları azaltır, ancak bu parametre çok yükseğe ayarlanırsa, hareketlilik sonuçları etkilenebilir.
Bu medakalarda karın masajı tekniği ile toplanan sperm miktarının düşük olması nedeniyle kılcal damardaki sperm hacmini doğru bir şekilde ölçmek ve böylece düzenli yaklaşımlar kullanarak sperm konsantrasyonlarını hesaplamak mümkün olmamıştır. Bununla birlikte, testislerin diseksiyonu ile alınan örnekler için, aktivasyon ortamının hacmini tutarlı tutarak ve testisleri tartarak, bireyler veya tedavi grupları arasında karşılaştırma yapmak için CASA sistemi tarafından verilen sperm konsantrasyonuna dayanarak göreceli bir konsantrasyon hesaplanabilir. Kalite analizinin yanı sıra, bağıl konsantrasyon, kriyoprezervasyon için optimum numune seyreltmelerinin belirlenmesinde de yararlıdır. Karın masajı ile toplanan hacim, yetiştirme koşulları veya farklı bir suş kullanılarak iyileştirilirse, kılcal tüpteki sütün yüksekliği ölçülerek hacim hesaplanabilir ve konsantrasyonu hesaplamak için programa girilebilir. Birkaç mikrolitrenin elde edilebildiği bu durumlarda, karın masajı ile hareketlilik testislerin diseksiyonuna göre daha yüksek olabilir (Ek Tablo 2). Düşük hacimler toplandığında, numuneler kontaminasyona daha yatkındır, bu da hareketliliği etkileyebilir, ancak hacimler benzer olduğunda bu etkiler tutarlı görünmektedir, bu nedenle tedavi grupları arasında karşılaştırmalar yapılabilir. Bununla birlikte, sütün hacminde veya renginde büyük farklılıklar gösteren örnekler arasında karşılaştırmalar yapılmamalıdır.
Karın masajı kullanılarak medakadan elde edilen düşük hacimli süt, büyük miktarda süt gerektiren deneyler için bir sınırlama olabilir. Bu gibi durumlarda, zebra balığı ve yeşil kılıç kuyruğundan hem diseksiyon hem de masaj yoluyla süt toplayan bir çalışmada gösterildiği gibi, testislerin diseksiyonu tercih edilebilir, ancak düşük hacim30 nedeniyle medakada sadece diseksiyon yapılabilir. Testis diseksiyonu, aynı nedenden dolayı diğer türlerle karşılaştırmak için tipik olarak daha iyidir. Karın masajı ile diğer benzer büyüklükteki balıklara kıyasla sınırlı hacim, daha küçük testislerden (zebra balığı45'te 7.0 ± 2.5 mg ile karşılaştırıldığında medaka'da 1.9 ± 0.6 mg) ve daha az sperm üretilmesinden (2.0 ± 0.4 x 10 6 sperm hücresi / mg testis, zebra balığı46'da 7.7 ± 2.0 x 106 sperm hücresi / mg testis) nedeniyle olabilir. veya kuluçkahanede yetiştirilen Afrika yayın balığı47'de önerildiği gibi, tekniği sınırlayan diğer bilinmeyen biyolojik faktörlere. Aradaki fark, gerinim veya çevresel koşullara göre fizyolojik veya anatomik olabilir, zebra balıklarının aksine, medaka testisleri kaynaştırılır ve daha medial olarak yerleştirilir ve bu nedenle kaynaşmış testisleri olan başka balıklar da olmasına rağmen, karın masajı ile erişmek daha zor olabilir.
Zebra balığı gibi bazı türler için, balıkların sabah48'de yumurtlama şansı olmadan önce spermi örneklemek veya yumurtlamayı önlemek için erkekleri bir gece önce bireysel tanklarda izole etmek en iyisidir32. Bu çalışmadan elde edilen Hd-rR medaka ile, örnekleme zamanlaması (yumurtlamadan önce veya sonra) ve barınma koşulları (1 ay boyunca dişi olsun veya olmasın) gibi çevresel koşulların sperm motilitesi üzerinde anlamlı bir etkisi olmamıştır (Şekil 7). Daha büyük bir örneklem büyüklüğünün veya erkekleri dişilerden daha uzun süre izole etmenin daha yüksek sperm miktarı ve / veya hareketliliği sağlaması mümkündür. Başka bir tesisten gelen CAB suşu medakasında, dişilerle birlikte barındırılan erkeklere kıyasla tek başına barındırılan erkeklerden daha iyi sperm kalitesi ve hacmi ile benzer bir eğilim görülmüştür (istatistiksel sonuçlar çıkarmak için çok az balık test edilmiştir). Bu balıklarla karın masajı ile nispeten yüksek hacimlerde süt toplamak da mümkündü (Ek Tablo 2), ancak Hd-rR suşu medaka kullanılarak çok küçük miktarlarda süt elde edildi ve diğerleri de CAB suşu medaka30'da aynı teknikle küçük hacimler bildirdi. Bununla birlikte, bu farklılıkların suştan mı kaynaklandığı (ki bu da doğuştan ziyade ticari bir suştur) yoksa yetiştirme farklılıklarından mı kaynaklandığı (tesisler arasında birçok şey vardır) belirsizliğini korumaktadır. Bu balıklarda, kontaminasyonu sınırlayan ve kaliteyi artıran birkaç mikrolitre süt toplanabilir. Ancak, her iki cinsiyeti de birlikte yaşamanın önemli olduğu deneyler için, sonuç vermek için onları ayırmak gerekli görünmemektedir. Ayrıca yumurtlamadan önce erkekleri örneklemek gerekli görünmemektedir.
Medaka'nın popülasyona ve çevresel faktörlere göre tam olarak nasıl farklılık gösterdiğini belirlemek için daha ileri çalışmalara ihtiyaç duyulmasına rağmen, deney düzeneği tasarlanırken gerilme ve yetiştirme koşulları göz önünde bulundurulmalı ve farklı miktarlarda sperm üreten popülasyonlar arasında karşılaştırma yaparken dikkatli olunmalıdır. Daha büyük miktarlarda süt elde edilirse, aktive edici çözeltinin seyreltilmesi ayarlanmalıdır (örneğin, tercih edilen konsantrasyon CASA sistemine göre değişebilse de, 1:60). Benzer şekilde, disseke edilmiş testisler, gerinim veya yetiştirme koşulları nedeniyle tipikten (2 mg) çok daha büyükse, CASA programının tüm sperm hücrelerini doğru bir şekilde etiketleyebilmesi için seyreltmenin arttırılması gerekecektir.
Sperm analizi yöntemleri medaka için büyük farklılıklar gösterir ve genellikle özneldir, bu da sonuçların çalışmalar arasında karşılaştırılmasını zorlaştırır. Farklı uzmanlık seviyelerine sahip teknisyenler tarafından kullanılan öznel ve objektif yöntemleri karşılaştıran bir çalışma, yüksek deneyimli teknisyenlerin bir CASA motilitesi programı tarafından sağlanan verilerin yüzde 10 puanı içinde balık sperm motilitesini tahmin edebildiğini, orta ve düşük deneyimli teknisyenlerin ise CASA motilitesini yüzde 30 puana kadar genliklerle abarttığını bulmuştur21 . Bununla birlikte, medakada motiliteyi belirleyen parametreler için standardizasyon eksikliği de daha objektif yöntemler kullananlar arasında farklılıklara neden olabilir. Örneğin, spermi saniyede 33 kare (fps) olarak kaydeden, 30 kareyi analiz eden ve spermin 2 μm / s hareketinden daha hızlı hareket ettiğini düşünen bir çalışma, ortalama 60 μm / s hıza ve kontrol balıkları için yaklaşık% 70'lik bir hareketliliğe sahipti18. Aynı protokolü kullanan başka bir çalışma, kontrol spermi için ortalama 40 μm / s hıza ve% 80'in üzerinde bir hareketliliğe sahipti 19. 47 fps'de 200 kareyi analiz eden başka bir grup, kontrol balıkları için 100 um / s'nin üzerinde ortalama bir VCL'ye sahipti, ancak ortalama hareketlilik% 50'nin altındaydı. Hangi parametrelerin hareketliliği belirlediğini açıklamadılar. Bu nedenle, bu protokolde, bilgisayar destekli sperm analiz yazılımı, medaka sperminin özellikleri için özelleştirilmiş bir dizi parametreye dayanarak spermi objektif, hızlı ve güvenilir bir şekilde analiz etmek için kullanılır. Motilitenin parametrelerinin laboratuvarlar arası karşılaştırmalar için tutarlı olması kritik olduğundan, bu çalışmada kullanılan tam konfigürasyon mevcuttur (Şekil 2B), bu nedenle bu protokol farklı araştırmacılar tarafından farklı bir laboratuvarda güvenilir bir şekilde çoğaltılabilir.
Teleost balıkları çok çeşitli sperm özellikleri gösterir, bu nedenle bu protokol başlangıçta SCA Evolution yazılımı için önerilen zebra balığı parametreleri kullanılarak test edilmesine rağmen, parametrelerin daha düşük hızlı, daha uzun ömürlü medaka spermi için ayarlanması gerektiği açıktı. Bu nedenle, zebra balığı parametreleri, medaka ve benzer sperm özelliklerini 19,34,35 bildiren diğer türlerin literatürü kullanılarak medakaya uyarlandı ve 18 kişiden 17.580 analiz edilen sperm izinin dağılımına en uygun eşikleri seçti. Motilite, hareketsiz < 10 μm / s ≤ 20 μm / s < orta ≤ 40 μm / s ≤ hızlı < eğrisel hıza (VCL) dayanır. Düzlük indeksi (STR) %68 > ise sperm ilerleyici olarak kabul edilir. Motiliteyi tanımlayan eşik, bazı literatür 18,19'da kullanıldığı gibi, 2 μm / s yerine 10 μm / s'de tutuldu, çünkü flagellar hareketten yoksun birçok sperm bu ayarla hareketli olarak yanlış etiketlendi. Benzer büyüklükte sperm kafalarına (~ 2 μm) sahip diğer balık türleri de hareketli sperm35,43'ü tanımlamak için 10 μm / s kullandı. Maksimum alan, zebra balığı ayarından 90 μm2'den 20 μm2'ye düşürüldü, böylece testislerin diseksiyonundan kaynaklanan büyük hücresel döküntüler göz ardı edildi.
Hareketlilik süresi, aktivasyondan önce depolanan ATP miktarına bağlı gibi görünmektedir, çünkü kamçı hareketi hızlı bir enerji tüketimi gerektirir. Muhtemelen bu hızlı tükenme nedeniyle, yüksek başlangıç hızı sperm ile daha kısa bir hareketlilik süresi arasında bir korelasyon vardır49. Balık spermini aktive etmek için tipik olarak ozmotik bir şok gerekli olsa da, hareketlilik döneminde membran hasarına da yol açabilir ve bu da uzun ömürlülüğü etkileyebilir. Bu etki, tatlı su spermi49'da daha kritiktir, bu da deniz sperminin neden daha uzun hareketlilik süresine sahip olduğunu açıklayabilir (tatlı su türleri için yaklaşık 150 s'ye kıyasla ortalama 550 s), tatlı su spermi 14,22 ile benzer bir ortalama hız ve hareketlilik göstermesine rağmen. 30 dakikadan daha uzun hareket süresi yaygın değildir, ancak birkaç deniz türünde22,49 bildirilmiştir. Bir tatlı su balığı olmasına rağmen, medaka ile elde edilen sonuçlar, deniz türlerinden daha düşük hıza ve daha uzun süreye sahip sperm profiline uyar. Bu, seminal plazmaya benzer ortamdaki aktivasyonla ilişkili olabilir - ozmotik şok olmadan, medaka spermi muhtemelen diğer tatlı su balıklarına benzer membran hasarına maruz kalmaz.
Aktivasyondan sonra aktive edici olmayan bir çözelti ve çok hızlı, tutarlı bir şekilde zamanlanmış analiz, sadece dakikalarca hareketli olan spermlerin analizi için genellikle gereklidir. Bununla birlikte, medaka sperm motilitesi doğal olarak birkaç saat sürer ve 4 ° C'de veya buz üzerinde saklanarak daha yüksek motilitesi korunabilir (Şekil 6). Bu nedenle, anında analizin mümkün olmadığı deneyler için, protokol değiştirilebilir, böylece örneğin, testisler, toplama süresi kaydedildiği sürece, analizin tutarlı kalabilmesi için bir saat boyunca buz üzerindeki çözeltiyi aktive etmede saklanır. Bununla birlikte, en iyi sonuçlar için, anında analiz hala en iyi seçenektir. Motilite, kademeli olduğu için hala azalırken, sonuçlar, aktivasyonu takiben analiz zamanındaki küçük farklılıklardan daha az etkilenir. Yine de, hem numunelerin depolama sıcaklığını hem de aktivasyondan sonra analiz zamanını raporlamak önemlidir, böylece veriler karşılaştırılabilir ve çoğaltılabilir.
Ayrıca, örnekleme sırasında sütün idrarla kirlenmesini önlemek balıklarda tipik olarak çok önemlidir, çünkü bu ozmolaliteyi değiştirebilir ve sperm 16,50'yi erken aktive edebilir. Bununla birlikte, bu medakada (daha uzun hareketlilik süresi nedeniyle) ve bu protokolle, numune hemen aktivasyon ortamına yerleştirildiği için daha az endişe vericidir. Düşük hacimli sütler idrar kontaminasyonuna eğilimlidir, bu nedenle düşük hacimler tedarik edildiğinde medakadan karın masajı ile bazı renk değişiklikleri beklenebilir. Bununla birlikte, eğer bu popülasyonda tutarlıysa, tedavi grupları arasında karşılaştırmalar yapılabilir. Sütün hacmine veya renklenmesine göre değişen medaka popülasyonlarının karşılaştırılmasında dikkatli olunmalıdır.
Sperm analizi sonuçları kullanılan yöntemlere çok bağlı olduğundan, farklı laboratuvarlarda kolayca tekrarlanabilen detaylı ve güvenilir yöntemler faydalıdır. Makalelerin tekrarlanabilirliği sağlamak için yöntemleriyle ilgili ayrıntıları açıklamaları da hayati önem taşımaktadır. Medaka, üreme araştırmaları için bir model olarak giderek daha fazla kullanıldığından, sperm kalitesinin değerlendirilmesi ile ilgili bilgi birikimi eksiktir. Bu yazıda sperm örneklemesi için açıklanan iki farklı yöntem, farklı deneyler için faydalı olabilir. Testisler diseksiyonu tipik olarak daha yüksek hareketlilik sperm verir ve göreceli konsantrasyon hesaplamalarına izin verirken, karın masajı aynı balık üzerinde tekrar tekrar yapılabilir ve yumurtlama olayının daha saf, biyolojik bir temsilidir. Bu nedenle, bu makale, hareketlilik, progresiflik, hız ve diğer kinematik parametreler de dahil olmak üzere sperm hareketi hakkında bol miktarda veri sağlayan güvenilir, objektif bir teknik olan CASA için parametreleri sunmaktadır. Bu protokoller bu nedenle medaka'da toksikoloji, ekoloji, üreme ve fizyoloji dahil olmak üzere çeşitli çalışmalar için yararlı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma Norveç Yaşam Bilimleri Üniversitesi ve ABD Fulbright programı tarafından finanse edilmiştir. Yazarlar, balık tesisi bakımı için NMBU'dan Anthony Peltier ve Lourdes Carreon G Tan'a ve INRAE'deki (Fransa) ISC LPGP'den Guillaume Gourmelin'e bu yöntemleri daha fazla test etmek için balık ve laboratuvar alanı sağladıkları için teşekkür eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tubes | Axygen | MCT-150-C | Any standard brand can be used |
| 10 µL disposable calibrated glass micropipette and aspirator tube assembly | Drummond | 2-000-010 | |
| 10x objective with phase contrast | Nikon | MRP90100 | |
| 2 mL tubes | Axygen | MCT-200-c-s | Any standard brand can be used |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Blunt smooth forceps | Millipore | XX6200006P | |
| Disposable 20 micron counting chamber slide | Microptic | 20.2.25 | Leja 2 chamber slides |
| Dissecting microscope | Olympus | SZX7 | Any standard brand can be used |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| HBSS | Sigmaaldrich | H8264-1L | |
| Holding sponge | self-made | ||
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ts2R | |
| SCA Evolution | Microptic | ||
| Small dissecting scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigmaaldrich | S9888 | |
| Tabletop vortex | Labnet | C1301B | |
| Tricaine | Sigmaaldrich | A5040 |
References
- Shima, A., Mitani, H. Medaka as a research organism: past, present and future. Mechanisms of Development. 121 (7-8), 599-604 (2004).
- Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka - a model organism from the far east. Nature Reviews Genetics. 3 (1), 53-64 (2001).
- Kasahara, M., et al. The medaka draft genome and insights into vertebrate genome evolution. Nature. 447 (7145), 714-719 (2007).
- Matsuda, M., et al. DMY is a Y-specific DM-domain gene required for male development in the medaka fish. Nature. 417 (6888), 559-563 (2002).
- Sakamoto, T., Kozaka, T., Takahashi, A., Kawauchi, H., Ando, M. Medaka (Oryzias latipes) as a model for hypoosmoregulation of euryhaline fishes. Aquaculture. 193 (3-4), 347-354 (2001).
- Royan, M. R., et al. 3D atlas of the pituitary gland of the model fish medaka (Oryzias latipes). Frontiers in Endocrinology. 12, 719843 (2021).
- Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. Healthy brain-pituitary slices for electrophysiological investigations of pituitary cells in teleost fish. Journal of Visualized Experiments. (138), e57790 (2018).
- Fontaine, R., Weltzien, F. -A. Labeling of blood vessels in the teleost brain and pituitary using cardiac perfusion with a dii-fixative. Journal of Visualized Experiments. (148), e59768 (2019).
- Ager-Wick, E., et al. Preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries. Journal of Visualized Experiments. (138), e58159 (2018).
- Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. Journal of Visualized Experiments. (46), e1937 (2010).
- Wiley-Blackwell. Medaka: Biology, Management, and Experimental Protocols. , Wiley-Blackwell. (2019).
- Royan, M. R., et al. Gonadectomy and blood sampling procedures in the small size teleost model japanese medaka (Oryzias latipes). Journal of Visualized Experiments. (166), e62006 (2020).
- Bhat, I. A., et al. Testicular development and spermatogenesis in fish: insights into molecular aspects and regulation of gene expression by different exogenous factors. Reviews in Aquaculture. 13 (4), 2142-2168 (2021).
- vander Horst, G., Garcia Alvarez, O., Garde, J. J., Soler, A. J., Jones, D. Status of sperm functionality assessment in wildlife species: From fish to primates. Animals. 11 (6), 1491 (2021).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 130 (4), 425-433 (2001).
- Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture. 234 (1-4), 1-28 (2004).
- Yang, H., Tiersch, T. R. Sperm motility initiation and duration in a euryhaline fish, medaka (Oryzias latipes). Theriogenology. 72 (3), 386-392 (2009).
- Hashimoto, S., et al. Effects of ethinylestradiol on medaka (Oryzias latipes) as measured by sperm motility and fertilization success. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 56 (2), 253-259 (2009).
- Hara, Y., Strüssmann, C. A., Hashimoto, S. Assessment of short-term exposure to nonylphenol in Japanese medaka using sperm velocity and frequency of motile sperm. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 53 (3), 406-410 (2007).
- Kawana, R., Strüssmann, C. A., Hashimoto, S. Effect of p-Nonylphenol on sperm motility in Japanese medaka (Oryzias latipes). Fish Physiology and Biochemistry. 28, 213-214 (2003).
- Gallego, V., Herranz-Jusdado, J. G., Rozenfeld, C., Pérez, L., Asturiano, J. F. Subjective and objective assessment of fish sperm motility: when the technique and technicians matter. Fish Physiology and Biochemistry. 44 (6), 1457-1467 (2018).
- Browne, R. K., et al. Sperm motility of externally fertilizing fish and amphibians. Theriogenology. 83 (1), 1-13 (2015).
- Arias Padilla, L. F., et al. Cystic proliferation of germline stem cells is necessary to reproductive success and normal mating behavior in medaka. eLife. 10, 62757 (2021).
- Okuyama, T., Yokoi, S., Takeuchi, H. Molecular basis of social competence in medaka fish. Development, Growth, and Differentiation. 59 (4), 211-218 (2017).
- Okubo, K., et al. Forebrain Gonadotropin-releasing hormone neuronal development: Insights from transgenic medaka and the relevance to X-linked Kallmann syndrome. Endocrinology. 147 (3), 1076-1084 (2006).
- Hodne, K., Fontaine, R., Ager-Wick, E., Weltzien, F. A. Gnrh1-induced responses are indirect in female Medaka Fsh cells, generated through cellular networks. Endocrinology. 160 (12), 3018-3032 (2019).
- Karigo, T., et al. Whole brain-pituitary in vitro preparation of the transgenic Medaka (Oryzias latipes) as a tool for analyzing the differential regulatory mechanisms of LH and FSH release. Endocrinology. 155 (2), 536-547 (2014).
- Kowalska, A., Kowalski, R., Zakęś, Z. The effect of selective cyclooxygenase (COX) inhibitors on japanese medaka (Oryzias latipes) reproduction parameters. World Academy of Science, Engineering and Technology. 77, 19-23 (2011).
- Kowalska, A., Siwicki, A. K., Kowalski, R. K. Dietary resveratrol improves immunity but reduces reproduction of broodstock medaka Oryzias latipes (Temminck & Schlegel). Fish Physiology and Biochemistry. 43 (1), 27-37 (2007).
- Tan, E., Yang, H., Tiersch, T. R. Determination of sperm concentration for small-bodied biomedical model fishes by use of microspectrophotometry. Zebrafish. 7 (2), 233-240 (2010).
- Harvey, B., Kelley, R. N., Ashwood-Smith, M. J. Cryopreservation of zebra fish spermatozoa using methanol. Canadian Journal of Zoology. 60 (8), 1867-1870 (1982).
- Wasden, M. B., Roberts, R. L., DeLaurier, A. Optimizing sperm collection procedures in Zebrafish. Journal of the South Carolina Academy of Science. 15 (2), 7 (2017).
- Draper, B. W., Moens, C. B. A High-throughput method for Zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments. (29), e1395 (2009).
- Castellini, C., Dal Bosco, A., Ruggeri, S., Collodel, G. What is the best frame rate for evaluation of sperm motility in different species by computer-assisted sperm analysis. Fertility and Sterility. 96 (1), 24-27 (2011).
- Acosta, I. B., et al. Effects of exposure to cadmium in sperm cells of zebrafish, Danio rerio. Toxicology Reports. 3, 696-700 (2016).
- Wilson-Leedy, J. G., Kanuga, M. K., Ingermann, R. L. Influence of osmolality and ions on the activation and characteristics of zebrafish sperm motility. Theriogenology. 71 (7), 1054-1062 (2009).
- Alavi, S. M. H., Cosson, J. Sperm motility in fishes. (II) Effects of ions and osmolality: A review. Cell Biology International. 30 (1), 1-14 (2006).
- Kowalska, A., Kamaszews ki, M., Czarnowska-Kujawska, M., Podlasz, P., Kowalski, R. K. Dietary ARA improves COX activity in broodstock and offspring survival fitness of a model organism (Medaka Oryzias latipes). Animals. 10 (11), 2174 (2020).
- Inoue, K., Takei, Y. Asian medaka fishes offer new models for studying mechanisms of seawater adaptation. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 136 (4), 635-645 (2003).
- Zadmajid, V., Myers, J. N., Sørensen, S. R., Ernest Butts, I. A. Ovarian fluid and its impacts on spermatozoa performance in fish: A review. Theriogenology. 132, 144-152 (2019).
- Poli, F., Immler, S., Gasparini, C. Effects of ovarian fluid on sperm traits and its implications for cryptic female choice in zebrafish. Behavioral Ecology. 30 (5), 1298-1305 (2019).
- Cosson, J., Groison, A. L., Suquet, M., Fauvel, C., Dreanno, C., Billard, R. Studying sperm motility in marine fish: An overview on the state of the art. Journal of Applied Ichthyology. 24 (4), 460-486 (2008).
- Beirão, J., Soares, F., Herráez, M. P., Dinis, M. T., Cabrita, E. Sperm quality evaluation in Solea senegalensis during the reproductive season at cellular level. Theriogenology. 72 (9), 1251-1261 (2009).
- Beirão, J., et al. Sperm handling in aquatic animals for artificial reproduction. Theriogenology. 133, 161-178 (2019).
- Yang, H., Tiersch, T. R. Current status of sperm cryopreservation in biomedical research fish models: Zebrafish, medaka, and Xiphophorus. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 149 (2), 224-232 (2009).
- Yang, H., Tiersch, T. R. Sperm cryopreservation in biomedical research fish models. Cryopreservation in Aquatic Species. 2, 439-454 (2011).
- Viveiros, A., Fessehaye, Y., ter Veld, M., Schulz, R., Komen, H. Hand-stripping of semen and semen quality after maturational hormone treatments, in African catfish Clarias gariepinus. Aquaculture. 213 (1-4), 373-386 (2002).
- Ransom, D. G., Zon, L. I. Appendix 3 collection, storage, and use of Zebrafish sperm. Methods in Cell Biology. 60, 365-372 (1998).
- Cosson, J. Frenetic activation of fish spermatozoa flagella entails short-term motility, portending their precocious decadence. Journal of Fish Biology. 76 (1), 240-279 (2010).
- Kowalski, R. K., Cejko, B. I. Sperm quality in fish: Determinants and affecting factors. Theriogenology. 135, 94-108 (2019).
