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Neuroscience

भ्रूण हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स के जमे हुए स्टॉक का उपयोग करके आसान और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य कम घनत्व वाली प्राथमिक संस्कृति

Published: January 27, 2023 doi: 10.3791/64872
Automatic Translation
1, 2, 3,4, 3, 5, 1,5
1Department of Pharmacology, Graduate School of Medicine, Gunma University, 2Gunma University Initiative for Advanced Research, Gunma University, 3Department of Veterinary Pathophysiology and Animal Health, Graduate school of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo, 4Institute for Drug Discovery Innovation, 5AlzMed, Inc.

Summary

न्यूरॉन्स का एक रेडी-टू-यूज़ जमे हुए स्टॉक सिनैप्टिक कार्यों के मूल्यांकन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। यहां, हम 96-वेल प्लेट का उपयोग करके जमे हुए स्टॉक से एक आसान कम घनत्व वाली प्राथमिक संस्कृति पेश करते हैं।

Abstract

न्यूरोनल संस्कृति सिनैप्टिक कार्यों और दवा स्क्रीनिंग के मूल्यांकन के लिए एक मूल्यवान प्रणाली है। विशेष रूप से, प्राथमिक हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स की कम घनत्व वाली संस्कृति व्यक्तिगत न्यूरॉन्स या उपकोशिकीय घटकों के अध्ययन की अनुमति देती है। हमने इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री, न्यूरोनल पोलैरिटी, सिनैप्टिक आकृति विज्ञान और कम घनत्व वाले प्राथमिक हिप्पोकैम्पल संस्कृति का उपयोग करके इसके विकासात्मक परिवर्तन द्वारा एक न्यूरॉन के भीतर उपकोशिकीय प्रोटीन स्थानीयकरण दिखाया है। हाल ही में, न्यूरॉन्स के रेडी-टू-यूज़ जमे हुए स्टॉक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हो गए हैं। न्यूरॉन्स के ये जमे हुए स्टॉक पशु प्रयोगों को तैयार करने के लिए आवश्यक समय को कम करते हैं और उपयोग किए जाने वाले जानवरों की संख्या को कम करने में भी योगदान करते हैं। यहां, हम 96-वेल प्लेट का उपयोग करके एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य कम घनत्व वाली प्राथमिक संस्कृति विधि पेश करते हैं। हमने चूहे के भ्रूण हिप्पोकैम्पस से न्यूरॉन्स के व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जमे हुए स्टॉक का उपयोग किया। न्यूरॉन्स को विशेष समय बिंदुओं पर ग्लियल कोशिकाओं के विकास को कम करके मीडिया परिवर्तन के बिना दीर्घकालिक रूप से सुसंस्कृत किया जा सकता है। कम घनत्व वाली संस्कृति का उपयोग करके यह उच्च-थ्रूपुट परख सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी के प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य इमेजिंग-आधारित मूल्यांकन की अनुमति देता है।

Introduction

एक इन विट्रो प्रयोगात्मक प्रणाली का विकास जो सीखने और स्मृति में शामिल सिनैप्टिक कार्यों का आकलन कर सकता है, महत्वपूर्ण है। न्यूरोनल संस्कृति विट्रो में सिनैप्टिक कार्यों का मूल्यांकन करने के लिए एक मूल्यवान प्रणाली है। न्यूरोनल कल्चर तकनीक का पहली बार 1980 के दशक में उपयोग किया गया था, और 1990 के दशक में, प्रोटीन घटकों, प्रोटीन तस्करी, न्यूरोनल ध्रुवीयता, रीढ़ की आकृति विज्ञान, सिनैप्स विकास और प्लास्टिसिटी 4,5,6,7,8 के उपकोशिकीय स्थानीयकरण के संदर्भ में व्यक्तिगत न्यूरॉन्स के अध्ययन के लिए प्राथमिक हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स की कम घनत्व वालीसंस्कृति विकसित की गई थी। . हालांकि, इस तकनीक में कई कदम शामिल हैं: जानवरों का संभोग करना, भ्रूण का विच्छेदन करना, संस्कृति वाहिकाओं को तैयार करना और सप्ताह में एक बार मीडिया परिवर्तन के साथ 3 सप्ताह के लिए कोशिकाओं की खेती करना। इसके अलावा, इसके लिए अग्रिमतकनीकों की आवश्यकता होती है।

हमने चूहे के भ्रूण 9,10 से अलग हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स के जमे हुए स्टॉक विकसित किए हैं। न्यूरॉन्स के जमे हुए स्टॉक उपयोग के लिए तैयार हैं, और कोशिकाओं11,12 की खेती के लिए कोई अग्रिम तकनीक की आवश्यकता नहीं है। दूसरे शब्दों में, जमे हुए स्टॉक से न्यूरॉन्स की खेती एक प्रयोगकर्ता की तकनीक पर निर्भर नहीं करती है। यह पशु प्रयोगों की आवश्यकता को समाप्त करता है (उदाहरण के लिए, पशु प्रयोगों के लिए अनुमति, समयबद्ध गर्भवती जानवरों की व्यवस्था करना, और चूहे के भ्रूण का विच्छेदन), जिससे उपयोग किए जाने वाले जानवरों की संख्या कम हो जाती है। हाल ही में, न्यूरॉन्स के उच्च गुणवत्ता वाले, उपयोग के लिए तैयार जमे हुए स्टॉक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हो गए हैं। यहां, हमने भ्रूण दिवस (ई) 18 चूहे हिप्पोकैम्पस 13,14,15 से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जमे हुए स्टॉक का उपयोग किया। जमे हुए स्टॉक से न्यूरॉन्स की खेती करने के लिए ग्लिया-वातानुकूलित मीडिया या ग्लियल कोशिकाओं के साथ सह-संस्कृति की आवश्यकता नहीं होती है। अतिरिक्त सीरम के बिना साधारण प्राथमिक संस्कृति मीडिया का उपयोग कोशिकाओं को संस्कृति करने के लिए किया जा सकता है; इसलिए हम प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा प्राप्त कर सकते हैं। इसके अलावा, सेल सीडिंग के बाद 3 सप्ताह तक मीडिया विनिमय की कोई आवश्यकता नहीं है क्योंकि ग्लियल कोशिकाओं की वृद्धि कम हो जाती है (चित्रा 1)।

डेंड्राइटिक स्पाइन अधिकांश उत्तेजक सिनैप्स के पोस्टसिनेप्टिक कम्पार्टमेंट हैं। उनमें रिसेप्टर प्रोटीन, पोस्टसिनेप्टिक पाड़ प्रोटीन और एक्टिन साइटोस्केलेटल प्रोटीन होते हैं। हमने एक एक्टिन-बाइंडिंग प्रोटीन ड्रेब्रिन 5,6,7,16,17,18 पर ध्यान केंद्रित किया। ड्रेब्रिन परिपक्व न्यूरॉन्स 19 में रीढ़ के सिर पर जमा होता है, और हमने सिनैप्टिक अवस्था 15,17,20,21,22,23 के लिए एक मार्कर के रूप में ड्रेब्रिन की सूचना दी। रीडआउट के रूप में ड्रेब्रिन का उपयोग करके एक उच्च-सामग्री विश्लेषण करके, हमने हाल ही में एन-मिथाइल-डी-एस्पार्टिक एसिड-टाइप ग्लूटामेट रिसेप्टर्स (एनएमडीएआर) 10 पर फेनसाइक्लिडीन एनालॉग्स के निरोधात्मक प्रभावों और सिनैप्टिक राज्यों15 पर प्राकृतिक यौगिकों और कच्चे दवाओं के एनएमडीएआर-निर्भर प्रभावों की सूचना दी है।

यहां, हम विस्तार से बताते हैं कि कम घनत्व पर न्यूरॉन्स के जमे हुए स्टॉक को कैसे कल्चर किया जाए। इसके अलावा, हम 96-वेल प्लेटों का उपयोग करके सिनैप्टिक स्थिति का एक ड्रेब्रिन इमेजिंग-आधारित मूल्यांकन दिखाते हैं।

Protocol

1. प्लेट कोटिंग

  1. पॉली-एल-लाइसिन (1 मिलीग्राम / एमएल, 0.1 एम बोरेट बफर [पीएच: 8.5]; 100 μL / कुएं) में पतला 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट को कोट करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
    नोट: केवल उन कुओं को कोट करें जिन्हें उपयोग करने की आवश्यकता है। यहां किए गए प्रयोगों में मध्य 60 कुओं का उपयोग किया जाता है। बोरेट बफर को स्टरलाइज़्ड पानी में 50 एमएम बोरिक एसिड और 12 एमएम बोरेट मिलाकर तैयार किया जाता है।
  2. प्लेट को दो बार स्टरलाइज़ किए गए पानी (250 μL / कुएं) से धोएं।
  3. पूरक के बिना ताजा संस्कृति माध्यम के साथ प्लेट को एक बार धो लें (250 μL /
  4. प्लेट को 20 मिनट के लिए एक साफ बेंच पर सुखाएं।
  5. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्लेट लपेटें और उपयोग तक इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें (1 महीने के लिए मान्य)।

2. सेल सीडिंग

  1. लेपित प्लेट में कल्चर माध्यम के 50 μL / वेल जोड़ें और इसे 30 मिनट से 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में रखें। परिधीय कुओं को निष्फल पानी (200 μL / कुएं) से भरें।
    नोट: संस्कृति माध्यम न्यूरोबेसल माध्यम में 50x B-27, 400x ग्लूटामैक्स, और पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के 100 U / mL जोड़कर तैयार किया जाता है (विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें)।
  2. तरल नाइट्रोजन टैंक से न्यूरॉन क्रायोवियल को हटा दें। यहां उपयोग किए जाने वाले न्यूरॉन्स डीएमएसओ-क्रायोप्रिजर्व्ड न्यूरॉन्स11 थे।
  3. क्रायोवियल को 37 डिग्री सेल्सियस के गर्मी ब्लॉक में 3 मिनट तक डुबोएं और सामग्री को आंशिक रूप से पिघलाएं। क्रायोवियल को बहुत लंबे समय तक गर्म न करें। जैसे ही यह पिघल जाता है, सामग्री को 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  4. धीरे-धीरे न्यूरॉन क्रायोवियल सामग्री को एक विस्तृत छिद्र युक्ति के साथ 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके एक बाँझ 50 एमएल ट्यूब ड्रॉप-वाइज (50 μL / s) में स्थानांतरित करें।
  5. खाली क्रायोवियल को कल्चर माध्यम के 1 एमएल (कमरे का तापमान) के साथ कुल्ला करें; आरटी)। संस्कृति माध्यम के इस 1 एमएल को क्रायोवियल ड्रॉप-वाइज (50 μL / s) से सेल निलंबन युक्त 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  6. 50 एमएल ट्यूब ड्रॉप-वाइज (0.5 एमएल / एस) में कल्चर माध्यम (आरटी) के 9 एमएल जोड़ें और वॉल्यूम को 11 एमएल तक बनाएं। पिपेटिंग को दोहराएं नहीं, लेकिन सेल निलंबन को धीरे-धीरे मिलाएं।
  7. सेल नंबर की गणना करें (सेल काउंटर या हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करें)।
  8. सभी सेल निलंबन को एक जलाशय में स्थानांतरित करें और वाइड-पोर टिप्स (1.0 x 104 सेल / वेल) के साथ मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके सेल निलंबन को 96-वेल प्लेट में वितरित करें। संस्कृति माध्यम वाष्पीकरण को कम करने के लिए, परिधीय कुओं को निष्फल पानी से भरें (चरण 2.1)।
    नोट: यह अध्ययन पुष्टि करता है कि मध्यम विनिमय के बिना 3 सप्ताह की संस्कृति के लिए संस्कृति माध्यम वाष्पीकरण छोटा है। माध्यम की कमी दर 3.6% (एन = 120 कुएं) है। इस प्रकार, 3 सप्ताह की इनक्यूबेशन अवधि के दौरान ऑस्मोलैलिटी परिवर्तन कठोर नहीं होगा।
  9. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में1-2 घंटे के लिए न्यूरॉन्स को इनक्यूबेट करें।
  10. संस्कृति माध्यम को 100 डिग्री सेल्सियस पूर्व गर्म संस्कृति माध्यम (37 डिग्री सेल्सियस) प्रति अच्छी तरह से बदलें और इसे 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में वापस रखें (संस्कृति के दौरान कोई मध्यम परिवर्तन की आवश्यकता नहीं है)।

3. आरा-सी उपचार

  1. विट्रो (DIV) में 4 दिनों में, ग्लियल कोशिकाओं के विकास को कम करने के लिए साइटोसिन β-डी-अरबिनो-फुरानोसाइड (आरा-सी) को 0.2 μM प्रति अच्छी तरह से अंतिम एकाग्रता में जोड़ें।

4. दवा उपचार

  1. विट्रो में 21 दिनों में, रुचि की दवाओं के साथ कोशिकाओं का इलाज करें।
  2. दवा उपचार के दौरान प्लेट का तापमान 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  3. एक सकारात्मक नियंत्रण के लिए, निर्धारण से पहले 10 मिनट के लिए कोशिकाओं को 100 μM ग्लूटामेट (अंतिम एकाग्रता के लिए प्रति अच्छी तरह से) के साथ इलाज करें।

5. निर्धारण

  1. निर्धारण के लिए, 0.1 एम फॉस्फेट बफर (100 μL / वेल) में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड का उपयोग करें।
  2. ~ 20 मिनट के निर्धारण के बाद, कुओं को फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस; 250 μL / वेल) 2x के साथ 5 मिनट के लिए धो लें।

6. इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री

  1. कोशिकाओं को पीबीएस (250 μL / वेल) 1x के साथ 5 मिनट के लिए धो लें।
  2. 5 मिनट के लिए पीबीएस में 0.1% ट्राइटन एक्स -100 (100 μL / वेल) के साथ कोशिकाओं को परमेबिलाइज करें।
  3. कोशिकाओं को पीबीएस (250 μL / वेल) के साथ 5 मिनट के लिए 3x धोएं।
  4. ब्लॉक करने के लिए, आरटी पर 1 घंटे के लिए पीबीएस (पीबीएसए; 100 μL / वेल) में 3% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन का उपयोग करें।
  5. कोशिकाओं को एंटी-ड्रेब्रिन (1: 1) और एंटी-माइक्रोट्यूबुल्स एसोसिएटेड प्रोटीन 2 (एमएपी 2) (1: 000) एंटीबॉडी (60 μL / वेल) के साथ रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  6. कोशिकाओं को पीबीएस (250 μL / वेल) के साथ 5 मिनट के लिए 4x धोएं।
  7. आरटी में 2 घंटे के लिए पीबीएसए (60 μL / वेल) में उपयुक्त द्वितीयक एंटीबॉडी और 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलइंडोल, डाइहाइड्रोक्लोराइड (DAPI; 1: 1000) के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  8. कोशिकाओं को पीबीएस (250 μL / वेल) के साथ 5 मिनट के लिए 4x धोएं।
  9. पीबीएस में 0.1% सोडियम एज़ाइड (150 μL / वेल) युक्त कोशिकाओं को स्टोर करें।

7. छवि अधिग्रहण और विश्लेषण

  1. छवियों को प्राप्त करने के लिए, एक उपयुक्त माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
  2. न्यूरॉन्स के सेल निकायों की पहचान करने के लिए, एमएपी 2-पॉजिटिव और डीएपीआई-पॉजिटिव दोनों क्षेत्रों का उपयोग करें।
  3. न्यूरॉन्स के डेंड्राइट की पहचान करने के लिए, सेल निकायों के बिना एमएपी 2-पॉजिटिव संकेतों का उपयोग करें।
  4. ड्रेब्रिन क्लस्टर की पहचान करने के लिए, एमएपी 2 पॉजिटिव डेंड्राइट के साथ ड्रेब्रिन-पॉजिटिव संकेतों का उपयोग करें।

Representative Results

प्रोटोकॉल के बाद, न्यूरॉन्स को 21 दिनों के लिए 96-वेल प्लेट में सुसंस्कृत किया गया था, और फिर ग्लूटामेट (चित्रा 1) के साथ इलाज किया गया था। न्यूरॉन्स 3 सप्ताह के लिए संस्कृति माध्यम के आदान-प्रदान के बिना सामान्य रूप से विकसित हुए (चित्रा 2)। हमने 10 मिनट के लिए ग्लूटामेट की कई सांद्रता (1 μM, 3 μM, 10 μM, 30 μM, और 100 μM को निष्फल पानी में पतला) के साथ कोशिकाओं का इलाज किया और उन्हें तय किया। इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री का प्रदर्शन किया गया था, और ड्रेब्रिन और एमएपी 2 की प्रतिदीप्ति छवियों को एक एससीएमओएस कैमरे के साथ एक स्वचालित फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके अधिग्रहित किया गया था। जैसा कि चित्रा 3 में दिखाया गया है, एमएपी 2-पॉजिटिव डेंड्राइट के साथ ड्रेब्रिन-पॉजिटिव डेंड्राइटिक स्पाइन स्पष्ट रूप से देखे जाते हैं। यह दिखाया गया है कि ग्लूटामेट उत्तेजना एनएमडीएआर के माध्यम से सीए2 + प्रवाह प्राप्त करती है, जो डेंड्राइटिक स्पाइन से ड्रेब्रिन पलायन का कारण बनती है जिसके परिणामस्वरूप ड्रेब्रिन क्लस्टर घनत्व 5,17 में कमी आती है। तदनुसार, हमने ग्लूटामेट उत्तेजना10 (चित्रा 4) के खिलाफ ड्रेब्रिन क्लस्टर घनत्व की खुराक-निर्भर कमी देखी। जैसा कि चित्रा 5 में दिखाया गया है, यह विधि अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है यदि ड्रेब्रिन का उपयोग सिनैप्टिक राज्यों के लिए मार्कर के रूप में किया जाता है।

Figure 1
चित्र 1: विधि की योजना। न्यूरॉन्स को 21 दिनों के लिए 96-वेल प्लेट में सुसंस्कृत किया गया था, और फिर ग्लूटामेट के साथ इलाज किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: 96-वेल प्लेट का उपयोग करके सुसंस्कृत न्यूरॉन्स की उज्ज्वल-क्षेत्र छवियां। चरण कंट्रास्ट छवियों को प्रत्येक विकास चरण (डीआईवी 1, 7, 14, 21) से एक कॉन्फोकल मात्रात्मक छवि साइटोमीटर का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। स्केल पट्टी: 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: इम्यूनोस्टेन्ड सुसंस्कृत न्यूरॉन्स की प्रतिनिधि छवियां। (बाएं) ड्रेब्रिन (हरा) और एमएपी 2 (लाल) की प्रतिदीप्ति छवियों का विलय। ड्रेब्रिन और एमएपी 2 की प्रत्येक प्रतिदीप्ति छवि क्रमशः मध्य और दाएं पैनलों में दिखाई दी। सफेद आयताकार नीचे दिए गए क्षेत्र को दिखाते हैं। स्केल बार; ऊपरी पैनल: 50 μm, निचले पैनल: 20 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: सामान्यीकृत ड्रेब्रिन क्लस्टर घनत्व में ग्लूटामेट-निर्भर खुराक-प्रतिक्रिया परिवर्तन। (A) प्रतिनिधि फ्लोरेसेंस छवियां कुएं से ड्रेब्रिन (हरा) और एमएपी 2 (लाल) का उपयोग करके इम्यूनोस्टेन्ड होती हैं, जिसका इलाज 0 μM, 10 μM, और 100 μM ग्लूटामेट (बाएं से दाएं) के साथ किया जाता है। स्केल बार: 50 μm. (B) ड्रेब्रिन क्लस्टर घनत्व को नियंत्रण के औसत (0 μM) द्वारा सामान्यीकृत किया गया था। 0 μM, N = 58 कुएं; 1 μM, N = 46; 3 μM, N = 54; 10 μM, N = 45; 30 μM, N = 54; 100 μM, N = 55, विभिन्न लॉट का उपयोग करके 13 प्रयोगों से। ** एनोवा के बाद डनेट के कई तुलना परीक्षण द्वारा पी < 0.01 बनाम नियंत्रण (0 μM)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: ड्रेब्रिन क्लस्टर घनत्व में ग्लूटामेट-निर्भर खुराक-प्रतिक्रिया परिवर्तन। विभिन्न लॉट का उपयोग करके छह प्रयोगों से कच्चा डेटा। प्रत्येक सांद्रता के लिए N = 4 कुएं (0 μM, 3 μM, 10 μM, 30 μM, और 100 μM)। मान SEM ± माध्य के रूप में व्यक्त किए जाते हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्रयोगों के लिए न्यूरॉन्स के जमे हुए स्टॉक का अनुप्रयोग। (ए) माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणी (एमईए) प्लेटों का उपयोग करके इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्रयोगों के लिए एक प्रोटोकॉल। कोटिंग: कोशिकाओं को चढ़ाने से एक दिन पहले, प्रत्येक 48-वेल एमईए प्लेट को पॉलीथीनिमाइन (पीईआई: 0.1%) समाधान के साथ पूर्व-लेपित किया गया था और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया था। एमईए प्लेट को तब निष्फल पानी के साथ 3 गुना धोया गया और 1 घंटे के लिए सुखाया गया। फिर, एमईए प्लेट को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया था। उच्च घनत्व संस्कृति: न्यूरॉन्स के 50,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से 48-अच्छी एमईए प्लेटों पर चढ़ाया गया था। सेल सीडिंग चरण ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल के खंड 2 में वर्णित के रूप में किया गया था। न्यूरॉन्स को प्लेट करने के लिए लैमिनिन (20 μg / mL) ने संस्कृति माध्यम जोड़ा (2 v / v% B-27, 2.5 mM ग्लूटामैक्स, और 100 μg / mL पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के 100 μg / mL को न्यूरोबेसल माध्यम में जोड़ें)। इसके बाद, न्यूरॉन्स को संस्कृति माध्यम में 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर सुसंस्कृत किया गया था। DIV 1 पर DIV 3 तक संस्कृति माध्यम के साथ मीडिया का पूरी तरह से आदान-प्रदान किया गया था। आरा-सी को DIV 4 (अंतिम 0.2 μM) में जोड़ा गया था। DIV 5 से और सप्ताह में 2 बार, 50% मीडिया को संस्कृति माध्यम के साथ बदल दिया गया था। एमईए प्लेट के प्रत्येक कुएं पर न्यूरॉन्स की गतिविधि को एमईए प्रणाली के साथ दर्ज किया गया था। (बी) डीआईवी21 पर 12.5 kHz/चैनल की नमूना दर पर एमईए प्रणाली का उपयोग करके 5% CO2 वातावरण के तहत 37 °C पर सहज न्यूरोनल गतिविधि का अधिग्रहण किया गया था। एक कुएं के भीतर 16 चैनलों में से 4 चैनलों की रिकॉर्डिंग दिखाई जाती है। सभी रिकॉर्डिंग के लिए, एक बटरवर्थ बैंड-पास फ़िल्टर (200-3,000 हर्ट्ज) लागू किया गया था। एरोहेड सिंक्रनाइज़ बर्स्ट फायरिंग के समय को दिखाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

इस विधि में एक महत्वपूर्ण कदम सेल निलंबन को पिघलाना है। बहुत गर्म होने से पहले सेल निलंबन का स्थानांतरण बहुत महत्वपूर्ण है। ऑस्मोलैलिटी के तेजी से परिवर्तन से बचने के लिए, हालांकि, सेल निलंबन को एक बार में माध्यम की एक बड़ी मात्रा में स्थानांतरित न करें। आसमाटिक दबाव में अचानक परिवर्तन से बचने के लिए संस्कृति माध्यम का ड्रॉप-वाइज जोड़ भी महत्वपूर्ण है।

न्यूरॉन्स को अन्य संस्कृति वाहिकाओं में सुसंस्कृत किया जा सकता है: 24-अच्छी प्लेटें, 8-वेल कक्ष, 60 मिमी व्यंजन, या एमईडी जांच। उन मामलों में, हालांकि, अंतिम एकाग्रता और आरा-सी को जोड़ने के समय को समायोजित करने की आवश्यकता है। इसके अलावा, न्यूरॉन्स के घनत्व को विभिन्न प्रकार के प्रयोगों में अनुकूलित करने की आवश्यकता है। उदाहरण के लिए, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्रयोगों के लिए उच्च घनत्व वाली संस्कृति की आवश्यकता होती है, और उस स्थिति में, सप्ताह में दो बार मीडिया विनिमय की आवश्यकता होती है (चित्रा 6)। इस प्रकार, कम घनत्व वाली संस्कृति को उच्च घनत्व वाली संस्कृति की तुलना में कम चरणों की आवश्यकता होती है।

कम घनत्व वाली न्यूरोनल संस्कृति को अक्सर अग्रिम तकनीकों की आवश्यकता होती है; हालांकि, रेडी-टू-यूज़ जमे हुए स्टॉक का उपयोग करने से यह समस्या हल हो जाती है। वर्णित विधि एक प्रयोगकर्ता के कौशल पर निर्भर नहीं करती है। जमे हुए स्टॉक की गुणवत्ता स्थिर है और जब तक वे तरल नाइट्रोजन में संग्रहीत होते हैं और 4 साल तक तापमान परिवर्तन से बचते हैं, तब तक स्थिर रूप से सुसंस्कृत किया जा सकता है।

मध्यम विनिमय के बिना 3 सप्ताह के लिए कोशिकाओं का संवर्धन करना यह सवाल उठाता है कि क्या महत्वपूर्ण ऑस्मोलैलिटी परिवर्तन या संस्कृति मीडिया वाष्पीकरण हैं। हालांकि, हमने पुष्टि की है कि संस्कृति मीडिया वाष्पीकरण छोटा है (3.6% की कमी दर)। सिनैप्टिक प्रोटीन का स्थानीयकरण और न्यूरॉन्स की आकृति विज्ञान 3 सप्ताह के बाद सामान्य दिखाई देते हैं। इसलिए, मीडिया विनिमय के बिना 3 सप्ताह की संस्कृति सुसंस्कृत न्यूरॉन्स की स्थितियों को प्रभावित करने वाले बड़े ऑस्मोलैलिटी परिवर्तनों का कारण नहीं बनती है। आरा-सी उपचार के बाद प्लेट को इनक्यूबेटर में रखना भी एक महत्वपूर्ण बिंदु है जो वाष्पीकरण को कम करता है।

जमे हुए स्टॉक न्यूरॉन्स के उपयोग के बारे में कोई सीमा नहीं है। हालांकि, कम घनत्व वाली संस्कृति विधि की कुछ सीमाएं हैं। हमने पुष्टि की कि कम घनत्व वाली संस्कृति को न्यूरॉन्स के रूपात्मक अवलोकन, सिनैप्टिक फ़ंक्शन के मूल्यांकन और जीएफपी अभिकर्मक के लिए लागू किया जा सकता है। हालांकि, हमने लाइव सेल इमेजिंग की जांच नहीं की है। इसके अलावा, जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी करने के लिए उच्च घनत्व संस्कृति की आवश्यकता होती है।

सिनैप्स परिपक्वता में आमतौर पर 3 सप्ताह7 लगते हैं, और हम यह पुष्टि नहीं कर सकते हैं कि सुसंस्कृत न्यूरॉन्स में अंत तक उचित सिनैप्स होते हैं। यदि 3 सप्ताह के बाद सिनैप्स परिपक्वता अच्छी नहीं है, तो हमें फिर से संस्कृति करनी होगी। प्रयोगशुरू करने से पहले न्यूरॉन्स की गुणवत्ता जानकर, हम इन 3 हफ्तों को बचा सकते हैं। इसलिए, प्रयोगों को कुशलतापूर्वक करने के लिए, पहले से न्यूरॉन्स की गुणवत्ता की जांच करना सबसे अच्छा है। जमे हुए स्टॉक पहले से न्यूरॉन्स की गुणवत्ता की जांच करना संभव बनाते हैं। जमे हुए स्टॉक का प्रत्येक बैच चूहों के एक कूड़े से उत्पन्न होता है, और हम गुणवत्ता की जांच के लिए प्रत्येक बैच से स्टॉक में से एक का उपयोग कर सकते हैं। ड्रेब्रिन न्यूरॉन्स की गुणवत्ता की जांच के लिए एक अच्छा मार्कर है। जैसा कि वर्णित है, ड्रेब्रिन परिपक्व न्यूरॉन्स में रीढ़ के सिर में जमा होता है, और यह सिनैप्टिक उत्तेजना पर प्रतिक्रिया करता है। इस प्रकार, हम मार्कर के रूप में ड्रेब्रिन का उपयोग करके जमे हुए स्टॉक में न्यूरॉन्स की गुणवत्ता की जांच कर सकते हैं।

इस विधि को सिनैप्टिक अवस्था पर दवाओं के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए लागू किया जा सकता है। डेंड्राइटिक स्पाइन से ड्रेब्रिन पलायन सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी22 के प्रारंभिक चरणों के दौरान होता है। इसलिए, दवा उपचार द्वारा प्राप्त ड्रेब्रिन क्लस्टर कमी का पता लगाने से पता चलता है कि दवा सिनैप्स को उत्तेजित करती है और सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी का कारण बनती है। इसके अलावा, यह पहचानने के लिए कि क्या कमी एनएमडीएआर निर्भर है, 2-एमिनो-5-फॉस्फोनोवेलेरिक एसिड (एपीवी, एक एनएमडीएआर विरोधी) का उपयोग करके एक प्रयोग उपयोगी है। मार्कर के रूप में ड्रेब्रिन का उपयोग करते हुए, यहां तक कि एनएमडीएआर-निर्भरता स्पष्ट रूप से10,15 निर्धारित की जाती है। वर्णित विधि दवा स्क्रीनिंग, सुरक्षा औषधीय अध्ययन और सिनैप्टिक फ़ंक्शन के मूल्यांकन में उपयोगी है।

Disclosures

तोमोकी शिराव अल्ज़मेड, इंक के सीईओ हैं। अध्ययन को AlzMed, Inc. (500,000 JPY से NK को "सिनैप्टिक फ़ंक्शन के उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण" नामक परियोजना के लिए वित्त पोषित किया गया था)।

Acknowledgments

हम प्रयोगों के साथ सहायता के लिए कज़ुमी कामियामा और मनमी कवाडा को धन्यवाद देते हैं। इस कार्य को JSPS KAKENHI (अनुदान संख्या 19K08010 से N.K.) और जापान एजेंसी फॉर मेडिकल रिसर्च एंड डेवलपमेंट (AMED) (अनुदान संख्या JP19bk0104077 और JP22bm0804024 को T.S.) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well plate Zeon Corporation Gifted
96 well plate greiner 655986
Anti-drebrin antibody (M2F6) MBL D029-3 Mouse monoclonal (dilution 1:1)
Anti-MAP2 antibody Millipore AB5622 Rabbit  (dilution 1:1000)
Anti-mouse Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A11031 Dilution 1: 500
Anti-rabbit Alexa Fluor  Thermo Fisher Scientific A11008 Dilution 1: 500
B-27 Gibco 17504-044 2 v/v% for MEA plates; 50x for normal plates
Borax Sigma B-9876 Final concentration 12 mM
Boric acid WAKO 021-02195 Final concentration 50 mM
Bovine serum albumin Millipore 12659-100G Final concentration: 3% in PBS
Confocal quantitative image cytometer
CellVoyager CQ1		 YOKOGAWA Phase contrast images
Cytosine β-D-arabino-furanoside (Ara-C) Sigma C-6645 Diluted in dH2O (final concentration: 0.2 µM)
DAPI FUJIFILM 340-07971 Dilution 1:1000
GlutaMAX Gibco 35050-061  2.5 mM for MEA plates; 400x for normal plates
In Cell Analyzer 2200 Cytiva Fluorescence images
Laminin Sigma 114956-81-9 Final concentration: 20 µg/mL
Maestro Axion Biosystems MEA recordings
MEA plate Axion Biosystems M768-tMEA-48W
Neurobasal Gibco 21103-049
Paraformaldehyde nacalai tesque 26126-25 Final concentration: 4% in PBS
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122  100 U/mL for normal plates
Penicillin/Streptomycin nacalai tesque 26253-84 100 µg/mL for MEA plates
polyethyleimine Sigma 9002-98-6 Final concentration: 0.1%
Poly-L-lysine Sigma P2636 Diluted in the borate buffer (final concentration: 1 mg/mL)
SKY Neuron AlzMed , Inc. ARH001 1.0 x 106 cells/tube
Sodium azide FUJIFILM 195-11092 0.1%
SodiumL(+)-Glutamate monohydrate WAKO 194-02032 Diluted in dH2O (final concentrations: 1 µM, 3 µM, 10 µM, 30 µM, 100 µM)

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 191
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Koganezawa, N., Roppongi, R. T., Sekino, Y., Tsutsui, I., Higa, A., Shirao, T. Easy and Reproducible Low-Density Primary Culture using Frozen Stock of Embryonic Hippocampal Neurons. J. Vis. Exp. (191), e64872, doi:10.3791/64872 (2023).

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