Summary
En klar til bruk frossen bestand av nevroner er et kraftig verktøy for å evaluere synaptiske funksjoner. Her introduserer vi en enkel primærkultur med lav tetthet fra frossen bestand ved hjelp av en 96-brønnsplate.
Abstract
Neuronal kultur er et verdifullt system for evaluering av synaptiske funksjoner og legemiddelundersøkelser. Spesielt tillater en lavtetthetskultur av primære hippocampus-nevroner studiet av individuelle nevroner eller subcellulære komponenter. Vi har vist subcellulær proteinlokalisering i et nevron ved immunocytokjemi, nevronpolaritet, synaptisk morfologi og dens utviklingsendring ved bruk av en primær hippocampuskultur med lav tetthet. Nylig har klare frosne lagre av nevroner blitt kommersielt tilgjengelige. Disse frosne bestandene av nevroner reduserer tiden som trengs for å forberede dyreforsøk og bidrar også til reduksjon av antall dyr som brukes. Her introduserer vi en reproduserbar primærkulturmetode med lav tetthet ved bruk av en 96-brønnsplate. Vi brukte en kommersielt tilgjengelig frossen bestand av nevroner fra rotteembryonale hippocampus. Nevronene kan dyrkes stabilt på lang sikt uten medieendringer ved å redusere veksten av gliaceller på bestemte tidspunkter. Denne analysen med høy gjennomstrømning ved bruk av kultur med lav tetthet tillater reproduserbare bildebaserte evalueringer av synaptisk plastisitet.
Introduction
Utviklingen av et in vitro eksperimentelt system som kan vurdere synaptiske funksjoner involvert i læring og hukommelse er viktig. Neuronal kultur er et verdifullt system for evaluering av synaptiske funksjoner in vitro. Den neuronale kulturteknikken ble først brukt på 1980-tallet, og på 1990-tallet ble lavdensitetskultur av primære hippocampus-nevroner utviklet 1,2,3 for studiet av individuelle nevroner når det gjelder subcellulær lokalisering av proteinkomponenter, proteinhandel, nevronpolaritet, ryggradsmorfologi, synapseutvikling og plastisitet 4,5,6,7,8 . Imidlertid er det mange trinn involvert i denne teknikken: parring av dyr, dissekering av embryoer, forberedelse av kulturbeholdere og dyrking av celler i 3 uker med medieendringer en gang i uken. I tillegg krever det forhåndsteknikker3.
Vi har utviklet frosne bestander av dissosierte hippocampus-nevroner fra rotteembryoer 9,10. De frosne lagrene av nevroner er klare til bruk, og det kreves ingen forhåndsteknikker for å dyrke cellene11,12. Med andre ord, dyrking av nevronene fra frosne bestander er ikke avhengig av teknikken til en eksperimentator. Det eliminerer behovet for dyreforsøk (f.eks. tillatelse til dyreforsøk, arrangering av tidsbestemte drektige dyr og dissekering av rotteembryoer), og reduserer dermed antall dyr som brukes. Nylig har frosne lagre av nevroner av høy kvalitet blitt kommersielt tilgjengelige. Her brukte vi kommersielt tilgjengelige frosne bestander fra embryonale dag (E) 18 rotte hippocampus13,14,15. Dyrking av nevronene fra en frossen bestand krever ikke gliabetingede medier eller samkultur med gliaceller. Vanlige primærkulturmedier uten ekstra serum kan brukes til å dyrke cellene; Derfor kan vi skaffe reproduserbare data. Videre er det ikke behov for medieutveksling i 3 uker etter cellesåingen, da veksten av gliaceller er redusert (figur 1).
Dendritiske pigger er det postsynaptiske rommet til de fleste eksitatoriske synapser. De inneholder reseptorproteiner, postsynaptiske stillasproteiner og aktincytoskeletale proteiner. Vi fokuserte på et aktinbindende protein drebrin 5,6,7,16,17,18. Drebrin akkumuleres ved ryggradshodet i modne nevroner19, og vi rapporterte drebrin som markør for synaptisk tilstand 15,17,20,21,22,23. Ved å gjennomføre en analyse med høyt innhold ved bruk av drebrin som avlesning, har vi nylig rapportert de hemmende effektene av fensyklidinanaloger på N-metyl-D-asparaginsyre-type glutamatreseptorer (NMDARs)10 og de NMDAR-avhengige effektene av naturlige forbindelser og rå stoffer på synaptiske tilstander15.
Her beskriver vi hvordan man dyrker frosne bestander av nevroner ved lav tetthet. I tillegg viser vi en drebrin imaging-basert evaluering av synaptisk tilstand ved hjelp av 96-brønnplater.
Protocol
1. Plate belegg
- Belegg en 96-brønns mikroplate med poly-L-lysin (1 mg/ml, fortynnet i 0,1 M boratbuffer [pH: 8,5]; 100 μL/brønn) og inkuber over natten ved 37 °C.
MERK: Belegg bare brønnene som skal brukes. I forsøkene som utføres her, brukes de midterste 60 brønnene. Boratbufferen fremstilles ved å blande 50 mM borsyre og 12 mM borat i sterilisert vann. - Vask platen to ganger med sterilisert vann (250 μL/brønn).
- Vask tallerkenen én gang med friskt dyrkningsmedium uten tilskudd (250 μL/brønn).
- Tørk platen på en ren benk i 20 min.
- Pakk platen inn med aluminiumsfolie og oppbevar den ved 4 °C til bruk (gyldig i 1 måned).
2. Celle såing
- Tilsett 50 μL / brønn av kulturmediet til den belagte platen og hold den i en 37 ° C, 5% CO2 -inkubator i 30 minutter til 1 time. Fyll de perifere brønnene med sterilisert vann (200 μL / brønn).
MERK: Kulturmediet fremstilles ved å tilsette 50x B-27, 400x Glutamax og 100 U / ml penicillin / streptomycin til det neurobasale mediet (se materialfortegnelsen for detaljer). - Fjern nevronkryovialet fra tanken med flytende nitrogen. Nevronene som ble brukt her var DMSO-kryopreserverte nevroner11.
- Dypp kryovialet i en varmeblokk på 37 °C i opptil 3 minutter og tine innholdet delvis. Ikke varm opp cryovial for lenge. Overfør innholdet til et 50 ml rør så snart det er tint.
- Overfør sakte nevronkryovialinnholdet til et sterilt 50 ml rør dråpevis (50 μL/s) ved hjelp av en 1 ml pipette med en bred porespiss.
- Skyll den tomme kryovialen med 1 ml av kulturmediet (romtemperatur; RT). Overfør disse 1 ml av dyrkningsmediet fra kryovialet dråpevis (50 μL/s) til 50 ml røret som inneholder cellesuspensjonen.
- Tilsett 9 ml av kulturmediet (RT) til 50 ml røret dråpevis (0,5 ml / s) og utgjør volumet til 11 ml. Ikke gjenta pipetteringen, men bland cellesuspensjonen langsomt.
- Telle cellenummeret (bruk en celleteller eller et hemocytometer).
- Overfør all cellesuspensjonen til et reservoar og dispenser cellesuspensjonen til 96-brønnsplaten ved hjelp av en flerkanalspipett med brede porespisser (1,0 x 104 celler/brønn). For å redusere fordampningen av kulturmediet, fyll de perifere brønnene med sterilisert vann (trinn 2.1).
MERK: Denne studien bekrefter at kulturmediumfordampningen er liten for en 3-ukers kultur uten middels utveksling. Reduksjonsraten for mediet er 3,6% (n = 120 brønner). Dermed vil osmolalitetsendringen ikke være drastisk i løpet av 3-ukers inkubasjonsperioden. - Inkuber nevronene i 1-2 timer i en 37 ° C, 5% CO2 -inkubator.
- Bytt ut kulturmediet med 100 μL forvarmet kulturmedium (37 °C) per brønn og sett det tilbake i en 37 °C, 5% CO2 -inkubator (ingen middels endring er nødvendig under kultur).
3. Ara-C behandling
- Etter 4 dager in vitro (DIV), tilsett cytosin β-D-arabino-furanosid (Ara-C) til en endelig konsentrasjon på 0,2 μM per brønn for å redusere veksten av gliaceller.
4. Narkotika behandlinger
- På 21 dager in vitro, behandle cellene med stoffene av interesse.
- Hold temperaturen på platen på 37 °C under legemiddelbehandling.
- For en positiv kontroll, behandle cellene med 100 μM glutamat (per brønn for endelig konsentrasjon) i 10 minutter før fiksering.
5. Fiksering
- For fiksering, bruk 4% paraformaldehyd i 0,1 M fosfatbuffer (100 μL / brønn).
- Etter ~20 min fiksering, vask brønnene med fosfatbufret saltvann (PBS; 250 μL / brønn) 2x i 5 min hver.
6. Immunocytokjemi
- Vask cellene med PBS (250 μL / brønn) 1x i 5 minutter.
- Permeabiliser cellene med 0,1% Triton X-100 (100 μL/brønn) i PBS i 5 minutter.
- Vask cellene med PBS (250 μL / brønn) 3x i 5 min hver.
- For blokkering, bruk 3% bovint serumalbumin i PBS (PBSA; 100 μL / brønn) i 1 time ved RT.
- Inkuber cellene med anti-drebrin (1:1) og anti-Microtubule Associated Protein 2 (MAP2) (1:000) antistoffer (60 μL/brønn) ved 4 °C over natten.
- Vask cellene med PBS (250 μL / brønn) 4x i 5 min hver.
- Inkuber cellene med passende sekundære antistoffer og 4',6-diamidino-2-fenylindol, dihydroklorid (DAPI; 1:1000) i PBSA (60 μL / brønn) i 2 timer ved RT.
- Vask cellene med PBS (250 μL / brønn) 4x i 5 min hver.
- Oppbevar cellene i PBS inneholdende 0,1 % natriumazid (150 μL/brønn).
7. Bildeinnsamling og analyse
- For å skaffe bildene, bruk et passende mikroskop.
- For å identifisere cellekroppene til nevroner, bruk både MAP2-positive og DAPI-positive regioner.
- For å identifisere dendritter av nevroner, bruk MAP2-positive signaler uten cellelegemer.
- For å identifisere drebrin-klynger, bruk drebrin-positive signaler langs MAP2-positive dendritter.
Representative Results
Etter protokollen ble nevronene dyrket i en 96-brønns plate i 21 dager, og deretter behandlet med glutamat (figur 1). Nevronene utviklet seg normalt uten bytte av dyrkningsmedium i 3 uker (figur 2). Vi behandlet cellene med flere konsentrasjoner av glutamat (1 μM, 3 μM, 10 μM, 30 μM og 100 μM fortynnet i sterilisert vann) i 10 minutter og fikserte dem. Immuncytokjemi ble utført, og fluorescensbilder av drebrin og MAP2 ble tatt med automatisert fluorescensmikroskop med sCMOS-kamera. Som vist i figur 3 observeres drebrinpositive dendrittiske pigger tydelig langs MAP2-positive dendritter. Det er vist at glutamatstimulering fremkaller Ca2+ tilstrømning gjennom NMDAR, noe som forårsaker drebrin exodus fra dendritiske pigger som resulterer i en reduksjon av drebrin cluster tettheter 5,17. Følgelig observerte vi den doseavhengige reduksjonen av drebrinklasetettheter mot glutamatstimulering10 (figur 4). Som vist i figur 5 er denne metoden sterkt reproduserbar hvis drebrin brukes som markør for synaptiske tilstander.
Figur 1: Skjema for metoden. Nevronene ble dyrket i en 96-brønns plate i 21 dager, og deretter behandlet med glutamat. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Lysfeltbilder av dyrkede nevroner ved hjelp av en 96-brønnsplate. Fasekontrastbilder ble tatt fra hvert utviklingsstadium (DIV 1, 7, 14, 21) ved bruk av et konfokalt kvantitativt bildecytometer. Skala bar: 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative bilder av immunfargede dyrkede nevroner. (Venstre) Sammenslåtte fluorescensbilder av drebrin (grønn) og MAP2 (rød). Hvert fluorescensbilde av drebrin og MAP2 viste i henholdsvis midtre og høyre panel. Hvite rektangler viser området forstørret nedenfor. Skala barer; Øvre paneler: 50 μm, nedre paneler: 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Glutamatavhengige dose-respons endringer i normalisert drebrin cluster density. (A) Representative fluorescensbilder immunfarget med drebrin (grønn) og MAP2 (rød) fra brønnen som behandles med 0 μM, 10 μM og 100 μM glutamat (fra venstre mot høyre). Skala bar: 50 μm. (B) Drebrin cluster tetthet ble normalisert ved gjennomsnittet av kontroll (0 μM). 0 μM, N = 58 brønner; 1 μM, N = 46; 3 μM, N = 54; 10 μM, N = 45; 30 μM, N = 54; 100 μM, N = 55, fra 13 eksperimenter med forskjellige partier. ** P < 0,01 versus kontroll (0 μM) av Dunnetts multiple sammenligningstest etter ANOVA. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Glutamatavhengige dose-respons endringer i drebrin cluster density. Rådataene fra seks eksperimenter med forskjellige partier. N = 4 brønner for hver konsentrasjon (0 μM, 3 μM, 10 μM, 30 μM og 100 μM). Verdier uttrykkes som gjennomsnitt ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Anvendelse av de frosne bestandene av nevroner til elektrofysiologiske eksperimenter. (A) En protokoll for elektrofysiologiske eksperimenter ved bruk av mikroelektrode-array (MEA) plater. Belegg: En dag før plating av cellene ble hver 48-brønns MEA-plate forhåndsbelagt med en polyetylenimin (PEI: 0,1%) løsning og inkubert i 1 time ved 37 ° C. MEA-platen ble deretter vasket 3x med sterilisert vann og tørket i 1 time. Deretter ble MEA-platen holdt på 4 °C over natten. Høy tetthetskultur: 50.000 celler / brønn av nevronene ble belagt på 48-brønns MEA-plater. Cellesåingstrinnet ble utført som beskrevet i avsnitt 2 i den ovenfor beskrevne protokollen. Laminin (20 μg/ml) tilsatt kulturmedium (tilsett 2 v/v% B-27, 2,5 mM glutamax og 100 μg/ml penicillin/streptomycin til det nevrobasale medium) ble brukt til å plate nevronene. Deretter ble nevronene dyrket ved 37 °C, 5% CO2 i kulturmediet. Mediene ble utvekslet fullt ut på DIV 1 med kulturmediet frem til DIV 3. Ara-C ble tilsatt ved DIV 4 (endelig 0,2 μM). Fra DIV 5 og utover og 2 ganger i uken ble 50% av mediene endret med kulturmediet. Aktiviteten til nevronene på hver brønn på MEA-platen ble registrert med et MEA-system. (B) Spontan nevronaktivitet ble oppnådd ved 37 °C under en 5 % CO2 atmosfære ved bruk av et MEA-system med en samplingsfrekvens på 12,5 kHz/kanal ved DIV 21. Opptak fra 4 kanaler av de 16 kanalene i en brønn vises. For alle opptakene ble det brukt et Butterworth-båndpassfilter (200-3000 Hz). Pilspisser viser tidspunktet for synkronisert utløsing. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Et kritisk skritt i denne metoden er å tine cellesuspensjonen. Overføring av cellesuspensjonen før den blir for varm er svært viktig. For å unngå rask endring av osmolalitet må du imidlertid ikke overføre cellesuspensjonen til et stort volum av mediet samtidig. Dråpevis tilsetning av kulturmediet er også avgjørende for å unngå plutselige endringer i osmotisk trykk.
Nevronene kan dyrkes i andre kulturkar: 24-brønnsplater, 8-brønnskamre, 60 mm retter eller MED-sonder. I slike tilfeller må imidlertid den endelige konsentrasjonen og tidspunktet for tilsetning av Ara-C justeres. I tillegg må tettheten av nevroner optimaliseres i forskjellige typer eksperimenter. For eksempel kreves kultur med høy tetthet for elektrofysiologiske eksperimenter, og i så fall er medieutvekslingen nødvendig to ganger i uken (figur 6). Dermed krever en kultur med lav tetthet færre trinn enn en kultur med høy tetthet.
Neuronkultur med lav tetthet krever ofte forhåndsteknikker; Bruk av bruksklar frossen lager løser imidlertid dette problemet. Den beskrevne metoden er ikke avhengig av en eksperimenters ferdighet. Kvaliteten på frossen bestand er stabil og kan dyrkes stabilt så lenge de lagres i flytende nitrogen og unngår temperaturendringer i opptil 4 år.
Dyrking av cellene i 3 uker uten middels utveksling reiser spørsmålet om det er signifikante osmolalitetsendringer eller kulturmediefordampning. Vi har imidlertid bekreftet at fordampningen av kulturmediet er liten (reduksjonsgrad på 3,6%). Lokaliseringen av synaptiske proteiner og nevronens morfologi virker normal etter 3 uker. Derfor forårsaker 3-ukers kultur uten medieutveksling ikke store osmolalitetsendringer som påvirker forholdene til de dyrkede nevronene. Å holde platen i en inkubator etter Ara-C-behandling er også et viktig punkt som minimerer fordampning.
Det er ingen begrensning med hensyn til bruken av de frosne stamnevronene. Det er imidlertid noen begrensninger ved kulturmetoden med lav tetthet. Vi bekreftet at lavdensitetskulturen kunne brukes til morfologisk observasjon av nevroner, evaluering av synaptisk funksjon og GFP-transfeksjon. Vi har imidlertid ikke undersøkt levende celleavbildning. I tillegg, som nevnt ovenfor, er det nødvendig med høy tetthetskultur for å utføre elektrofysiologi.
Synapsemodning tar vanligvis 3 uker7, og vi kan ikke bekrefte at de dyrkede nevronene har riktige synapser til slutten. Hvis synapsemodningen ikke er god etter 3 uker, må vi dyrke igjen. Ved å vite kvaliteten på nevronene før vi starter forsøkene, kan vi spare disse 3 ukene. Derfor, for å utføre eksperimenter effektivt, er det best å sjekke kvaliteten på nevronene på forhånd. Frosne lagre gjør det mulig å sjekke kvaliteten på nevronene på forhånd. Hvert parti med fryste bestander genereres fra ett kull rotter, og vi kan bruke en av bestandene fra hver batch til en kvalitetskontroll. Drebrin er en god markør for kvalitetskontroll av nevronene. Som beskrevet akkumuleres drebrin i ryggraden i modne nevroner, og det reagerer på synaptisk stimulering. Dermed kan vi sjekke kvaliteten på nevronene i frosne lagre ved å bruke drebrin som markør.
Denne metoden kan brukes til å evaluere effekten av legemidler på synaptisk tilstand. Drebrin exodus fra dendritiske pigger forekommer i begynnelsen av synaptisk plastisitet22. Derfor viser påvisning av drebrin-klyngereduksjon fremkalt ved medikamentell behandling at stoffet stimulerer synapsen og forårsaker synaptisk plastisitet. Videre, for å identifisere om reduksjonen er NMDAR-avhengig, er et eksperiment med 2-amino-5-fosfonovalersyre (APV, en NMDAR-antagonist) nyttig. Ved å bruke drebrin som markør, er selv en NMDAR-avhengighet klart bestemt10,15. Den beskrevne metoden er nyttig i legemiddelundersøkelser, sikkerhetsfarmakologiske studier og evaluering av synaptisk funksjon.
Disclosures
Tomoaki Shirao er administrerende direktør i AlzMed, Inc. Studien ble finansiert av AlzMed, Inc. (500 000 JPY til NK for prosjektet "High-throughput analysis of synaptic function").
Acknowledgments
Vi takker Kazumi Kamiyama og Manami Kawada for hjelp med eksperimenter. Dette arbeidet ble støttet av JSPS KAKENHI (Grant Number 19K08010 to N.K.) og Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) (Grant Number JP19bk0104077 og JP22bm0804024 til T.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well plate | Zeon Corporation | Gifted | |
| 96 well plate | greiner | 655986 | |
| Anti-drebrin antibody (M2F6) | MBL | D029-3 | Mouse monoclonal (dilution 1:1) |
| Anti-MAP2 antibody | Millipore | AB5622 | Rabbit (dilution 1:1000) |
| Anti-mouse Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11031 | Dilution 1: 500 |
| Anti-rabbit Alexa Fluor | Thermo Fisher Scientific | A11008 | Dilution 1: 500 |
| B-27 | Gibco | 17504-044 | 2 v/v% for MEA plates; 50x for normal plates |
| Borax | Sigma | B-9876 | Final concentration 12 mM |
| Boric acid | WAKO | 021-02195 | Final concentration 50 mM |
| Bovine serum albumin | Millipore | 12659-100G | Final concentration: 3% in PBS |
| Confocal quantitative image cytometer CellVoyager CQ1 |
YOKOGAWA | Phase contrast images | |
| Cytosine β-D-arabino-furanoside (Ara-C) | Sigma | C-6645 | Diluted in dH2O (final concentration: 0.2 µM) |
| DAPI | FUJIFILM | 340-07971 | Dilution 1:1000 |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 2.5 mM for MEA plates; 400x for normal plates |
| In Cell Analyzer 2200 | Cytiva | Fluorescence images | |
| Laminin | Sigma | 114956-81-9 | Final concentration: 20 µg/mL |
| Maestro | Axion Biosystems | MEA recordings | |
| MEA plate | Axion Biosystems | M768-tMEA-48W | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| Paraformaldehyde | nacalai tesque | 26126-25 | Final concentration: 4% in PBS |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 U/mL for normal plates |
| Penicillin/Streptomycin | nacalai tesque | 26253-84 | 100 µg/mL for MEA plates |
| polyethyleimine | Sigma | 9002-98-6 | Final concentration: 0.1% |
| Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | Diluted in the borate buffer (final concentration: 1 mg/mL) |
| SKY Neuron | AlzMed , Inc. | ARH001 | 1.0 x 106 cells/tube |
| Sodium azide | FUJIFILM | 195-11092 | 0.1% |
| SodiumL(+)-Glutamate monohydrate | WAKO | 194-02032 | Diluted in dH2O (final concentrations: 1 µM, 3 µM, 10 µM, 30 µM, 100 µM) |
References
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Research. 126 (3), 397-342 (1977).
- Kaech, S., Banker, G.
- Roppongi, R. T., Champagne-Jorgensen, K. P., Siddiqui, T. J. Low-density primary hippocampal neuron culture. Journal of Visualized Experiments. (122), e55000 (2017).
- Mizui, T., et al. Drebrin E is involved in the regulation of axonal growth through actin-myosin interactions. Journal of Neurochemistry. 109 (2), 611-622 (2009).
- Mizui, T., et al. Myosin II ATPase activity mediates the long-term potentiation-induced exodus of stable F-actin bound by drebrin A from dendritic spines. PLoS One. 9 (1), 85367 (2014).
- Takahashi, H., Mizui, T., Shirao, T. Down-regulation of drebrin A expression suppresses synaptic targeting of NMDA receptors in developing hippocampal neurons. Journal of Neurochemistry. 97, 110-115 (2006).
- Takahashi, H., et al. Drebrin-dependent actin clustering in dendritic filopodia governs synaptic targeting of postsynaptic density-95 and dendritic spine morphogenesis. The Journal of Neuroscience. 23 (16), 6586-6595 (2003).
- Yamazaki, H., Sasagawa, Y., Yamamoto, H., Bito, H., Shirao, T. CaMKIIbeta is localized in dendritic spines as both drebrin-dependent and drebrin-independent pools. Journal of Neurochemistry. 146 (2), 145-159 (2018).
- Hanamura, K., et al. High-content imaging analysis for detecting the loss of drebrin clusters along dendrites in cultured hippocampal neurons. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 99, 106607 (2019).
- Mitsuoka, T., et al. Assessment of NMDA receptor inhibition of phencyclidine analogues using a high-throughput drebrin immunocytochemical assay. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 99, 106583 (2019).
- Ishizuka, Y., Bramham, C. R. A simple DMSO-based method for cryopreservation of primary hippocampal and cortical neurons. Journal of Neuroscience Methods. 333, 108578 (2020).
- Pischedda, F., et al. Cryopreservation of primary mouse neurons: The benefit of neurostore cryoprotective medium. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 81 (2018).
- Kobayashi, Y., et al. Impairment of ciliary dynamics in an APP knock-in mouse model of Alzheimer's disease. Biochemical and Biophysical Research Communications. 610, 85-91 (2022).
- Kobayashi, Y., et al. Properties of primary cilia in melanin-concentrating hormone receptor 1-bearing hippocampal neurons in vivo and in vitro. Neurochemistry International. 142, 104902 (2021).
- Koganezawa, N., et al. NMDA receptor-dependent and -independent effects of natural compounds and crude drugs on synaptic states as revealed by drebrin imaging analysis. The European Journal of Neuroscience. 53 (11), 3548-3560 (2021).
- Mizui, T., Takahashi, H., Sekino, Y., Shirao, T. Overexpression of drebrin A in immature neurons induces the accumulation of F-actin and PSD-95 into dendritic filopodia, and the formation of large abnormal protrusions. Molecular and Cellular Neurosciences. 30 (1), 149-157 (2005).
- Sekino, Y., et al. Activation of N-methyl-D-aspartate receptor induces a shift of drebrin distribution: disappearance from dendritic spines and appearance in dendritic shafts. Molecular and Cellular Neurosciences. 31 (3), 493-504 (2006).
- Takahashi, H., Yamazaki, H., Hanamura, K., Sekino, Y., Shirao, T. Activity of the AMPA receptor regulates drebrin stabilization in dendritic spine morphogenesis. Journal of Cell Science. 122, 1211-1219 (2009).
- Aoki, C., et al. Drebrin A is a postsynaptic protein that localizes in vivo to the submembranous surface of dendritic sites forming excitatory synapses. The Journal of Comparative Neurology. 483 (4), 383-402 (2005).
- Koganezawa, N., Hanamura, K., Sekino, Y., Shirao, T.
- Shirao, T., et al.
- Sekino, Y., Koganezawa, N., Mizui, T., Shirao, T.
- Togo, K., et al. Postsynaptic structure formation of human iPS cell-derived neurons takes longer than presynaptic formation during neural differentiation in vitro. Molecular Brain. 14 (1), 149 (2021).
