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Medicine

Rattenmodell der normothermischen Ex-situ-perfundierten heterotopen Herztransplantation

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/64954
Automatic Translation
*1,2,3, *2,3, 2,3, 2, 2,3, 4, 5, 3,6
1Department of Medical Science, Chonnam National University Graduate School, 2Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Chonnam National University Hospital and Medical School, 3Cardiovascular and Respiratory Research Team, Chonnam National University Hospital, 4Department of Internal Medicine, Chonnam National University Hospital and Medical School, 5Departments of Surgery, Chonnam National University Hospital and Medical School, 6Department of Pediatrics, Chonnam National University Children’s Hospital, and Medical School
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

In dieser Arbeit stellen wir ein Bewertungsprotokoll eines heterotopisch implantierten Herzens nach normothermer ex situ Konservierung im Rattenmodell vor.

Abstract

Die Herztransplantation ist die wirksamste Therapie bei Herzinsuffizienz im Endstadium. Trotz der Verbesserungen bei den therapeutischen Ansätzen und Interventionen nimmt die Zahl der Herzinsuffizienzpatienten, die auf eine Transplantation warten, weiter zu. Die normotherme Ex-situ-Konservierungstechnik hat sich als vergleichbare Methode zur konventionellen statischen Kühllagerungstechnik etabliert. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Spenderherzen bis zu 12 Stunden in physiologischem Zustand konserviert werden können. Darüber hinaus ermöglicht diese Technik die Wiederbelebung der Spenderherzen nach dem Kreislauftod und wendet die erforderlichen pharmakologischen Eingriffe an, um die Spenderfunktion nach der Implantation zu verbessern. Zahlreiche Tiermodelle wurden etabliert, um normotherme Ex-situ-Konservierungstechniken zu verbessern und konservierungsbedingte Komplikationen zu beseitigen. Obwohl große Tiermodelle im Vergleich zu Kleintiermodellen einfach zu handhaben sind, ist es kostspielig und herausfordernd. Wir präsentieren ein Rattenmodell der normothermen ex situ Spenderherzkonservierung gefolgt von einer heterotopen abdominalen Transplantation. Dieses Modell ist relativ billig und kann von einem einzigen Experimentator durchgeführt werden.

Introduction

Die Herztransplantation ist nach wie vor die einzige praktikable Therapie bei refraktärer Herzinsuffizienz 1,2,3,4. Trotz eines stetigen Anstiegs der Zahl der Patienten, die eine Herztransplantation benötigen, wurde kein proportionaler Anstieg der Verfügbarkeit von Spenderorganen beobachtet5. Um dieses Problem anzugehen, wurden neuartige Ansätze zur Konservierung von Spenderherzen entwickelt, mit dem Ziel, die Herausforderungen zu verbessern und die Verfügbarkeit von Spendern zu erhöhen 6,7,8,9.

Die normothermische Ex-situ-Herzperfusion (NESHP) mit Geräten des Organversorgungssystems (OCS) hat sich als klinische Intervention herauskristallisiert 1,3. Diese Technik wurde als geeignete Alternative zur herkömmlichen statischen Kühllagermethode (SCS) erachtet 2,9. NESHP verkürzt effektiv die Dauer der Kälteischämie, verringert den Stoffwechselbedarf und ermöglicht eine optimale Nährstoffversorgung und Sauerstoffversorgung während des Transports von Spenderorganen10,11. Trotz des eindeutigen Potenzials dieser Methode, die Konservierung von Spenderorganen zu verbessern, wurden ihre klinische Anwendung und weitere Untersuchungen durch hohe Kosten eingeschränkt. Daher sind präklinische Tiermodelle der NESHP von entscheidender Bedeutung, um die wichtigsten technischen Herausforderungen im Zusammenhang mit dieser Technik zu identifizieren12,13. Schweine und Ratten sind aufgrund ihrer ischämischen Toleranz die bevorzugten Tiermodelle für präklinische Studien9. Obwohl das Schweinemodell ideal für die Grundlagen- und translationale Forschung ist, ist es durch seine hohen Kosten und den intensiven Arbeitsaufwand für Pflege und Wartung begrenzt. Im Gegensatz dazu sind Rattenmodelle kostengünstiger und einfacher zu handhaben14.

In dieser Studie stellen wir ein vereinfachtes Rattenmodell von NESHP vor, gefolgt von einer heterotopen Herztransplantation, um den Einfluss der Konservierungstechnik auf den Transplantatzustand nach der Implantation zu bewerten. Dieses Modell ist einfach, kostengünstig und kann von einem einzigen Experimentator ausgeführt werden. Abbildung 1 zeigt die schematische Darstellung des Verfahrens.

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Protocol

Die Ethikkommission des Versuchstierforschungszentrums des Nationalen Universitätskrankenhauses Chonnam (Zulassungs-Nr. CNU IACUC - H - 2022-36) genehmigte alle Tierversuche. Männliche Sprague-Dawley-Ratten (350-450 g), die in dieser Studie verwendet wurden, wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Pflege und Verwendung der Versuchstiere behandelt. Die Ratten wurden in temperaturkontrollierten Räumen mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus untergebracht, wobei Standardfutter und Wasser zur Verfügung standen.

1. Vorbereitung

HINWEIS: Ein einziger Versuchsleiter kann alle experimentellen Verfahren durchführen.

  1. Montieren Sie die Langendorff-Apparatur, einschließlich des Oxygenators, der Pumpe und der Perfusionsleitungen, vor der Operation (Abbildung 2). Füllen Sie den Perfusionskreislauf mit 20 ml Kochsalzlösung und lassen Sie ihn zirkulieren, bis er mit Eigenblut gefüllt ist.
    HINWEIS: Das Ziel dieses Schritts ist es, den extrakorporalen Kreislauf zu erwärmen.
  2. Befestigen Sie den kardioplegikerischen Zugang über den an der Aortenkanüle befestigten Absperrhahn und bereiten Sie die Spritzenpumpe für die abschließende kardioplegikerische Infusion vor.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Luftblasen aus dem Perfusionskreislauf und dem kardioplegischen Zugang entfernt werden.
  3. Platzieren Sie den Temperatursensor in dem Reservoir, in dem das Spenderherz aufbewahrt wird, und halten Sie die Temperatur des Kreislaufs bei 37 °C.
  4. Chirurgische Vorbereitungen
    1. Bereiten Sie für jede Spender- und Empfängerratte einen separaten Satz steriler Mikroinstrumente und Materialien vor.
      1. Bereiten Sie das chirurgische Set für den Spender vor: chirurgische Schere, Mikropinzette, scharfe Moskizzange, 5-0 Seidennähte, Wattestäbchen, 50-ml-Spritze, Perfusionsleitung für die kardioplegikerische Lösung (CPS), Spritzenpumpe, 18-G-Angiokatheter, ein Satz von 5 Fr. Femurkathetern und sterile Gaze.
      2. Bereiten Sie das chirurgische Set für den Empfänger vor: mikrochirurgische Schere, Wundretraktor, Mikropinzette, Moskizzange, vaskuläre Mikroklemmen, 1-ml-Spritze, ein 5-0- und 9-0-Polypropylen-Nahtmaterial, 5-0-Seidennähte, Wattestäbchen und sterile Gaze.

2. Konservierung und Blutentnahme des Spenderherzes

  1. Die Anästhesie bei der Spenderratte mit Isofluran (5%) in der Anästhesiekammer einleiten und das Gewicht der Ratte aufzeichnen, bevor sie auf den Operationstisch gelegt wird.
  2. Legen Sie die Ratte in Rückenlage auf den Operationstisch und verabreichen Sie eine kontinuierliche Anästhesie, indem Sie 2%-2,5% Isofluran mit 90% Sauerstoff durch eine Nasenspitze abgeben.
  3. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie die mangelnde Reaktion auf das Einklemmen der Zehen und die Atemfrequenz überprüfen, die zwischen 50 und 60 pro Minute liegen sollte.
    HINWEIS: Ein angemessenes Maß an Anästhesie ist entscheidend, um unnötigen Stress und Schmerzen für die Spenderratte zu vermeiden.
  4. Tragen Sie Augengleitmittel auf und rasieren Sie die Schambeinregion bis zum Schlüsselbein, wo die Operation durchgeführt wird. Reinigen Sie den Bereich mit einem Peeling auf Jodbasis und 70%igem Alkohol.
  5. Katheterisierung
    1. Machen Sie einen 7 cm langen Bauchschnitt in der Mittellinie und bilaterale Schnitte von 3 cm vom Processus xiphoideus bis zum mittleren Schlüsselbein. Entfernen Sie das Fell aus dem Brustbereich.
    2. Mobilisieren Sie mit Wattestäbchen die Bauchorgane auf der linken Seite des Bauches. Isolieren Sie die Bauchaorta von der retroperitonealen Faszie und dem Fettgewebe.
    3. Injizieren Sie 1.000 I.E. Heparin, gelöst in 0,3 ml isotonischer Kochsalzlösung, mit einer 1-ml-Spritze durch die untere Hohlvene (IVC). Stoppen Sie Blutungen aus dem Nadelloch, indem Sie es vorsichtig mit einem Wattestäbchen zusammendrücken.
      HINWEIS: Seien Sie vorsichtig mit einer Luftembolie während der Injektion, da dies zu einem Herzstillstand führen kann.
    4. Einführen eines 5 Fr. Femurkatheters in die Bauchschlagaorta (Abd. A). Stellen Sie sicher, dass die Katheterspitze den Aortenbogen erreicht. Bestätigen Sie die Katheterposition, indem Sie die ungefähre Länge des eingeführten Teils des Katheters bestimmen.
  6. Blutentnahme
    1. Entnehmen Sie etwa 10 ml Blut über den Katheter, der in den Abd. A eingeführt wird.
    2. Später wird das Priming-Blut mit isotonischer Kochsalzlösung verdünnt, bis das Gesamtvolumen 12 ml erreicht. Fügen Sie 5 mg Cefazolin in 0,3 ml Kochsalzlösung und Insulin (20 I.E.) hinzu.
  7. Herzstillstand
    1. Schließen Sie die zuvor vorbereitete CPS-Perfusionsleitung an den Bauchkatheter an und beginnen Sie die CPS-Verabreichung mit der Spritzenpumpe mit einer Rate von 800 ml/h.
    2. Öffnen Sie die Brusthöhle vom Zwerchfell aus und schneiden Sie die IVC in der Nähe des Zwerchfells durch, um eine ventrikuläre Dehnung zu verhindern. Schneiden Sie die Rippen beidseitig entlang der Brustwirbelsäule bis zum Brusteingang. Reflektieren Sie die mobilisierte ventrale Brustwand überlegen mit einer Mückenzange.
    3. Entfernen Sie den Thymus vollständig mit einer Mikropinzette, um den Aortenbogen sichtbar zu machen. Wenden Sie eine leichte Kompression an, wenn die Thymusarterien bluten.
  8. Extraktion
    1. Nach der Verabreichung des gesamten CPS ist der Aortenbogen vom umgebenden Gewebe zu isolieren. Sezieren Sie vorsichtig direkt unterhalb der linken Schlüsselbeinarterie.
    2. Durchtrennen Sie die Arteria brachiocephalica und die Arteria carotis communis communis an einer entfernten Position, wobei die längeren Stümpfe des Aortenbogens für eine einfache Handhabung während der Aortenkanülierung belassen werden. Durchtrennen Sie die Hauptschlagader der Pulmonalarterie (MPA) so nah wie möglich an der Bifurkation. Achten Sie darauf, das linke Vorhofohr nicht zu beschädigen.
    3. Die obere Hohlvene (SVC) und IVC werden vorsichtig mit 5-0-Seidennähten ligiert, um die Obstruktion des rechten Vorhofs (RA) und der Koronarsinus zu verhindern. Bedecken Sie den linken Rand des Thorax mit nasser Gaze, legen Sie das Herz darauf und ziehen Sie die SVC- und IVC-Ligaturen vorsichtig zurück, um das Hilum freizulegen.
    4. Ligatieren Sie die Vena pulmonalis und Azygos zusammen mit einer 5-0 Seidennaht. Durchtrennen Sie das Gewebe dorsal der Ligatur und extrahieren Sie das Herz. Untersuche das Herz auf Verletzungen. Zum Schluss wird das Herz vor der Aortenkanülierung gewogen.

3. Ex-situ-Perfusion

  1. Kanülierung und Perfusion der Aorta
    1. Ersetzen Sie vor der Kanülierung der Aorta den mit Kochsalzlösung behandelten Kreislauf durch eine Blutansaugung.
    2. Führen Sie die Aortenkanüle in den Aortenbogen ein und fixieren Sie sie mit einer provisorischen Mikroklemme. Stellen Sie sicher, dass die Spitze der Kanüle am brachiozephalen Übergang positioniert ist.
    3. Bestätigen Sie die korrekte Position der Kanüle, indem Sie die Aorta vorsichtig mit einer Mikropinzette greifen.
    4. Beginnen Sie die Perfusion mit einer Flussrate von 2-3 ml/min, so dass Perfusat aus der Kanülenstelle austreten kann, um alle Luftblasen zu entfernen.
    5. Überwachen Sie den Perfusionsdruck und die Temperatur über den Sensor, der an das Überwachungssystem angeschlossen ist.
    6. Massieren Sie das Herz sanft mit dem ersten Finger und dem Zeigefinger, bis venöses Blut aus der Hauptpulmonalarterie (MPA) austritt.
    7. Befestigen Sie die Aorta mit einer 1-0-Seidenligatur und entfernen Sie die Klemme nach Überprüfung aller Einstellungen (Perfusionskreislauf, Perfusionsdruck, Temperatur).
    8. Sobald die permanente Ligatur platziert ist, stellen Sie sicher, dass sich das Herz innerhalb weniger Sekunden zusammenzieht und innerhalb von 60 Sekunden einen normalen Rhythmus erreicht. Ein mittlerer Perfusionsdruck von 55-65 mmHg mit einer koronaren Flussrate von 3-4 mL bei 37 °C deutet auf eine ausreichende Perfusion hin.
    9. Sammeln Sie 0,15 ml Blut aus dem Reservoir und überprüfen Sie die Blutgasanalyse (BGA) zu Beginn der Perfusion und danach alle 20 Minuten. Überwachen und zeichnen Sie den pH-Wert, pCO2,pO2, Glukose, Hämatokrit, Kalium und Laktat während der Perfusion auf. Nach 120 Minuten Perfusion werden 3 ml Custodiol mit einer Geschwindigkeit von 250 ml/h durch die Spritzenpumpe verabreicht, um das Herz zum Stillstand zu bringen.

4. Implantation

  1. Vorbereitung des Empfängers
    1. Beginnen Sie mit der Präparation des Empfängers 30 Minuten vor Beendigung der Ex-situ-Perfusion .
    2. Betäuben Sie das Empfängertier mit der gleichen Methode wie in Schritt 2.2 beschrieben.
    3. Legen Sie die Ratte in Rückenlage auf das Heizkissen und führen Sie den Temperaturfühler in das Rektum ein, um die Körpertemperatur bei 37 °C zu halten.
    4. Tragen Sie Augengleitmittel auf, rasieren Sie die Schambeinfläche bis zum Magenbereich und reinigen Sie den Bereich mit einem Peeling auf Jodbasis und 70%igem Alkohol.
  2. Medikamente
    1. Injizieren Sie 2 ml warme Kochsalzlösung subkutan, um den Flüssigkeitsverlust während der Operation auszugleichen. Injizieren Sie 200 IE Heparin subkutan.
    2. Verabreichen Sie eine Antibiotikaprophylaxe durch Injektion von 10 mg/kg Cefazolin, gelöst in 0,3 ml Kochsalzlösung, subkutan oder intramuskulär.
    3. Verabreichen Sie Schmerzmittel, indem Sie 20 mg/kg Diclofenac subkutan injizieren.
  3. Führen Sie die Mittellinien-Laparotomie durch und führen Sie einen Retraktor ein, um die Bauchhöhle zu erweitern. Mobilisieren Sie die Bauchorgane auf der linken Seite des Empfängers mit Wattestäbchen, um Platz für den Eingriff zu schaffen.
  4. Beugen Sie einer Dehydrierung vor, indem Sie die Bauchorgane mit warmer und feuchter Gaze umwickeln. Verteilen Sie während der Operation zeitweise warme Kochsalzlösung mit einer 50-ml-Spritze.
  5. Mobilisieren Sie mit einem Operationsmikroskop mit 10-facher Vergrößerung den Zwölffingerdarm und das proximale Jejunum durch stumpfe Dissektion mit Wattestäbchen, um die Abd. A. und IVC freizulegen. Bereiten Sie die Abd. A und IVC für die Anastomose und die systematische Implantation des Spenderherzens gemäß Abbildung 3 oder zuvor dokumentierten Methoden15.
    HINWEIS: Trennen Sie die Abd. A. und IVC nicht.
    1. Unter der Annahme, dass die vaskuläre Anastomose infrarenal platziert wird, bereiten Sie einen ausreichenden Teil der Aorta und der IVC für die Klemmung vor.
    2. Führen Sie eine stumpfe Präparation mit Wattestäbchen oder einer scharf gezackten Pinzette durch, um die Fette und Faszien um die Gefäße herum zu entfernen.
    3. Platzieren Sie 5-0 Seidenligaturen an den Mesenterialästen und sowohl an der kranialen als auch an der kaudalen Seite der großen Gefäße. Heben Sie die Bauchgefäße an und koagulieren oder ligieren Sie die Lendenäste mit 5-0 Seidennähten. Denken Sie daran, die Hodenarterien und Venen zu schonen und nicht abzuklemmen.
    4. Verwenden Sie Ligaturen, um die Gefäße anzuheben, und positionieren Sie die Mikroklemmen an den Mesenterialästen, der kaudalen und kranialen Seite der großen Gefäße, um den Blutfluss an der Anastomosenstelle zu stoppen. Schalten Sie das Heizkissen aus, bevor Sie die Klemmen einsetzen, da übermäßiges Erhitzen die Ischämie der Gliedmaßen verschlimmern kann. Stellen Sie sicher, dass das Heizkissen nach dem Lösen der Gefäße eingeschaltet wird, um eine Unterkühlung zu vermeiden.
    5. Die Aorta wird mit einer 27-G-Nadel punktiert und der Schnitt mit einer Mikroschere auf eine Länge verlängert, die gleich oder etwas größer ist als die Öffnung der aufsteigenden Aorta des Spenders (Asc. A), das sind ca. 5 mm.
    6. Machen Sie einen Längsschnitt an der IVC auf die gleiche Weise wie bei der Aortotomie, aber machen Sie ihn 3 mm näher an der kaudalen Seite als an der Aorteninzision.
    7. Beginnen Sie mit der Anastomose, legen Sie das Spenderherz auf die rechte Seite des Bauches des Empfängers und befestigen Sie das Spender-Asc. A an die Abd. A mit einem einfachen unterbrochenen Stich (9-0 Polypropylen) an der Schädelecke des Längsschnitts.
    8. Bewegen Sie das Herz auf die linke Seite des Empfängerabdomens und führen Sie eine Anastomose des ASC des Spenders durch. A mit dem Abd. A mit einem laufenden 9-0 Polypropylen-Nahtmaterial.
    9. Fixieren Sie die Spenderpulmonalarterie mit zwei unterbrochenen Nähten (9-0 Polypropylen) an den kaudalen und kranialen Ecken des Längsschnitts an der IVC.
    10. Führen Sie die erste Hälfte der venösen Anastomose von der intraluminalen Seite des Gefäßes aus durch und vervollständigen Sie die zweite Hälfte von der extraluminalen Seite des Gefäßes. Bevor Sie die Knoten festziehen, spülen Sie das Feld mit Kochsalzlösung, um eine Luftembolie zu vermeiden.
  6. Entlüften und Entspannen
    1. Entfernen Sie die Mesenterialvenenklemme zuerst nach Abschluss der Anastomose, damit sich die rechte Seite des Herzens mit venösem Blut füllen kann.
    2. Entfernen Sie die Luft im Koronarkreislauf und Asc. A. durch Anwendung einer retrograden Koronarperfusion für mehrere Sekunden.
    3. Legen Sie ein Stück Gaze auf beide Seiten der Gefäße und entfernen Sie die kaudale Klemme und die Schädelklemme.
    4. Sanfte Kompression mit Wattestäbchen für 1-2 Min. auftragen. Nachdem Sie eine ausreichende Hämostase sichergestellt haben, entfernen Sie die Tupfer und waschen Sie die Anastomosen mit warmer Kochsalzlösung.
      HINWEIS: Das Herz sollte innerhalb der ersten Minute der Reperfusion zu schlagen beginnen. Liegt die Körpertemperatur der Empfängerratte unter 35 °C, normalisiert sich der Herzrhythmus, sobald die Temperatur 36 °C erreicht hat.
  7. Ersetzen Sie die Bauchorgane mäanderartig und verschließen Sie die Schichten des Bauchschnitts mit durchgehenden 5-0-Polypropylennähten.
  8. Nach der Operation wird das betäubte Tier auf eine saubere Stelle über einem Heizkissen gelegt, bis die Körpertemperatur 37 °C erreicht.
    HINWEIS: Beginnen Sie mit den postoperativen Untersuchungen erst, wenn die Körpertemperatur 37 °C erreicht hat. Halten Sie die Anästhesie bis zum Ende der Experimente bei 2-2,5% Isofluran aufrecht.
  9. Überwachen Sie das EKG des transplantierten Spenderherzens 3 Stunden lang. Dann wird das Herz unter tiefer Betäubung für histologische Untersuchungen herausgeschnitten.
    HINWEIS: Bestätigen Sie die Anästhesietiefe durch fehlenden Pedalreflex, bevor Sie das Herz entfernen. Der chirurgische Eingriff und die EKG-Überwachung dauern weniger als 6 h. Diclofenac, perioperativ verabreicht (Schritt 4.2.3.), ermöglicht eine Schmerztherapie über die gesamte Dauer dieses Eingriffs. Das Analgesie-Regime kann gemäß den institutionellen Richtlinien für die Verwendung von Tieren angepasst werden.

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Representative Results

Abbildung 1 zeigt den Versuchsaufbau in einem Kleintiermodell. Abbildung 2 zeigt die modifizierte Langendorff-Perfusionsapparatur, die einen Kleintier-Oxygenator enthält. Die Reihenfolge der Anastomose bei der heterotopen abdominalen Implantation ist in Abbildung 3 dargestellt.

Abbildung 4 zeigt die Parameter, die zur Beurteilung der Lebensfähigkeit des Herzens während der Ex-situ-Perfusion verwendet werden, wie z. B. Laktat, Kalium und mittlerer Aortendruck. In dieser Studie verringerte die Verwendung der normothermen Ex-situ-Konservierung die ischämische Gesamtzeit von sechs erfolgreichen Fällen auf 46,2 ± 4,7 Minuten, während die Gesamtzeit außerhalb des Körpers 166,2 ± 4,7 Minuten betrug (Abbildung 5). Die Entnahme des Herzens aus dem Spender und die Vorbereitung auf die Ex-situ-Perfusion und die heterotope Transplantation erforderten 5,8 ± 1,3 Minuten, wie in Abbildung 5 dargestellt. Die Gesamterfolgsrate der Operation betrug 70% und die mittlere Anastomosenzeit der sechs erfolgreichen Fälle betrug 38,4 ± 3,4 min. In allen Experimenten nahm die Herzfrequenz unmittelbar nach der Implantation signifikant ab, erholte sich aber schließlich im Laufe der Zeit, wie in Abbildung 6 dargestellt. Die grobe Struktur der Spenderherzen war nach ex-situ-Konservierung und heterotoper Implantation gut erhalten, wobei keine sichtbaren Schäden festgestellt wurden. Die Hämatoxylin-Eosin-Färbung zeigte jedoch nach 3 h heterotoper Implantation eine erhöhte Anzahl von Entzündungszellen, meist neutrophile Granulozyten (Abbildung 7).

Figure 1
Abbildung 1: Experimentelles Design der normothermen ex situ Herzerhaltung mit heterotoper Herztransplantation. Abkürzungen: BGA = Blutgasanalyse, CPS = kardioplegikerische Lösung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Schematische Darstellung der modifizierten Ex-situ-Herzkonservierung von Kleintieren. Abkürzungen: Blutdrucksensor = Blutdrucksensor, CPS = kardioplegikerische Lösung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Die Reihenfolge der Anastomose bei der heterotopen Herztransplantation . (A) Schematische Darstellung der Position des Spenderherzens im Abdomen des Empfängers und Reihenfolge der Anastomose. (B) Anastomose der aufsteigenden Aorta des Spenders und Anastomose der abdominalen Aorta des Empfängers. (C) Spenderpulmonalarterie und IVC-Anastomose des Empfängers. Abkürzungen: LV = linker Ventrikel, RV = rechter Ventrikel, LA = linker Vorhof, MPA = Hauptpulmonalarterie, IVC = Vena cava inferior. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Parameter für die Viabilitätsbeurteilung während der Ex-situ-Perfusion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Konservierungszeitleiste der sechs erfolgreich konservierten Herzen. Herzextraktion und Ex-situ-Perfusionserleichterung: 5,8 ± 1,3 Min. Ex-situ-Perfusion: 120 Min. Implantation in das Abdomen der Empfängerratte: 38,4 ± 3,4 Min. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Die elektrophysiologische Leistung des Spenderherzens vor der Entnahme und nach der Implantation . (A) Veränderungen der Herzfrequenz. Vorernte, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 150 min, 180 min: die Zeiten nach der Implantation. (B) Elektrokardiographie-Bilder vor der Entnahme des Spenderherzes und nach 3 Stunden nach der Implantation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 7
Abbildung 7: Makroskopisches (A-C) und mikroskopisches (D-F) Erscheinungsbild des Spenderherzens. (A,D) Vor normotherm ex situ Konservierung. (B,E) Nach normothermischer Ex-situ-Konservierung . (C,F) Nach 2 h heterotoper Implantation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Unser Fokus bei der Etablierung dieses Modells lag auf der Replikation der normothermen menschlichen Herztransplantation. Modelle ohne Auswurf sind die allgemein bevorzugte Technik zur Konservierung des Spenderherzens in einer Ex-situ-Umgebung 16. Während auswerfende Modelle viele Vorteile bei der Beurteilung der Herzfunktion während der Ex-situ-Perfusion bieten17, sind sie für heterotope Transplantationsmodelle nicht geeignet. Bei der heterotopen Transplantation muss das implantierte Spenderherz den systolischen Nachlastdruck überwinden, der vom Wirtsherzen im Kreislaufsystem des Empfängers erzeugt wird, was zu einer eingeschränkten Leistung des Spenderherzens und einer Unterschätzung in der Beurteilung führt18. Daher sind nicht-ejektive Modelle bei der heterotopen Transplantation günstiger. Bei Modellen ohne Auswurf wird das Spenderherz durchblutet, unterstützt aber nicht den Kreislauf des Empfängers, was die Leistungsbeurteilung des Herzens erheblich einschränkt. Morphologische und molekulare Beurteilungen, wie z. B. histologische Färbungen und Blotting-Analysen, können für die Untersuchung von Spenderherzerkrankungen von Vorteil sein, wenn die funktionellen Beurteilungen begrenzt sind. Darüber hinaus können die metabolischen Marker mit fortschrittlichen Technologien wie der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) oder der Magnetresonanztomographie (MRT) ausgewertet werden19. Dieses Modell kann nützlich sein, um die langfristige Wirksamkeit pharmakologischer und genetischer Interventionen vor der Implantation zu testen.

Zahlreiche Forschungsgruppen haben ein normothermes Ex-situ-Konservierungsmodell entwickelt, das erfolgreich für die Konservierung von Schweineherzen für bis zu 12 h6 eingesetzt wurde. Die Wartung von Großtiermodellen kann jedoch für kleine Labore unerschwinglich sein, da sie mit erheblichen Kosten verbunden ist und eine beträchtliche Anzahl von geschultem Personal erfordert. Um dieses Problem anzugehen, schlagen wir eine kostengünstigere und technisch unkomplizierte Ex-situ-Konservierungsmethode vor, bei der autologes Blut mit anschließender heterotoper Herztransplantation verwendet wird. Bemerkenswert ist, dass die Kosten für ein einzelnes Experiment mit unserem Modell etwa 300 US-Dollar betragen. Obwohl es kein gleichwertiges Kleintiermodell gibt, um die Kosten zu vergleichen, kann der Ex-situ-Perfusionsapparat für Großtiere bei einmaligem Gebrauch bis zu 30.000 US-Dollar kosten16.

Das vorgestellte Protokoll zeigt, dass alle experimentellen Verfahren schrittweise von einem einzigen Experimentator durchgeführt werden können (Abbildung 3). Die Möglichkeit der heterotopen Implantation nach Ex-situ-Konservierung ist ein weiterer Vorteil dieses Modells. Durch die Kanülierung der absteigenden Aorta des Spenderherzens für die Ex-situ-Perfusion konnten wir den aufsteigenden Teil schonen, ohne Schaden anzurichten. Darüber hinaus haben wir den Langendorff-Kreislauf modifiziert und die Menge der Perfusionslösung, die für eine effektive Herzperfusion erforderlich ist, auf 12 ml reduziert. Das Perfusionsblut wurde vor der Entnahme von der Spenderratte gewonnen, so dass wir das Herz mit seinem eigenen Blut konservieren und immunologische Reaktionen während der Konservierung vermeiden können.

Modifikationen und Fehlerbehebung
Der Ex-situ-Perfusionskreislauf wird empfohlen, um einen mittleren Nachlastdruck im Bereich von 50-70 mmHg aufrechtzuerhalten. Der Druck wird durch verschiedene Faktoren bestimmt, darunter der Perfusionsfluss, der Koronararterienwiderstand und die Perfusatviskosität20. Der koronare arterielle Widerstand ist anfällig für Schwankungen aufgrund von Temperatur- und pH-Schwankungen, daher ist es wichtig, diese Parameter im normalen Bereich zu halten. Der erforderliche Perfusionsfluss variiert für jedes Experiment und ist abhängig von dem notwendigen Durchfluss, um den gewünschten Perfusionsdruck aufrechtzuerhalten. In der Regel ist ein Durchfluss von 3-4 ml/min (entspricht 5-6 U/min für unsere Pumpe) für ein 350-450 g Rattenherz ausreichend. Der Hämatokritspiegel ist eine Determinante für die Perfusatviskosität21. Für unseren Kreislauf liegt der optimale Hämatokritbereich bei 25 % bis 30 %. Trotz des Einsatzes des kleinsten experimentellen Oxygenators kann die große Gasaustauschfläche von 0,05 m2 bei einem Perfusatvolumen von12 mL im Laufe der Zeit zu Verdunstung und daraus resultierendem Flüssigkeitsverlust führen. Dieser Flüssigkeitsverlust kann bei Bedarf durch Zugabe von destilliertem Wasser ausgeglichen werden. Es wird nicht empfohlen, dem Perfusat Kochsalzlösung oder Ringerlösung zuzusetzen, da sie Hypernatriämie verursachen können. Die Perfusat-Glukosekonzentration sollte bei 100-150 mg/dl gehalten werden.

Es ist von entscheidender Bedeutung, Arrhythmien während der Perfusion zu vermeiden, da sie die Verschlechterung eines oder mehrerer physiologischer Parameter der Ex-situ-Umgebung bedeuten 10. Tachyarrhythmie oder linksventrikuläres Flimmern sind häufig mit verschiedenen Faktoren verbunden, wie z. B. elektrolytischem Ungleichgewicht, niedrigem Hämatokrit, Azidose/Alkalose, Hyperthermie und übermäßiger Nachlast. Auf der anderen Seite wird Bradyarrhythmie hauptsächlich durch Unterkühlung verursacht. Laktat und Kalium sind die Schlüsselparameter bei der Beurteilung der myokardialen Lebensfähigkeit. Erhöhte Laktatwerte (>5 mmol/l) und Hyperkaliämie (>5,0 mg/dl) deuten auf einen erheblichen Grad der Myokardschädigung hin22.

Die sorgfältige Überwachung der Anästhesiedosierung und des Atemverhaltens der Empfängerratte ist bei chirurgischen Eingriffen von entscheidender Bedeutung. Da die Tiere nicht beatmet werden, kann eine kontinuierliche Verabreichung einer übermäßigen Anästhesie zu Hypoventilation und Versagen führen. Die totale Laparotomie und die Entnahme der Bauchorgane führen zu einem erheblichen Wärmeverlust, der den Zustand des Empfängers weiter verschlechtern kann. Daher ist die Verwendung eines Temperaturreglers, der mit einem Heizkissen und einem Temperaturfühler ausgestattet ist, von entscheidender Bedeutung, um die Auswirkungen des Wärmeverlusts zu mildern und eine stabile Körpertemperatur aufrechtzuerhalten.

Kritische Schritte
Zu den kritischen Phasen des chirurgischen Eingriffs gehören die Dissektion des Aortenbogens und der MPA, die Aortenkanülierung für die Ex-situ-Perfusion, die Entlüftung vor der Ex-situ-Perfusion und die Entlüftung vor dem Entfernen der Klemmen nach der Implantation. Diese Schritte sind sehr anfällig und oft mit einem Scheitern verbunden. Der Schlüssel zur Bewältigung dieser Herausforderungen liegt jedoch darin, die geeignete Technik zu identifizieren und ausreichend Übung zu erlangen. Bei der Gefäßisolierung beim Empfänger muss besonders auf den rechten Harnleiter geachtet werden, der sich in unmittelbarer Nähe des IVC im retroperitonealen Raum befindet und den Lymphgang imitieren kann. Im Rahmen der Venenanastomose wird empfohlen, zunächst das kaudale Ende mit Stegnähten und anschließend das kraniale Ende zu sichern, um Risse und Stenosen zu vermeiden. Dies ist besonders wichtig, da Venen im Vergleich zur Aorta relativ zerbrechlich sind.

Begrenzungen
Die chirurgischen Eingriffe in diesem Experiment sind sehr komplex, insbesondere bei der Entnahme des Spenderherzens und der Perfusierung von Blut desselben Tieres. Die funktionellen Beurteilungen nach der Implantation sind begrenzt, da wir ein Modell ohne Auswurf verwendet haben. Es wird davon ausgegangen, dass ein Auswurfmodell in einer Ex-situ-Umgebung fortschrittlichere Ergebnisse liefert. Bei der heterotopen Transplantation ist sie jedoch durch das Vorhandensein eines unterstützenden Wirtsherzens im Kreislaufsystem eingeschränkt.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss B2021-0991 des Chonnam National University Hospital Biomedical Research Institute und NRF-2020R1F1A1073921 der National Research Foundation of Korea unterstützt

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AES active evacuation system Smiths medical PC-6769-51A Utilize CO2 and excess isoflurane
Anesthesia machine Smiths medical PC-8801-01A Mixes isoflurane and oxyegn and delivers to animal
B20 patient monitor GE medical systems B20 to observe mean aortic pressure and temperature
Homeothermic Monitoring System Harvard apparatus 55-7020 To monitor and maintain animal's temperature
Micro-1 Rat oxygenator Dongguan Kewei medical instruments Micro-MO For gas exchange in the langendorff circuit
Micropuncture introducer Set COOK medical G48007 for delivering cardioplegic solution to the arch through the abdominal aorta
Microscope Amscope MU1403 For zooming surgical field (Recipient)
Surgical loupe SurgiTel L2S09 For zooming surgical field (Donor)
Syringe pump AMP all SP-8800 To deliver cardioplegic solution
Transonic flow sensor Transonic ME3PXL-M5 Perfusion circuit flow sensor
Transonic tubing flow module Transonic TS410 flow acquiring system
Watson - Marlow pumps Harvard apparatus 010.6131.DAO Peristaltic pump used for recirculate perfusate
WBC-1510A JEIO TECH E03056D Heating bath
Sprague-Dawley rats Samtako Bio Korea Co., Ltd., Osan City Korea
Medications
BioHAnce Gel Eye Drops SENTRIX Animal care wet ointments for eye
Cefazolin JW pharmaceutical For prophilaxis
Custodiol DR, FRANZ KOHLER CHEMIE GMBH For heart harvesting
Diclofenac Myungmoon Pharm. Co. Ltd For pain control
Heparin JW pharmaceutical Anticoagulant
Insulin JW pharmaceutical hormon therapy
Saline JW pharmaceutical For hydration therapy

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References

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Medizin Heft 194

Erratum

Formal Correction: Erratum: Rat Model of Normothermic Ex-Situ Perfused Heterotopic Heart Transplantation
Posted by JoVE Editors on 08/28/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Rat Model of Normothermic Ex-Situ Perfused Heterotopic Heart Transplantation. The Protocol section was updated.

Section 4 of the Protocol was updated from:

4. Implantation

  1. Preparation of recipient
    1. Begin the recipient preparation 30 min before the cessation of ex situ perfusion.
    2. Anesthetize the recipient animal using the same method as mentioned in step 2.2.
    3. Place the rat in a supine position on the heating pad and insert the temperature probe into the rectum to maintain the body temperature at 37 °C.
    4. Apply eye lubricant, shave the pubic to the epigastric area, and cleanse the area with an iodine-based scrub and 70% alcohol.
  2. Medications
    1. Inject 2 mL of warm saline subcutaneously to compensate for the fluid lost during the surgery. Inject 200 IU of heparin subcutaneously.
    2. Administer antibiotic prophylaxis by injecting 10 mg/kg cefazolin dissolved in 0.3 mL of saline subcutaneously or intramuscularly.
    3. Administer pain control by injecting 20 mg/kg of diclofenac subcutaneously.
  3. Perform the mid-line laparotomy and insert a retractor to widen the abdominal cavity. Mobilize the abdominal organs to the left side of the recipient using cotton swabs to make space for the procedure.
  4. Prevent dehydration by wrapping the abdominal organs with warm and wet gauze. Intermittingly spread warm saline with a 50 mL syringe during the surgery.
  5. Utilizing a surgical microscope with a 10x magnification, mobilize the duodenum and proximal jejunum by blunt dissection with cotton swabs to expose the Abd. A. and IVC. Prepare the Abd. A and IVC for anastomosis and systematically implant the donor heart, in accordance with Figure 3 or previously documented methods15.
    NOTE: Do not separate the Abd. A. and IVC.
    1. Assuming vascular anastomosis to be placed infrarenal, prepare a sufficient portion of the aorta and IVC for clamping.
    2. Perform blunt preparation using cotton swabs or sharp-serrated forceps to remove the fats and fascia around the vessels.
    3. Place 5-0 silk ligatures to the mesenteric branches and both the cranial and caudal sides of the major vessels. Elevate the abdominal vessels and coagulate or ligate the lumbar branches with 5-0 silk sutures. Remember to spare the testicular arteries and veins and do not clamp them.
    4. Use ligatures to lift the vessels and position the micro-clamps to the mesenteric branches, caudal, and cranial sides of the major vessels to stop the blood flow at the anastomosis site. Be sure to switch off the heating pad before placing the clamps, as excess heating can exacerbate limb ischemia.
    5. Puncture the aorta using a 27 G needle and elongate the incision with micro scissors to a length equal to or slightly larger than the opening of the donor ascending aorta (Asc. A), which is approximately 5 mm.
    6. Make a longitudinal incision on the IVC in the same way as the aortotomy, but make it 3 mm closer to the caudal side compared to the aorta incision.
    7. Starting the anastomoses, placed the donor heart on the right side of the recipient's abdomen and attach the donor Asc. A to the recipient's Abd. A with one simple interrupted stitch (9-0 polypropylene) at the cranial corner of the longitudinal incision.
    8. Move the heart to the left side of the recipient abdomen and perform anastomosis of the donor's Asc. A with the recipient's Abd. A using a running 9-0 polypropylene suture.
    9. Fixate the donor pulmonary artery to the IVC with two interrupted sutures (9-0 polypropylene) at the caudal and cranial corners of the longitudinal incision.
    10. Perform the first half of the venous anastomosis from the intraluminal side of the vessel and complete the second half from the extraluminal side of the vessel. Before tightening the knots, flush the field with saline to prevent air embolism.
  6. De-airing and de-clamping
    1. Remove the mesenteric vein clamp first after completing the anastomosis to allow the right side of the heart to fill with venous blood.
    2. Remove the air in the coronary circuit and Asc. A. by applying retrograde coronary perfusion for several seconds.
    3. Place a piece of gauze on both sides of the vessels and remove the caudal clamp and the cranial clamp.
    4. Apply gentle compression with cotton swabs for 1-2 min. After ensuring adequate hemostasis, remove the swabs and wash the anastomoses with warm saline.
      NOTE: The heart should begin beating within the first minute of reperfusion. If the recipient rat's body temperature is below 35 °C, the heart rhythm will normalize after the temperature reaches 36 °C.
  7. Replace the abdominal organs in a meander-like manner and close the layers of the abdominal incision using continuous 5-0 polypropylene sutures.

to:

4. Implantation

  1. Preparation of recipient
    1. Begin the recipient preparation 30 min before the cessation of ex situ perfusion.
    2. Anesthetize the recipient animal using the same method as mentioned in step 2.2.
    3. Place the rat in a supine position on the heating pad and insert the temperature probe into the rectum to maintain the body temperature at 37 °C.
    4. Apply eye lubricant, shave the pubic to the epigastric area, and cleanse the area with an iodine-based scrub and 70% alcohol.
  2. Medications
    1. Inject 2 mL of warm saline subcutaneously to compensate for the fluid lost during the surgery. Inject 200 IU of heparin subcutaneously.
    2. Administer antibiotic prophylaxis by injecting 10 mg/kg cefazolin dissolved in 0.3 mL of saline subcutaneously or intramuscularly.
    3. Administer pain control by injecting 20 mg/kg of diclofenac subcutaneously.
  3. Perform the mid-line laparotomy and insert a retractor to widen the abdominal cavity. Mobilize the abdominal organs to the left side of the recipient using cotton swabs to make space for the procedure.
  4. Prevent dehydration by wrapping the abdominal organs with warm and wet gauze. Intermittingly spread warm saline with a 50 mL syringe during the surgery.
  5. Utilizing a surgical microscope with a 10x magnification, mobilize the duodenum and proximal jejunum by blunt dissection with cotton swabs to expose the Abd. A. and IVC. Prepare the Abd. A and IVC for anastomosis and systematically implant the donor heart, in accordance with Figure 3 or previously documented methods15.
    NOTE: Do not separate the Abd. A. and IVC.
    1. Assuming vascular anastomosis to be placed infrarenal, prepare a sufficient portion of the aorta and IVC for clamping.
    2. Perform blunt preparation using cotton swabs or sharp-serrated forceps to remove the fats and fascia around the vessels.
    3. Place 5-0 silk ligatures to the mesenteric branches and both the cranial and caudal sides of the major vessels. Elevate the abdominal vessels and coagulate or ligate the lumbar branches with 5-0 silk sutures. Remember to spare the testicular arteries and veins and do not clamp them.
    4. Use ligatures to lift the vessels and position the micro-clamps to the mesenteric branches, caudal, and cranial sides of the major vessels to stop the blood flow at the anastomosis site. Switch off the heating pad before placing the clamps, as excess heating can exacerbate limb ischemia. Ensure to switch on the heating pad after de-clamping the vessels to avoid hypothermia.
    5. Puncture the aorta using a 27 G needle and elongate the incision with micro scissors to a length equal to or slightly larger than the opening of the donor ascending aorta (Asc. A), which is approximately 5 mm.
    6. Make a longitudinal incision on the IVC in the same way as the aortotomy, but make it 3 mm closer to the caudal side compared to the aorta incision.
    7. Starting the anastomoses, placed the donor heart on the right side of the recipient's abdomen and attach the donor Asc. A to the recipient's Abd. A with one simple interrupted stitch (9-0 polypropylene) at the cranial corner of the longitudinal incision.
    8. Move the heart to the left side of the recipient abdomen and perform anastomosis of the donor's Asc. A with the recipient's Abd. A using a running 9-0 polypropylene suture.
    9. Fixate the donor pulmonary artery to the IVC with two interrupted sutures (9-0 polypropylene) at the caudal and cranial corners of the longitudinal incision.
    10. Perform the first half of the venous anastomosis from the intraluminal side of the vessel and complete the second half from the extraluminal side of the vessel. Before tightening the knots, flush the field with saline to prevent air embolism.
  6. De-airing and de-clamping
    1. Remove the mesenteric vein clamp first after completing the anastomosis to allow the right side of the heart to fill with venous blood.
    2. Remove the air in the coronary circuit and Asc. A. by applying retrograde coronary perfusion for several seconds.
    3. Place a piece of gauze on both sides of the vessels and remove the caudal clamp and the cranial clamp.
    4. Apply gentle compression with cotton swabs for 1-2 min. After ensuring adequate hemostasis, remove the swabs and wash the anastomoses with warm saline.
      NOTE: The heart should begin beating within the first minute of reperfusion. If the recipient rat's body temperature is below 35 °C, the heart rhythm will normalize after the temperature reaches 36 °C.
  7. Replace the abdominal organs in a meander-like manner and close the layers of the abdominal incision using continuous 5-0 polypropylene sutures.
  8. After the surgery, place the anesthetized animal on a clean area over a heating pad until the body temperature reaches 37°C. 
    NOTE: Do not initiate the postoperative examinations till the body temperature reaches 37°C. Maintain anesthesia at 2-2.5% isoflurane until the end of the experiments.
  9. Monitor ECG of the transplanted donor heart for 3 h. Then, excise the heart under deep anesthesia for histological studies.
    NOTE: Confirm anesthesia depth via lack of pedal reflex before excising the heart. The surgical procedure and the ECG monitoring take less than 6 h. Diclofenac, administered perioperatively (step 4.2.3.), enables pain management for the entire duration of this procedure. The analgesia regimen can be adjusted per the institutional animal use guidelines.
Rattenmodell der normothermischen Ex-situ-perfundierten heterotopen Herztransplantation
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Kayumov, M., Jeong, I. S., Kim, D.,… More

Kayumov, M., Jeong, I. S., Kim, D., Kwak, Y., Obiweluozor, F. O., Yoon, N., Kim, H. S., Cho, H. J. Rat Model of Normothermic Ex-Situ Perfused Heterotopic Heart Transplantation. J. Vis. Exp. (194), e64954, doi:10.3791/64954 (2023).

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