监测 Stub1 介导的过氧化物酶体自噬

摘要

本方案提供了在活细胞中诱导并监测 Stub1 介导的过氧化物酶体自噬的实验指导。

摘要

哺乳动物细胞可通过 Stub1 介导的过氧化物酶体自噬（pexophagy）来更新过氧化物酶体。该通路可能使细胞能够调控过氧化物酶体的数量与质量。在此过程中，热休克蛋白 70 和泛素 E3 连接酶 Stub1 会转位至将被降解的过氧化物酶体上，从而启动过氧化物酶体自噬。Stub1 的连接酶活性可促使泛素及其他自噬相关模块在靶向的过氧化物酶体上聚集。过氧化物酶体腔内活性氧（ROS）水平的升高可激活 Stub1 介导的过氧化物酶体自噬。因此，可利用染料辅助的 ROS 生成来触发并监测这一通路。本文概述了使用两类染料——荧光蛋白和合成荧光探针——在哺乳动物细胞培养中诱导过氧化物酶体自噬的操作步骤。这些基于染料辅助 ROS 生成的实验方案不仅可用于全局性地靶向细胞群体中的全部过氧化物酶体，还可实现对单个细胞内特定过氧化物酶体的操控。我们还描述了如何通过活细胞显微镜示踪 Stub1 介导的过氧化物酶体自噬过程。

引言

过氧化物酶体是存在于大多数真核细胞中的单层膜细胞器。过氧化物酶体是一种重要的代谢区室，负责极长链脂肪酸的β-氧化、嘌呤降解以及醚磷脂和胆汁酸的合成¹。过氧化物酶体来源的乙酰辅酶A通过调控代谢中的核心信号通路来维持脂质稳态²。因此，过氧化物酶体功能受损与多种疾病相关，包括神经退行性疾病、衰老、癌症、肥胖和糖尿病，这并不令人意外^3,4,5。维持过氧化物酶体正常功能的一个关键过程是过氧化物酶体自噬（pexophagy）。过氧化物酶体自噬是一种通过自噬选择性降解过氧化物酶体的分解代谢过程。细胞利用过氧化物酶体自噬来调控过氧化物酶体的数量和质量，从而确保其正常功能。最近一项研究表明，由于PEX1和PEX6过氧化物酶体生物发生因子突变导致的过氧化物酶体丢失，是由于失控的过氧化物酶体自噬所致⁶。值得注意的是，在所有过氧化物酶体生物发生障碍（PBD）患者中，有65%存在哺乳动物细胞中由PEX1、PEX6和PEX26组成的过氧化物酶体AAA ATP酶复合物的缺陷⁷。

有多种方法....

方案

1. 准备表达二聚化KillerRed或过氧化物酶体腔内自标记蛋白（SLPs）的细胞

1. 在玻璃底细胞培养皿中接种所需细胞。本实验中，在直径为35 mm、带有直径20 mm玻璃微孔的培养皿中，接种2 × 10⁵个人源SHSY5Y细胞于840 µL培养基（DMEM/F-12，添加10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素）中，或接种6 × 10⁴个小鼠NIH3T3细胞于840 µL培养基（DMEM，添加10%牛血清和1%青霉素/链霉素）中。
   注意：若使用其他规格的玻璃底培养皿，应根据玻璃微孔面积按比例调整接种细胞数量。
2. 将细胞置于5% CO₂、37 °C条件下培养24小时。
3. 使用转染试剂将目标质粒转染至细胞中。
   1. 使用PMP34-TagBFP标记活细胞中的过氧化物酶体。为在过氧化物酶体腔内产生活性氧（ROS），可选用靶向过氧化物酶体的diKillerRed-VKSKL或SLP-VKSKL（联合染料标记的SLP配体）（通过光激活产生ROS）。在本方案中，我们使用自标记蛋白HaloTag-VKSKL²¹。为监测Stub1/Hsp70的转位、泛素化蛋白的聚集以及自噬体在受ROS应激的过氧化物酶体上的形成，分别转染EGFP-Stub1、EGFP-Hsp70、EGFP-Ub或EGFP-LC3B。为检测过氧化物酶....

结果

本文所示的 Stub1 介导的过氧化物酶体自噬诱导方案利用了过氧化物酶体腔内染料辅助的活性氧（ROS）生成。该操作仅需极低的光照强度，因此含有荧光蛋白或染料的过氧化物酶体可使用标准的激光扫描共聚焦显微镜进行照射。局部照射可在单个过氧化物酶体内瞬时且特异性地产生 ROS，如荧光报告分子 roGFP2-VKSKL 所示（图9）。在进行 roGFP2-VKSKL 检测时，我们未对 diKillerRed-VKSKL 进行成像，以避免成像过程中产生额外的 ROS。位于 图9 右下角的 diKillerRed-VKSKL 图像是在完成所有 roGFP2-VKSKL 检测后采集的，以清晰标示受损过氧化物酶体的位置¹³。实验数据还显示，未受照射的过氧化物酶体未受到影响，表明该方法具有高度精确性。ROS 会导致少量过氧化物酶体驻留分子发生氧化，从而引起过氧化物酶体功能障碍。这种急性操作可有效用于深入研究多种过氧化物酶体质量控制通路。

讨论

本方案详细描述了如何通过光照升高过氧化物酶体内的活性氧（ROS）水平，从而在细胞培养物中诱导Stub1介导的过氧化物酶体自噬（pexophagy）。由于该方案依赖于染料辅助的ROS生成，因此需要确保目标细胞中充分表达diKillerRed-VKSKL或染料标记的SLP配体。鉴于不同细胞类型或不同遗传背景的细胞其过氧化物酶体可能具有略微不同的特性，可能需要调整具体的光照条件以确保有效诱导过氧化物酶体自噬。检测Stub1介导的过氧化物酶体自噬是否被成功激活的一个可靠指标是观察EGFP-Ub是否在光照后转位至受照的过氧化物酶体上（光照后1小时）¹³。在健康细胞中，EGFP-Ub信号通常均匀分布于细胞质中，因此其向受照过氧化物酶体的转位易于观察。为优化光照条件，可调整光照强度或光照时间。在试图损伤过氧化物酶体时，应尽量避免对染料过度照射，因为某些染料可能发生光化学反应，干扰后续成像。例如，已有研究表明，KillerRed过度照射后会呈现微弱的绿色荧光。过度照射会在光照结束后立即在受照的过氧化物酶体上产生微弱的绿色信号²³（这与基于EGFP的报告蛋白的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
直径20 mm玻璃微孔的35 mm培养皿	MatTek	P35G-1.5-20-C	20 mm 玻璃底
3-氨基-1,2,4-三唑（3-AT）	Sigma Aldrich	A8056
牛血清	赛默飞世尔科技	16170060
细胞培养箱	Nuaire	NU-4750
diKillerRed-PTS1	中国台湾中央研究院		通过将 KillerRed 串联二聚体与 PTS1（VKSKL）融合而成
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	赛默飞世尔科技	11965092
Dulbecco改良型Eagle培养基/营养混合物F-12（DMEM/F-12）	赛默飞世尔科技	11330032
EGFP-C1	Clontech	pEGFP-C1	EGFP-C1 载体骨架用于克隆 EGFP-Stub1、EGFP-Hsp70、EGFP-p62
EGFP-Hsp70	中国台湾中央研究院		Hsp70 基因（HSPA1A）从 HeLa cDNA 中通过 PCR 扩增，并克隆至 EGFP-C1 载体
EGFP-LC3B	Addgene	11546
EGFP-p62	中国台湾中央研究院		通过将人 SQSTM1 基因（经 PCR 扩增自 HeLa 细胞 cDNA）插入 EGFP-C1 载体构建而成
EGFP-Stub1	中国台湾中央研究院		通过将小鼠 Stub1 基因（经 PCR 扩增自小鼠肾总 cDNA）插入 EGFP-C1 载体构建而成
EGFP-Ub	Addgene	11928
胎牛血清	赛默飞世尔科技	10437028
HaloTag TMR 配体	Promega	G8252
HaloTag-PTS1	中国台湾中央研究院		将PTS1添加并克隆至EGFP-C1载体骨架中
HEPES	赛默飞世尔科技	15630080
倒置共聚焦显微镜	Olympus	FV3000RS	405 nm 激发，488 nm 激发，561 nm 激发  配备TOKAI HIT腔室培养箱和UNIV2-D35培养皿支架的显微镜
Janelia Fluor 646 HaloTag 配体	Promega	GA1120
LED	VitaStar	PAR64	80 W，555-570 nm
lipofectamine 2000	赛默飞世尔科技	11668	转染试剂
NIH3T3 细胞	ATCC	CRL-1658	贴壁的
Opti-MEM	赛默飞世尔科技	319850	低血清培养基
青霉素/链霉素	赛默飞世尔科技	15140
PMP34-TagBFP	中国台湾中央研究院		从HeLa cDNA中PCR扩增PMP34并克隆至TagBFP-C（Evrogen FP171）
roGFP2-PTS1	中国台湾中央研究院		通过将 eroGFP（源自 Addgene 质粒 20131）的 C 末端添加氨基酸序列 VKSKL，并克隆至 EGFP-C1 载体中构建而成
SHSY5Y 细胞	ATCC	CRL-2266	贴壁的