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Behavior

ड्रोसोफिला में लोकोमोटर गतिविधि की परख करने के लिए एक सरल तकनीक

Published: February 24, 2023 doi: 10.3791/65092
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Institute of Neuroscience, Soochow University, 2Department of Neurology and Clinical Research Center of Neurological Disease, The Second Affiliated Hospital of Soochow University

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल में ड्रोसोफिला की लोकोमोटर गतिविधि का आकलन ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर फिजी का उपयोग करके हाथ से बने क्षेत्र में मक्खियों की गति को ट्रैक और विश्लेषण करके किया जाता है, जो गति, दूरी आदि के मापदंडों की गणना करने के लिए उच्च-परिभाषा वीडियो रिकॉर्डिंग के आधार पर प्रत्येक फ्रेम के पिक्सेल को सेगमेंट करने के लिए प्लगइन्स के साथ संगत है।

Abstract

ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर उन्नत आनुवंशिक हेरफेर तकनीकों और विविध व्यवहार विशेषताओं की प्रचुरता के कारण विभिन्न बीमारियों का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श मॉडल जीव है। पशु मॉडल में व्यवहार की कमी की पहचान करना रोग की गंभीरता का एक महत्वपूर्ण उपाय है, उदाहरण के लिए, न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में जहां रोगियों को अक्सर मोटर फ़ंक्शन में हानि का अनुभव होता है। हालांकि, फ्लाई मॉडल में मोटर घाटे को ट्रैक करने और आकलन करने के लिए विभिन्न प्रणालियों की उपलब्धता के साथ, जैसे कि दवा-उपचारित या ट्रांसजेनिक व्यक्ति, कई कोणों से सटीक मूल्यांकन के लिए एक किफायती और उपयोगकर्ता के अनुकूल प्रणाली की अभी भी कमी है। एनिमलट्रैकर एप्लिकेशन प्रोग्रामिंग इंटरफेस (एपीआई) पर आधारित एक विधि यहां विकसित की गई है, जो फिजी छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम के साथ संगत है, रिकॉर्ड किए गए वीडियो से वयस्क और लार्वा दोनों व्यक्तियों की आंदोलन गतिविधियों का व्यवस्थित रूप से मूल्यांकन करने के लिए, इस प्रकार उनके ट्रैकिंग व्यवहार के विश्लेषण की अनुमति देता है। इस विधि को व्यवहार को रिकॉर्ड और विश्लेषण करने के लिए केवल एक उच्च-परिभाषा कैमरा और एक कंप्यूटर परिधीय हार्डवेयर एकीकरण की आवश्यकता होती है, जिससे यह ट्रांसजेनिक या पर्यावरणीय व्यवहार संबंधी कमियों के साथ फ्लाई मॉडल की स्क्रीनिंग के लिए एक किफायती और प्रभावी दृष्टिकोण बन जाता है। औषधीय रूप से इलाज की गई मक्खियों का उपयोग करके व्यवहार परीक्षणों के उदाहरण यह दिखाने के लिए दिए गए हैं कि तकनीक वयस्क मक्खियों और लार्वा दोनों में व्यवहार परिवर्तन ों का अत्यधिक दोहराए जाने योग्य तरीके से पता लगा सकती है।

Introduction

ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर जीन संशोधन1, दवा उपचार2, और सेनेसेंस3 द्वारा बनाए गए न्यूरोनल रोग मॉडल में सेलुलर और आणविक कार्यों की जांच के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल जीव प्रदान करता है। मनुष्यों और ड्रोसोफिला के बीच जैविक मार्गों, भौतिक गुणों और रोग से जुड़े होमोलॉग जीन का उच्च संरक्षण फल मक्खी को आणविक से व्यवहार स्तर4 तक एक आदर्श नकल बनाता है। कई रोग मॉडल में, व्यवहार की कमी एक महत्वपूर्ण सूचकांक है, जो विभिन्न मानव न्यूरोपैथियों 5,6 के लिए एक सहायक मॉडल प्रदान करता है। ड्रोसोफिला का उपयोग अब कई मानव रोगों, न्यूरोडेवलपमेंट और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों जैसे पार्किंसंस रोग और एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस 7,8 का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। रोगजनक प्रगति को समझने के लिए रोग मॉडल की मोटर क्षमता का पता लगाना महत्वपूर्ण है और रोग प्रक्रिया को अंतर्निहित आणविक तंत्र के लिए एक फेनोटाइपिक सहसंबंध प्रदान कर सकता है।

हाल ही में, ड्रोसोफिला लोकोमोटर पहचान रणनीतियों के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर उपकरण और लागत प्रभावी कार्यक्रम विकसित किए गए हैं, जैसे कि समूहीकृत मक्खियों9,10 में उच्च-थ्रूपुट परीक्षण और वास्तविक समय11,12 में हरकत को मापना। ऐसा ही एक पारंपरिक दृष्टिकोण तेजी से इंटरैक्टिव नकारात्मक जियोटैक्सिस (रिंग) है, जिसे चढ़ाई परख भी कहा जाता है, जिसमें कई चैनल शामिल हैं जो समान लिंग और उम्र के साथ एक बड़ी मक्खी की आबादी को शामिल करने की अनुमति देते हैं, 9,13 डेटा एकत्र करते समय भिन्नता को कम करते हैं। लोकोमोटर व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए एक और पूर्व-परीक्षण विधि ट्राइकैनेटीक्स ड्रोसोफिला गतिविधि मॉनिटर (डीएएम) है, एक उपकरण जो एक पतली ग्लास ट्यूब14 के भीतर फ्लाई गतिविधि आंदोलन का पता लगाने के लिए कई बीम का उपयोग करता है। डिवाइस लगातार स्थिति रिकॉर्ड करता है, जो लंबी अवधि में मक्खियों की गतिविधि और सर्कैडियन लय का अध्ययन करने के लिए बीम-क्रॉसिंग की गणना करके स्वचालित हरकत का प्रतिनिधित्व करताहै। यद्यपि इन विधियों का व्यापक रूप से व्यवहार लोकोमोशन में परिवर्तन निर्धारित करने के लिए फल मक्खियों में व्यवहार दोषों का विश्लेषण करने में उपयोग किया गया है, उन्हें हमेशा विशेष परीक्षण उपकरण या जटिल विश्लेषण प्रक्रियाओं की आवश्यकता होती है, और एक सीमित, सरल उपकरण के साथ कुछ मॉडलों में उनके आवेदन को प्रतिबंधित करते हैं। वयस्क ड्रोसोफिला के परीक्षण के लिए पशु-अनुरेखण समूह-आधारित रणनीतियां, जैसे फ्लाईजीआरएएम11 और ड्रोसोफिला द्वीप परख10, एक पूर्वनिर्धारित क्षेत्र में सामाजिक भर्ती और व्यक्तिगत ट्रैकिंग को लागू करती हैं। फिर भी, अवज्ञा वाले क्षेत्रों में सामाजिक व्यक्तिगत प्रतिबंध का छवियों में पहचान पर नकारात्मक प्रभाव पड़ सकता है, जो मक्खियों के टकराव या अतिव्यापी होने के कारण होता है। भले ही कुछ ओपन-सोर्स सामग्री-आधारित विधियां, जैसे कि TRex16, MARGO12, और FlyPi17, में एक आपात स्थिति है, वे व्यवहार परीक्षण में लचीले उपयोग के साथ मक्खियों का तेजी से पता लगा सकते हैं। ये परीक्षण दृष्टिकोण विस्तृत प्रयोगात्मक उपकरण स्थापनाओं, विशेष सॉफ्टवेयर आवश्यकताओं या पेशेवर कंप्यूटर भाषाओं से जुड़े हैं। लार्वा के लिए,18 के प्रति यूनिट ग्रिड सीमा लाइनों की संख्या में तय की गई कुल दूरी को मापना, या मैन्युअल रूप से19 व्यक्तियों के लिए शरीर की दीवार के संकुचन की गणना करना, उनकी लोकोमोटर क्षमता का आकलन करने के लिए प्रमुख तरीके हैं। उपकरण या उपकरणों और विश्लेषण विधियों में परिशुद्धता की कमी के कारण, लार्वा के कुछ व्यवहार लोकोमोशन पहचान से बच सकते हैं, जिससे व्यवहार आंदोलन का सही आकलन करना मुश्किल हो जाता है, विशेष रूप से ठीक आंदोलन15।

वर्तमान विकसित विधि एनिमलट्रैकर एप्लिकेशन प्रोग्रामिंग इंटरफेस (एपीआई) का उपयोग करती है, जो फिजी (इमेजजे) इमेज प्रोसेसिंग प्रोग्राम के साथ संगत है, ताकि उच्च-परिभाषा (एचडी) वीडियो से उनके ट्रैकिंग व्यवहार का विश्लेषण करके वयस्क और लार्वा मक्खियों दोनों की लोकोमोटर गतिविधि का व्यवस्थित रूप से मूल्यांकन किया जा सके। फिजी एक ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर इमेजजे वितरण है जो कई स्क्रिप्टिंग भाषाओं के साथ मजबूत सॉफ्टवेयर पुस्तकालयों को जोड़ सकता है, जिसके परिणामस्वरूप छवि प्रसंस्करण एल्गोरिदम का तेजी से प्रोटोटाइप होता है, जिससे यह अपनी छविविश्लेषण क्षमताओं के लिए जीवविज्ञानियों के बीच लोकप्रिय हो जाता है। वर्तमान दृष्टिकोण में, एनिमलट्रैकर एपीआई में फिजी के एकीकरण का उपयोग व्यक्तिगत एल्गोरिथ्म सम्मिलन के साथ एक अद्वितीय ड्रोसोफिला व्यवहार परख विकसित करने के लिए किया जाता है, और लोकोमोटर व्यवहार की मजबूत विश्लेषणात्मक क्षमताओं का समर्थन करने के लिए विस्तृत प्रलेखन और ट्यूटोरियल के लिए एक उपयोगी कदम प्रदान करता है (चित्रा 1)। मक्खियों के टकराव या अतिव्यापी होने के कारण छवियों में उद्देश्य पहचान की जटिलता को दरकिनार करने के लिए, प्रत्येक क्षेत्र केवल एक मक्खी की मेजबानी करने तक सीमित है। दृष्टिकोण की ट्रैकिंग सटीकता का आकलन करने पर, इसे ड्रोसोफिला के लोकोमोटर आंदोलनों का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए लागू किया गया था, जिन्हें विषाक्त दवा रोटेनोन के साथ प्रशासित किया गया था, जिसका उपयोग आमतौर पर पार्किंसंस रोग के पशु मॉडल के लिए किया जाता है, अंततःदवा उपचार में हरकत हानि की खोज करता है। यह पद्धति, जो ओपन-सोर्स और मुफ्त सॉफ्टवेयर को नियोजित करती है, उच्च लागत वाले इंस्ट्रूमेंटेशन की आवश्यकता नहीं है, और ड्रोसोफिला व्यवहार हरकत का सटीक और पुन: विश्लेषण कर सकती है।

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Protocol

वर्तमान अध्ययन के लिए डब्ल्यू 1118 वयस्क मक्खियों और तीसरे इनस्टार लार्वा का उपयोग किया गया था।

1. प्रायोगिक तैयारी

नोट: ड्रोसोफिला लोकोमोशन ट्रैकिंग के लिए एक ओपन-फील्ड क्षेत्र रंगहीन और गंधहीन सिलिका जेल के साथ बनाया गया है।

  1. सिलिका किट के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार, अभिकर्मक ए और अभिकर्मक बी को 1: 10 के अनुपात में मिलाएं ( सामग्री की तालिका देखें)। सुनिश्चित करें कि सोडियम बाइकार्बोनेट मिश्रण में तब तक मिलाया जाता है जब तक कि रंग सफेद न हो जाए। मिश्रण को एक साफ पेट्री डिश में स्थानांतरित करें और इसे 48 घंटे के लिए सूखने के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में रखें।
  2. एक ट्राइपॉड पर एचडी कैमरा (सामग्री की तालिका देखें) सेट करें, इसे समायोजित करें ताकि कैमरा लेंस सिलिका क्षेत्र की सतह के लंबवत हो। फोकल लंबाई और कैमरे के एपर्चर को समायोजित करते हुए, सुनिश्चित करें कि कैमरा सिलिका की सतह पर केंद्रित है और डिस्प्ले पर्याप्त रूप से रोशन है। प्रयोगात्मक सेटअप चित्रा 1 में चित्रित किया गया है।
  3. कम से कम 61 सेकंड के निरंतर वीडियो रिकॉर्ड करने के लिए ओपन-फील्ड क्षेत्र में एक मक्खी को स्थानांतरित करें।
    नोट: लार्वा की सुस्त प्रकृति को ध्यान में रखते हुए, 10 मिनट से अधिक के वीडियो रिकॉर्डिंग समय की सिफारिश की जाती है।
    1. फिजी के साथ वीडियो खोलें, प्रगति पट्टी को प्रारंभिक फ्रेम में खींचें, और मौन रूप से अनुमोदित करें। "फ्रीहैंड चयन" उपकरण (चित्रा 2 बी, सी) का उपयोग करके मक्खी के पूरे शरीर का चयन करें।
    2. जब तक चयनित क्षेत्र >का ग्रे मान व्यापक पृष्ठभूमि तक नहीं पहुंच जाता, तब तक सफेद संतुलन को समायोजित करने के लिए छवि पर क्लिक करें > चमक और कंट्रास्ट को समायोजित करें।
      नोट: पहले फ्रेम का पृष्ठभूमि समरूपीकरण सॉफ्टवेयर को किसी भी वस्तु के बिना पृष्ठभूमि को अलग करने और एक मक्खी मौजूद होने पर एक कंट्रास्ट बनाने में सक्षम बनाता है, इस प्रकार सॉफ्टवेयर को इसे ट्रैक करने की अनुमति देता है।
  4. पूरे प्रयोग को 25 डिग्री सेल्सियस और 60% सापेक्ष आर्द्रता पर सेट परीक्षण वातावरण में करें, एक ऐसे क्षेत्र में जो शांत है और उज्ज्वल प्रकाश के संपर्क से रहित है।

2. वीडियो रिकॉर्डिंग और प्रीप्रोसेसिंग

  1. 95% कार्बन डाइऑक्साइड (सीओ2) का उपयोग करके संज्ञाहरण की एक छोटी अवधि के बाद, एक फ्लाई को ओपन-फाइल क्षेत्र में स्थानांतरित करें और वीडियो रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए कैमरा एप्लिकेशन पर रिकॉर्ड बटन दबाएं।
    नोट: हरकत पर एनेस्थेटिक के प्रभाव को कम करने के लिए, मक्खियों को वीडियो रिकॉर्डिंग शुरू करने से पहले 10 मिनट के लिए ठीक होने दें। चिलिंग द्वारा कूल-एनेस्थेटाइजिंग की भी सिफारिश की जाती है।
    1. एक बार जब मक्खियां संज्ञाहरण से ठीक हो जाती हैं, तो मक्खी वाले अखाड़े के पकवान को कैमरे के नीचे रखें और प्लेट को एक तरफ से जल्दी हिलाएं ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि रिकॉर्डिंग शुरू होने पर मक्खी गति में है।
  2. रिकॉर्डिंग के पूरा होने पर, वीडियो रिकॉर्डिंग को समाप्त करने के लिए स्टॉप बटन दबाएं।
    नोट: सुनिश्चित करें कि वीडियो रिकॉर्डिंग समय गंतव्य ट्रैकिंग समय से थोड़ा अधिक है। इसके अलावा, प्रयोगात्मक दक्षता में सुधार करने के लिए, कई मक्खियों को अनायास ट्रैक करना संभव है। यह उच्च गुणवत्ता वाली वीडियो फसल को सक्षम करने के लिए कैमरे के रिज़ॉल्यूशन पर निर्भर करता है।
  3. रिकॉर्ड किए गए वीडियो को एमजेपीईजी एन्कोडिंग के साथ एवीआई प्रारूप में परिवर्तित करें, ताकि उन्हें फिजी का उपयोग करके खोला और विश्लेषण किया जा सके। इस बीच, वीडियो की फ्रेम प्रति सेकंड (एफपीएस) दर को वयस्क मक्खियों के लिए 15 एफपीएस और लार्वा के लिए 12 एफपीएस पर सेट करें।

3. वीडियो विश्लेषण

  1. फिजी के साथ वीडियो खोलते समय पॉपअप विंडो में दो विकल्प "वर्चुअल स्टैक का उपयोग करें" और "ग्रेस्केल में कनवर्ट" के साथ रूपांतरित किए गए वीडियो को खोलें (चित्रा 2 ए)।
  2. एक खाली पहला फ्रेम बनाएं, जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है।
  3. एनिमलट्रैकर प्लगइन के "सक्रिय छवि सेट करें" उपकरण का उपयोग करके एक प्रोसेसिंग विंडो प्राप्त करें और एक ट्रैकिंग क्षेत्र बनाएं जो "अंडाकार" टूल (चित्रा 3 ए) का उपयोग करके मूल वीडियो विंडो में क्षेत्र को घेरता है।
  4. प्रसंस्करण विंडो में पहले रिक्त फ्रेम के लिए फ़िल्टर (चित्रा 3 ए, 3) और दो फिल्टर (चित्रा 4 ए-जी) के पैरामीटर सेट करें। फिर, मूल वीडियो विंडो में अगले फ्रेम का चयन करें, और प्रसंस्करण विंडो (चित्रा 5 ए-सी) की फ़िल्टर की गई सतह चुनें।
    नोट: फ़िल्टरिंग चरण छवि शोर को कम करने और / या पृष्ठभूमि को हटाने का कार्य करता है, इस प्रकार फ्रेम के बिनाराइजेशन में अग्रभूमि को पृष्ठभूमि से अलग करना आसान हो जाता है।
  5. एक बार फ़िल्टर की गई प्रोसेसिंग विंडो का चयन हो जाने के बाद, "सेट थ्रेशोल्ड" टूल (चित्रा 3 ए, 4, चित्रा 5 डी-ई, और चित्रा 6 ए) का उपयोग करके प्रसंस्करण विंडो में कवर किए गए लाल प्रोफ़ाइल के साथ ट्रैक किए गए फ्लाई को चालू करें।
  6. कंप्यूटर को प्रसंस्करण विंडो (चित्रा 3 ए, 5 और चित्रा 6 बी) में कवर किए गए लाल प्रोफ़ाइल के साथ मक्खी को पहचानने के लिए "सेट ब्लॉब-डिटेक्टर" का उपयोग करें।
  7. वयस्क मक्खी के लिए अंतिम फ्रेम के रूप में फ्रेम 901 सेट करें, जिसकी गणना वीडियो की रिकॉर्डिंग अवधि और एफपीएस (चित्रा 3 ए, 6, चित्रा 6 सी) द्वारा की जाती है।
    नोट: लार्वा के साथ निम्नलिखित प्रयोग 10 मिनट के लिए ट्रैक किया गया है, इसलिए फ्रेम 7200 को अंतिम फ्रेम के रूप में सेट किया गया है।
  8. मूल वीडियो विंडो (चित्रा 3 ए, 7 और चित्रा 6 डी, ई) में एक ट्रैकिंग आयत प्रस्तुत करने के लिए "ब्लॉब्स दिखाएं" उपकरण का उपयोग करें। फिर, ट्रैकिंग शुरू करें और निगरानी पूरी होने के बाद ट्रैकिंग फ़ाइल निर्यात करें (चित्रा 3 ए, 8, 9 और चित्रा 7 ए, बी)।

4. फ़ाइल विश्लेषण ट्रैक करना

  1. पशु ट्रैकर > ट्रैकिंग विश्लेषक प्लगइन (चित्रा 8 ए) का उपयोग करके ट्रैक और ज़ोन फ़ाइलों को लोड करें।
  2. ज़ोन सेटिंग्स का उपयोग करके वांछित अनुक्रमणिका का चयन करें और पैरामीटर सेटिंग्स (चित्रा 8) को बदलें। फ़्रेम दर का उपयोग करके फ़्रेम अंतराल के समय की गणना करें.
    नोट: इस स्थिति में, फ्रेम दर 15 एफपीएस है, और फ्रेम अंतराल लगभग 0.067 एस है, जो डिफ़ॉल्ट सेटिंग (चित्रा 8 डी) है।
  3. ट्रैकिंग विश्लेषक (चित्रा 9) में विश्लेषण किए जाने के बाद स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर और ग्राफपैड प्रिज्म का उपयोग करके मात्रात्मक विश्लेषण चार्ट का उत्पादन करें।

5. प्रति फ्रेम विश्लेषण

  1. प्रति फ्रेम अंतराल गति विश्लेषण करें। यदि अधिक विस्तृत शोध की आवश्यकता है तो फिजी के बिना ट्रैक फ़ाइल का विश्लेषण करें।
    1. ट्रैक फ़ाइल खोलें, Microsoft Office Excel में सभी निर्देशांकों की प्रतिलिपि बनाएँ, और स्थान कुंजी का उपयोग करके कक्षों को विभाजित करें.
      नोट: उदाहरण के लिए, एक बार फ़ाइल को "सी" और "डी" कॉलम में विभाजित करने के बाद, ड्रोसोफिला प्रति फ्रेम अंतराल की गति की गणना सूत्र एसक्यूआरटी ((सी 5-सी 4)^2 + (डी 5-डी 4)^2) द्वारा की जाती है, जिसे "ई" कॉलम (चित्रा 10 ए) में दिखाया गया है। कॉलम "ई" में डेटा पिक्सेल की संख्या को इंगित करता है जो फ्लाई दो फ्रेम के बीच स्थानांतरित होती है, जिसमें पहले फ्रेम पर विचार नहीं किया जाता है। सभी परिकलित परिणामों का चयन करें और लाइन चार्ट (चित्रा 10 बी) पर एक शिखर के साथ प्रति फ्रेम अंतराल एक सहज ज्ञान युक्त फ्लाई मूवमेंट गति प्रदर्शित करने के लिए एक लाइन चार्ट डालें।
  2. प्रति फ्रेम अंतराल गतिहीनता समय की गणना करें। फ़ाइल को "C" और "D" कॉलम में विभाजित करने के बाद, सूत्र IF(SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2) <20, 0, 1) का उपयोग करके प्रति फ्रेम अंतराल ड्रोसोफिला की गतिहीनता की स्थिति की गणना करें, जिसे "E" कॉलम में दिखाया गया है। (चित्र 10सी)।
    नोट: गति विश्लेषण के विपरीत, पहले फ्रेम के परिणाम परिभाषित किए गए थे। 20 पिक्सेल से कम स्थानांतरित होने वाली मक्खियों को स्थिर माना जाता था और कॉलम "ई" में "0" के रूप में दर्ज किया जाता था।
    1. सभी परिकलित परिणामों का चयन करें और पूरे स्तंभ चार्ट (चित्रा 10D) के मार्जिन से गतिहीनता समय को नेत्रहीन रूप से प्रदर्शित करने के लिए एक स्तंभ चार्ट सम्मिलित करें.
  3. सुनिश्चित करें कि दिशा का कोण बदलता है।
    नोट: दिशा परिवर्तन विश्लेषण का कोण मक्खियों की दिशा पसंद का प्रतिनिधित्व करता है। एक बार फ़ाइल को "C" और "D" स्तंभों में विभाजित किए जाने के बाद, दिशा परिवर्तन के कोण की गणना सूत्र ACOS (((SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2))^2+(SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))^2-(SQRT((C7-C5)^2+(D7-D5)^2)^2)^2/(2 *SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2)^2) द्वारा की जाती है। परिकलित परिणाम तीन निर्देशांकों के बीच के कोण को इंगित करते हैं।
    1. सभी परिकलित परिणामों का चयन करें और मक्खियों की गति के दिशा परिवर्तन के कोण को चित्रित करने के लिए एक स्कैटर आरेख डालें (चित्र 10एफ)।

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Representative Results

वर्तमान अध्ययन में, वयस्क मक्खियों में लोकोमोटर की कमी और रोटेनोन के साथ इलाज किए गए तीसरे इनस्टार लार्वा की जांच की गई और उनकी मोटर गतिविधि में दवा विलायक डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) के साथ खिलाए गए नियंत्रण मक्खी की तुलना की गई। ड्रोसोफिला में रोटेनोन के साथ उपचार मस्तिष्क में डोपामिनर्जिक न्यूरॉन हानि का कारण बनता है22 और महत्वपूर्ण लोकोमोटर घाटे का कारणबनता है। जैसा कि चित्र 11 और चित्र 12 में दिखाया गया है, वयस्क मक्खियों और रोटेनोन के साथ इलाज किए गए तीसरे इनस्टार लार्वा में डीएमएसओ के साथ खिलाए गए नियंत्रण मक्खियों की तुलना में महत्वपूर्ण लोकोमोटर घाटे होते हैं। चित्र 11 और चित्र 12बी-ई रोटेनोन के साथ या उसके बिना इलाज की गई मक्खियों के बीच आंदोलन मापदंडों के लिए दूरी, वेग और गतिहीनता समय में सापेक्ष परिवर्तनों को दर्शाते हैं। चित्रा 11 और चित्रा 12 एफ-के वयस्कों और लार्वा में रोटेनोन उपचार के साथ या उसके बिना गति, गतिहीनता समय और दिशा चयन के मापदंडों के प्रतिनिधि विश्लेषण को चित्रित करते हैं। वयस्क मक्खियों (चित्रा 11) और दवा-आहार समूहों के तीसरे इनस्टार लार्वा (चित्रा 12) में फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके दूरी, गतिहीनता समय और वेग के मापदंडों का मात्रात्मक विश्लेषण आगे पुष्टि करता है कि रोटेनोन के साथ उपचार का उपयोग मानव रोगों में लोकोमोटर घाटे की जांच करने के लिए किया जा सकता है, जिसमें न्यूरोडीजेनेरेटिव स्थितियां शामिल हैं, और मनुष्यों और स्तनधारियों में देखी गई कुछ व्यवहार विशेषताओं को दोहराने के लिए।

Figure 1
चित्रा 1: ड्रोसोफिला आंदोलन ट्रैकिंग विश्लेषण के लिए उपकरण सेटअप और प्रयोगात्मक प्रक्रिया को रेखांकित करने वाला फ्लो चार्ट। लोकोमोटर ट्रैकिंग क्षेत्र को एक ओवरहेड एचडी कैमरे के साथ चित्रित किया जाता है जिसे कंप्यूटर द्वारा शामिल और नियंत्रित किया जाता है। ड्रोसोफिला की हरकत का विश्लेषण करने की प्रक्रिया में वीडियो रिकॉर्डिंग, आंदोलन ट्रैकिंग, ट्रैकिंग फ़ाइल विश्लेषण, डेटा प्रोसेसिंग और पैरामीट्रिक विश्लेषण शामिल हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: पहले फ्रेम का पृष्ठभूमि समरूपीकरण। (ए) रूपांतरित वीडियो को खोलते समय "ग्रेस्केल में कनवर्ट" विकल्प की जांच करें, ताकि वीडियो को ग्रेस्केल में बदल दिया जा सके और रंग के हस्तक्षेप से बचा जा सके। (बी) लाल बॉक्स में दिखाए गए "फ्रीहैंड चयन" उपकरण का उपयोग करके ड्रोसोफिला को रेखांकित करें। (ग) विश्लेषण चयन के रूप में, मक्खियों की रूपरेखा को चित्रित करने के लिए एक पीली रेखा का उपयोग किया गया था। मक्खी की आकृति के करीब पीली रेखा रखने से एक ऐसे क्षेत्र का चयन करने की संभावना कम हो जाती है जो मक्खी द्वारा कब्जा नहीं किया जाता है। स्केल बार = 1 सेमी (डी) पहले फ्रेम के लिए चमक और कंट्रास्ट समायोजित करें जब तक कि पीले रंग में बॉक्स किया गया क्षेत्र पृष्ठभूमि के समान ग्रेस्केल में बदल न जाए। (ई) "स्टैक" विंडो में "नहीं" पर क्लिक करके पहले फ्रेम के लिए चमक और कंट्रास्ट समायोजन पूरा करें, लेकिन सभी फ्रेम के लिए नहीं। (एफ) अंततः, पहले फ्रेम को एक समान और बेदाग पृष्ठभूमि बनाने के लिए समायोजित किया जाता है। स्केल बार = 1 सेमी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: ट्रैकिंग विंडो और ट्रैकिंग ज़ोन सेटिंग्स। (ए) पशु ट्रैकिंग विंडो में चिह्नित क्रम में ट्रैकर प्लगइन्स पर क्लिक करके ट्रैकिंग विश्लेषण पूरा करें। (बी) चित्रा ए, 1 में सक्रिय छवि सेट करने के बाद, एक प्रोसेसिंग विंडो जो केवल वर्तमान फ्रेम दिखाती है, प्रस्तुत की जाती है। प्राथमिक वीडियो विंडो और प्रसंस्करण विंडो स्पष्ट रूप से प्रतिष्ठित हैं और विभिन्न स्थितियों में उपयोग किए जाते हैं। वर्तमान फ़्रेम को बदलने के लिए, सुनिश्चित करें कि परिवर्तन प्राथमिक वीडियो विंडो में निष्पादित किया गया है; परिवर्तन दोनों खिड़कियों में दिखाई देगा। स्केल बार = 1 सेमी (सी) एक ट्रैकिंग क्षेत्र बनाएं जो कंप्यूटर पहचान के लिए "अंडाकार" उपकरण का उपयोग करके अखाड़े को घेरता है। ट्रैकिंग ज़ोन चयन प्रोसेसिंग विंडो के बजाय एक खुली वीडियो विंडो में एक सर्कल क्षेत्र में होना चाहिए। (डी) बाहरी प्रकाश की गड़बड़ी को कम करने के लिए, क्षेत्र को अधिकतम सीमा तक फिट करने के लिए पीली रेखाओं के साथ एक ट्रैकिंग क्षेत्र की रूपरेखा तैयार करें। स्केल बार = 1 सेमी. (E) ट्रैकिंग क्षेत्र में रुचि का क्षेत्र (ROI ) सेट करने के लिए, "ज़ोन डिज़ाइनर" विंडो में दिखाए गए नंबरों के साथ चिह्नित क्रम का पालन करने वाले बटन पर क्लिक करें। इस चरण में, चुनी हुई वीडियो विंडो खुलने के बाद पूरी कार्रवाई पूरी होनी चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: पहले फ्रेम के लिए फ़िल्टर सेटिंग। (ए) ट्रैकिंग क्षेत्र के लिए आरओआई की सेटिंग को पूरा करके, एरिना को घेरने वाली पीली रेखा खुली वीडियो विंडो और प्रोसेसिंग विंडो दोनों में हरे रंग में बदल जाती है। स्केल बार = 1 सेमी (बी) फिल्टर का उद्देश्य जोड़ना प्रोसेसिंग विंडो में पहले फ्रेम के लिए लक्ष्य ऑब्जेक्ट को अधिक स्पष्ट बनाने के लिए एक काली पृष्ठभूमि सेट करता है। पूरे ऑपरेशन को एक खुली वीडियो विंडो के बजाय एक प्रोसेसिंग विंडो के भीतर आयोजित किया जाना चाहिए। (C, D) "फ़िल्टर सेटिंग्स" विंडो में "पृष्ठभूमि घटाव" और "गॉसियन ब्लर" फ़िल्टर जोड़ने से प्रोसेसिंग विंडो में पहला फ्रेम काला हो जाता है। संपूर्ण फ़िल्टर सेटिंग प्रक्रिया पहले फ़्रेम में पूरी होनी चाहिए. (ई) पैरामीटर "पृष्ठभूमि घटाने" विंडो में एक संख्या और एक लाल आयत के साथ चिह्नित बटन पर क्लिक करके चरण-दर-चरण सेट किए जाते हैं। प्रसंस्करण विंडो का चयन करने के बाद "सेट छवि" चरण संचालित किया जाना चाहिए। (एफ) स्केल बार = 1 सेमी। "ई 4" में "फ़िल्टर दिखाएं" बटन पर क्लिक करने और बिना किसी ऑपरेशन के सीधे विंडो को बंद करने के बाद "औसत छवि" विंडो प्रस्तुत की जाएगी। (जी) गॉसियन ब्लर का पैरामीटर 2.0 के डिफ़ॉल्ट सिग्मा मान के साथ सेट किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: दूसरे फ्रेम की थ्रेशोल्ड सेटिंग्स। (ए) निचली प्रगति पट्टी पर क्लिक करके, वीडियो विंडो को दूसरे फ्रेम में आगे बढ़ाएं। मक्खी स्क्रीन के बीच में पुनरावृत्ति करती है और फिजी द्वारा पहचानी जाती है। स्केल बार = 1 सेमी (बी, सी) फ़िल्टरिंग से पहले और बाद में प्रोसेसिंग विंडो प्रदर्शित करें। (बी) लाल आयत के साथ चिह्नित मोड का चयन करके फ़िल्टर की गई प्रोसेसिंग विंडो दिखाएं। (सी) "फ़िल्टर किए गए" मोड का चयन करने के बाद लाल आयत के साथ एक प्रसंस्करण विंडो का एक उदाहरण। स्केल बार = 1 सेमी (डी) चित्रा 3 ए, 4 में "सेट थ्रेशोल्ड" टूल चुनने के बाद, "थ्रेशोल्डर्स" विंडो में दिखाए गए डिफ़ॉल्ट थ्रेशोल्ड विधि, "ग्रेस्केल थ्रेसहोल्डर" का चयन करके दहलीज सेट करें। (ई) बीच में प्रगति बार बॉक्स को स्लाइड करके मापदंडों को समायोजित करें जब तक कि ट्रैकिंग फ्लाई को लाल प्रोफ़ाइल द्वारा देखा और कवर नहीं किया जाता है। नीचे दिए गए लाल आयत में बॉक्स किए गए मापदंडों के लिए डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स को बदलने की अनुशंसा नहीं की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: ब्लॉब डिटेक्टर, अंतिम फ्रेम सेटिंग, और पशु ट्रैकिंग चयन। (ए) चित्रा 5 ई में बताई गई सीमा तक पहुंचने पर, प्रसंस्करण खिड़की दूसरे फ्रेम में मक्खी के बाद एक बड़े लाल प्रोफ़ाइल को प्रकट करती है। फ्लाई को कवर करने वाली लाल प्रोफ़ाइल को मक्खी को ट्रैक करने के लिए फिट बनाएं। स्केल बार = 1 सेमी (बी) डिफ़ॉल्ट ब्लॉब डिटेक्टर विधि, "बेस ब्लॉब डिटेक्टर" का चयन करके ट्रैकिंग के लिए लक्ष्य के रूप में लाल प्रोफ़ाइल-कवर फ्लाई को परिभाषित करें। (सी) चित्रा 3 ए, 6 में "सेट लास्ट फ्रेम" टूल का उपयोग करके फ्रेम 901 को अंतिम फ्रेम के रूप में सेट करें। कुल फ्रेम संख्या की गणना सूत्र "फ्रेम नंबर = एफपीएस * रिकॉर्डिंग समय" द्वारा की जाती है। (डी ) ट्रैकिंग खुली हुई वीडियो विंडो (बाएं पैनल अनुभाग) में ब्लॉब्स दिखाने के बाद पीले आयत बॉक्स के साथ उड़ती है। बढ़े हुए बाएं पैनल में, फल मक्खियों को लाल (दाएं पैनल खंड) में जोड़ा जाता है। स्केल बार = 1 सेमी. (E) "D" (ऊपरी पैनल अनुभाग ) में लाल आयत का चयन करने के लिए क्लिक करने के बाद लाल आयत बॉक्स के साथ ट्रैकिंग फ्लाई। ऊपरी पैनल वृद्धि में, फल मक्खियों को लाल (निचला पैनल खंड) में जोड़ा जाता है। सुनिश्चित करें कि ट्रैकिंग फ्लाई के चारों ओर एक पीले आयत का चयन खुली वीडियो विंडो में पूरा हो गया है। खुली हुई वीडियो विंडो में चयन पूरा करें, और फ्लाई को फिजी द्वारा सभी फ्रेम में पहचाना जाएगा। स्केल बार = 1 सेमी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: ट्रैकिंग ट्रेस के परिणाम। ट्रैकिंग ट्रेस को खुली वीडियो विंडो ( ए ) और प्रोसेसिंग विंडो (बी) में अलग से दिखाया गया है। ट्रैकिंग ट्रेस प्रोफ़ाइल प्राप्त करने के लिए, मूल वीडियो विंडो में प्रगति बार पर क्लिक करें और ट्रेस की निरंतरता की जांच करने के लिए प्रगति बार को स्लाइड करें। ट्रैकिंग ट्रेस मक्खियों की रेंगने वाली दूरी को सहज रूप से प्रस्तुत करता है। स्केल बार = 1 सेमी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 8
चित्रा 8: एनिमलट्रैकर प्लगइन्स का उपयोग कर फ़ाइल विश्लेषण को ट्रैक करना। (ए) ट्रैकिंग विश्लेषक ट्रैकिंग फ़ाइल के विस्तृत विश्लेषण की सुविधा प्रदान करता है; लाल आयत से चिह्नित प्रत्येक चरण को एक संख्या द्वारा निरूपित किया जाता है। (बी) ए, 4 में "ज़ोन सेटिंग्स" पैरामीटर सेट करें। लाल आयत में चार पैरामीटर, समय, दूरी, गतिहीनता समय और वेग वेक्टर दिखाए गए हैं। पैरामीटर वांछित परिणाम के आधार पर चुना जाता है। (C-G) ए,5 की "सेट पैरामीटर" विंडो में कॉन्फ़िगरेशन पैरामीटर को व्यक्तिगत रूप से सेट करें। (सी) चार समायोज्य पैरामीटर "कॉन्फ़िगरेशन पैरामीटर सेटिंग्स" विंडो में चित्रित किए गए हैं, (डी-जी) क्रमशः "समय सेटिंग्स", "गतिहीनता समय सेटिंग", "दूरी सेटिंग्स" और "वेग वेक्टर सेटिंग" विंडो का प्रदर्शन करते हैं। पैरामीटर सेटिंग्स के लिए डिफ़ॉल्ट मान संशोधित करना अनुशंसित नहीं है. हालांकि, "फ्रेम अंतराल" के लिए, पैरामीटर की गणना सूत्र "फ्रेम अंतराल = 1/एफपीएस" का उपयोग करके की जानी चाहिए जब वीडियो के एफपीएस को बदल दिया जाता है। इसके अलावा, एक मक्खी की ट्रैकिंग के साथ दर्ज किए गए पिक्सेल को मूर्त मूल्य से सहसंबंधित करके वास्तविक दूरी और वेग का पता लगाने के लिए एक ज्ञात पैमाने को नियोजित करना संभव है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 9
चित्रा 9: ट्रैकिंग फ़ाइल विश्लेषण प्रदर्शित करने वाला परिणाम। (ए) चित्रा 8 ए, 6 की स्थापना। डेटा प्रदर्शित करने के दो तरीके उपलब्ध हैं: "ज़ोन द्वारा समूहीकृत" और "मापदंडों द्वारा समूहीकृत"। (बी) ट्रैकिंग फ़ाइल विश्लेषण के परिणाम "ए, 6.1" में "ज़ोन द्वारा समूहीकृत" के रूप में दिखाए गए हैं। (C-F) ट्रैकिंग फ़ाइल विश्लेषण के परिणामों को ए,6.2 में "मापदंडों द्वारा समूहीकृत" के रूप में दिखाया गया है, जो अलग-अलग "गतिहीनता समय" (सी), "वेग वेक्टर" (डी), "समय" (ई), और "दूरी" (एफ) प्रदर्शित करता है। गतिहीनता समय और दूरी के परिणामों को "एस" और "पिक्सेल" के रूप में निर्धारित किया जाता है। वेग वेक्टर की इकाई को "पिक्सेल / एस" के रूप में परिभाषित किया जाना चाहिए, और एनोटेशन "लंबाई" के साथ आउटपुट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 10
चित्रा 10: प्रति एफपीएस गति के लिए डेटा विश्लेषण के परिणाम। (ए, सी, और ई) निर्यात डेटा में क्षैतिज (कॉलम "सी") और ऊर्ध्वाधर (कॉलम "डी") विभाजन में पिक्सेल के निर्देशांक, साथ ही दो-फ्रेम अंतराल (क्रमशः ए, सी और ई में कॉलम "ई") के बीच पिक्सेल की गति, गतिहीनता और दिशा परिवर्तन कोण शामिल हैं, जो स्वचालित रूप से संदर्भ में वर्णित सूत्र द्वारा गणना की जाती है। चूंकि फिजी से निर्यात किए गए परिणाम पाठ दस्तावेज़ हैं, इसलिए फ़ाइल को Microsoft Office Excel के साथ खोलने और उनके बीच रिक्त स्थान जोड़कर डेटा को तीन स्तंभों में विभाजित करने की अनुशंसा की जाती है। (B, D और F) एक लाइन चार्ट पिक्सेल (बी) के आंदोलन के डेटा सेट से परिकलित परिणाम प्रदर्शित करता है। वैश्विक शिखर मूल्य वेग का प्रतिनिधित्व करता है, गति का पता लगाने की क्षमताओं का संकेत देता है; स्तंभ चार्ट गतिहीनता (D) के डेटा सेट से परिकलित परिणाम प्रदर्शित करता है. कॉलम चार्ट में स्पर्श की डिग्री गतिहीनता का प्रतिनिधित्व करती है, जो मक्खियों की मोटर क्षमता दोष को प्रदर्शित करती है; एक स्कैटर आरेख दिशा परिवर्तन कोण (एफ) के डेटा सेट से गणना किए गए परिणामों को प्रदर्शित करता है। स्कैटर आरेख में दिखाए गए छींटों का संवर्धन मक्खी द्वारा चुनी गई दिशा का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 11
चित्रा 11: रोटेनोन के साथ या बिना इलाज की गई मक्खियों के बीच आंदोलन का तुलनात्मक विश्लेषण। (ए) डब्ल्यू1118 वयस्क मक्खियों के ट्रैकिंग ट्रेस के प्रतिनिधि ग्राफ ़ दिखाए गए हैं जिन्हें नियंत्रण के लिए 500 μM रोटेनोन या DMSO युक्त मानक भोजन के साथ खिलाया जाता है। डब्ल्यू1118 मक्खियों को एकत्र किया गया और फिर 500 μM रोटेनोन या DMSO, 25 ° C और 60% आर्द्रता के साथ मानक भोजन से युक्त एक नियंत्रित वातावरण में रखा गया। 48 घंटे के बाद प्रत्येक समूह से विश्लेषण के लिए छह मक्खियों का उपयोग किया गया था। परिणाम से पता चलता है कि रोटेनोन के साथ खिलाए गए मक्खियों को ट्रैक करने की गति दूरी नियंत्रण की तुलना में काफी कम हो गई है। परिणाम ने रोटेनोन के साथ खिलाए गए मक्खियों में एक दोषपूर्ण मोटर क्षमता प्रदर्शित की। (B-E) फिजी का उपयोग करके यात्रा की गई औसत दूरी, गतिहीनता समय, औसत वेग और अधिकतम वेग पर रोटेनोन उपचार का मात्रात्मक विश्लेषण किया जाता है। रोटेनोन उपचार के परिणामों ने यात्रा की गई दूरी और औसत वेग में उल्लेखनीय कमी और गतिहीनता समय में उल्लेखनीय वृद्धि दिखाई। (F-K) रोटेनोन (जी, आई, के) या डीएमएसओ (एफ, एच, जे) के साथ इलाज की जाने वाली मक्खियों के बीच पिक्सेल प्रति फ्रेम (एफ, जी), गतिहीनता समय प्रति फ्रेम (एच, आई), और दिशा परिवर्तन के कोण (जे, के) का विश्लेषण। आंदोलन की गति पर रोटेनोन के प्रभावों को दर्शाने वाले उदाहरण ग्राफ नियंत्रण (एफ) की तुलना में रोटेनोन (जी) के साथ खिलाए गए मक्खियों में प्रति फ्रेम अंतराल में आंदोलन की गति का प्रतिनिधित्व करने वाली कम चोटियां दिखाते हैं, जो लोकोमोटर गतिविधि दोष (एफ, जी) की गंभीरता को दर्शाता है। प्रति फ्रेम स्थानांतरित पिक्सेल का अंतर्ज्ञानात्मक गतिहीनता स्तंभ कम है, जो नियंत्रण मक्खियों (एच) की तुलना में रोटेनोन-खिलाए गए मक्खियों (आई) के लिए 1 मिनट के भीतर काफी कम आंदोलन दिखाता है। रोटेनोन-फेड (के) और नियंत्रण (जे) जानवरों में दिशा परिवर्तन के गतिशील कोण के उदाहरण ग्राफ मक्खियों द्वारा चुनी गई दिशा में परिवर्तन को प्रकट करते हैं। डेटा छह नर मक्खियों के औसत ± एसईएम हैं जिनकी 1 मिनट के लिए निगरानी की जाती है। तारांकन समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर को इंगित करते हैं (**p < 0.001; अप्रकाशित टी-टेस्ट, p = 0.05)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 12
चित्रा 12: रोटेनोन के साथ या बिना इलाज किए गए लार्वा के बीच आंदोलन का तुलनात्मक विश्लेषण। (ए) रोटेनोन या डीएमएसओ के साथ खिलाए गए डब्ल्यू1118 तीसरे इनस्टार लार्वा के निशान को ट्रैक करके लोकोमोटर गतिविधि की तुलना के प्रतिनिधि परिणाम। संक्षेप में, डब्ल्यू1118 तीसरे इनस्टार लार्वा को 60% आर्द्रता के साथ 25 डिग्री सेल्सियस वातावरण में 10% सुक्रोज, या 500 μM रोटेनोन युक्त 10% सुक्रोज में एकत्र और सुसंस्कृत किया गया था। विश्लेषण के लिए प्रति समूह छह लार्वा का उपयोग किया गया था। लार्वा की धीमी गति को ध्यान में रखते हुए, 5 मिनट की अवधि में डेटा रिकॉर्डिंग को गति पर रोटेनोन के प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए परिमाणित और विश्लेषण किया गया है। (B-E) फिजी में विश्लेषण किए गए दो समूहों की औसत दूरी, गतिहीनता समय, औसत वेग और अधिकतम वेग का मात्रात्मक विश्लेषण किया जाता है। मात्रात्मक परिणाम बताते हैं कि रोटेनोन के साथ खिलाए गए लार्वा में आंदोलन दूरी, औसत वेग और अधिकतम वेग में काफी कमी आती है, और रोटेनोन के साथ खिलाए गए लार्वा में गतिहीनता का समय काफी बढ़ जाता है। (F-K) वयस्क मक्खियों के समान, प्रति फ्रेम पिक्सेल के विश्लेषण, गतिहीनता समय, और रोटेनोन (जी, आई, के) और रोटेनोन (एफ, एच, जे) के बिना इलाज की गई मक्खियों के बीच दिशा परिवर्तन के कोण से पता चला है कि रोटेनोन के साथ इलाज किए गए लार्वा में आंदोलन की गति कम थी, अधिक गतिहीनता समय था, और उनकी दिशाओं को वैकल्पिक किया गया था। परिणाम बताते हैं कि रोटेनोन के साथ खिलाए गए लार्वा को ट्रैक करने का व्यवहार आंदोलन नियंत्रण की तुलना में काफी बिगड़ा हुआ है। परिणाम रोटेनोन के साथ खिलाए गए मक्खियों की एक दोषपूर्ण लोकोमोटर गतिविधि प्रदर्शित करते हैं। डेटा छह 3-दिवसीय लार्वा के औसत ± एसईएम हैं जिनकी 5 मिनट के लिए निगरानी की जाती है। तारांकन समूहों के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर को इंगित करता है (* p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; अप्रकाशित t-test, p = 0.05)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: ड्रोसोफिला में लोकोमोटर गतिविधि की मात्रा का परिमाणन के लिए पशु-ट्रैकिंग-आधारित पद्धतियों की तुलना। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

हमने फिजी छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम के साथ संगत ओपन-सोर्स सामग्री एनिमलट्रैकर एपीआई के आधार पर एक विधि तैयार की है, जो शोधकर्ताओं को वयस्क और व्यक्तिगत लार्वा मक्खियों दोनों को ट्रैक करके लोकोमोटर गतिविधि का व्यवस्थित रूप से मूल्यांकन करने में सक्षम बना सकती है। एनिमलट्रैक जावा में लिखा गया एक उपकरण है जिसे एप्लिकेशन-डिज़ाइन किए गए पशु-ट्रैकिंग व्यवहार24 के विश्लेषण की सुविधा के लिए मौजूदा डेटाबेस या अन्य उपकरणों में आसानी से एकीकृत किया जा सकता है। एक सॉफ्टवेयर गणना सूत्र द्वारा फ्रेम-दर-फ्रेम विश्लेषण पर जो वयस्कों और लार्वा की लोकोमोटर गतिविधि को निर्धारित करता है, आंदोलन की गति, यात्रा की दूरी, गतिहीनता और दिशा परिवर्तन के कोण सहित कई मापदंडों का लचीले ढंग से विश्लेषण किया जा सकता है। ये पैरामीटर, जो व्यवहार हरकत के विभिन्न पहलुओं का प्रतिनिधित्व करते हैं, को समय के साथ लोकोमोटर परिवर्तनों को चित्रित करने के लिए प्लॉट किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, एक ग्राफिकल यूजर इंटरफेस बनाकर, इसके उपयोग पर विस्तृत प्रलेखन प्रदान करके, और एक एप्लिकेशन प्रोग्रामिंग इंटरफ़ेस, हम इस विधि को उन शोधकर्ताओं के लिए सुलभ बनाने का लक्ष्य रखते हैं जिनके पास प्रोग्रामिंग अनुभव की कमी है और कस्टम प्रयोगात्मक प्रतिमान बनाने वाले अनुभवी उपयोगकर्ता हैं।

यह सत्यापित करने के लिए कि विधि व्यवहार की सटीक निगरानी कर सकती है, रोटेनोन के साथ इलाज किए गए वयस्क मक्खियों और लार्वा के लोकोमोटर परीक्षण, साथ ही दवा के विलायक के साथ खिलाए गए नियंत्रण मक्खियों की तुलना में उनकी मोटर गतिविधि की तुलना की गई है। फिजी सॉफ्टवेयर, अपने प्लगइन्स के साथ, आंदोलन की वीडियो रिकॉर्डिंग में प्रत्येक फ्रेम के पिक्सेल निर्देशांक का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया जाता है, जिससे प्रयोगात्मक मक्खियों की गति, दूरी और अन्य मापदंडों की गणना की अनुमति मिलती है। हमने रोटेनोन प्रशासन (चित्रा 11) में समय के साथ यात्रा की गई दूरी में उल्लेखनीय कमी देखी, जो रिपोर्ट किए गए परिणामों23 के अनुरूप है। इस बीच, बढ़ती गति की गति और असामान्य दिशा को दवा-पोषित समूहों में देखा गया है, ताकि मक्खियों में व्यवहार की कमी के अधिक विवरण को चित्रित करने में मदद मिल सके। वयस्क मक्खियों की लोकोमोटर गतिविधि का पता लगाने में सफलता को देखते हुए, हमने तब लार्वा की गतिशीलता का मूल्यांकन करने की मांग की (चित्रा 12)। नियंत्रण की तुलना में, रोटेनोन के साथ खिलाए गए ट्रैकिंग लार्वा के परिणाम काफी बिगड़ा हुआ था, जो दवाओं के साथ खिलाए गए वयस्क मक्खियों के समानांतर था। वयस्कों और रोटेनोन के साथ खिलाए गए लार्वा के साथ प्रयोगों से पता चलता है कि यह विधि नियंत्रण की तुलना में लोकोमोटर घाटे का उत्पादन करने वाली मक्खियों की कमी को सटीक रूप से रिकॉर्ड कर सकती है। इस रिपोर्ट ने जानवरों में परीक्षण मॉडल या औषधीय अनुसंधान में लोकोमोटर क्षमता और फल मक्खियों के व्यवहार दोषों के अन्य पहलुओं को निर्धारित करने और विश्लेषण करने में वर्तमान विधि के अनुप्रयोगों का सफलतापूर्वक प्रदर्शन किया है।

यह सुनिश्चित करने के लिए कि वीडियो और ट्रैकिंग विश्लेषण सफल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम देता है, निम्नलिखित दिशानिर्देशों का पालन करने की सिफारिश की जाती है। सबसे पहले, वीडियो फ्रेम दर की पसंद के लिए, हम रिकॉर्ड किए गए वीडियो को 15 फ्रेम प्रति सेकंड (एफपीएस) के प्रारूप में परिवर्तित करने की सलाह देते हैं। यह न केवल अच्छी गति ट्रैकिंग बनाए रख सकता है, बल्कि विशाल मात्रा में डेटा के कारण कंप्यूटर विश्लेषण की धीमीता से भी बच सकता है। वीडियो फ्रेम दर में सुधार करके, गति प्रक्षेपवक्र विश्लेषण अधिक विस्तृत हो जाता है। दूसरे, प्रत्येक दो फ्रेम के बीच स्थैतिक गति का विश्लेषण करते समय सूत्र में मापदंडों को संबंधित प्रयोगात्मक योजना के अनुरूप समायोजित किया जा सकता है। लार्वा लोकोमोटर निगरानी के लिए, अगर के बजाय सिलिका जेल का उपयोग करना आवश्यक है, क्योंकि ठोस सिलिका जेल तंग है और लार्वा इसमें नहीं जा सकता है। इसके अलावा, सिलिका जेल पारदर्शी है और इष्टतम पृष्ठभूमि का उत्पादन करने के लिए रंग पदार्थ जोड़कर रंगा जा सकता है, वांछित ऑप्टिकल प्रभावों की सुविधा प्रदान करता है जो छवि की गुणवत्ता को बढ़ाते हैं।

एटियलजि, तंत्रिका विज्ञान और व्यवहार आनुवंशिकी समुदायों के लिए व्यापक समाधान प्रदान करने के लिए पशु ट्रैकिंग सिस्टम को उन्नत किया जा रहा है। तालिका 1 वर्तमान में उपलब्ध कई ट्रैकिंग कार्यक्रमों की विशेषताओं की तुलना प्रदान करती है 10,11,12,16,17,25,26. यह दृष्टिकोण बेहद लागत प्रभावी, सीखने के लिए सरल है, और महंगे सॉफ्टवेयर और उपकरणों की आवश्यकता के बिना लोकोमोटर व्यवहार को मापने में सटीक है। इसमें कोई संदेह नहीं है कि इस विधि को अन्य ड्रोसोफिला जैसे पशु मॉडल और यहां तक कि चूहों और चूहों जैसे बड़े जानवरों के लिए भी आसानी से बढ़ाया जा सकता है। एनिमलट्रैकर एपीआई की संरचना को स्वतंत्र इमेजजे अनुप्रयोगों या प्लगइन्स के माध्यम से आसानी से बढ़ाया जा सकता है, जो कस्टम व्यवहार अनुसंधानऔर विश्लेषण के लिए उपयोगी टूलकिट की एक विस्तृत श्रृंखला प्रदान करता है। फिर भी, इस अध्ययन में कुछ प्रतिबंध हैं। चूंकि एक एकल मक्खी को छवि रिकॉर्डिंग के लिए एक खुले क्षेत्र के क्षेत्र में रखा जाता है और वीडियो ट्रैकिंग व्यक्तिगत रूप से आयोजित की जाती है, इसलिए यह विधि अक्षम और समय लेने वाली है। हमने एक साथ कई क्षेत्रों को रिकॉर्ड करने की क्षमता का विस्तार करने का प्रयास किया है, जिससे छह व्यक्तिगत रिकॉर्डिंग की अनुमति मिलती है। सैद्धांतिक रूप से ड्रोसोफिला की अधिक संख्या को एक साथ रिकॉर्ड करना संभव है; यह अखाड़े के आकार और कैमरे के विन्यास पर निर्भर करता है। वैकल्पिक रूप से, यदि उपयोगकर्ता समूहीकृत ड्रोसोफिला को रिकॉर्ड करना चाहते हैं, तो मक्खियों के बीच टकराव और ओवरलैप की पहचान करने के लिए एकल रिकॉर्ड की सीमित संख्या और पर्याप्त गुणवत्ता के विन्यास पर विचार करने की सिफारिश की जाती है। मशीन लर्निंग द्वारा परीक्षण दक्षता में सुधार को अध्ययन में नहीं माना गया था, क्योंकि एक किफायती और संगत दृष्टिकोण का पता नहीं लगाया गया है जिसे वर्तमान प्रणाली के साथ एकीकृत किया जा सकता है ताकि पहचान को नेत्रहीन रूप से अलग किया जा सके और मॉडल को सटीक रूप से ट्रैक किया जा सके।

सारांश में, यहां वर्णित विधि मुक्त, ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर के आधार पर एक कुशल और सीधा दृष्टिकोण विकसित और मान्य करती है, जिसे समय की खपत को कम करने और लार्वा और वयस्क चरणों में ड्रोसोफिला हरकत को मात्रात्मक रूप से इंगित करने और विश्लेषण करने के लिए प्रयोगात्मक तकनीकों को परिष्कृत करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। व्यवस्थित विश्लेषण के माध्यम से, यह विधि हमें यह समझने में मदद कर सकती है कि आंदोलन के दौरान समय के साथ जानवर का वेग कैसे बदलता है, साथ ही दिशात्मक चयन की विशेषताएं भी। इस प्रकार, आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले डिजिटल उपकरणों में ओपन-सोर्स सॉफ़्टवेयर का समावेश विभिन्न फ्लाई मॉडल में लोकोमोटर गतिविधि का परीक्षण करने का एक विश्वसनीय तरीका प्रदान करता है। यह ड्रोसोफिला के साथ-साथ अन्य जानवरों में औषधीय उपचार और ट्रांसजेनिक संशोधन से प्राप्त न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग मॉडल के परीक्षण में शारीरिक और पैथोलॉजिकल लोकोमोटर आउटपुट का मूल्यांकन करने के लिए उपयोगी हो सकता है।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं हैं।

Acknowledgments

इस काम को सूचो विश्वविद्यालय और चीन के राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (एनएसएफसी) (82171414) से एक विशेष लॉन्च फंड द्वारा समर्थित किया गया था। हम प्रोफेसर चुनफेंग लियू के प्रयोगशाला सदस्यों को उनकी चर्चा और टिप्पणियों के लिए धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Animal tracker Hungarian Brain Research Program version: 1.7 pfficial website: http://animaltracker.elte.hu/main/downloads
Camera software Microsoft version: 2021.105.10.0 built-in windows 10 system
Computer DELL Vostro-14-5480 a comupter running win 10 system is available
Drosophila carbon dioxide anesthesia workstation Wu han Yihong technology #YHDFPCO2-018 official website: http://www.yhkjwh.com/
Fiji software Fiji team version: 1.53v official website: https://fiji.sc/
Format factory software Pcfreetime version: X64 5.4.5 official website: http://www.pcfreetime.com/formatfactory/CN/index.html
Graph pad prism GraphPad Software version: 8.0.2 official website: https://www.graphpad-prism.cn
Hight definition camera TTQ Jingwang2 (HD1080P F1.6 6-60mm) official website: http://www.ttq100.com/product_show.php?id=35
Office software Microsoft version: office 2019 official website: https://www.microsoftstore.com.cn/software/office
Petri dish Bkman 110301003 size: 60 mm
Silica gel DOW SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit Mix well according to the instructions
Sodium bicarbonate Macklin #144-55-8 Mix well with silica gel

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