Summary
Het huidige protocol beoordeelt de locomotorische activiteit van Drosophila door de beweging van vliegen in een handgemaakte arena te volgen en te analyseren met behulp van open-source software Fiji, compatibel met plug-ins om pixels van elk frame te segmenteren op basis van high-definition video-opname om parameters van snelheid, afstand, enz. Te berekenen.
Abstract
Drosophila melanogaster is een ideaal modelorganisme voor het bestuderen van verschillende ziekten vanwege de overvloed aan geavanceerde genetische manipulatietechnieken en diverse gedragskenmerken. Het identificeren van gedragsdeficiëntie in diermodellen is een cruciale maat voor de ernst van de ziekte, bijvoorbeeld bij neurodegeneratieve ziekten waarbij patiënten vaak stoornissen in de motorische functie ervaren. Met de beschikbaarheid van verschillende systemen om motorische tekorten in vliegmodellen te volgen en te beoordelen, zoals met geneesmiddelen behandelde of transgene personen, ontbreekt het echter nog steeds aan een economisch en gebruiksvriendelijk systeem voor nauwkeurige evaluatie vanuit meerdere hoeken. Een methode op basis van de AnimalTracker application programming interface (API) is hier ontwikkeld, die compatibel is met het Fiji-beeldverwerkingsprogramma, om systematisch de bewegingsactiviteiten van zowel volwassen als larvale individuen van opgenomen video te evalueren, waardoor de analyse van hun trackinggedrag mogelijk is. Deze methode vereist alleen een high-definition camera en een computerrandapparatuurintegratie om gedrag vast te leggen en te analyseren, waardoor het een betaalbare en effectieve aanpak is voor het screenen van vliegmodellen met transgene of omgevingsgedragsgebreken. Voorbeelden van gedragstests met farmacologisch behandelde vliegen worden gegeven om te laten zien hoe de technieken gedragsveranderingen bij zowel volwassen vliegen als larven op een zeer herhaalbare manier kunnen detecteren.
Introduction
Drosophila melanogaster biedt een uitstekend modelorganisme voor het onderzoeken van cellulaire en moleculaire functies in neuronale ziektemodellen gemaakt door genmodificatie1, medicamenteuze behandeling2 en senescentie3. Het hoge behoud van biologische routes, fysieke eigenschappen en ziekte-geassocieerde homologe genen tussen mensen en Drosophila maakt de fruitvlieg een ideale nabootsing van het moleculaire naar het gedragsniveau4. In veel ziektemodellen is gedragsdeficiëntie een belangrijke index, die een nuttig model biedt voor verschillende menselijke neuropathieën 5,6. Drosophila wordt nu gebruikt om meerdere menselijke ziekten, neurologische ontwikkeling en neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Parkinson en amyotrofische laterale sclerose te bestuderen 7,8. Het detecteren van het motorisch vermogen van de ziektemodellen is cruciaal voor het begrijpen van de pathogene vooruitgang en kan een fenotypische correlatie bieden met de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan het ziekteproces.
Onlangs zijn commercieel beschikbare softwaretools en kosteneffectieve programma's ontwikkeld voor Drosophila locomotorische detectiestrategieën, zoals high-throughput testen in gegroepeerde vliegen 9,10 en het meten van voortbeweging in real-time11,12. Een dergelijke conventionele benadering is snelle interactieve negatieve geotaxis (RING), ook wel de klimtest genoemd, die meerdere kanalen omvat waarmee een grote vliegenpopulatie met hetzelfde geslacht en dezelfde leeftijd kan worden ingeperkt, waardoor variatie wordt verminderd terwijl gegevens 9,13 worden verzameld. Een andere pre-testmethode voor het analyseren van locomotorisch gedrag is TriKinetics Drosophila activity monitor (DAM), een apparaat dat meerdere bundels gebruikt om vliegactiviteitsbewegingen in een dunne glazen buiste detecteren 14. Het apparaat registreert continu de positie, wat de geautomatiseerde voortbeweging vertegenwoordigt door de balkkruisingen te berekenen om de activiteit en het circadiane ritme van vliegen over een langere periode te bestuderen15. Hoewel deze methoden op grote schaal zijn gebruikt bij het analyseren van gedragsdefecten bij fruitvliegen om veranderingen in gedragsvoortbeweging te bepalen, vereisen ze altijd speciale testapparatuur of complexe analyseprocessen en beperken ze hun toepassing in sommige modellen met een beperkt, eenvoudig apparaat. Diertraceringsgroepgebaseerde strategieën voor het testen van de volwassen Drosophila, zoals FlyGrAM11 en de Drosophila-eilandtest 10, implementeren sociale rekrutering en individuele tracking in een vooraf gedefinieerd gebied. Niettemin kan sociale individuele beperking in getrotseerde gebieden een negatief effect hebben op identificaties in de beelden, veroorzaakt door de botsing of overlapping van vliegen. Hoewel sommige op open-source materialen gebaseerde methoden, zoals TRex16, MARGO 12 en FlyPi17, een noodgeval hebben, kunnen ze de vliegen snel traceren met flexibel gebruik in gedragstests. Deze testbenaderingen worden geassocieerd met uitgebreide experimentele apparaatinstallaties, speciale softwarevereisten of professionele computertalen. Voor larven zijn het meten van de totale afgelegde afstand over het aantal rastergrenslijnen per tijdseenheid18, of het ruw tellen van de lichaamswandcontracties voor individuen handmatig19, de belangrijkste methoden om hun motorische vermogen te beoordelen. Vanwege het gebrek aan precisie in apparatuur of apparaten en analysemethoden, kan enige gedragsbeweging van larven aan detectie ontsnappen, waardoor het moeilijk wordt om gedragsbewegingen nauwkeurig te beoordelen, vooral fijne beweging15.
De huidige ontwikkelde methode maakt gebruik van de AnimalTracker application programming interface (API), compatibel met het Fiji (ImageJ) beeldverwerkingsprogramma, om systematisch de locomotorische activiteit van zowel volwassen als larvale vliegen te evalueren door hun trackinggedrag van high-definition (HD) video's te analyseren. Fiji is een open-source software ImageJ-distributie die robuuste softwarebibliotheken kan combineren met tal van scripttalen, wat resulteert in snelle prototyping van beeldverwerkingsalgoritmen, waardoor het populair is bij biologen vanwege de beeldanalysemogelijkheden20. In de huidige aanpak wordt de integratie van Fiji in de AnimalTracker API gebruikt om een unieke Drosophila-gedragstest te ontwikkelen met gepersonaliseerde algoritme-invoeging, en biedt een nuttige stap voor gedetailleerde documentatie en tutorials ter ondersteuning van robuuste analytische mogelijkheden van locomotorisch gedrag (figuur 1). Om de complicatie van objectieve identificaties in de beelden veroorzaakt door de botsing of overlapping van vliegen te omzeilen, is elke arena beperkt tot het hosten van slechts één vlieg. Na het beoordelen van de trackingprecisie van de aanpak, werd het geïmplementeerd om de locomotorische bewegingen van Drosophila te traceren en te kwantificeren die werden toegediend met het toxische medicijn rotenon, dat over het algemeen wordt gebruikt voor diermodellen van de ziekte van Parkinson, en uiteindelijk locomotiestoornissen ontdekte in de medicamenteuze behandeling21. Deze methodologie, die open-source en vrije software gebruikt, vereist geen dure instrumentatie en kan de gedragsbeweging van Drosophila nauwkeurig en reproduceerbaar analyseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
W1118 volwassen vliegen en derde instar larven werden gebruikt voor de huidige studie.
1. Experimentele voorbereiding
OPMERKING: Een open-veld arena voor Drosophila locomotion tracking is gemaakt metacolorless en geurloze silicagel.
- Meng reagens A en reagens B in een verhouding van 1:10, volgens de instructies van de fabrikant voor de silicakit (zie materiaaltabel). Zorg ervoor dat natriumbicarbonaat aan het mengsel wordt toegevoegd door te roeren totdat de kleur wit wordt. Breng het mengsel over in een schone petrischaal en plaats het in een oven op 40 °C om gedurende 48 uur te drogen.
- Plaats de HD-camera (zie Materiaaltabel) op een statief en stel deze zo in dat de cameralens loodrecht op het oppervlak van de silica-arena staat. Door de brandpuntsafstand en de diafragma's van de camera aan te passen, moet u ervoor zorgen dat de camera op het oppervlak van het silica is gericht en dat het display voldoende wordt verlicht. De experimentele opzet wordt geïllustreerd in figuur 1.
- Breng een vlieg over in de open arena om een continue video van ten minste 61 s op te nemen.
OPMERKING: Gezien de trage aard van larven, wordt een video-opnametijd van meer dan 10 minuten aanbevolen.- Open de video met Fiji, sleep de voortgangsbalk naar het beginframe en keur stilzwijgend goed. Kies het hele lichaam van de vlieg met behulp van het gereedschap "selectie uit de vrije hand" (figuur 2B, C).
- Klik op de afbeelding > pas > helderheid en contrast aan om de witbalans aan te passen totdat de grijswaarde van het geselecteerde gebied de brede achtergrond nadert (figuur 2D-F).
OPMERKING: Achtergrondhomogenisatie van het eerste frame stelt de software in staat om de achtergrond zonder objecten te onderscheiden en een contrast te creëren wanneer een vlieg aanwezig is, waardoor de software deze kan volgen.
- Voer het hele experiment uit in een testomgeving die is ingesteld op 25 °C en 60% relatieve vochtigheid, in een ruimte die stil is en verstoken van blootstelling aan fel licht.
2. Video-opname en voorbewerking
- Na een korte periode van anesthesie met behulp van95% koolstofdioxide (CO2), breng je een vlieg over naar de open arena en druk je op de opnameknop op de cameratoepassing om de video-opname te starten.
OPMERKING: Om het effect van de verdoving op de voortbeweging te minimaliseren, laat u de vliegen 10 minuten herstellen voordat u de video-opname start. Koel-verdoving door koelen wordt ook aanbevolen.- Zodra de vliegen herstellen van de anesthesie, plaatst u de arenaschotel met de vlieg onder de camera en schudt u de plaat snel van links naar rechts om ervoor te zorgen dat de vlieg in beweging is wanneer de opname begint.
- Druk na voltooiing van de opname op de stopknop om de video-opname te beëindigen.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de video-opnametijd de tijd voor het volgen van de bestemming met een kleine marge iets overschrijdt. Om de experimentele efficiëntie te verbeteren, is het bovendien mogelijk om meerdere vliegen spontaan te volgen. Dit is afhankelijk van de resolutie van de camera om een video-uitsnede van hoge kwaliteit mogelijk te maken. - Converteer de opgenomen video's naar AVI-formaat met MJPEG-codering, zodat ze kunnen worden geopend en geanalyseerd met Fiji. Stel ondertussen de frames per seconde (fps) snelheid van de video in op 15 fps voor volwassen vliegen en 12 fps voor larven.
3. Video-analyse
- Open de video die is getransformeerd met "gebruik virtuele stapel" en "converteren naar grijswaarden", twee opties in het pop-upvenster bij het openen van de video met Fiji (figuur 2A).
- Maak een leeg eerste frame, zoals hierboven vermeld.
- Verkrijg een verwerkingsvenster met behulp van de tool "actieve afbeelding instellen" van de AnimalTracker-plug-in en maak een trackinggebied dat de arena in het oorspronkelijke videovenster omcirkelt met behulp van het gereedschap "ovaal" (figuur 3A).
- Stel de filters (Figuur 3A,3) en de parameters van de twee filters (Figuur 4A-G) in voor het eerste lege frame in het verwerkingsvenster. Selecteer vervolgens het volgende frame in het originele videovenster en kies het gefilterde oppervlak van het verwerkingsvenster (figuur 5A-C).
OPMERKING: De filterstap dient om beeldruis te verminderen en/of de achtergrond te verwijderen, waardoor het eenvoudiger wordt om de voorgrond van de achtergrond te scheiden in de binarisatie van de frames. - Zodra een gefilterd verwerkingsvenster is geselecteerd, draait u de gevolgde vlieg met een rood profiel bedekt in het verwerkingsvenster met behulp van het gereedschap "drempel instellen" (figuur 3A,4, figuur 5D-E en figuur 6A).
- Gebruik de "set blob-detector" om de computer de vlieg te laten herkennen met een rood profiel bedekt in het verwerkingsvenster (figuur 3A,5 en figuur 6B).
- Stel frame 901 in als het laatste frame voor de volwassen vlieg, berekend op basis van de opnameduur en fps van de video (figuur 3A,6, figuur 6C).
OPMERKING: Het volgende experiment met larven is gedurende 10 minuten gevolgd, dus frame 7200 is ingesteld als het laatste frame. - Gebruik het gereedschap "blobs weergeven" om een trackingrechthoek in het oorspronkelijke videovenster weer te geven (figuur 3A,7 en figuur 6D,E). Start vervolgens de tracking en exporteer het trackingbestand nadat de monitoring is voltooid (figuur 3A,8,9 en figuur 7A,B).
4. Bestandsanalyse bijhouden
- Laad de track- en zonebestanden met de plug-in Animal tracker > Tracking analyzer (Figuur 8A).
- Selecteer de gewenste index met behulp van zone-instellingen en wijzig de parameterinstellingen (Afbeelding 8). Bereken de tijd van het frame-interval met behulp van de framesnelheid.
OPMERKING: In deze situatie is de framesnelheid 15 fps en is het frame-interval ongeveer 0,067 s, wat de standaardinstelling is (Figuur 8D). - Produceer de kwantitatieve analysegrafieken met behulp van de spreadsheetsoftware en GraphPad Prism na analyse in tracking analyzer (figuur 9).
5. Analyse per frame
- Voer snelheidsanalyses uit per frame-interval. Analyseer het trackbestand zonder Fiji als er meer gedetailleerd onderzoek nodig is.
- Open het trackbestand, kopieer alle coördinaten naar Microsoft Office Excel en splits de cellen met de spatietoets.
OPMERKING: Zodra het bestand bijvoorbeeld is verdeeld in de kolommen "C" en "D", wordt de snelheid van Drosophila per frame-interval berekend met de formule SQRT((C5-C4)^ 2+(D5-D4)^2), die wordt weergegeven in de kolom "E" (Figuur 10A). De gegevens in kolom "E" geven het aantal pixels aan dat de vlieg tussen twee frames heeft verplaatst, waarbij het eerste frame niet in aanmerking wordt genomen. Selecteer alle berekende resultaten en voeg een lijndiagram in om een intuïtieve vliegbewegingssnelheid per frame-interval weer te geven, met een piek in het lijndiagram (figuur 10B).
- Open het trackbestand, kopieer alle coördinaten naar Microsoft Office Excel en splits de cellen met de spatietoets.
- Bereken de immobiliteitstijd per frame-interval. Nadat het bestand is gesplitst in de kolommen "C" en "D", berekent u de immobiliteitsstatus van Drosophila per frame-interval met behulp van de formule ALS(SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2) <20, 0, 1), die wordt weergegeven in de kolom "E". (Figuur 10C).
OPMERKING: In tegenstelling tot snelheidsanalyse werden de resultaten van het eerste frame gedefinieerd. Vliegen die minder dan 20 pixels bewogen, werden als onbeweeglijk beschouwd en geregistreerd als "0" in kolom "E".- Selecteer alle berekende resultaten en voeg een kolomdiagram in om de immobiliteitstijd visueel weer te geven met de marge van het hele kolomdiagram (figuur 10D).
- Zorg ervoor dat de hoek van richting verandert.
OPMERKING: De analyse van de hoek van de richtingsverandering vertegenwoordigt de richtingskeuze van de vliegen. Zodra het bestand is gesplitst in de kolommen "C" en "D", wordt de hoek van richtingsverandering berekend met de formule ACOS(((SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2))^2+(SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))^2-(SQRT((C7-C5)^2+(D7-D5)^2))^2)/(2*SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))*(SQRT((C7-C6)^ 2+(D7-D6)^2)))*180/PI(), die wordt weergegeven in de kolom "E" (Figuur 10E). De berekende resultaten geven de hoek tussen drie coördinaten aan.- Selecteer alle berekende resultaten en voeg een spreidingsdiagram in om de richtingshoek van de beweging van de vliegen te illustreren (figuur 10F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In deze studie werden locomotorische tekorten bij volwassen vliegen en derde instarlarven behandeld met rotenon onderzocht en vergeleken in hun motorische activiteit met die van een controlevlieg gevoed met het geneesmiddel oplosmiddel dimethylsulfoxide (DMSO). Van behandeling met rotenon in Drosophila is aangetoond dat het dopaminerge neuronverlies in de hersenenveroorzaakt 22 en leidt tot significante locomotorische tekorten23. Zoals te zien is in figuur 11 en figuur 12, hebben volwassen vliegen en derde instarlarven behandeld met rotenon significante locomotorische tekorten in vergelijking met die van controlevliegen gevoed met DMSO. Figuur 11 en figuur 12B-E illustreren de relatieve veranderingen in de afstand, snelheid en immobiliteitstijd voor bewegingsparameters tussen vliegen behandeld met of zonder rotenon. Figuur 11 en figuur 12F-K illustreren een representatieve analyse van de parameters snelheid, immobiliteitstijd en richtingskeuze, met of zonder rotenonbehandeling bij volwassenen en larven. Kwantitatieve analyse van de parameters van afstand, immobiliteitstijd en snelheid met behulp van Fiji-software bij volwassen vliegen (figuur 11) en derde instarlarven (figuur 12) van de geneesmiddelenvoedende groepen valideert verder dat behandeling met rotenon kan worden gebruikt om locomotorische tekorten bij menselijke ziekten, waaronder neurodegeneratieve aandoeningen, te onderzoeken en enkele van de gedragskenmerken te repliceren die bij mensen en zoogdieren zijn waargenomen.
Figuur 1: Stroomschema met de opstelling van de apparatuur en de experimentele procedure voor de analyse van drosophila-bewegingstracering . De locomotorische volgarena wordt in beeld gebracht met een bovengrondse HD-camera die is ingebouwd in en bestuurd door een computer. De procedure voor het analyseren van de voortbeweging van Drosophila bestaat uit video-opname, bewegingstracking, tracking bestandsanalyse, gegevensverwerking en parametrische analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Achtergrondhomogenisatie van het eerste frame. (A) Vink de optie "converteren naar grijswaarden" aan tijdens het openen van de getransformeerde video om de video naar grijswaarden te transformeren en de interferentie van kleur te voorkomen. (B) Schets Drosophila met behulp van de "vrije hand selectie" tool, weergegeven in het rode vak. (C) Als analyseselectie werd een gele lijn gebruikt om de contouren van de vliegen af te bakenen. Door de gele lijn dicht bij de contouren van de vlieg te houden, verkleint u de kans dat u een gebied selecteert dat niet door de vlieg wordt bezet. Schaalbalk = 1 cm. (D) Pas de helderheid en het contrast voor het eerste frame aan totdat het gele gebied verandert in dezelfde grijswaarden als de achtergrond. (E) Voltooi de helderheids- en contrastaanpassing voor het eerste frame, maar niet voor alle frames, door op "Nee" te klikken in het venster "stapelen". (F) Uiteindelijk wordt het eerste frame aangepast om een uniforme en smetteloze achtergrond te creëren. Schaalbalk = 1 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Afbeelding 3: Trackingvenster en trackingzone-instellingen. (A) Voltooi de trackinganalyse door op de trackingplug-ins te klikken in de volgorde die is gemarkeerd in het venster Dieren volgen. (B) Na het instellen van de actieve afbeelding in figuur A,1, wordt een verwerkingsvenster weergegeven dat alleen het huidige frame toont. Het primaire videovenster en het verwerkingsvenster worden duidelijk onderscheiden en worden in verschillende situaties gebruikt. Als u het huidige frame wilt wijzigen, moet u ervoor zorgen dat de wijziging wordt uitgevoerd in het primaire videovenster. De wijziging zal in beide vensters zichtbaar zijn. Schaalbalk = 1 cm. (C) Maak een volggebied dat de arena omcirkelt met behulp van het "ovale" gereedschap voor computerherkenning. De selectie van de trackingzone moet zich in een omcirkelde arena in een open videovenster bevinden in plaats van in een verwerkingsvenster. (D) Schets een volggebied met de gele lijnen om de arena zo goed mogelijk te passen, om de verstoring van extern licht tot een minimum te beperken. Schaalbalk = 1 cm. (E) Voor het instellen van de regio van belang (ROI ) in het trackinggebied, klikt u op de knoppen na de volgorde gemarkeerd met de nummers die worden weergegeven in het venster "zoneontwerper". In deze stap moet de hele bewerking worden voltooid nadat het gekozen videovenster is geopend. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Filterinstelling voor het eerste frame. (A) Door de instelling van de ROI voor het trackinggebied te voltooien, verandert de gele lijn rond de arena in groen in zowel het geopende videovenster als het verwerkingsvenster. Schaalbalk = 1 cm. (B) Als u het doel van filters toevoegt, wordt een zwarte achtergrond ingesteld om het doelobject duidelijker te maken voor het eerste frame in het verwerkingsvenster. De hele bewerking moet worden uitgevoerd binnen een verwerkingsvenster in plaats van een open videovenster. (C,D) Door de filters "background subtractor" en "Gaussian blur" toe te voegen aan het venster "filterinstellingen" wordt het eerste frame in het verwerkingsvenster zwart. Het hele filterinstellingsproces moet in het eerste frame worden voltooid. (E) De parameters worden stap voor stap ingesteld door te klikken op knoppen gemarkeerd met een nummer en een rode rechthoek in het venster "achtergrondaftrekmiddel". De stap "afbeelding instellen" moet worden uitgevoerd nadat het verwerkingsvenster is geselecteerd. (F) Schaalbalk = 1 cm. Het venster "mediane afbeelding" wordt weergegeven nadat u op de knop "filter weergeven" in "E4" hebt geklikt en het venster direct hebt gesloten zonder enige bewerking. (G) De parameter van de Gaussiaanse vervaging wordt ingesteld met een standaard sigmawaarde van 2,0. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Drempelinstellingen van het tweede frame. (A) Door op de onderste voortgangsbalk te klikken, laat u het videovenster doorgaan naar het tweede frame. De vlieg keert terug in het midden van het scherm en wordt geïdentificeerd door Fiji. Schaalbalk = 1 cm. (B,C) Geef het verwerkingsvenster weer voor en na het filteren. (B) Toon het gefilterde verwerkingsvenster door de modus te selecteren die is gemarkeerd met een rode rechthoek. (C) Een voorbeeld van een verwerkingsvenster met een rode rechthoek nadat de modus "gefilterd" is geselecteerd. Schaalbalk = 1 cm. (D) Stel de drempel in door de standaarddrempelmethode te selecteren, "grijswaardendrempelhouder", weergegeven in het venster "drempelwaarden", na het kiezen van het gereedschap "drempel instellen" in figuur 3A,4. (E) Pas de parameters aan door het voortgangsbalkvak in het midden te schuiven totdat de volgvlieg wordt gezien en bedekt door het rode profiel. Het wordt niet aanbevolen om de standaardinstellingen voor de parameters in de rode rechthoek hieronder te wijzigen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Blobdetector, laatste frame-instelling en selectie van het volgen van dieren. (A) Bij het bereiken van de in figuur 5E vermelde drempel onthult het verwerkingsvenster een aanzienlijk rood profiel dat volgt op de vlieg in het tweede frame. Maak het rode profiel dat de vlieg bedekt geschikt om de vlieg te volgen. Schaalbalk = 1 cm. (B) Definieer de met rode profielen bedekte vlieg als het doel voor tracking door de standaard blobdetectormethode te selecteren, "base blob detector". (C) Stel frame 901 in als het laatste frame met behulp van het gereedschap "laatste frame instellen" in figuur 3A,6. Het totale framenummer wordt berekend met de formule "framenummer = fps * opnametijd". (D) De tracking vliegt met een gele rechthoek in een doos na het tonen van blobs in het geopende videovenster (linkerpaneelgedeelte). In het vergrote linkerpaneel zijn fruitvliegjes in het rood bevestigd (rechterpaneelgedeelte). Schaalbalk = 1 cm. (E) De volgvlieg met een rode rechthoek in het vak na het klikken om de rode rechthoek in "D" (bovenste paneelgedeelte) te selecteren. In de vergroting van het bovenste paneel zijn fruitvliegjes in rood bevestigd (onderste paneelgedeelte). Zorg ervoor dat de selectie van een gele rechthoek rond een trackingvlieg is voltooid in het geopende videovenster. Voltooi de selectie in het geopende videovenster en de vlieg wordt door Fiji in alle frames geïdentificeerd. Schaalbalk = 1 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Resultaten van tracking trace. De trackingtracering wordt afzonderlijk weergegeven in het geopende videovenster ( A ) en het verwerkingsvenster (B). Om het traceringsprofiel te krijgen, klikt u op de voortgangsbalk in het oorspronkelijke videovenster en schuift u de voortgangsbalk om de continuïteit van de tracering te controleren. Het volgspoor geeft de kruipafstand van de vliegen intuïtief weer. Schaalbalk = 1 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Bestandsanalyse bijhouden met behulp van de AnimalTracker-plug-ins. (A) De tracking analyzer vergemakkelijkt een gedetailleerde analyse van het trackingbestand; Elke stap gemarkeerd met een rode rechthoek wordt aangeduid met een nummer. (B) Stel de parameters "zone-instellingen" in A,4 in. Vier parameters, tijd, afstand, immobiliteitstijd en snelheidsvector, worden weergegeven in de rode rechthoek. De parameter wordt geselecteerd op basis van het gewenste resultaat. (C-G) Stel de configuratieparameters afzonderlijk in het venster "parameters instellen" van A,5. (C) Vier instelbare parameters worden geïllustreerd in het venster "instellingen voor configuratieparameters" (D-G) met respectievelijk de vensters "tijdinstellingen", "immobiliteitstijdinstelling", "afstandsinstellingen" en "snelheidsvectorinstelling". Het wordt niet aanbevolen de standaardwaarde voor de parameterinstellingen te wijzigen. Voor het "frame-interval" moet de parameter echter worden berekend met behulp van de formule "frame-interval = 1/fps" wanneer de fps van de video wordt gewijzigd. Bovendien is het mogelijk om een bekende schaal te gebruiken om de werkelijke afstand en snelheid vast te stellen door de geregistreerde pixels te correleren met het volgen van een vlieg tot een tastbare waarde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: Resultaat met analyse van trackingbestanden. (A) De instelling van figuur 8A,6. Er zijn twee manieren om de gegevens weer te geven beschikbaar: "gegroepeerd op zones" en "gegroepeerd op parameters". (B) De resultaten van de analyse van het trackingbestand worden weergegeven als "gegroepeerd per zone" in "A,6.1". (C-F) De resultaten van de analyse van het trackingbestand worden weergegeven als "gegroepeerd op parameters" in A,6.2, met afzonderlijk "immobiliteitstijd" (C), "snelheidsvector" (D), "tijd" (E) en "afstand" (F). De uitkomsten van de immobiliteitstijd en afstand worden gekwantificeerd als "s" en "pixels". De eenheid van de snelheidsvector moet worden gedefinieerd als "pixel /s" en moet worden uitgevoerd met de annotatie "lengte". Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 10: Resultaten van de data-analyse voor snelheid per fps. (A, C en E) De exportgegevens bevatten coördinaten van pixels in horizontale (kolom "C") en verticale (kolom "D") partities, evenals de beweging van pixels, immobiliteit en richtingsveranderingshoek tussen intervallen van twee frames (kolom "E" in respectievelijk A, C en E), die automatisch wordt berekend met de formule die in de context wordt beschreven. Aangezien de resultaten die vanuit Fiji worden geëxporteerd tekstdocumenten zijn, wordt het aanbevolen om het bestand te openen met Microsoft Office Excel en de gegevens in drie kolommen te splitsen door er spaties tussen toe te voegen. (B, D en F) Een lijndiagram toont de berekende resultaten van de gegevensset van de beweging van pixels (B). De globale piekwaarde vertegenwoordigt de snelheid, indicatief voor de bewegingsdetectiemogelijkheden; het kolomdiagram geeft de berekende resultaten weer van de gegevensset immobiliteit (D). De mate van spaarzaamheid in het kolomdiagram vertegenwoordigt de immobiliteit, die het motorische defect van vliegen vertoont; een spreidingsdiagram toont de berekende resultaten van de gegevensset van de richtingsveranderingshoek (F). De verrijking van spatten in het strooidiagram vertegenwoordigt de richting die door de vlieg is gekozen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 11: Een vergelijkende analyse van de beweging tussen vliegen behandeld met of zonder rotenon. (A) Representatieve grafieken van het traceerspoor van W1118 volwassen vliegen gevoed met standaardvoedsel dat 500 μM rotenon bevat, of DMSO voor controle, worden getoond. W1118 vliegen werden verzameld en vervolgens in een gecontroleerde omgeving geplaatst bestaande uit standaard voedsel met 500 μM rotenon of DMSO, 25 °C en 60% luchtvochtigheid. Zes vliegen werden gebruikt voor analyse van elke groep na 48 uur. Het resultaat laat zien dat de bewegingsafstand van het volgen van vliegen gevoed met rotenon aanzienlijk is afgenomen in vergelijking met die van de controle. Het resultaat toonde een defect motorisch vermogen bij vliegen gevoed met rotenon. (B-E) Kwantitatieve analyse van de rotenonbehandeling op de gemiddelde afgelegde afstand, immobiliteitstijd, gemiddelde snelheid en maximale snelheid wordt uitgevoerd met behulp van Fiji. De resultaten van de rotenonbehandeling toonden een significante afname van de afgelegde afstand en de gemiddelde snelheid, en een significante toename van de immobiliteitstijd. (F-K) Analyse van pixels per frame (F,G), immobiliteitstijd per frame (H,I) en richtingshoekveranderingen (J,K) tussen vliegen behandeld met rotenon (G,I,K) of DMSO (F,H,J). Voorbeeldgrafieken die de effecten van rotenon op de bewegingssnelheid illustreren, tonen minder pieken die de bewegingssnelheid per frame-interval weergeven bij vliegen gevoed met rotenon (G) in vergelijking met die in de controle (F), wat de ernst van het locomotorische activiteitsdefect (F, G) aangeeft. De intuïtionistische immobiliteitskolom van verplaatste pixels per frame is lager en toont aanzienlijk minder beweging binnen 1 minuut voor rotenon-gevoede vliegen (I) in vergelijking met de controlevliegen (H). Voorbeeldgrafieken van de bewegingshoek van richtingsveranderingen bij rotenon-gevoede (K) en controle (J) dieren onthullen veranderingen in de richting die door vliegen wordt gekozen. Gegevens zijn de gemiddelde ± SEM van zes mannelijke vliegen die gedurende 1 minuut worden gevolgd. Asterisken geven significante verschillen tussen groepen aan (***p < 0,001; ongepaarde t-test, p = 0,05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 12: Een vergelijkende analyse van de beweging tussen larven behandeld met of zonder rotenon. (A) Representatieve resultaten van de vergelijking van locomotorische activiteit door het volgen van het spoor van W1118 derde instarlarven gevoed met rotenon of DMSO. In het kort werden W1118 derde instarlarven verzameld en gekweekt in 10% sucrose, of 10% sucrose met 500 μM rotenon, in een omgeving van 25 °C met 60% vochtigheid. Zes larven per groep werden gebruikt voor analyse. Rekening houdend met de langzame beweging van larven, is de gegevensregistratie over een periode van 5 minuten gekwantificeerd en geanalyseerd om de effecten van rotenon op de voortbeweging te evalueren. (B-E) De gemiddelde afstand, immobiliteitstijd, gemiddelde snelheid en maximale snelheid van de twee groepen geanalyseerd in Fiji wordt kwantitatief geanalyseerd. De kwantitatieve resultaten tonen aan dat de bewegingsafstand, gemiddelde snelheid en maximale snelheid aanzienlijk afnemen bij larven gevoed met rotenon, en de immobiliteitstijd neemt aanzienlijk toe bij larven gevoed met rotenon. (F-K) Net als bij volwassen vliegen, toonde analyse van pixels per frame, immobiliteitstijd en de hoek van richtingsveranderingen tussen vliegen behandeld met rotenon (G, I, K) en zonder rotenon (F, H, J) aan dat larven behandeld met rotenon een lagere bewegingssnelheid hadden, meer immobiliteitstijd en wisselden hun richtingen af. De resultaten laten zien dat de gedragsbeweging van het volgen van larven gevoed met rotenon aanzienlijk is aangetast in vergelijking met de controle. De resultaten tonen een defecte locomotorische activiteit van vliegen gevoed met rotenon. Gegevens zijn de gemiddelde ± SEM van zes 3-dagen oude larven die gedurende 5 minuten worden gecontroleerd. Sterretjes geven een significant verschil tussen groepen aan (*p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ongepaarde t-test, p = 0,05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Vergelijking van op dieren gebaseerde methoden voor het kwantificeren van de locomotorische activiteit in Drosophila. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hebben een methode ontworpen, gebaseerd op het open-source materiaal AnimalTracker API compatibel met het Fiji-beeldverwerkingsprogramma, waarmee onderzoekers systematisch locomotorische activiteit kunnen evalueren door zowel volwassen als individuele larvale vliegen te volgen. AnimalTracke is een tool geschreven in Java die eenvoudig kan worden geïntegreerd in bestaande databases of andere tools om de analyse van door de toepassing ontworpen gedrag van het volgen van dieren te vergemakkelijken24. Op basis van een frame-voor-frame analyse door een softwareberekeningsformule die de locomotorische activiteit van de volwassenen en larven kwantificeert, kunnen verschillende parameters, waaronder bewegingssnelheid, afgelegde afstand, immobiliteit en richtingshoekveranderingen, flexibel worden geanalyseerd. Deze parameters, die verschillende aspecten van gedragsmatige voortbeweging vertegenwoordigen, kunnen worden uitgezet om locomotorische veranderingen in de loop van de tijd te illustreren. Door een grafische gebruikersinterface te maken, gedetailleerde documentatie over het gebruik ervan te bieden en een applicatieprogrammeringsinterface, willen we deze methode toegankelijk maken voor onderzoekers die geen programmeerervaring hebben en ervaren gebruikers die aangepaste experimentele paradigma's maken.
Om te verifiëren dat de methode het gedrag nauwkeurig kan volgen, is locomotorisch testen van volwassen vliegen en larven behandeld met rotenon, evenals een vergelijking van hun motorische activiteit met die van controlevliegen gevoed met het oplosmiddel van het medicijn, uitgevoerd. De Fiji-software, met zijn plug-ins, wordt gebruikt om de pixelcoördinaten van elk frame in de video-opname van de beweging te analyseren, waardoor de snelheid, afstand en andere parameters van de experimentele vliegen kunnen worden berekend. We zagen een significante afname van de afgelegde afstand in de loop van de tijd bij rotenontoediening (figuur 11), wat consistent is met de gerapporteerde resultaten23. Ondertussen zijn de stijgende bewegingssnelheid en abnormale richting die is gekozen waargenomen in groepen met medicijnen, om meer details van het gedragstekort bij vliegen te illustreren. Gezien het succes bij het detecteren van de locomotorische activiteit van volwassen vliegen, hebben we vervolgens geprobeerd de mobiliteit van larven te evalueren (figuur 12). In vergelijking met de controle waren de resultaten van de met rotenon gevoede volglarven aanzienlijk verminderd, parallel aan die van volwassen vliegen die met medicijnen werden gevoed. Experimenten met de volwassenen en larven gevoed met rotenon suggereren dat deze methode nauwkeurig de vermindering van vliegen kan registreren die locomotorische tekorten produceerden in vergelijking met controles. Dit rapport heeft met succes toepassingen van de huidige methode aangetoond bij het kwantificeren en analyseren van locomotorisch vermogen en andere facetten van gedragsdefecten van fruitvliegen in testmodellen of farmacologisch onderzoek bij dieren.
Om ervoor te zorgen dat de video- en trackinganalyse succesvolle en reproduceerbare resultaten oplevert, wordt aanbevolen om de volgende richtlijnen na te leven. Ten eerste raden we voor de keuze van de videoframesnelheid aan om de opgenomen video te converteren naar een indeling van 15 frames per seconde (fps). Dit kan niet alleen een goede bewegingsregistratie handhaven, maar ook de traagheid van computeranalyse vermijden die wordt veroorzaakt door enorme hoeveelheden gegevens. Door de framesnelheid van de video te verbeteren, wordt de analyse van het bewegingstraject gedetailleerder. Ten tweede kunnen de parameters in de formule ook worden aangepast aan het overeenkomstige experimentele schema bij het analyseren van de statische beweging tussen elke twee frames. Voor de locomotorische monitoring van larven is het essentieel om silicagel te gebruiken in plaats van agar, omdat de gestolde silicagel strak is en de larven er niet in kunnen komen. Bovendien is silicagel transparant en kan het worden geverfd door kleursubstantie toe te voegen om een optimale achtergrond te produceren, waardoor gewenste optische effecten mogelijk worden die de beeldkwaliteit verbeteren.
Diervolgsystemen worden ontwikkeld om uitgebreide oplossingen te bieden voor de etiologie, neurowetenschappen en gedragsgenetische gemeenschappen. Tabel 1 geeft een vergelijking van de kenmerken van meerdere trackingprogramma's die momenteel beschikbaar zijn 10,11,12,16,17,25,26. Deze aanpak is uiterst kosteneffectief, eenvoudig te leren en nauwkeurig in het meten van locomotorisch gedrag, zonder dat er dure software en apparatuur nodig is. Het lijdt geen twijfel dat deze methode gemakkelijk kan worden uitgebreid naar andere Drosophila-achtige diermodellen, en zelfs naar grotere dieren zoals ratten en muizen. De structuur van de AnimalTracker API kan eenvoudig worden uitgebreid via onafhankelijke ImageJ-toepassingen of plug-ins, met een breed scala aan nuttige toolkits voor onderzoek en analyse van aangepast gedrag24. Toch heeft deze studie bepaalde beperkingen. Omdat een enkele vlieg in een open arena wordt geplaatst voor beeldopname en videotracking individueel wordt uitgevoerd, is deze methode inefficiënt en tijdrovend. We hebben geprobeerd de capaciteit voor het opnemen van meerdere arena's tegelijkertijd uit te breiden, waardoor maximaal zes individuele opnames mogelijk zijn. Het is theoretisch mogelijk om een groter aantal Drosophila tegelijkertijd op te nemen; Dit is afhankelijk van de grootte van de arena en de configuratie van de camera. Als alternatief, als gebruikers willen uitbreiden naar het opnemen van gegroepeerde Drosophila, wordt het aanbevolen om het beperkte aantal afzonderlijke records en een configuratie van voldoende kwaliteit te overwegen om botsingen en overlappingen tussen de vliegen te identificeren. Verbeteringen in de testefficiëntie door machine learning werden niet overwogen in de studie, omdat er geen betaalbare en compatibele aanpak is gevonden die kan worden geïntegreerd met het huidige systeem om identiteiten visueel te onderscheiden en modellen nauwkeurig te volgen.
Samenvattend ontwikkelt en valideert de hier beschreven methode een efficiënte en eenvoudige aanpak op basis van gratis, open-source software, ontworpen om het tijdsverbruik te verminderen en experimentele technieken te verfijnen voor het kwantitatief aangeven en analyseren van Drosophila-voortbeweging in de larven en volwassen stadia. Door middel van systematische analyse kan deze methode ons helpen begrijpen hoe de snelheid van het dier in de loop van de tijd verandert tijdens beweging, evenals de kenmerken van richtingsselectie. De integratie van open-source software in veelgebruikte digitale apparaten biedt dus een betrouwbare manier om de locomotorische activiteit in verschillende vliegmodellen te testen. Dit kan nuttig zijn voor het evalueren van fysiologische en pathologische locomotorische outputs bij het testen van neurodegeneratieve ziektemodellen afgeleid van farmacologische behandeling en transgene modificatie bij Drosophila en andere dieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een speciaal lanceringsfonds van Soochow University en de National Science Foundation of China (NSFC) (82171414). We bedanken prof. Chunfeng Liu's lableden voor hun discussie en commentaar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal tracker | Hungarian Brain Research Program | version: 1.7 | pfficial website: http://animaltracker.elte.hu/main/downloads |
| Camera software | Microsoft | version: 2021.105.10.0 | built-in windows 10 system |
| Computer | DELL | Vostro-14-5480 | a comupter running win 10 system is available |
| Drosophila carbon dioxide anesthesia workstation | Wu han Yihong technology | #YHDFPCO2-018 | official website: http://www.yhkjwh.com/ |
| Fiji software | Fiji team | version: 1.53v | official website: https://fiji.sc/ |
| Format factory software | Pcfreetime | version: X64 5.4.5 | official website: http://www.pcfreetime.com/formatfactory/CN/index.html |
| Graph pad prism | GraphPad Software | version: 8.0.2 | official website: https://www.graphpad-prism.cn |
| Hight definition camera | TTQ | Jingwang2 (HD1080P F1.6 6-60mm) | official website: http://www.ttq100.com/product_show.php?id=35 |
| Office software | Microsoft | version: office 2019 | official website: https://www.microsoftstore.com.cn/software/office |
| Petri dish | Bkman | 110301003 | size: 60 mm |
| Silica gel | DOW | SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Mix well according to the instructions |
| Sodium bicarbonate | Macklin | #144-55-8 | Mix well with silica gel |
References
- Ham, S. J., et al. Loss of UCHL1 rescues the defects related to Parkinson's disease by suppressing glycolysis. Science Advances. 7 (28), (2021).
- Algarve, T. D., Assmann, C. E., Aigaki, T., da Cruz, I. B. M. Parental and preimaginal exposure to methylmercury disrupts locomotor activity and circadian rhythm of adult Drosophila melanogaster. Drug and Chemical Toxicology. 43 (3), 255-265 (2020).
- Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental Gerontology. 46 (5), 320-325 (2011).
- Yamaguchi, M., Yoshida, H. Drosophila as a model organism. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1076, 1-10 (2018).
- Rothenfluh, A., Heberlein, U. Drugs, files, and videotape: the effects of ethanol and cocaine on Drosophila locomotion. Current Opinion in Neurobiology. 12 (6), 639-645 (2002).
- Tsuda, L., Lim, Y. M. Alzheimer's disease model system using Drosophila. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1076, 25-40 (2018).
- Dung, V. M., Thao, D. T. P.
- Liguori, F., Amadio, S., Volonte, C. Fly for ALS: Drosophila modeling on the route to amyotrophic lateral sclerosis modifiers. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (17-18), 6143-6160 (2021).
- Cao, W., et al. An automated rapid iterative negative geotaxis assay for analyzing adult climbing behavior in a Drosophila model of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (127), 56507 (2017).
- Eidhof, I., et al. High-throughput analysis of locomotor behavior in the Drosophila island assay. Journal of Visualized Experiments. (129), 55892 (2017).
- Scaplen, K. M., et al. Automated real-time quantification of group locomotor activity in Drosophila melanogaster. Scientific Reports. 9 (1), 4427 (2019).
- Werkhoven, Z., Rohrsen, C., Qin, C., Brembs, B., de Bivort, B. MARGO (Massively Automated Real-time GUI for Object-tracking), a platform for high-throughput ethology. PLoS One. 14 (11), e0224243 (2019).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental Gerontology. 40 (5), 386-395 (2005).
- Cichewicz, K., Hirsh, J. ShinyR-DAM: a program analyzing Drosophila activity, sleep and circadian rhythms. Communications Biology. 1, 25 (2018).
- McParland, A. L., Follansbee, T. L., Ganter, G. K. Measurement of larval activity in the Drosophila activity monitor. Journal of Visualized Experiments. 98, e52684 (2015).
- Walter, T., Couzin, I. D. TRex, a fast multi-animal tracking system with markerless identification, and 2D estimation of posture and visual fields. eLife. 10, (2021).
- Maia Chagas, A., Prieto-Godino, L. L., Arrenberg, A. B., Baden, T. The €100 lab: A 3D-printable open-source platform for fluorescence microscopy, optogenetics, and accurate temperature control during behaviour of zebrafish, Drosophila, and Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 15 (7), e2002702 (2017).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
- Xiao, G. Methods to assay the behavior of Drosophila melanogaster for toxicity study. Methods in Molecular Biology. 2326, 47-54 (2021).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Johnson, M. E., Bobrovskaya, L. An update on the rotenone models of Parkinson's disease: their ability to reproduce the features of clinical disease and model gene-environment interactions. Neurotoxicology. 46, 101-116 (2015).
- Coulom, H., Birman, S. Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson's disease in Drosophila melanogaster. The Journal of Neuroscience. 24 (48), 10993-10998 (2004).
- Kumar, P. P., Bawani, S. S., Anandhi, D. U., Prashanth, K. V. H. Rotenone mediated developmental toxicity in Drosophila melanogaster. Environmental Toxicology and Pharmacology. 93, 103892 (2022).
- Gulyas, M., Bencsik, N., Pusztai, S., Liliom, H., Schlett, K. AnimalTracker: an ImageJ-based tracking API to create a customized behaviour analyser program. Neuroinformatics. 14 (4), 479-481 (2016).
- Qu, S. EasyFlyTracker: a simple video tracking Python package for analyzing adult Drosophila locomotor and sleep activity to facilitate revealing the effect of psychiatric drugs. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 15, 809665 (2022).
- Yarwais, Z. H., Najmalddin, H. O., Omar, Z. J., Mohammed, S. A. Automated data collection of Drosophila movement behaviour assays using computer vision in Python. International Journal of Innovative Approaches in Science Research. 4 (1), 15-22 (2020).
