Summary
Настоящий протокол оценивает локомоторную активность дрозофилы путем отслеживания и анализа движения мух на самодельной арене с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом Fiji, совместимого с плагинами для сегментации пикселей каждого кадра на основе видеозаписи высокой четкости для расчета параметров скорости, расстояния и т.д.
Abstract
Drosophila melanogaster является идеальным модельным организмом для изучения различных заболеваний благодаря обилию передовых методов генетических манипуляций и разнообразным поведенческим особенностям. Выявление поведенческого дефицита на животных моделях является важнейшим показателем тяжести заболевания, например, при нейродегенеративных заболеваниях, когда пациенты часто испытывают нарушения двигательной функции. Однако при наличии различных систем для отслеживания и оценки двигательного дефицита в моделях мух, таких как лекарственные препараты или трансгенные люди, по-прежнему отсутствует экономичная и удобная для пользователя система для точной оценки с разных точек зрения. Здесь разработан метод, основанный на интерфейсе прикладного программирования (API) AnimalTracker , который совместим с программой обработки изображений Фиджи, для систематической оценки двигательной активности как взрослых, так и личиночных особей по записанному видео, что позволяет анализировать их поведение при отслеживании. Этот метод требует только камеры высокой четкости и интеграции компьютерного периферийного оборудования для записи и анализа поведения, что делает его доступным и эффективным подходом для скрининга моделей мух с трансгенными или экологическими поведенческими недостатками. Приведены примеры поведенческих тестов с использованием фармакологически обработанных мух, чтобы показать, как методы могут обнаруживать поведенческие изменения как у взрослых мух, так и у личинок с высокой повторяемостью.
Introduction
Drosophila melanogaster является отличным модельным организмом для исследования клеточных и молекулярных функций в моделях нейрональных заболеваний, созданных с помощью модификациигенов 1, медикаментозного лечения2 и старения3. Высокая степень сохранности биологических путей, физических свойств и генов-гомологов, связанных с заболеванием, между человеком и дрозофилой делает плодовую мушку идеальным подражателем от молекулярного до поведенческого уровня4. Во многих моделях заболеваний поведенческий дефицит является важным показателем, обеспечивающим полезную модель для различных невропатийчеловека 5,6. Дрозофила в настоящее время используется для изучения множества заболеваний человека, развития нервной системы и нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона и боковой амиотрофический склероз 7,8. Обнаружение двигательной способности моделей заболевания имеет решающее значение для понимания патогенного прогресса и может обеспечить фенотипическую корреляцию с молекулярными механизмами, лежащими в основе процесса заболевания.
В последнее время были разработаны коммерчески доступные программные инструменты и экономически эффективные программы для стратегий обнаружения локомотора дрозофилы, такие как высокопроизводительные испытания на сгруппированных мухах9,10 и измерение локомоции в режиме реального времени11,12. Одним из таких традиционных подходов является быстрый интерактивный отрицательный геотаксис (RING), также называемый альпинистским анализом, который включает в себя несколько каналов, которые позволяют сдерживать большую популяцию мух того же пола и возраста, уменьшая вариации при сборе данных 9,13. Другим методом предварительного тестирования для анализа двигательного поведения является монитор активности дрозофилы TriKinetics (DAM), устройство, которое использует несколько лучей для обнаружения движения активности мух в тонкой стеклянной трубке14. Устройство непрерывно регистрирует положение, которое представляет собой автоматическую локомоцию путем вычисления пересечений лучей для изучения активности и циркадного ритма мух в течение более длительного периода времени15. Хотя эти методы широко используются при анализе поведенческих дефектов у плодовых мушек для определения изменений в поведенческой локомоции, они всегда требуют специального испытательного оборудования или сложных процессов анализа и ограничивают их применение в некоторых моделях с ограниченным, простым устройством. Групповые стратегии по отслеживанию животных для тестирования взрослых дрозофил, такие как FlyGrAM11 и анализ острова Drosophila 10, реализуют социальный набор и индивидуальное отслеживание в заранее определенной области. Тем не менее, социальные индивидуальные ограничения в неконтролируемых районах могут оказать негативное влияние на идентификацию на изображениях, вызванную столкновением или перекрытием мух. Несмотря на то, что некоторые методы, основанные на материалах с открытым исходным кодом, такие как TRex16, MARGO 12 и FlyPi17, имеют чрезвычайную ситуацию, они могут быстро отслеживать мух с гибким использованием в поведенческом тестировании. Эти подходы к тестированию связаны со сложными экспериментальными установками, специальными требованиями к программному обеспечению или профессиональными компьютерными языками. Для личинок измерение общего расстояния, пройденного по количеству пограничных линий сетки в единицу времени18, или грубый подсчет сокращений стенок тела для особей вручную19 являются преобладающими методами оценки их двигательных способностей. Из-за отсутствия точности в оборудовании или устройствах и методах анализа некоторые поведенческие локомоции личинок могут ускользнуть от обнаружения, что затрудняет точную оценку поведенческих движений, особенно тонких движений15.
В настоящем разработанном способе используется интерфейс прикладного программирования (API) AnimalTracker , совместимый с программой обработки изображений Fiji (ImageJ), для систематической оценки двигательной активности как взрослых, так и личинок мух путем анализа их поведения при отслеживании видео высокой четкости (HD). Fiji — это дистрибутив программного обеспечения ImageJ с открытым исходным кодом, который может сочетать надежные программные библиотеки с многочисленными языками сценариев, что приводит к быстрому прототипированию алгоритмов обработки изображений, что делает его популярным среди биологов благодаря своим возможностям анализа изображений20. В текущем подходе интеграция Фиджи в API AnimalTracker используется для разработки уникального поведенческого анализа дрозофилы с персонализированной вставкой алгоритма и обеспечивает полезный шаг для подробной документации и учебных пособий для поддержки надежных аналитических возможностей локомоторного поведения (рис. 1). Чтобы избежать усложнения объективной идентификации на изображениях, вызванного столкновением или перекрытием мух, каждая арена ограничена приемом только одной мухи. После оценки точности отслеживания подхода был реализован для отслеживания и количественной оценки локомоторных движений дрозофилы , которые вводили с токсичным препаратом ротеноном, который обычно используется для животных моделей болезни Паркинсона, в конечном итоге обнаружив нарушение локомоции при медикаментозном лечении21. Эта методология, использующая открытое и свободное программное обеспечение, не требует дорогостоящих инструментов и может точно и воспроизводимо анализировать поведенческую локомоцию дрозофилы .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Для настоящего исследования использовали W 1118 взрослых мух и личинок третьего возраста.
1. Экспериментальная подготовка
ПРИМЕЧАНИЕ: Открытая арена для отслеживания локомоции дрозофилы изготовлена из бесцветного силикагеля без запаха.
- Смешайте реагент А и реагент В в соотношении 1:10 в соответствии с инструкциями производителя к набору кремнезема (см. Таблицу материалов). Убедитесь, что в смесь добавлен бикарбонат натрия, помешивая, пока цвет не изменится на белый. Переложите смесь в чистую чашку Петри и поставьте ее в духовку при температуре 40 °C для сушки на 48 часов.
- Установите HD-камеру (см. Таблицу материалов) на штатив, отрегулировав его так, чтобы объектив камеры был перпендикулярен поверхности кварцевой арены. Регулируя фокусное расстояние и диафрагмы камеры, убедитесь, что камера сфокусирована на поверхности кремнезема и что дисплей достаточно освещен. Экспериментальная установка проиллюстрирована на рисунке 1.
- Перенесите муху на арену открытого поля, чтобы записать непрерывное видео продолжительностью не менее 61 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая вялый характер личинок, рекомендуется время видеозаписи более 10 минут.- Откройте видео с Фиджи, перетащите индикатор выполнения в начальный кадр и молчаливо одобрите. Выберите все тело мухи с помощью инструмента «выбор от руки» (рис. 2B, C).
- Щелкните изображение> > отрегулируйте яркость и контрастность, чтобы настроить баланс белого до тех пор, пока значение серого выбранной области не приблизится к широкому фону (рис. 2D-F).
ПРИМЕЧАНИЕ: Гомогенизация фона первого кадра позволяет программному обеспечению различать фон без каких-либо объектов и создавать контраст при наличии мухи, что позволяет программному обеспечению отслеживать ее.
- Проведите весь эксперимент в тестовой среде с температурой 25 °C и относительной влажностью 60%, в тихом месте, где нет яркого света.
2. Запись и предварительная обработка видео
- После короткого периода анестезии с использованием 95% углекислого газа (CO2) перенесите муху на открытую арену и нажмите кнопку записи в приложении камеры, чтобы начать запись видео.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму влияние анестетика на передвижение, дайте мухам восстановиться в течение 10 минут, прежде чем начинать видеозапись. Также рекомендуется холодная анестезия путем охлаждения.- Как только мухи оправятся от анестезии, поместите тарелку с мухой под камеру и быстро встряхните пластину из стороны в сторону, чтобы убедиться, что муха находится в движении, когда начинается запись.
- По завершении записи нажмите кнопку остановки , чтобы прервать запись видео.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что время записи видео немного превышает время отслеживания пункта назначения с небольшим отрывом. Кроме того, для повышения эффективности эксперимента можно отслеживать несколько мух спонтанно. Это зависит от разрешения камеры, чтобы обеспечить качественную обрезку видео. - Конвертируйте записанные видео в формат AVI с кодировкой MJPEG, чтобы их можно было открывать и анализировать с помощью Fiji. Между тем, установите частоту кадров в секунду (fps) видео на 15 кадров в секунду для взрослых мух и 12 кадров в секунду для личинок.
3. Анализ видео
- Откройте видео, которое было преобразовано с помощью «использовать виртуальный стек» и «преобразовать в оттенки серого», двух вариантов во всплывающем окне при открытии видео с Фиджи (рис. 2A).
- Сделайте пустой первый кадр, как уже говорилось выше.
- Получите окно обработки с помощью инструмента «установить активное изображение» плагина AnimalTracker и создайте область отслеживания, которая окружает арену в исходном видеоокне, используя инструмент «овал» (рис. 3A).
- Установите фильтры (рис. 3A,3) и параметры двух фильтров (рис. 4A-G) для первого пустого кадра в окне обработки. Затем выберите следующий кадр в исходном видеоокне и выберите отфильтрованную поверхность окна обработки (рис. 5A-C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этап фильтрации служит для уменьшения шума изображения и/или удаления фона, тем самым упрощая отделение переднего плана от фона при бинаризации кадров. - После того, как отфильтрованное окно обработки выбрано, поверните гусеничную муху с красным профилем, закрытым в окне обработки, с помощью инструмента «установить порог» (рис. 3A, 4, рис. 5D-E и рис. 6A).
- Используйте «set blob-detector», чтобы компьютер распознал муху с красным профилем, закрытым в окне обработки (рис. 3A, 5 и рис. 6B).
- Установите кадр 901 в качестве последнего кадра для взрослой мухи, рассчитанного по длительности записи видео и частоте кадров в секунду (рис. 3A,6, рис. 6C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий эксперимент с личинками отслеживался в течение 10 минут, поэтому кадр 7200 установлен в качестве последнего кадра. - Используйте инструмент «показать большие двоичные объекты», чтобы представить прямоугольник отслеживания в исходном видеоокне (рис. 3A, 7 и рис. 6D, E). Затем запустите отслеживание и экспортируйте файл отслеживания после завершения мониторинга (рис. 3A, 8, 9 и рис. 7A, B).
4. Отслеживание анализа файлов
- Загрузите файлы треков и зон с помощью плагина Animal tracker > Tracking analyzer (рисунок 8A).
- Выберите нужный индекс с помощью настроек зоны и измените настройки параметров (рисунок 8). Рассчитайте время интервала кадров, используя частоту кадров.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае частота кадров составляет 15 кадров в секунду, а интервал кадров составляет примерно 0,067 с, что является настройкой по умолчанию (рис. 8D). - Создайте диаграммы количественного анализа с помощью программного обеспечения для работы с электронными таблицами и GraphPad Prism после анализа в анализаторе отслеживания (рис. 9).
5. Анализ каждого кадра
- Выполняйте анализ скорости для каждого интервала кадров. Проанализируйте файл трека без Фиджи, если требуется более подробное исследование.
- Откройте файл трека, скопируйте все координаты в Microsoft Office Excel и разделите ячейки с помощью клавиши пробела.
ПРИМЕЧАНИЕ: Например, после того, как файл был разделен на столбцы «C» и «D», скорость дрозофилы за интервал кадра рассчитывается по формуле SQRT ((C5-C4) ^ 2 + (D5-D4) ^ 2), которая показана в столбце «E» (рис. 10A). Данные в столбце «E» указывают количество пикселей, на которое муха переместилась между двумя кадрами, при этом первый кадр не учитывается. Выберите все вычисленные результаты и вставьте линейную диаграмму, чтобы показать интуитивно понятную скорость движения мухи за интервал кадра с пиком на линейном графике (рис. 10B).
- Откройте файл трека, скопируйте все координаты в Microsoft Office Excel и разделите ячейки с помощью клавиши пробела.
- Рассчитайте время неподвижности за интервал кадра. После того, как файл был разбит на столбцы «C» и «D», рассчитайте состояние неподвижности дрозофилы за интервал кадров по формуле ЕСЛИ(SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2) <20, 0, 1), которая показана в столбце «E». (Рисунок 10С).
ПРИМЕЧАНИЕ: В отличие от анализа скорости, результаты первого кадра были определены. Мухи, которые переместились менее чем на 20 пикселей, считались неподвижными и записывались как «0» в столбце «E».- Выберите все вычисленные результаты и вставьте гистограмму, чтобы визуально отобразить время неподвижности на полях всей гистограммы (рис. 10D).
- Убедитесь, что угол направления изменился.
ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ угла изменения направления представляет собой выбор направления мухами. После того, как файл был разбит на столбцы «C» и «D», угол изменения направления вычисляется по формуле ACOS(((SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2))^2+(SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))^2-(SQRT((C7-C5)^2+(D7-D5)^2))^2)/(2*SQRT((C6-C5)^2 +(D6-D5)^2))*(SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2)))*180/PI(), которая представлена в столбце «E» (рис. 10E). В вычисленных результатах указывается угол между тремя координатами.- Выберите все вычисленные результаты и вставьте точечную диаграмму, чтобы проиллюстрировать угол изменения направления движения мух (рис. 10F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В настоящем исследовании был изучен двигательный дефицит у взрослых мух и личинок третьего возраста, обработанных ротеноном, и их двигательная активность сравнивалась с таковой у контрольной мухи, получавшей лекарственный растворитель диметилсульфоксид (ДМСО). Было показано, что лечение ротеноном у дрозофилы вызывает потерю дофаминергических нейронов в головном мозге22 и приводит к значительному дефициту опорно-двигательного аппарата23. Как показано на рисунках 11 и 12, взрослые мухи и личинки третьего возраста, получавшие ротенон, имеют значительный дефицит опорно-двигательного аппарата по сравнению с контрольными мухами, получавшими ДМСО. Рисунки 11 и 12B-E иллюстрируют относительные изменения расстояния, скорости и времени неподвижности параметров движения между мухами, обработанными ротеноном или без него. Рисунок 11 и рисунок 12F-K иллюстрируют репрезентативный анализ параметров скорости, времени неподвижности и выбора направления с обработкой ротеноном или без нее взрослых особей и личинок. Количественный анализ параметров расстояния, времени неподвижности и скорости с использованием программного обеспечения Фиджи у взрослых мух (рис. 11) и личинок третьего возраста (рис. 12) групп лекарственного питания дополнительно подтверждает, что лечение ротеноном может быть использовано для исследования двигательного дефицита при заболеваниях человека, включая нейродегенеративные состояния, и воспроизвести некоторые поведенческие характеристики, наблюдаемые у людей и млекопитающих.
Рисунок 1: Блок-схема, описывающая настройку оборудования и экспериментальную процедуру для анализа отслеживания движения дрозофилы . Арена слежения за опорно-двигательным аппаратом отображается с помощью потолочной HD-камеры, встроенной в компьютер и управляемой им. Процедура анализа локомоции дрозофилы состоит из видеозаписи, отслеживания перемещений, анализа файлов отслеживания, обработки данных и параметрического анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Гомогенизация фона первого кадра. (A) Установите флажок «преобразовать в оттенки серого» при открытии преобразованного видео, чтобы преобразовать видео в оттенки серого и избежать вмешательства цвета. (B) Обведите дрозофилу контуром с помощью инструмента «выбор от руки», показанного в красном поле. (C) В качестве аналитического отбора была использована желтая линия для очертания контуров мух. Удержание желтой линии близко к контурам мухи снижает вероятность выбора области, которая не занята мухой. Масштабная линейка = 1 см. (D) Отрегулируйте яркость и контрастность для первого кадра до тех пор, пока область, выделенная желтым цветом, не изменится на те же оттенки серого, что и фон. (E) Завершите регулировку яркости и контрастности для первого кадра, но не для всех кадров, нажав «Нет» в окне «стек». (F) В конечном счете, первый кадр корректируется таким образом, чтобы создать однородный и безупречный фон. Масштабная линейка = 1 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Окно слежения и настройки зоны слежения. (A) Завершите анализ отслеживания, щелкнув плагины трекера в порядке, указанном в окне отслеживания животных. (B) После установки активного изображения на рисунке A,1 появляется окно обработки, в котором отображается только текущий кадр. Основное видеоокно и окно обработки четко разграничены и используются в разных ситуациях. Для изменения текущего кадра убедитесь, что изменение выполняется в основном видеоокне; Изменение будет видно в обоих окнах. Масштабная линейка = 1 см. (C) Создайте область слежения, которая окружает арену, используя инструмент «овал» для компьютерного распознавания. Выбор зоны слежения должен быть в обведенном кругом арене в открытом видеоокне, а не в окне обработки. (D) Очертите желтыми линиями зону слежения, чтобы она в наибольшей степени соответствовала арене, чтобы свести к минимуму помехи внешнего освещения. Масштабная линейка = 1 см. (E) Для установки интересующей области (ROI ) в области отслеживания нажимайте кнопки в порядке, отмеченном цифрами, показанными в окне «конструктор зон». На этом этапе вся операция должна быть завершена после того, как откроется выбранное окно видео. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Настройка фильтра для первого кадра. (A) После завершения настройки ROI для области отслеживания желтая линия, опоясывающая арену, меняется на зеленую как в открытом видеоокне, так и в окне обработки. Масштабная линейка = 1 см. (B) При добавлении назначения фильтров задается черный фон, чтобы сделать целевой объект более заметным для первого кадра в окне обработки. Вся операция должна выполняться в окне обработки, а не в открытом видеоокне. (С,Д) Добавление фильтров «вычитатель фона» и «размытие по Гауссу» в окно «настройки фильтра» делает первый кадр в окне обработки черным. Весь процесс настройки фильтра должен быть завершен в первом кадре. (E) Параметры задаются поэтапно путем нажатия кнопок, отмеченных цифрой и красным прямоугольником в окне "фонового вычитания". Шаг «установить изображение» необходимо выполнить после выбора окна обработки. (F) Масштабная линейка = 1 см. Окно «медианное изображение» будет представлено после нажатия кнопки «показать фильтр» в «E4» и прямого закрытия окна без каких-либо операций. (G) Параметр гауссовского размытия устанавливается со значением сигмы по умолчанию, равным 2,0. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Пороговые настройки второго кадра. (A) Щелкнув нижний индикатор выполнения, сделайте так, чтобы видеоокно перешло ко второму кадру. Муха повторяется в середине экрана и идентифицируется Фиджи. Масштабная линейка = 1 см. (B,C) Отображение окна обработки до и после фильтрации. (B) Отобразите отфильтрованное окно обработки, выбрав режим, отмеченный красным прямоугольником. (C) Пример окна обработки с красным прямоугольником после выбора режима "фильтрации". Масштабная линейка = 1 см. (D) Установите пороговое значение, выбрав метод порога по умолчанию, «пороговое значение оттенков серого», показанное в окне «пороговые значения», после выбора инструмента «установить пороговое значение» на рисунке 3A,4. (E) Отрегулируйте параметры, сдвинув индикатор выполнения посередине до тех пор, пока мушка слежения не будет видна и не будет закрыта красным профилем. Не рекомендуется изменять настройки по умолчанию для параметров, расположенных в красном прямоугольнике ниже. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Детектор больших двоичных объектов, настройка последнего кадра и выбор отслеживания животных. (A) При достижении порогового значения, указанного на рисунке 5E, в окне обработки отображается значительный красный профиль, следующий за мухой во втором кадре. Сделайте так, чтобы красный профиль, покрывающий муху, подходил для отслеживания мухи. Масштабная линейка = 1 см. (B) Определите муху, покрытую красным профилем, в качестве цели для отслеживания, выбрав метод обнаружения больших двоичных объектов по умолчанию, «базовый детектор больших двоичных объектов». (C) Установите кадр 901 в качестве последнего кадра с помощью инструмента «установить последний кадр» на фиг.3A,6. Общее количество кадров вычисляется по формуле «номер кадра = кадры в секунду * время записи». (D) Трекинг летит с желтым прямоугольником, помещенным в рамку после показа больших двоичных объектов в открытом окне видео (левая часть панели). На увеличенной левой панели плодовые мушки прикреплены красным цветом (правая секция панели). Масштабная линейка = 1 см. (E) Отслеживающая муха с красным прямоугольником в рамке после щелчка, чтобы выбрать красный прямоугольник в «D» (верхняя часть панели). В верхнем расширении панели плодовые мушки прикреплены красным цветом (нижняя часть панели). Убедитесь, что выделение желтого прямоугольника вокруг отслеживающей мухи завершено в открывшемся окне видео. Завершите выбор в открывшемся окне видео, и муха будет идентифицирована Фиджи во всех кадрах. Масштабная линейка = 1 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Результаты отслеживания трассировки. Трассировка слежения отображается отдельно в открывшемся окне видео (А) и окне обработки (Б). Чтобы получить профиль трассировки отслеживания, нажмите на индикатор выполнения в исходном окне видео и сдвиньте индикатор выполнения, чтобы проверить непрерывность трассировки. След слежения интуитивно показывает расстояние ползания мух. Масштабная линейка = 1 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8: Отслеживание анализа файлов с помощью плагинов AnimalTracker. (A) анализатор отслеживания облегчает детальный анализ файла отслеживания; Каждый шаг, отмеченный красным прямоугольником, обозначается числом. (B) Установите параметры «настройки зоны» в A,4. Четыре параметра: время, расстояние, время неподвижности и вектор скорости показаны красным прямоугольником. Параметр подбирается исходя из желаемого результата. (К-Г) Задайте параметры конфигурации по отдельности в окне "задать параметры" А,5. (C) Четыре регулируемых параметра проиллюстрированы в окне "настройки параметров конфигурации", (D-G) - в окнах "настройки времени", "настройки времени неподвижности", "настройки расстояния" и "настройки вектора скорости", соответственно. Изменять значение параметров по умолчанию не рекомендуется. Однако для «интервала кадров» параметр должен быть рассчитан по формуле «интервал кадров = 1/fps» при изменении fps видео. Кроме того, можно использовать известную шкалу для определения фактического расстояния и скорости путем корреляции пикселей, записанных с отслеживанием мухи, с осязаемым значением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 9: Результат, отображающий анализ файла отслеживания. (A) Настройка, показанная на рисунке 8А,6. Доступны два режима отображения данных: «сгруппированные по зонам» и «сгруппированные по параметрам». (B) Результаты анализа файлов отслеживания показаны как "сгруппированные по зонам" в "A,6.1". (С-Ж) Результаты анализа файлов слежения показаны как «сгруппированные по параметрам» в A,6.2, демонстрирующие «время неподвижности» (C), «вектор скорости» (D), «время» (E) и «расстояние» (F) отдельно. Результаты времени и расстояния неподвижности количественно обозначаются как «s» и «пиксели». Единица вектора скорости должна быть определена как «пиксель/с», а выводиться с аннотацией «длина». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 10: Результаты анализа данных на скорость в секунду. (A, C и E ) Экспортируемые данные содержат координаты пикселей в горизонтальных (столбец «C») и вертикальных (столбец «D») разделах, а также перемещение пикселей, неподвижность и угол изменения направления между двухкадровыми интервалами (столбец «E» в A, C и E соответственно), который автоматически вычисляется по формуле, описанной в контексте. Поскольку результаты, экспортируемые с Фиджи, представляют собой текстовые документы, рекомендуется открыть файл с помощью Microsoft Office Excel и разделить данные на три столбца, добавив между ними пробелы. (B, D и F) Линейная диаграмма отображает вычисленные результаты из набора данных о движении пикселей (B). Глобальное пиковое значение представляет собой скорость, указывающую на возможности обнаружения движения; на гистограмме отображаются вычисленные результаты из набора данных неподвижности (D). Степень разреженности в гистограмме представляет собой неподвижность, которая проявляет дефект двигательных способностей мух; точечная диаграмма отображает вычисленные результаты на основе набора данных угла изменения направления (F). Обогащение брызгами, показанное на диаграмме рассеяния, представляет собой направление, выбранное мухой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 11: Сравнительный анализ движения между мухами, обработанными ротеноном или без него. (A) Показаны репрезентативные графики отслеживания следов взрослых мух W1118, которых кормили стандартным кормом, содержащим 500 мкМ ротенон, или ДМСО для контроля. W1118 мух были собраны, а затем помещены в контролируемую среду, состоящую из стандартного корма с 500 мкМ ротенона или ДМСО, 25 ° C и влажностью 60%. Для анализа использовали шесть мух из каждой группы через 48 часов. Результат показывает, что расстояние движения отслеживающих мух, питаемых ротеноном, значительно уменьшается по сравнению с контролем. Результат показал дефектную двигательную способность у мух, которых кормили ротеноном. (Б-Е) Количественный анализ обработки ротеноном по среднему пройденному расстоянию, времени неподвижности, средней скорости и максимальной скорости проводится с использованием Фиджи. Результаты лечения ротеноном показали значительное уменьшение пройденного расстояния и средней скорости, а также значительное увеличение времени неподвижности. (Ф-К) Анализ пикселей на кадр (F, G), времени неподвижности на кадр (H, I) и угла изменения направления (J, K) между мухами, обработанными ротеноном (G, I, K) или DMSO (F, H, J). Примеры графиков, иллюстрирующих влияние ротенона на скорость движения, показывают меньшее количество пиков, представляющих скорость движения за интервал кадра у мух, которых кормили ротеноном (G), по сравнению с мухами в контроле (F), что указывает на тяжесть дефекта двигательной активности (F, G). Интуиционистская неподвижность столбца перемещенных пикселей на кадр ниже, показывая значительно меньшее движение в течение 1 минуты для мух, питающихся ротеноном (I), по сравнению с контрольными мухами (H). Примеры графиков изменения угла перемещения у животных, получающих ротенон (K) и контрольных (J), показывают изменения в направлении, выбранном мухами. Данные представляют собой среднюю ± SEM шести самцов мух, наблюдаемых в течение 1 минуты. Звездочки указывают на значимые различия между группами (***p < 0,001; непарный t-критерий, p = 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 12: Сравнительный анализ перемещения между личинками, обработанными ротеноном или без него. (A) Репрезентативные результаты сравнения двигательной активности путем отслеживания следов личинок W 1118 третьего возраста, питаемых ротеноном или ДМСО. Вкратце, личинки W 1118 третьего возраста были собраны и культивированы в 10% сахарозе или 10% сахарозе, содержащей 500 мкМ ротенона, в среде 25 ° C с влажностью 60%. Для анализа использовали шесть личинок в группе. Принимая во внимание медленное движение личинок, данные, записанные в течение 5 минут, были количественно оценены и проанализированы для оценки влияния ротенона на передвижение. (Б-Е) Количественно проанализированы среднее расстояние, время неподвижности, средняя скорость и максимальная скорость двух групп, проанализированных на Фиджи. Количественные результаты показывают, что дистанция движения, средняя скорость и максимальная скорость значительно уменьшаются у личинок, получающих ротенон, и время неподвижности значительно увеличивается у личинок, получающих ротенон. (Ф-К) Подобно взрослым мухам, анализ пикселей на кадр, времени неподвижности и изменения угла направления между мухами, обработанными ротеноном (G, I, K) и без ротенона (F, H, J), показал, что личинки, обработанные ротеноном, имели более низкую скорость движения, большее время неподвижности и чередовали свои направления. Результаты показывают, что поведенческое движение личинок слежения, которых кормили ротеноном, значительно нарушено по сравнению с контролем. Результаты показывают дефектную двигательную активность мух, которых кормили ротеноном. Данные представляют собой среднее ± SEM шести 3-дневных личинок, контролируемых в течение 5 минут. Звездочки указывают на достоверную разницу между группами (*p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; непарный t-критерий, p = 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Сравнение методологий, основанных на отслеживании животных, для количественной оценки двигательной активности дрозофилы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы разработали метод, основанный на материалах с открытым исходным кодом AnimalTracker API, совместимых с программой обработки изображений Фиджи, который может позволить исследователям систематически оценивать двигательную активность, отслеживая как взрослых, так и отдельных личинок мух. AnimalTracke - это инструмент, написанный на Java, который может быть легко интегрирован в существующие базы данных или другие инструменты для облегчения анализа поведения при отслеживании животных, разработанного приложением24. При покадровом анализе с помощью формулы расчета, которая количественно оценивает двигательную активность взрослых особей и личинок, можно гибко проанализировать несколько параметров, включая скорость движения, пройденное расстояние, неподвижность и изменение угла направления. Эти параметры, которые представляют различные аспекты поведенческой локомоции, могут быть построены для иллюстрации локомоторных изменений с течением времени. Кроме того, создавая графический пользовательский интерфейс, предоставляя подробную документацию по его использованию и интерфейс прикладного программирования, мы стремимся сделать этот метод доступным для исследователей, которым не хватает опыта программирования, и опытных пользователей, создающих собственные экспериментальные парадигмы.
Чтобы убедиться в том, что метод может точно контролировать поведение, было проведено локомоторное тестирование взрослых мух и личинок, обработанных ротеноном, а также сравнение их двигательной активности с таковой у контрольных мух, получавших растворитель препарата. Программное обеспечение Fiji с его плагинами используется для анализа пиксельных координат каждого кадра в видеозаписи движения, что позволяет вычислять скорость, расстояние и другие параметры подопытных мух. Мы наблюдали значительное уменьшение расстояния, пройденного с течением времени при введении ротенона (рис. 11), что согласуется с сообщенными результатами23. Между тем, восходящая скорость движения и выбранное ненормальное направление наблюдались в группах, получавших лекарственное питание, чтобы помочь проиллюстрировать более подробную информацию о поведенческом дефиците у мух. Учитывая успех в обнаружении двигательной активности взрослых мух, мы попытались оценить подвижность личинок (рис. 12). По сравнению с контролем, результаты отслеживания личинок, которых кормили ротеноном, были значительно ухудшены, параллельно с результатами взрослых мух, которых кормили препаратами. Эксперименты со взрослыми особями и личинками, которых кормили ротеноном, показывают, что этот метод может точно регистрировать сокращение мух, которые вызывали дефицит опорно-двигательного аппарата, по сравнению с контрольной группой. В этом отчете успешно продемонстрировано применение современного метода для количественной оценки и анализа локомоторных способностей и других аспектов дефектов поведения плодовых мушек в моделях тестирования или фармакологических исследованиях на животных.
Чтобы убедиться, что анализ видео и трекинга дает успешные и воспроизводимые результаты, рекомендуется придерживаться следующих рекомендаций. Во-первых, для выбора частоты кадров видео мы рекомендуем конвертировать записанное видео в формат 15 кадров в секунду (fps). Это может не только поддерживать хорошее отслеживание движения, но и избежать медлительности компьютерного анализа, вызванной огромными объемами данных. Улучшая частоту кадров видео, анализ траектории движения становится более подробным. Во-вторых, параметры в формуле также могут быть скорректированы в соответствии с соответствующей экспериментальной схемой при анализе статического движения между каждыми двумя кадрами. Для мониторинга опорно-двигательного аппарата личинок важно использовать силикагель, а не агар, так как затвердевший силикагель плотный, и личинки не могут попасть в него. Кроме того, силикагель прозрачен и может быть окрашен путем добавления цветного вещества для создания оптимального фона, способствуя желаемым оптическим эффектам, повышающим качество изображения.
Системы слежения за животными совершенствуются, чтобы обеспечить комплексные решения для сообществ этиологии, неврологии и поведенческой генетики. В таблице 1 приведено сравнение функций нескольких программ отслеживания, доступных в настоящее время 10,11,12,16,17,25,26. Этот подход чрезвычайно экономичен, прост в освоении и точен в измерении двигательного поведения, не требуя дорогостоящего программного обеспечения и оборудования. Нет никаких сомнений в том, что этот метод может быть удобно распространен на другие модели животных, подобных дрозофилам, и даже на более крупных животных, таких как крысы и мыши. Структура API AnimalTracker может быть легко расширена с помощью независимых приложений или плагинов ImageJ, предлагающих широкий спектр полезных наборов инструментов для исследования и анализа пользовательского поведения24. Тем не менее, это исследование имеет определенные ограничения. Поскольку одиночная мушка размещается на арене в открытом поле для записи изображения, а видеослежение ведется индивидуально, этот метод малоэффективен и трудозатратен. Мы попытались расширить возможности для одновременной записи нескольких арен, что позволило сделать до шести отдельных записей. Теоретически возможно регистрировать большее количество дрозофил одновременно; Это зависит от размера арены и конфигурации камеры. В качестве альтернативы, если пользователи хотят расширить регистрацию сгруппированных дрозофил, рекомендуется рассмотреть ограниченное количество одиночных записей и конфигурацию достаточного качества для выявления столкновений и перекрытий между мухами. Повышение эффективности тестирования с помощью машинного обучения в исследовании не рассматривалось, поскольку не был найден доступный и совместимый подход, который можно было бы интегрировать с текущей системой для визуального различения идентичностей и точного отслеживания моделей.
Таким образом, описанный здесь метод разрабатывает и проверяет эффективный и простой подход, основанный на свободном программном обеспечении с открытым исходным кодом, предназначенном для сокращения затрат времени и совершенствования экспериментальных методов количественной индикации и анализа локомоции дрозофилы на личинках и взрослых стадиях. Благодаря систематическому анализу этот метод может помочь нам понять, как скорость животного изменяется с течением времени во время движения, а также характеристики выбора направления. Таким образом, включение программного обеспечения с открытым исходным кодом в широко используемые цифровые устройства обеспечивает надежный способ проверки двигательной активности в различных моделях мух. Это может быть полезно для оценки физиологических и патологических локомоторных выходов при тестировании моделей нейродегенеративных заболеваний, полученных в результате фармакологического лечения и трансгенной модификации у дрозофилы, а также у других животных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана специальным стартовым фондом Университета Сучжоу и Национальным научным фондом Китая (NSFC) (82171414). Мы благодарим сотрудников лаборатории профессора Чуньфэн Лю за их обсуждение и комментарии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal tracker | Hungarian Brain Research Program | version: 1.7 | pfficial website: http://animaltracker.elte.hu/main/downloads |
| Camera software | Microsoft | version: 2021.105.10.0 | built-in windows 10 system |
| Computer | DELL | Vostro-14-5480 | a comupter running win 10 system is available |
| Drosophila carbon dioxide anesthesia workstation | Wu han Yihong technology | #YHDFPCO2-018 | official website: http://www.yhkjwh.com/ |
| Fiji software | Fiji team | version: 1.53v | official website: https://fiji.sc/ |
| Format factory software | Pcfreetime | version: X64 5.4.5 | official website: http://www.pcfreetime.com/formatfactory/CN/index.html |
| Graph pad prism | GraphPad Software | version: 8.0.2 | official website: https://www.graphpad-prism.cn |
| Hight definition camera | TTQ | Jingwang2 (HD1080P F1.6 6-60mm) | official website: http://www.ttq100.com/product_show.php?id=35 |
| Office software | Microsoft | version: office 2019 | official website: https://www.microsoftstore.com.cn/software/office |
| Petri dish | Bkman | 110301003 | size: 60 mm |
| Silica gel | DOW | SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Mix well according to the instructions |
| Sodium bicarbonate | Macklin | #144-55-8 | Mix well with silica gel |
References
- Ham, S. J., et al. Loss of UCHL1 rescues the defects related to Parkinson's disease by suppressing glycolysis. Science Advances. 7 (28), (2021).
- Algarve, T. D., Assmann, C. E., Aigaki, T., da Cruz, I. B. M. Parental and preimaginal exposure to methylmercury disrupts locomotor activity and circadian rhythm of adult Drosophila melanogaster. Drug and Chemical Toxicology. 43 (3), 255-265 (2020).
- Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental Gerontology. 46 (5), 320-325 (2011).
- Yamaguchi, M., Yoshida, H. Drosophila as a model organism. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1076, 1-10 (2018).
- Rothenfluh, A., Heberlein, U. Drugs, files, and videotape: the effects of ethanol and cocaine on Drosophila locomotion. Current Opinion in Neurobiology. 12 (6), 639-645 (2002).
- Tsuda, L., Lim, Y. M. Alzheimer's disease model system using Drosophila. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1076, 25-40 (2018).
- Dung, V. M., Thao, D. T. P.
- Liguori, F., Amadio, S., Volonte, C. Fly for ALS: Drosophila modeling on the route to amyotrophic lateral sclerosis modifiers. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (17-18), 6143-6160 (2021).
- Cao, W., et al. An automated rapid iterative negative geotaxis assay for analyzing adult climbing behavior in a Drosophila model of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (127), 56507 (2017).
- Eidhof, I., et al. High-throughput analysis of locomotor behavior in the Drosophila island assay. Journal of Visualized Experiments. (129), 55892 (2017).
- Scaplen, K. M., et al. Automated real-time quantification of group locomotor activity in Drosophila melanogaster. Scientific Reports. 9 (1), 4427 (2019).
- Werkhoven, Z., Rohrsen, C., Qin, C., Brembs, B., de Bivort, B. MARGO (Massively Automated Real-time GUI for Object-tracking), a platform for high-throughput ethology. PLoS One. 14 (11), e0224243 (2019).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental Gerontology. 40 (5), 386-395 (2005).
- Cichewicz, K., Hirsh, J. ShinyR-DAM: a program analyzing Drosophila activity, sleep and circadian rhythms. Communications Biology. 1, 25 (2018).
- McParland, A. L., Follansbee, T. L., Ganter, G. K. Measurement of larval activity in the Drosophila activity monitor. Journal of Visualized Experiments. 98, e52684 (2015).
- Walter, T., Couzin, I. D. TRex, a fast multi-animal tracking system with markerless identification, and 2D estimation of posture and visual fields. eLife. 10, (2021).
- Maia Chagas, A., Prieto-Godino, L. L., Arrenberg, A. B., Baden, T. The €100 lab: A 3D-printable open-source platform for fluorescence microscopy, optogenetics, and accurate temperature control during behaviour of zebrafish, Drosophila, and Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 15 (7), e2002702 (2017).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
- Xiao, G. Methods to assay the behavior of Drosophila melanogaster for toxicity study. Methods in Molecular Biology. 2326, 47-54 (2021).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Johnson, M. E., Bobrovskaya, L. An update on the rotenone models of Parkinson's disease: their ability to reproduce the features of clinical disease and model gene-environment interactions. Neurotoxicology. 46, 101-116 (2015).
- Coulom, H., Birman, S. Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson's disease in Drosophila melanogaster. The Journal of Neuroscience. 24 (48), 10993-10998 (2004).
- Kumar, P. P., Bawani, S. S., Anandhi, D. U., Prashanth, K. V. H. Rotenone mediated developmental toxicity in Drosophila melanogaster. Environmental Toxicology and Pharmacology. 93, 103892 (2022).
- Gulyas, M., Bencsik, N., Pusztai, S., Liliom, H., Schlett, K. AnimalTracker: an ImageJ-based tracking API to create a customized behaviour analyser program. Neuroinformatics. 14 (4), 479-481 (2016).
- Qu, S. EasyFlyTracker: a simple video tracking Python package for analyzing adult Drosophila locomotor and sleep activity to facilitate revealing the effect of psychiatric drugs. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 15, 809665 (2022).
- Yarwais, Z. H., Najmalddin, H. O., Omar, Z. J., Mohammed, S. A. Automated data collection of Drosophila movement behaviour assays using computer vision in Python. International Journal of Innovative Approaches in Science Research. 4 (1), 15-22 (2020).
