Summary
Il presente protocollo valuta l'attività locomotoria di Drosophila tracciando e analizzando il movimento delle mosche in un'arena fatta a mano utilizzando il software open source Fiji, compatibile con plugin per segmentare i pixel di ogni fotogramma in base alla registrazione video ad alta definizione per calcolare i parametri di velocità, distanza, ecc.
Abstract
Drosophila melanogaster è un organismo modello ideale per lo studio di varie malattie grazie alla sua abbondanza di tecniche avanzate di manipolazione genetica e diverse caratteristiche comportamentali. Identificare la carenza comportamentale nei modelli animali è una misura cruciale della gravità della malattia, ad esempio, nelle malattie neurodegenerative in cui i pazienti spesso presentano menomazioni nella funzione motoria. Tuttavia, con la disponibilità di vari sistemi per tracciare e valutare i deficit motori nei modelli di mosca, come gli individui trattati con farmaci o transgenici, manca ancora un sistema economico e facile da usare per una valutazione precisa da più angolazioni. Qui viene sviluppato un metodo basato sull'interfaccia di programmazione dell'applicazione (API) AnimalTracker , compatibile con il programma di elaborazione delle immagini delle Fiji, per valutare sistematicamente le attività di movimento di individui adulti e larvali dai video registrati, consentendo così l'analisi del loro comportamento di tracciamento. Questo metodo richiede solo una telecamera ad alta definizione e un'integrazione hardware periferica per registrare e analizzare il comportamento, rendendolo un approccio economico ed efficace per lo screening di modelli di mosche con carenze comportamentali transgeniche o ambientali. Vengono forniti esempi di test comportamentali che utilizzano moscerini trattati farmacologicamente per mostrare come le tecniche possono rilevare cambiamenti comportamentali sia nelle mosche adulte che nelle larve in modo altamente ripetibile.
Introduction
Drosophila melanogaster fornisce un eccellente organismo modello per studiare le funzioni cellulari e molecolari in modelli di malattia neuronale creati da modificazione genica1, trattamento farmacologico2 e senescenza3. L'elevata conservazione dei percorsi biologici, delle proprietà fisiche e dei geni omologhi associati alla malattia tra gli esseri umani e la Drosophila rende il moscerino della frutta un imitatore ideale dal livello molecolare a quello comportamentale4. In molti modelli di malattia, la carenza comportamentale è un indice importante, fornendo un modello utile per varie neuropatie umane 5,6. La Drosophila è ora utilizzata per studiare molteplici malattie umane, neurosviluppo e malattie neurodegenerative come il morbo di Parkinson e la sclerosi laterale amiotrofica 7,8. Rilevare la capacità motoria dei modelli di malattia è fondamentale per comprendere il progresso patogenetico e può fornire una correlazione fenotipica ai meccanismi molecolari alla base del processo patologico.
Recentemente, sono stati sviluppati strumenti software disponibili in commercio e programmi convenienti per le strategie di rilevamento locomotorio della Drosophila, come il test ad alta produttività in mosche raggruppate9,10 e la misurazione della locomozione in tempo reale11,12. Uno di questi approcci convenzionali è la geotassi negativa interattiva rapida (RING), chiamata anche saggio di arrampicata, che include più canali che consentono di contenere una grande popolazione di mosche con lo stesso sesso ed età, riducendo la variazione durante la raccolta dei dati 9,13. Un altro metodo di pre-test per analizzare il comportamento locomotore è TriKinetics Drosophila activity monitor (DAM), un dispositivo che utilizza più fasci per rilevare il movimento dell'attività della mosca all'interno di un sottile tubo di vetro14. Il dispositivo registra continuamente la posizione, che rappresenta la locomozione automatizzata calcolando gli attraversamenti del fascio per studiare l'attività e il ritmo circadiano delle mosche per un periodo di tempo più lungo15. Sebbene questi metodi siano stati ampiamente utilizzati nell'analisi dei difetti comportamentali nei moscerini della frutta per determinare i cambiamenti nella locomozione comportamentale, richiedono sempre attrezzature di prova speciali o processi di analisi complessi e limitano la loro applicazione in alcuni modelli con un dispositivo limitato e semplice. Le strategie basate sul gruppo di tracciamento degli animali per testare la Drosofila adulta, come FlyGrAM11 e il test dell'isola di Drosophila 10, implementano il reclutamento sociale e il monitoraggio individuale in un'area predefinita. Tuttavia, la restrizione sociale individuale nelle aree sfidate potrebbe avere un effetto negativo sulle identificazioni nelle immagini, causate dalla collisione o dalla sovrapposizione delle mosche. Anche se alcuni metodi basati su materiali open source, come TRex16, MARGO 12 e FlyPi17, hanno un'emergenza, possono tracciare rapidamente le mosche con un utilizzo flessibile nei test comportamentali. Questi approcci di test sono associati a elaborate installazioni di apparecchiature sperimentali, requisiti software speciali o linguaggi informatici professionali. Per le larve, misurare la distanza totale percorsa attraverso il numero di linee di confine della griglia per unità di tempo18, o contare approssimativamente le contrazioni della parete corporea per gli individuimanualmente 19, sono i metodi predominanti per valutare la loro capacità locomotoria. A causa della mancanza di precisione nelle attrezzature o nei dispositivi e nei metodi di analisi, alcune locomozioni comportamentali delle larve potrebbero sfuggire al rilevamento, rendendo difficile valutare con precisione il movimento comportamentale, in particolare il movimento fine15.
Il presente metodo sviluppato utilizza l'interfaccia di programmazione dell'applicazione AnimalTracker (API), compatibile con il programma di elaborazione delle immagini Fiji (ImageJ), per valutare sistematicamente l'attività locomotoria di mosche adulte e larvali analizzando il loro comportamento di tracciamento da video ad alta definizione (HD). Fiji è una distribuzione software open source ImageJ in grado di combinare robuste librerie software con numerosi linguaggi di scripting, con conseguente prototipazione rapida di algoritmi di elaborazione delle immagini, rendendolo popolare tra i biologi per le sue capacità di analisi delle immagini20. Nell'approccio attuale, l'integrazione delle Fiji nell'API AnimalTracker viene sfruttata per sviluppare un test comportamentale unico di Drosophila con inserimento personalizzato dell'algoritmo e fornisce un passaggio utile per una documentazione dettagliata e tutorial per supportare solide capacità analitiche del comportamento locomotore (Figura 1). Per aggirare la complicazione delle identificazioni oggettive nelle immagini causate dalla collisione o dalla sovrapposizione di mosche, ogni arena è limitata ad ospitare una sola mosca. Dopo aver valutato la precisione di tracciamento dell'approccio, è stato implementato per tracciare e quantificare i movimenti locomotori di Drosophila che sono stati somministrati con il farmaco tossico rotenone, che viene generalmente utilizzato per modelli animali della malattia di Parkinson, scoprendo infine la compromissione della locomozione nel trattamento farmacologico21. Questa metodologia, che impiega software open source e libero, non richiede strumentazione ad alto costo e può analizzare in modo preciso e riproducibile la locomozione comportamentale della Drosophila .
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Protocol
Per il presente studio sono state utilizzate W1118 mosche adulte e larve di terzo stadio.
1. Preparazione sperimentale
NOTA: Un'arena in campo aperto per il monitoraggio della locomozione della Drosophila è realizzata conun gel di silice incolore e inodore.
- Miscelare il reagente A e il reagente B in un rapporto di 1:10, secondo le istruzioni del produttore per il kit di silice (vedere la tabella dei materiali). Assicurarsi che il bicarbonato di sodio venga aggiunto alla miscela mescolando fino a quando il colore diventa bianco. Trasferire il composto in una piastra di Petri pulita e metterlo in forno a 40 °C per l'essiccazione per 48 ore.
- Posizionare la videocamera HD (vedere Tabella dei materiali) su un treppiede, regolandolo in modo che l'obiettivo della fotocamera sia perpendicolare alla superficie dell'arena di silice. Regolando la lunghezza focale e le aperture della fotocamera, assicurarsi che la fotocamera sia focalizzata sulla superficie della silice e che il display sia adeguatamente illuminato. La configurazione sperimentale è illustrata nella Figura 1.
- Trasferisci una mosca nell'arena in campo aperto per registrare un video continuo di almeno 61 s.
NOTA: Considerando la natura lenta delle larve, si consiglia un tempo di registrazione video di oltre 10 minuti.- Apri il video con Fiji, trascina la barra di avanzamento sul fotogramma iniziale e approva tacitamente. Scegli l'intero corpo della mosca usando lo strumento "selezione a mano libera" (Figura 2B, C).
- Fare clic sull'immagine > regolare > luminosità e contrasto per regolare il bilanciamento del bianco fino a quando il valore di grigio dell'area selezionata si avvicina allo sfondo generale (Figura 2D-F).
NOTA: L'omogeneizzazione dello sfondo del primo fotogramma consente al software di distinguere lo sfondo senza oggetti e creare un contrasto quando è presente una mosca, consentendo così al software di seguirlo.
- Eseguire l'intero esperimento in un ambiente di prova impostato a 25 °C e 60% di umidità relativa, in un'area silenziosa e priva di esposizione alla luce intensa.
2. Registrazione video e pre-elaborazione
- Dopo un breve periodo di anestesia utilizzando il 95% di anidride carbonica (CO2), trasferire una mosca nell'arena aperta e premere il pulsante di registrazione sull'applicazione della fotocamera per avviare la registrazione video.
NOTA: Per ridurre al minimo l'effetto dell'anestetico sulla locomozione, consentire alle mosche di recuperare per 10 minuti prima di iniziare la registrazione video. Si raccomanda anche l'anestetizzazione a freddo mediante raffreddamento.- Una volta che le mosche si sono riprese dall'anestesia, metti il piatto dell'arena contenente la mosca sotto la fotocamera e scuoti rapidamente la piastra da un lato all'altro per assicurarti che la mosca sia in movimento quando inizia la registrazione.
- Al termine della registrazione, premere il pulsante di arresto per terminare la registrazione video.
NOTA: assicurarsi che il tempo di registrazione video superi leggermente il tempo di tracciamento della destinazione di un piccolo margine. Inoltre, per migliorare l'efficienza sperimentale, è possibile tracciare più mosche spontaneamente. Questo dipende dalla risoluzione della fotocamera per consentire un ritaglio video di alta qualità. - Converti i video registrati in formato AVI con codifica MJPEG, in modo che possano essere aperti e analizzati utilizzando le Fiji. Nel frattempo, imposta la frequenza dei fotogrammi al secondo (fps) del video su 15 fps per le mosche adulte e 12 fps per le larve.
3. Analisi video
- Apri il video che è stato trasformato con "usa stack virtuale" e "converti in scala di grigi", due opzioni nella finestra popup quando apri il video con Fiji (Figura 2A).
- Crea un primo fotogramma vuoto, come menzionato sopra.
- Ottenere una finestra di elaborazione utilizzando lo strumento "imposta immagine attiva" del plugin AnimalTracker e creare un'area di tracciamento che circonda l'arena nella finestra video originale utilizzando lo strumento "ovale" (Figura 3A).
- Impostate i filtri (Figura 3A,3) e i parametri dei due filtri (Figura 4A-G) per il primo fotogramma vuoto nella finestra di elaborazione. Quindi, selezionate il fotogramma successivo nella finestra video originale e scegliete la superficie filtrata della finestra di elaborazione (Figura 5A-C).
NOTA: La fase di filtraggio serve a diminuire il rumore dell'immagine e/o rimuovere lo sfondo, rendendo così più semplice separare il primo piano dallo sfondo nella binarizzazione dei fotogrammi. - Una volta selezionata una finestra di elaborazione filtrata, ruotare la mosca tracciata con un profilo rosso coperto nella finestra di elaborazione utilizzando lo strumento "imposta soglia" (Figura 3A,4, Figura 5D-E e Figura 6A).
- Utilizzare il "set blob-detector" per consentire al computer di riconoscere la mosca con un profilo rosso coperto nella finestra di elaborazione (Figura 3A,5 e Figura 6B).
- Impostare il fotogramma 901 come ultimo fotogramma per la mosca adulta, calcolato in base alla durata della registrazione del video e agli fps (Figura 3A,6, Figura 6C).
NOTA: Il seguente esperimento con le larve è stato monitorato per 10 minuti, quindi il fotogramma 7200 è impostato come ultimo fotogramma. - Utilizzare lo strumento "mostra blob" per presentare un rettangolo di tracciamento nella finestra video originale (Figura 3A,7 e Figura 6D,E). Quindi, avviare il rilevamento ed esportare il file di rilevamento al termine del monitoraggio (Figura 3A,8,9 e Figura 7A,B).
4. Analisi dei file di tracciamento
- Caricare i file di traccia e zona utilizzando il plug-in Animal tracker > Tracking analyzer (Figura 8A).
- Selezionare l'indice desiderato utilizzando le impostazioni della zona e modificare le impostazioni dei parametri (Figura 8). Calcolate il tempo dell'intervallo di fotogrammi utilizzando la frequenza fotogrammi.
NOTA: in questa condizione, la frequenza fotogrammi è 15 fps e l'intervallo di fotogrammi è di circa 0,067 s, che è l'impostazione predefinita (Figura 8D). - Produrre i grafici di analisi quantitativa utilizzando il software per fogli di calcolo e GraphPad Prism dopo essere stati analizzati nell'analizzatore di tracciamento (Figura 9).
5. Analisi per fotogramma
- Eseguire l'analisi della velocità per intervallo di fotogrammi. Analizza il file di traccia senza Fiji se è necessaria una ricerca più dettagliata.
- Aprire il file di traccia, copiare tutte le coordinate in Microsoft Office Excel e dividere le celle utilizzando la barra spaziatrice.
NOTA: Ad esempio, una volta che il file è stato diviso in colonne "C" e "D", la velocità di Drosophila per intervallo di fotogrammi viene calcolata dalla formula SQRT((C5-C4)^ 2+(D5-D4)^2), mostrata nella colonna "E" (Figura 10A). I dati nella colonna "E" indicano il numero di pixel che la mosca ha spostato tra due fotogrammi, senza considerare il primo fotogramma. Selezionare tutti i risultati calcolati e inserire un grafico a linee per visualizzare una velocità di movimento di volo intuitiva per intervallo di fotogrammi, con un picco sul grafico a linee (Figura 10B).
- Aprire il file di traccia, copiare tutte le coordinate in Microsoft Office Excel e dividere le celle utilizzando la barra spaziatrice.
- Calcola il tempo di immobilità per intervallo di fotogrammi. Dopo che il file è stato diviso in colonne "C" e "D", calcolare lo stato di immobilità di Drosophila per intervallo di fotogrammi utilizzando la formula IF(SQRT((C6-C5)^ 2+(D6-D5)^2) <20, 0, 1), che viene mostrata nella colonna "E". (Figura 10C).
NOTA: a differenza dell'analisi della velocità, sono stati definiti i risultati del primo fotogramma. Le mosche che si muovevano meno di 20 pixel erano considerate immobili e registrate come "0" nella colonna "E".- Selezionare tutti i risultati calcolati e inserire un istogramma per visualizzare visivamente il tempo di immobilità con il margine dell'intero istogramma (Figura 10D).
- Assicurarsi che l'angolo di direzione cambi.
NOTA: l'analisi del cambio di direzione rappresenta la scelta della direzione delle mosche. Una volta che il file è stato suddiviso nelle colonne "C" e "D", l'angolo di cambio di direzione viene calcolato dalla formula ACOS(((SQRT(((C7-C6)^2+(D7-D6)^2))^2+(SQRT(((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))^2-(SQRT((C7-C5)^2+(D7-D5)^2))^2)/(2*SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))*( SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2)))*180/PI(), che è presentata nella colonna "E" (Figura 10E). I risultati calcolati indicano l'angolo tra tre coordinate.- Selezionare tutti i risultati calcolati e inserire un diagramma a dispersione per illustrare l'angolo di cambio di direzione del movimento delle mosche (Figura 10F).
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Representative Results
Nel presente studio, i deficit locomotori nelle mosche adulte e nelle larve di terzo stadio trattate con rotenone sono stati esaminati e confrontati nella loro attività motoria con quella di una mosca di controllo alimentata con il solvente farmaco dimetil solfossido (DMSO). Il trattamento con rotenone in Drosophila ha dimostrato di causare perdita di neuroni dopaminergici nel cervello22 e portare a significativi deficit locomotori23. Come mostrato in Figura 11 e Figura 12, le mosche adulte e le larve di terzo stadio trattate con rotenone hanno deficit locomotori significativi rispetto a quelli delle mosche di controllo alimentate con DMSO. La Figura 11 e la Figura 12B-E illustrano i cambiamenti relativi nella distanza, nella velocità e nel tempo di immobilità per i parametri di movimento tra mosche trattate con o senza rotenone. La Figura 11 e la Figura 12F-K illustrano un'analisi rappresentativa dei parametri di velocità, tempo di immobilità e selezione della direzione, con o senza trattamento con rotenone negli adulti e nelle larve. L'analisi quantitativa dei parametri di distanza, tempo di immobilità e velocità utilizzando il software delle Fiji nelle mosche adulte (Figura 11) e nelle larve del terzo stadio (Figura 12) dei gruppi di alimentazione dei farmaci convalida ulteriormente che il trattamento con rotenone può essere utilizzato per studiare i deficit locomotori nelle malattie umane, comprese le condizioni neurodegenerative, e replicare alcune delle caratteristiche comportamentali osservate negli esseri umani e nei mammiferi.
Figura 1: Diagramma di flusso che illustra la configurazione dell'apparecchiatura e la procedura sperimentale per l'analisi del tracciamento del movimento della Drosophila . L'arena di tracciamento locomotore viene ripresa con una telecamera HD dall'alto incorporata e controllata da un computer. La procedura per analizzare la locomozione della Drosophila consiste nella registrazione video, nel tracciamento del movimento, nell'analisi dei file di tracciamento, nell'elaborazione dei dati e nell'analisi parametrica. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Omogeneizzazione dello sfondo del primo fotogramma. (A) Selezionare l'opzione "converti in scala di grigi" durante l'apertura del video trasformato, per trasformare il video in scala di grigi ed evitare l'interferenza del colore. (B) Descrivi Drosophila usando lo strumento "selezione a mano libera", mostrato nel riquadro rosso. (C) Come selezione dell'analisi, è stata utilizzata una linea gialla per delineare i contorni delle mosche. Mantenere la linea gialla vicino ai contorni della mosca riduce la probabilità di selezionare una regione che non è occupata dalla mosca. Barra della scala = 1 cm. (D) Regolate la luminosità e il contrasto per il primo fotogramma fino a quando l'area rivestita in giallo diventa la stessa scala di grigi dello sfondo. (E) Completare la regolazione della luminosità e del contrasto per il primo fotogramma, ma non per tutti i fotogrammi, facendo clic su "No" nella finestra "pila". (F) In definitiva, il primo fotogramma viene regolato per creare uno sfondo uniforme e senza macchia. Barra della scala = 1 cm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Impostazioni della finestra di rilevamento e della zona di rilevamento. (A) Completare l'analisi di tracciamento facendo clic sui plug-in del tracker nell'ordine contrassegnato nella finestra Monitoraggio animali. (B) Dopo aver impostato l'immagine attiva nella Figura A,1, viene presentata una finestra di elaborazione che mostra solo il fotogramma corrente. La finestra video principale e la finestra di elaborazione sono chiaramente distinte e vengono utilizzate in situazioni diverse. Per modificare il fotogramma corrente, assicurarsi che la modifica venga eseguita nella finestra video principale; L'alterazione sarà visibile in entrambe le finestre. Barra della scala = 1 cm. (C) Creare un'area di tracciamento che circondi l'arena, utilizzando lo strumento "ovale" per il riconoscimento del computer. La selezione della zona di tracciamento deve trovarsi in un'arena cerchiata in una finestra video aperta, anziché in una finestra di elaborazione. (D) Delimitare un'area di tracciamento con le linee gialle per adattarsi al massimo all'arena, al fine di ridurre al minimo il disturbo della luce esterna. Barra della scala = 1 cm. (E) Per impostare la regione di interesse (ROI ) nell'area di tracciamento, fare clic sui pulsanti seguendo l'ordine contrassegnato con i numeri mostrati nella finestra "zone designer". In questo passaggio, l'intera operazione deve essere completata dopo l'apertura della finestra video scelta. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Impostazione del filtro per il primo fotogramma. (A) Completando l'impostazione del ROI per l'area di tracciamento, la linea gialla che circonda l'arena diventa verde sia nella finestra video aperta che nella finestra di elaborazione. Barra della scala = 1 cm. (B) L'aggiunta dello scopo dei filtri imposta uno sfondo nero per rendere l'oggetto di destinazione più evidente per il primo fotogramma nella finestra di elaborazione. L'intera operazione deve essere condotta all'interno di una finestra di elaborazione, piuttosto che di una finestra video aperta. (C,D) L'aggiunta dei filtri "subtractor di sfondo" e "sfocatura gaussiana" alla finestra "impostazioni filtro" rende nero il primo fotogramma nella finestra di elaborazione. L'intero processo di impostazione del filtro deve essere completato nel primo fotogramma. (E) I parametri vengono impostati passo dopo passo facendo clic sui pulsanti contrassegnati con un numero e un rettangolo rosso nella finestra "subtractor di sfondo". Il passaggio "imposta immagine" deve essere eseguito dopo aver selezionato la finestra di elaborazione. (F) Barra della scala = 1 cm. La finestra "immagine mediana" verrà visualizzata dopo aver fatto clic sul pulsante "mostra filtro" in "E4" e aver chiuso direttamente la finestra senza alcuna operazione. (G) Il parametro della sfocatura gaussiana è impostato con un valore sigma predefinito di 2,0. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Impostazioni di soglia del secondo fotogramma. (A) Facendo clic sulla barra di avanzamento inferiore, fate avanzare la finestra video al secondo fotogramma. La mosca ricorre al centro dello schermo ed è identificata dalle Figi. Barra della scala = 1 cm. (B,C) Consente di visualizzare la finestra di elaborazione prima e dopo il filtraggio. (B) Visualizzare la finestra di elaborazione filtrata selezionando la modalità contrassegnata da un rettangolo rosso. (C) Un esempio di finestra di elaborazione con un rettangolo rosso dopo che è stata selezionata la modalità "filtrata". Barra della scala = 1 cm. (D) Impostare la soglia selezionando il metodo di soglia predefinito, "soglia in scala di grigi", mostrato nella finestra "thresholder", dopo aver scelto lo strumento "imposta soglia" nella Figura 3A,4. (E) Regolare i parametri facendo scorrere la casella della barra di avanzamento al centro fino a quando la mosca di tracciamento non viene vista e coperta dal profilo rosso. Non è consigliabile modificare le impostazioni predefinite per i parametri quadrati nel rettangolo rosso sottostante. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Rilevatore BLOB, impostazione dell'ultimo fotogramma e selezione del tracciamento degli animali. (A) Al raggiungimento della soglia indicata nella Figura 5E, la finestra di elaborazione rivela un profilo rosso considerevole che segue la mosca nel secondo fotogramma. Fai in modo che il profilo rosso che copre la mosca si adatti a tracciare la mosca. Barra della scala = 1 cm. (B) Definire la mosca coperta di profilo rosso come destinazione per il tracciamento selezionando il metodo predefinito del rilevatore di BLOB, "rilevatore di BLOB di base". (C) Impostare il fotogramma 901 come ultimo fotogramma utilizzando lo strumento "imposta ultimo fotogramma" nella Figura 3A,6. Il numero totale di fotogrammi viene calcolato con la formula "numero fotogramma = fps * tempo di registrazione". (D) Il tracciamento vola con un rettangolo giallo inscatolato dopo aver mostrato i blob nella finestra video aperta (sezione del pannello di sinistra). Nel pannello sinistro ingrandito, i moscerini della frutta sono attaccati in rosso (sezione del pannello destro). Barra della scala = 1 cm. (E) Il tracking vola con un rettangolo rosso inscatolato dopo aver fatto clic per selezionare il rettangolo rosso in "D" (sezione del pannello superiore). Nell'ingrandimento del pannello superiore, i moscerini della frutta sono attaccati in rosso (sezione del pannello inferiore). Assicurati che la selezione di un rettangolo giallo attorno a una mosca di tracciamento sia completata nella finestra video aperta. Completa la selezione nella finestra video aperta e la mosca sarà identificata dalle Figi in tutti i fotogrammi. Barra della scala = 1 cm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Risultati del tracciamento delle tracce. La traccia di tracciamento viene visualizzata separatamente nella finestra video aperta ( A) e nella finestra di elaborazione (B). Per ottenere il profilo di traccia di tracciamento, fare clic sulla barra di avanzamento nella finestra video originale e far scorrere la barra di avanzamento per verificare la continuità della traccia. La traccia di tracciamento presenta la distanza di strisciamento delle mosche in modo intuitivo. Barra della scala = 1 cm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Analisi dei file di tracciamento utilizzando i plugin AnimalTracker. (A) L'analizzatore di tracciamento facilita un'analisi dettagliata del file di tracciamento; Ogni passaggio contrassegnato da un rettangolo rosso è indicato da un numero. (B) Impostare i parametri "impostazioni della zona" in A,4. Quattro parametri, tempo, distanza, tempo di immobilità e vettore velocità, sono mostrati nel rettangolo rosso. Il parametro viene selezionato in base al risultato desiderato. (C-G) Impostare i parametri di configurazione singolarmente nella finestra "imposta parametri" di A,5. (C) Quattro parametri regolabili sono illustrati nella finestra "impostazioni parametri di configurazione", (D-G) che mostrano rispettivamente le finestre "impostazioni del tempo", "impostazione del tempo di immobilità", "impostazioni della distanza" e "impostazione del vettore di velocità". Non è consigliabile modificare il valore predefinito per le impostazioni dei parametri. Tuttavia, per l'"intervallo di fotogrammi", il parametro deve essere calcolato utilizzando la formula "intervallo fotogrammi = 1 / fps" quando gli fps del video vengono modificati. Inoltre, è possibile utilizzare una scala nota per accertare la distanza e la velocità effettive correlando i pixel registrati con il tracciamento di una mosca a un valore tangibile. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 9: Risultato che visualizza l'analisi del file di tracciamento. (A) L'impostazione della figura 8A,6. Sono disponibili due modalità di visualizzazione dei dati: "raggruppati per zone" e "raggruppati per parametri". (B) I risultati dell'analisi del file di tracciamento sono mostrati come "raggruppati per zone" in "A,6.1". (C-F) I risultati dell'analisi del file di tracciamento sono mostrati come "raggruppati per parametri" in A,6.2, esibendo separatamente "tempo di immobilità" (C), "vettore velocità" (D), "tempo" (E) e "distanza" (F). I risultati del tempo e della distanza di immobilità sono quantificati come "s" e "pixel". L'unità del vettore velocità deve essere definita come "pixel/s" e l'output con l'annotazione "lunghezza". Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 10: Risultati dell'analisi dei dati per velocità per fps. (A, C ed E) I dati di esportazione contengono le coordinate dei pixel nelle partizioni orizzontali (colonna "C") e verticali (colonna "D"), nonché il movimento dei pixel, l'immobilità e l'angolo di cambio di direzione tra intervalli di due fotogrammi (colonna "E" rispettivamente in A, C ed E), che viene calcolato automaticamente dalla formula descritta nel contesto. Poiché i risultati esportati dalle Figi sono documenti di testo, si consiglia di aprire il file con Microsoft Office Excel e dividere i dati in tre colonne aggiungendo spazi tra di loro. (B, D e F) Un grafico a linee visualizza i risultati calcolati dal set di dati del movimento dei pixel (B). Il valore di picco globale rappresenta la velocità, indicativa delle capacità di rilevamento del movimento; il grafico a colonne visualizza i risultati calcolati dal set di dati di immobilità (D). Il grado di scarsità nel grafico a colonne rappresenta l'immobilità, che mostra il difetto di abilità motoria delle mosche; un diagramma a dispersione visualizza i risultati calcolati dal set di dati dell'angolo di cambio di direzione (F). L'arricchimento degli spruzzi mostrato nel diagramma a dispersione rappresenta la direzione scelta dalla mosca. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 11: Un'analisi comparativa del movimento tra mosche trattate con o senza rotenone. (A) Sono mostrati grafici rappresentativi della traccia di tracciamento di mosche adulte W1118 alimentate con alimenti standard contenenti 500 μM di rotenone, o DMSO per il controllo. Le mosche W1118 sono state raccolte e poi collocate in un ambiente controllato costituito da cibo standard con 500 μM di rotenone o DMSO, 25 ° C e 60% di umidità. Sei mosche sono state utilizzate per l'analisi da ciascun gruppo dopo 48 ore. Il risultato rivela che la distanza di movimento delle mosche di tracciamento alimentate con rotenone è significativamente ridotta rispetto a quella del controllo. Il risultato ha mostrato una capacità motoria difettosa nelle mosche alimentate con rotenone. (B-E) L'analisi quantitativa del trattamento con rotenone sulla distanza media percorsa, il tempo di immobilità, la velocità media e la velocità massima viene condotta utilizzando le Figi. I risultati del trattamento con rotenone hanno mostrato una significativa diminuzione della distanza percorsa e della velocità media e un aumento significativo del tempo di immobilità. (F-K) Analisi dei pixel per fotogramma (F,G), del tempo di immobilità per fotogramma (H,I) e dei cambiamenti di angolo di direzione (J,K) tra moscerini trattati con rotenone (G,I,K) o DMSO (F,H,J). I grafici di esempio che illustrano gli effetti del rotenone sulla velocità di movimento mostrano meno picchi che rappresentano la velocità di movimento per intervallo di frame nei moscerini alimentati con rotenone (G) rispetto a quelli nel controllo (F), indicando la gravità del difetto dell'attività locomotoria (F,G). La colonna di immobilità intuizionistica dei pixel spostati per fotogramma è inferiore, mostrando un movimento significativamente inferiore entro 1 minuto per le mosche alimentate con rotenone (I) rispetto alle mosche di controllo (H). Esempi di grafici dell'angolo di movimento dei cambiamenti di direzione negli animali nutriti con rotenone (K) e controllo (J) rivelano alterazioni nella direzione scelta dalle mosche. I dati sono la media ± SEM di sei moscerini maschi monitorati per 1 minuto. Gli asterischi indicano differenze significative tra i gruppi (***p < 0,001; test t spaiato, p = 0,05). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 12: Un'analisi comparativa del movimento tra larve trattate con o senza rotenone. (A) Risultati rappresentativi del confronto dell'attività locomotoria tracciando la traccia di W1118 larve di terzo stadio alimentate con rotenone o DMSO. In breve, W1118 larve di terzo stadio sono state raccolte e coltivate in 10% di saccarosio, o 10% di saccarosio contenente 500 μM di rotenone, in un ambiente a 25 °C con il 60% di umidità. Sei larve per gruppo sono state utilizzate per l'analisi. Tenendo conto del lento movimento delle larve, la registrazione dei dati nell'arco di 5 minuti è stata quantificata e analizzata per valutare gli effetti del rotenone sulla locomozione. (B-E) La distanza media, il tempo di immobilità, la velocità media e la velocità massima dei due gruppi analizzati nelle Figi sono analizzati quantitativamente. I risultati quantitativi mostrano che la distanza di movimento, la velocità media e la velocità massima diminuiscono significativamente nelle larve alimentate con rotenone e il tempo di immobilità aumenta significativamente nelle larve alimentate con rotenone. (F-K) Analogamente alle mosche adulte, l'analisi dei pixel per fotogramma, del tempo di immobilità e dei cambiamenti di angolo di direzione tra le mosche trattate con rotenone (G, I, K) e senza rotenone (F, H, J) ha mostrato che le larve trattate con rotenone avevano una velocità di movimento inferiore, più tempo di immobilità e alternavano le loro direzioni. I risultati rivelano che il movimento comportamentale delle larve di tracciamento alimentate con rotenone è significativamente compromesso rispetto al controllo. I risultati mostrano un'attività locomotoria difettosa delle mosche alimentate con rotenone. I dati sono la media ± SEM di sei larve di 3 giorni monitorate per 5 minuti. Gli asterischi indicano una differenza significativa tra i gruppi (*p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; t-test spaiato, p = 0,05). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Tabella 1: Confronto delle metodologie basate sul tracciamento degli animali per la quantificazione dell'attività locomotoria in Drosophila. Clicca qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
Abbiamo progettato un metodo, basato sul materiale open source AnimalTracker API compatibile con il programma di elaborazione delle immagini delle Fiji, che può consentire ai ricercatori di valutare sistematicamente l'attività locomotoria monitorando sia le mosche larvali adulte che individuali. AnimalTracke è uno strumento scritto in Java che può essere facilmente integrato in database esistenti o altri strumenti per facilitare l'analisi del comportamento di tracciamento degli animali progettato dall'applicazione24. Dopo un'analisi fotogramma per fotogramma mediante una formula di calcolo software che quantifica l'attività locomotoria degli adulti e delle larve, è possibile analizzare in modo flessibile diversi parametri, tra cui la velocità di movimento, la distanza percorsa, l'immobilità e i cambiamenti di angolo di direzione. Questi parametri, che rappresentano diversi aspetti della locomozione comportamentale, possono essere tracciati per illustrare i cambiamenti locomotori nel tempo. Inoltre, creando un'interfaccia utente grafica, fornendo una documentazione dettagliata sul suo utilizzo e un'interfaccia di programmazione dell'applicazione, miriamo a rendere questo metodo accessibile ai ricercatori che non hanno esperienza di programmazione e agli utenti esperti che creano paradigmi sperimentali personalizzati.
Per verificare che il metodo possa monitorare accuratamente il comportamento, è stato effettuato test locomotori di mosche adulte e larve trattate con rotenone, nonché un confronto della loro attività motoria con quella delle mosche di controllo alimentate con il solvente del farmaco. Il software Fiji, con i suoi plugin, viene utilizzato per analizzare le coordinate dei pixel di ogni fotogramma nella registrazione video del movimento, consentendo il calcolo della velocità, della distanza e di altri parametri delle mosche sperimentali. Abbiamo osservato una significativa diminuzione della distanza percorsa nel tempo nella somministrazione di rotenone (Figura 11), che è coerente con i risultati riportati23. Nel frattempo, la velocità di movimento ascendente e la direzione anormale scelta sono state osservate nei gruppi alimentati con farmaci, per aiutare a illustrare maggiori dettagli della carenza comportamentale nelle mosche. Dato il successo nel rilevare l'attività locomotoria delle mosche adulte, abbiamo quindi cercato di valutare la mobilità delle larve (Figura 12). Rispetto al controllo, i risultati delle larve di tracciamento alimentate con rotenone erano significativamente compromessi, parallelamente a quelli delle mosche adulte alimentate con farmaci. Esperimenti con adulti e larve alimentati con rotenone suggeriscono che questo metodo può registrare con precisione la riduzione delle mosche che hanno prodotto deficit locomotori rispetto ai controlli. Questo rapporto ha dimostrato con successo le applicazioni dell'attuale metodo nella quantificazione e nell'analisi della capacità locomotoria e di altri aspetti dei difetti comportamentali dei moscerini della frutta nei modelli di test o nella ricerca farmacologica negli animali.
Per garantire che l'analisi video e di tracciamento produca risultati positivi e riproducibili, si raccomanda di attenersi alle seguenti linee guida. Innanzitutto, per la scelta della frequenza dei fotogrammi video, si consiglia di convertire il video registrato in un formato di 15 fotogrammi al secondo (fps). Ciò può non solo mantenere un buon tracciamento del movimento, ma anche evitare la lentezza dell'analisi del computer causata da grandi quantità di dati. Migliorando la frequenza dei fotogrammi video, l'analisi della traiettoria di movimento diventa più dettagliata. In secondo luogo, i parametri nella formula possono anche essere regolati per adattarsi allo schema sperimentale corrispondente quando si analizza il movimento statico tra ogni due fotogrammi. Per il monitoraggio locomotore delle larve, è essenziale utilizzare gel di silice piuttosto che agar, poiché il gel di silice solidificato è stretto e le larve non possono entrare. Inoltre, il gel di silice è trasparente e può essere tinto aggiungendo sostanza colorata per produrre uno sfondo ottimale, facilitando gli effetti ottici desiderati che migliorano la qualità dell'immagine.
I sistemi di tracciamento degli animali sono in fase avanzata per fornire soluzioni complete per le comunità di eziologia, neuroscienze e genetica comportamentale. La tabella 1 fornisce un confronto delle caratteristiche di più programmi di tracciamento attualmente disponibili 10,11,12,16,17,25,26. Questo approccio è estremamente conveniente, semplice da imparare e preciso nella misurazione del comportamento locomotore, senza richiedere costosi software e attrezzature. Non c'è dubbio che questo metodo può essere convenientemente esteso ad altri modelli animali simili a Drosophila, e anche ad animali più grandi come ratti e topi. La struttura dell'API AnimalTracker può essere estesa con facilità attraverso applicazioni o plug-in ImageJ indipendenti, offrendo una vasta gamma di toolkit utili per la ricerca e l'analisi del comportamento personalizzato24. Tuttavia, questo studio ha alcune restrizioni. Poiché una singola mosca viene posizionata in un'arena in campo aperto per la registrazione delle immagini e il tracciamento video viene condotto individualmente, questo metodo è inefficiente e richiede tempo. Abbiamo tentato di espandere la capacità di registrazione di più arene contemporaneamente, consentendo fino a sei registrazioni individuali. È teoricamente possibile registrare un numero maggiore di Drosophila contemporaneamente; Questo dipende dalle dimensioni dell'arena e dalla configurazione della telecamera. In alternativa, se gli utenti desiderano estendere alla registrazione di Drosophila raggruppata, si raccomanda di considerare il numero limitato di registrazioni singole e una configurazione di qualità sufficiente per identificare collisioni e sovrapposizioni tra le mosche. I miglioramenti nell'efficienza dei test mediante l'apprendimento automatico non sono stati considerati nello studio, poiché non è stato individuato un approccio economico e compatibile che possa essere integrato con il sistema attuale per distinguere visivamente le identità e tracciare i modelli in modo accurato.
In sintesi, il metodo qui descritto sviluppa e convalida un approccio efficiente e diretto basato su software libero e open source, progettato per ridurre il consumo di tempo e perfezionare le tecniche sperimentali per indicare quantitativamente e analizzare la locomozione della Drosophila nelle larve e negli stadi adulti. Attraverso l'analisi sistematica, questo metodo può aiutarci a capire come cambia la velocità dell'animale nel tempo durante il movimento, nonché le caratteristiche della selezione direzionale. Pertanto, l'incorporazione di software open source in dispositivi digitali comunemente usati fornisce un modo affidabile per testare l'attività locomotoria in vari modelli di mosca. Ciò potrebbe essere utile per valutare i risultati locomotori fisiologici e patologici nella sperimentazione di modelli di malattie neurodegenerative derivati dal trattamento farmacologico e dalla modificazione transgenica in Drosophila e in altri animali.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da uno speciale fondo di lancio della Soochow University e della National Science Foundation of China (NSFC) (82171414). Ringraziamo i membri del laboratorio del Prof. Chunfeng Liu per la loro discussione e i loro commenti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal tracker | Hungarian Brain Research Program | version: 1.7 | pfficial website: http://animaltracker.elte.hu/main/downloads |
| Camera software | Microsoft | version: 2021.105.10.0 | built-in windows 10 system |
| Computer | DELL | Vostro-14-5480 | a comupter running win 10 system is available |
| Drosophila carbon dioxide anesthesia workstation | Wu han Yihong technology | #YHDFPCO2-018 | official website: http://www.yhkjwh.com/ |
| Fiji software | Fiji team | version: 1.53v | official website: https://fiji.sc/ |
| Format factory software | Pcfreetime | version: X64 5.4.5 | official website: http://www.pcfreetime.com/formatfactory/CN/index.html |
| Graph pad prism | GraphPad Software | version: 8.0.2 | official website: https://www.graphpad-prism.cn |
| Hight definition camera | TTQ | Jingwang2 (HD1080P F1.6 6-60mm) | official website: http://www.ttq100.com/product_show.php?id=35 |
| Office software | Microsoft | version: office 2019 | official website: https://www.microsoftstore.com.cn/software/office |
| Petri dish | Bkman | 110301003 | size: 60 mm |
| Silica gel | DOW | SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Mix well according to the instructions |
| Sodium bicarbonate | Macklin | #144-55-8 | Mix well with silica gel |
References
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