Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

माउस सुपीरियर कोलिकुलस में कैल्शियम इमेजिंग

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/65181
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Chinese Institute for Brain Research
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल जागृत चूहों के बेहतर कोलिकुलस (एससी) में कैल्शियम प्रतिक्रियाओं की इमेजिंग की प्रक्रिया का विवरण देता है, जिसमें जंगली-प्रकार के चूहों में कॉर्टेक्स को बरकरार रखते हुए दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी के साथ एकल-न्यूरॉन गतिविधि की इमेजिंग और आंशिक-कॉर्टेक्स उत्परिवर्ती चूहों में वाइड-फील्ड माइक्रोस्कोपी के साथ पूरे एससी की इमेजिंग शामिल है।

Abstract

सुपीरियर कोलिकुलस (एससी), सभी कशेरुकियों में एक विकासवादी रूप से संरक्षित मिडब्रेन संरचना, सेरेब्रल कॉर्टेक्स के उद्भव से पहले सबसे परिष्कृत दृश्य केंद्र है। यह ~ 30 प्रकार के रेटिना गैंग्लियन कोशिकाओं (आरजीसी) से प्रत्यक्ष इनपुट प्राप्त करता है, जिसमें प्रत्येक एक विशिष्ट दृश्य सुविधा को एन्कोडिंग करता है। यह अभी भी अस्पष्ट है कि क्या एससी को रेटिना विशेषताएं विरासत में मिलती हैं या क्या एससी में अतिरिक्त और संभावित रूप से नए सिरे से प्रसंस्करण होता है। एससी में दृश्य जानकारी के तंत्रिका कोडिंग को प्रकट करने के लिए, हम यहां जागृत चूहों में दो पूरक तरीकों के साथ दृश्य प्रतिक्रियाओं को ऑप्टिकल रूप से रिकॉर्ड करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। एक विधि दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एकल-कोशिका रिज़ॉल्यूशन पर कैल्शियम गतिविधि को चित्रित करने के लिए ओवरलेइंग कॉर्टेक्स को हटा देती है, जबकि दूसरी एक उत्परिवर्ती माउस के पूरे एससी को चित्रित करने के लिए वाइड-फील्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग करती है जिसका कॉर्टेक्स काफी हद तक अविकसित है। यह प्रोटोकॉल इन दो तरीकों का विवरण देता है, जिसमें पशु तैयारी, वायरल इंजेक्शन, हेडप्लेट आरोपण, प्लग आरोपण, डेटा अधिग्रहण और डेटा विश्लेषण शामिल हैं। प्रतिनिधि परिणामों से पता चलता है कि दो-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन पर नेत्रहीन न्यूरोनल प्रतिक्रियाओं को प्रकट करती है, और वाइड-फील्ड कैल्शियम इमेजिंग पूरे एससी में तंत्रिका गतिविधि को प्रकट करती है। इन दो विधियों के संयोजन से, कोई भी एससी में तंत्रिका कोडिंग को विभिन्न पैमानों पर प्रकट कर सकता है, और इस तरह के संयोजन को अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों पर भी लागू किया जा सकता है।

Introduction

सुपीरियर कोलिकुलस (एससी) सभी कशेरुकियों में एक महत्वपूर्ण दृश्य केंद्र है। स्तनधारियों में, यह रेटिना और दृश्य कॉर्टेक्स1 से सीधे इनपुट प्राप्त करता है। जबकि ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग को कॉर्टेक्स 2,3,4,5 पर व्यापक रूप से लागू किया गया है, एससी में इसका आवेदन खराब ऑप्टिकल एक्सेस 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 से बाधित है।, 18,19. इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एससी में तंत्रिका गतिविधि की ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग के लिए दो पूरक तरीकों के बारे में विवरण प्रदान करना है।

एससी कॉर्टेक्स और ट्रांसवर्स साइनस के नीचे स्थित है, जो कोलिकुलर न्यूरॉन्स तक ऑप्टिकल पहुंच को सीमित करता है। इस सीमा को दूर करने का एक तरीका ओवरलेइंग कॉर्टेक्स को हटाना और पूर्वकाल-पार्श्व एससी 7,9,10,13,14,19 को उजागर करना है। हालांकि, क्योंकि एससी कॉर्टिकल इनपुट प्राप्त करता है, इस तरह का ऑपरेशन प्रभावित कर सकता है कि एससी न्यूरॉन्स दृश्य उत्तेजनाओं का जवाब कैसे देते हैं। इस सीमा को दूर करने के लिए, हम यहां एक वैकल्पिक प्रोटोकॉल का विस्तार करते हैं जो एक सिलिकॉन प्लग के साथ पश्च-औसत दर्जे के एससी की सतही परत को चित्रित करता है, जबकि कॉर्टेक्सको बरकरार रखता है। विशेष रूप से, एकल-कोशिका संकल्प प्राप्त करने के लिए, हमने जंगली-प्रकार के चूहों के पश्च-उपचारात्मक एससी में कैल्शियम प्रतिक्रियाओं को चित्रित करने के लिए दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी लागू की। इसके अलावा, व्यापक कवरेज प्राप्त करने के लिए, हमने एक उत्परिवर्ती माउस के पूरे एससी की छवि के लिए वाइड-फील्ड माइक्रोस्कोपी लागू की, जिसका पिछला कॉर्टेक्स20 विकसित नहीं हुआ है।

इस प्रोटोकॉल में वर्णित दो विधियां एक दूसरे के पूरक हैं। कॉर्टेक्स को अलग किए बिना दो-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग बरकरार कॉर्टिकल इनपुट के साथ एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन पर तंत्रिका गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए उपयुक्त है। वाइड-फील्ड कैल्शियम इमेजिंग स्थानिक संकल्प का त्याग करते हुए पूरे एससी में तंत्रिका गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए उपयुक्त है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को पशु कल्याण दिशानिर्देशों के अनुसार किया गया था और चीनी मस्तिष्क अनुसंधान संस्थान, बीजिंग में आईएसीयूसी द्वारा अनुमोदित किया गया था।

नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए समयरेखा निम्नानुसार है: 1) सक्शन कप बनाएं; 2) वायरस को इंजेक्ट करें; 3) हेडप्लेट प्रत्यारोपण; 4) 3 सप्ताह के बाद, प्लग प्रत्यारोपित करें; 5) ट्रेडमिल पर ~ 3 दिन की वसूली और आदत के बाद, दो-फोटॉन / वाइड-फील्ड इमेजिंग करें।

1. एक सक्शन कप की तैयारी (चित्रा 1 ए)।

  1. एक ऐक्रेलिक डिश में फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस, 1x) की एक बूंद जमा करें और केशिकाओं द्वारा नोक को भरने के लिए इसे 21 ग्राम फ्लैट सुई के साथ स्पर्श करें।
  2. सुई की नोक को पारभासी सिलिकॉन चिपकने वाला के साथ कवर करें और लगभग ~ 10 मिनट के लिए सेट करें।
  3. कैंची के साथ सिलिकॉन चिपकने वाले को ~ 2 मिमी व्यास वाली डिस्क पर काटें।

2. प्लग की तैयारी (चित्रा 1 बी)

  1. 0.75 मिमी मोटी प्लास्टिक शिम स्टॉक तैयार करें और केंद्र में 1 सेमी x 1 सेमी वर्ग काट लें। दो ऐक्रेलिक ब्लॉक तैयार करें। शराब के साथ शिम स्टॉक और ऐक्रेलिक ब्लॉक को साफ करें और उन्हें लेंस पेपर से पोंछ दें।
  2. शिम स्टॉक को एक ऐक्रेलिक ब्लॉक पर रखें, सिलिकॉन चिपकने वाले को केंद्र में ~ 90% खोलने के लिए जमा करें (बुलबुले से बचें), एक और ऐक्रेलिक ब्लॉक और ~ 1 किलो बल जोड़ें, और 20 मिनट प्रतीक्षा करें।
  3. एक सर्जिकल माइक्रोस्कोप के तहत, स्केलपेल के साथ सिलिकॉन चिपकने वाला पदार्थ को कागज के एक टुकड़े के ऊपर 1 मिमी ऊंचा 1.5 मिमी चौड़ा त्रिकोणीय प्रिज्म काट लें, जिस पर त्रिकोण मुद्रित हों।
  4. प्लास्टिक चिपचिपा टेप के साथ त्रिकोणीय प्रिज्म से किसी भी धूल को हटा दें और इसे 5 मिमी व्यास और 0.15 मिमी मोटाई के ग्लास कवरस्लिप पर रखें।
  5. कोरोना ट्रीटर के नीचे त्रिकोणीय प्रिज्म के साथ कवरस्लिप रखें, कोरोना ट्रीटर को चालू करें, और इसे कवरस्लिप के करीब लाएं जब तक कि लाइटनिंग दिखाई न दे। इसे कुछ मिनट के लिए उस स्थिति में रखें जब तक कि वे एक-दूसरे से जुड़े न हों।
    नोट: यह कदम अन्य कोरोना उपचारकर्ताओं के लिए अलग हो सकता है।
  6. प्लग को पेट्री डिश में रखें और इसे रात भर 70 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में रखें।

3. जानवरों की तैयारी और वायरल निर्माण का इंजेक्शन

  1. C57BL/6J (जंगली-प्रकार) और Emx1-Cre:Pals1flox/wt (आंशिक-कॉर्टेक्स) 20 चूहों का उपयोग 6 सप्ताह की उम्र में (इमेजिंग के समय 9 सप्ताह) दोनों लिंगों के करें।
  2. सर्जिकल प्रक्रिया के लिए उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों और उपकरणों को निष्फल करें।
  3. माउस को 5% आइसोफ्लुरेन के साथ एनेस्थेटाइज करें और फिर सर्जरी के दौरान 1 एल / मिनट की प्रवाह दर के साथ आइसोफ्लुरेन को 1% -2% पर बनाए रखें। पैर की अंगुली पिंच रिफ्लेक्स की कमी से संज्ञाहरण के स्तर की पुष्टि करें।
  4. कान की सलाखों के साथ एक स्टीरियोटेक्सिक फ्रेम पर माउस को हेड-फिक्स करें। सर्जरी के दौरान, सूखने से बचाने के लिए माउस आंखों पर नेत्र मरहम लगाएं, और थर्मोस्टैटिक हीटिंग पैड के साथ अपने शरीर के तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें।
  5. फर को शेव करें और आयोडोफोर और 75% इथेनॉल के साथ त्वचा की सतह को निष्फल करें। लिडोकेन (5 मिलीग्राम / किग्रा, चमड़े के नीचे इंजेक्शन [एसक्यू]), टिलिडाइन (2 मिलीग्राम / किग्रा, एसक्यू), और मेलॉक्सिकैम (2 मिलीग्राम / किग्रा, एसक्यू) इंजेक्ट करें।
    नोट: नसबंदी, एनाल्जेसिया और स्थानीय संज्ञाहरण के लिए शल्य चिकित्सा प्रक्रिया संस्थानों में भिन्न हो सकती है।
  6. खोपड़ी को उजागर करने के लिए सर्जिकल कैंची के साथ एससी पर त्वचा को हटा दें। खोपड़ी को रूई के फाहे से साफ करें।
  7. खोपड़ी की सतह सपाट होने तक स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम को समायोजित करें। ड्यूरा के उजागर होने तक लैम्ब्डा में 0.5 मिमी पार्श्व और 0.42 मिमी पूर्वकाल में छेद ड्रिल करें।
  8. एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) को जीसीएएमपी 6 एम (आरएएवी 2/9-एचसिन-जीसीएएमपी 6 एम; 1 x 1013 जीसी / एमएल 1 x पीबीएस में घुलित) को 1 मिमी और 1.6 मिमी की गहराई पर लैम्ब्डा से एक बेवल्ड ग्लास माइक्रोपिपेट के साथ इंजेक्ट करें (टिप 40-50 μm के व्यास के साथ 25 ° तक फैला हुआ है)।
  9. प्रत्येक गहराई पर, 50 nL / min की गति से 100 nL इंजेक्ट करें और प्रत्येक इंजेक्शन के बाद 5 मिनट प्रतीक्षा करें। इंजेक्शन के बाद, धीरे-धीरे इंजेक्टर को वापस ले लें।

4. हेडप्लेट का प्रत्यारोपण

  1. खोपड़ी के ऊपर की मांसपेशियों और ऊतकों को साफ करें और ब्लेड से खोपड़ी को खरोंचें। यदि रक्तस्राव होता है, तो इसे जेल फोम के साथ रोकें और रक्त को साफ करें। हेडप्लेट (चित्रा 1 सी) को खोपड़ी से एक स्व-इलाज दंत चिपकने वाला राल सीमेंट के साथ संलग्न करें। विशेष रूप से, बर्फ पर एक सिरेमिक कटोरे में 3/4 चम्मच बहुलक, मोनोमर की तीन बूंदें और उत्प्रेरक की एक बूंद मिलाएं। मिश्रण को हेडप्लेट और खोपड़ी पर लगाएं। उन्हें एक साथ संलग्न करें और चिपकने वाला सेट होने के लिए 5 मिनट प्रतीक्षा करें।
  2. संक्रमण को रोकने के लिए एंटीबायोटिकदवाओं (सेफ्टिओफर सोडियम, 5 मिलीग्राम / किग्रा, एसक्यू) इंजेक्ट करें। स्टीरियोटेक्सिक फ्रेम से माउस निकालें और इसे वसूली के लिए हीटिंग पैड पर रखें। एनेस्थीसिया से ठीक होने के बाद इसे घर के पिंजरे में वापस कर दें। दर्द प्रबंधन के लिए, सर्जरी के बाद 3 दिनों के लिए माउस को इबुप्रोफेन युक्त पीने का पानी (0.5 एमएल / 50 एमएल) प्रदान करें।

5. प्लग का आरोपण (चित्रा 2)

  1. वायरल इंजेक्शन के 3 सप्ताह बाद प्लग को प्रत्यारोपित करें। चरण 3.2-3.5 में वर्णित के रूप में एक स्टीरियोटेक्सिक फ्रेम पर माउस को एनेस्थेटाइज और ठीक करें। संभावित रक्तस्राव को रोकने के लिए खारा में भिगोया हुआ जेल फोम तैयार करें।
  2. लैम्ब्डा के पीछे 0.5 मिमी पीछे केंद्रित माइक्रोड्रिल के साथ 3 मिमी x 2 मिमी अंडाकार ड्रिल करें। अंडाकार की सीमा को तब तक पतला करें जब तक कि उसमें दरार न आ जाए। कवरस्लिप को एससी के करीब बनाने के लिए अंडाकार रिकॉर्डिंग विंडो के सामने खोपड़ी को पतला करें।
  3. बारीक बल का उपयोग करके हड्डी के फ्लैप को हटा दें। अनुप्रस्थ साइनस के पीछे के ड्यूरा पर एक कट बनाएं और ड्यूरा के टुकड़े को हटा दें। यदि आवश्यक हो, तो सूखने से रोकने के लिए 3 एमएल सिरिंज के साथ मस्तिष्क में कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (एसीएसएफ) जोड़ें। जेल फोम और कपास के फाहे के साथ खोपड़ी और रिकॉर्डिंग खिड़की को सुखाएं।
  4. रिकॉर्डिंग विंडो में सिलिकॉन चिपकने वाला की एक बूंद जमा करें। नकारात्मक दबाव के साथ प्लग रखने के लिए सक्शन कप का उपयोग करें। सक्शन कप को स्थानांतरित करने के लिए एक मोटराइज्ड माइक्रोमैनिपुलेटर का उपयोग करें और प्लग को सिलिकॉन चिपकने वाले में तब तक कम करें जब तक कि कवरस्लिप खोपड़ी को छू न जाए। फिर, अनुप्रस्थ साइनस को दूर धकेलने और एससी को उजागर करने के लिए प्लग को ~ 1 मिमी आगे ले जाएं। सिलिकॉन चिपकने वाला चिपचिपा होने से पहले यह चरण 1-2 मिनट में किया जाना चाहिए।
  5. हेडप्लेट को साफ करें और इसे हेडप्लेट पर ठीक करने के लिए प्लग की सीमा के चारों ओर ब्यूटाइल साइनोएक्रिलेट और राल सीमेंट लागू करें।
    नोट: चरण 4.2 में वर्णित के रूप में पोस्टऑपरेटिव देखभाल प्रदान करें।

6. दो-फोटॉन इमेजिंग (चित्रा 3)

  1. जानवर को अपनी हेडप्लेट के साथ घूमने वाले ट्रेडमिल पर रखें। ट्रेडमिल को दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप के नीचे रखें और ऊंचाई को एक उपयुक्त स्थिति में समायोजित करें। दृश्य उत्तेजना के लिए मॉनिटर से प्रकाश संदूषण को रोकने के लिए उद्देश्य और हेडप्लेट के बीच एक काला एल्यूमीनियम शंकु रखें। ~ 15 मिनट के लिए माउस की आदत डालें।
  2. माइक्रोस्कोप पर 16x आवर्धन, 0.8 संख्यात्मक एपर्चर (NA), और 3 मिमी कामकाजी दूरी (WD) उद्देश्य के साथ दो-फोटॉन इमेजिंग करें। 920 एनएम पर जीसीएएमपी 6 एम को उत्तेजित करने के लिए दो गैल्वो स्कैनर द्वारा नियंत्रित मोड-लॉकिंग तकनीक के साथ टीआई: नीलम लेजर का उपयोग करें। नमूना विमान पर लेजर शक्ति को 20-80 किलोवाट के बीच समायोजित करें।
  3. 2.4 μ मीटर / पिक्सेल के स्थानिक रिज़ॉल्यूशन के साथ 4.8 हर्ट्ज पर 600 μm x 600 μm दृश्य क्षेत्र स्कैन करें, और 350 μ मीटर तक की गहराई में छवि तंत्रिका गतिविधि करें।
    नोट: नमूना दर और स्थानिक रिज़ॉल्यूशन गैल्वो स्कैनर के लिए हैं, और इसे अनुनाद स्कैनर के लिए समायोजित किया जाना चाहिए।
  4. एक डाइक्रोइक दर्पण के साथ उत्सर्जित प्रतिदीप्ति एकत्र करें और बैंडपास फिल्टर के माध्यम से गुजरने के बाद फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब (पीएमटी) का उपयोग करके इसका पता लगाएं।
  5. रोटरी एनकोडर के साथ ट्रेडमिल पर माउस की हरकत रिकॉर्ड करें। अपने पुतली के आकार और स्थिति को रिकॉर्ड करने के लिए 50 मिमी लेंस वाले कैमरे का उपयोग करें। उत्तेजना कंप्यूटर द्वारा भेजे गए ट्रिगर्स को रिकॉर्ड करके इन रिकॉर्डिंग और छवि अधिग्रहण को दृश्य उत्तेजना में सिंक्रनाइज़ करें।

7. दो-फोटॉन इमेजिंग द्वारा मापा कैल्शियम प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण

  1. SIMA21 या NoRMCorre22 का उपयोग करके इमेजिंग के दौरान मस्तिष्क की गति को सही करें।
  2. मैन्युअल रूप से सेल मैजिक वैंड टूल (इमेजजे) का उपयोग करके रुचि का एक क्षेत्र (आरओआई) खींचें और इसे MATLAB में एक दीर्घवृत्त के साथ फिट करें। न्यूरोपिल संदूषण को हटाने के बाद प्रत्येक आरओआई के प्रतिदीप्ति निशान निकालें:
    Equation 1
    एफ ट्रूऔर एफ कच्चे क्रमशः आरओआई के सही और कच्चेप्रतिदीप्ति आयाम हैं, एफ न्यूरोपिल आसपास के न्यूरोपिल का प्रतिदीप्ति आयाम है, और आर आउट-ऑफ-फोकस न्यूरोपिलसंदूषण कारक (हमारे सेटअप के लिए 0.7) है। आर का अनुमान एक रक्त वाहिका पर संकेतों को मापकर लगाया जाता है जिसके लिए एफट्रू = 0, जैसा कि पहले23,24 वर्णित है।
  3. प्रत्येक फ्रेम25 पर केंद्रित 15 सेकंड विंडो से आठवें प्रतिशत मान को घटाकर धीमी बेसलाइन उतार-चढ़ाव को दूर करें।
  4. एक न्यूरॉन की दृश्य प्रतिक्रियाओं को उत्तेजना अवधि के दौरान अपने आरओआई में प्रतिदीप्ति आयाम के सापेक्ष परिवर्तन के रूप में परिभाषित करें:
    Equation 2
    एफ पीक दृश्य उत्तेजना के दौरान प्रतिदीप्ति ट्रेस का चरम आयाम है, और एफबेसलाइनउत्तेजना से पहले 0.5 सेकंड की अवधि के दौरान औसत आयाम है।

8. वाइड-फील्ड इमेजिंग और डेटा विश्लेषण (चित्रा 4)।

  1. एक अग्रानुक्रम लेंस 4 (चित्रा 4 ए) के साथ एक वाइड-फील्ड मैक्रोस्कोप बनाएं। टेंडम-लेंस मैक्रोस्कोप दो कैमरा लेंस (50 मिमी और 105 मिमी) है जो एक एडाप्टर के माध्यम से जुड़ा हुआ है, और आवर्धन ~ 2x है।
  2. चरण 3.2-3.5 में वर्णित आंशिक-कॉर्टेक्स उत्परिवर्ती चूहों को तैयार करें। एससी के प्रत्येक पक्ष के केंद्र में 200 μm की गहराई पर GCaMP6m व्यक्त करने वाले AAV के 100 nL इंजेक्ट करें।
  3. ~ 3 सप्ताह के बाद, एससी पर 5 मिमी व्यास का कवरस्लिप प्रत्यारोपित करें। एससी पर केंद्रित 4 मिमी x 3 मिमी का अंडाकार क्रैनियोटॉमी करें और इसके चारों ओर की हड्डी को पतला करें। फिर, कवरस्लिप को सीधे एससी पर दबाएं और इसे राल सीमेंट के साथ ठीक करें।
  4. उत्तेजना फिल्टर (469 एनएम ± 35 एनएम) के साथ ब्लू लाइट एमिटिंग डायोड (एलईडी) के साथ जीसीएएमपी 6 एम को उत्तेजित करें। 10 हर्ट्ज पर उत्सर्जन फिल्टर (525 एनएम ± 39 एनएम) पारित करने के बाद एक पूरक धातु ऑक्साइड अर्धचालक (सीएमओएस) कैमरे का उपयोग करके छवियों को प्राप्त करें। कैमरा 2.63 μm / पिक्सेल के स्थानिक रिज़ॉल्यूशन पर 5.36 मिमी x 2.85 मिमी के क्षेत्र को कवर करता है।
  5. प्रत्येक अधिग्रहित छवि को एक सामान्यीकृत बॉक्स फ़िल्टर के साथ मिलाएं और इसे मूल आकार के 1/4 तक डाउनसैंपल करें। छवि में प्रत्येक पिक्सेल के लिए, प्रतिक्रिया को परिभाषित करें, जैसा कि चरण 7.4 में वर्णित है।
    नोट: चरण 4.2 में वर्णित के रूप में पोस्टऑपरेटिव देखभाल प्रदान करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

आंकड़े 1 ए, बी दिखाते हैं कि क्रमशः सक्शन कप और प्लग कैसे बनाएं। चित्रा 2 दिखाता है कि प्लग को सफलतापूर्वक कैसे प्रत्यारोपित किया जाए। प्लग को प्रत्यारोपित करने के बाद, पश्च-उपचारात्मक एससी उजागर होता है, जैसा कि चित्रा 2 डी में दिखाया गया है। चित्रा 3 दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके चित्रित एक उदाहरण जंगली-प्रकार माउस से एससी न्यूरॉन्स की कैल्शियम प्रतिक्रियाओं को दर्शाता है। त्रिकोणीय प्रिज्म, जिसे माइक्रोस्कोप के नीचे आसानी से कैप्चर किया जाता है, का उपयोग इमेजिंग साइट (चित्रा 3 बी) का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। दृश्य प्रतिक्रियाएं एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन (आंकड़े 3 सी , डीऔर वीडियो 1) पर दिखाई जाती हैं। चित्रा 4 वाइड-फील्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके चित्रित एक उदाहरण आंशिक-कॉर्टेक्स उत्परिवर्ती माउस से एससी न्यूरॉन्स की कैल्शियम प्रतिक्रियाओं को दर्शाता है। अधिग्रहित छवि को पहले मूल आकार (चित्रा 4 बी) के एक-चौथाई तक कम किया गया था। दृष्टि से उत्पन्न कैल्शियम प्रतिक्रियाएं एससी के दोनों किनारों पर दिखाई जाती हैं (चित्रा 4 सी और वीडियो 2)। चित्रा 5 इंजेक्शन साइट और इमेजिंग साइट पर एससी में जीसीएएमपी 6 एम की अभिव्यक्ति दिखाता है; इंजेक्शन साइट पर कम न्यूरॉन्स होते हैं।

Figure 1
चित्र 1: तैयारी। (ए) सक्शन कप बनाने के लिए तीन चरण (चरण 1.1-1.3); सुई के अंदर पीबीएस नहीं दिखाया गया है। (बी) प्लग बनाने के लिए तीन चरण (चरण 2.1-2.3)। (सी) जंगली प्रकार के चूहों के लिए 8 मिमी व्यास के साथ दो प्रकार की हेडप्लेट। आंशिक-कॉर्टेक्स उत्परिवर्ती चूहों के लिए 7 मिमी व्यास के साथ दो प्रकार की हेडप्लेट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: प्लग का आरोपण (चरण 5.2-5.5)। (ए) हड्डी पतली है। आसपास राल सीमेंट हैं। (बी) अवर कोलिकुलस और सेरिबैलम को उजागर करने के लिए हड्डी और ड्यूरा को हटा दिया जाता है। (सी) प्लग को नीचे उतारा जाता है, और इसने अनुप्रस्थ साइनस को पीछे की ओर धकेलदिया ताकि पश्च-उपचारात्मक एससी को उजागर किया जा सके। हरे रंग का डैश्ड सर्कल कवरस्लिप को चिह्नित करता है। नीला डैश्ड त्रिकोण प्लग को चिह्नित करता है। लाल डैश्ड सर्कल सक्शन कप को चिह्नित करता है। (डी) प्लग को ब्यूटाइल साइनोएक्रिलेट और राल सीमेंट के साथ तय किया जाता है। तस्वीर को पोस्टीरियर-मेडियल एससी को स्पष्ट रूप से दिखाने के लिए ओवरएक्सपोज़्ड किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: दो-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग । (ए) प्लग प्रत्यारोपित करने के बाद माउस मस्तिष्क शरीर रचना विज्ञान का योजनाबद्ध। डार्क डैश्ड लाइन सुप्रीम कोर्ट की रूपरेखा को चिह्नित करती है। पीला त्रिभुज त्रिकोणीय प्रिज्म को इंगित करता है। हरा रंग GCaMP अभिव्यक्ति को इंगित करता है। (बी) स्कैनिंग से पहले माइक्रोस्कोप के नीचे सिलिकॉन त्रिकोणीय प्रिज्म की एक तस्वीर। (सी) एससी न्यूरॉन्स से जीकैमएमपी की प्रतिदीप्ति की एक छवि, एक उदाहरण वाइल्ड-टाइप माउस से दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा मापा जाता है। (डी) छवियों में प्रतिदीप्ति का एक मानक विचलन प्रक्षेपण ( वीडियो 1 देखें)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: वाइड-फील्ड कैल्शियम इमेजिंग। (ए) वाइड-फील्ड इमेजिंग सेटअप की एक तस्वीर। (बी) एक उदाहरण कच्ची छवि और नमूना छवि। (सी) एससी न्यूरॉन्स की कैल्शियम प्रतिक्रियाओं का एक एकल फ्रेम और एक मानक विचलन प्रक्षेपण, जिसे एक उदाहरण आंशिक-कॉर्टेक्स माउस से वाइड-फील्ड माइक्रोस्कोपी द्वारा मापा जाता है (वीडियो 2 देखें)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: इंजेक्शन साइट से अलग-अलग दूरी पर एक माउस मस्तिष्क के कोरोनल खंड। नीचे की पंक्ति शीर्ष पंक्ति में चिह्नित बक्से के उच्च आवर्धन को दर्शाती है। पीला डैश्ड आयत इंजेक्शन साइट को चिह्नित करता है, जिसमें इसके दाईं ओर के क्षेत्र की तुलना में कम न्यूरॉन्स होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वीडियो 1: दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा वीडियो 3 में दृश्य उत्तेजना के लिए एससी न्यूरॉन्स की कैल्शियम प्रतिक्रियाओं के कच्चे और गति-सही वीडियो। छवियों को 4.8 हर्ट्ज पर प्राप्त किया गया था और 20 हर्ट्ज पर प्रदर्शित किया गया था। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो 2: वाइड-फील्ड माइक्रोस्कोपी द्वारा वीडियो 3 में दृश्य उत्तेजना के लिए एससी न्यूरॉन्स की कैल्शियम प्रतिक्रियाओं के कच्चे और गति-सही वीडियो। छवियों को 10 हर्ट्ज पर प्राप्त किया गया था और 20 हर्ट्ज पर प्रदर्शित किया गया था। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो 3: एक काली पूर्ण-स्क्रीन पट्टी (5 ° चौड़ी) 12 अलग-अलग दिशाओं (50 ° / सेकंड) में बहती है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम
सबसे महत्वपूर्ण कदम चरण 5.2 और 5.3 में क्रैनियोटॉमी है। सबसे पहले, लैम्ब्डा के पीछे 0.5 मिमी की हड्डी मोटी होती है और अंदर रक्त वाहिकाएं होती हैं, जिससे ड्रिलिंग प्रक्रिया के दौरान रक्तस्राव हो सकता है। रक्तस्राव को रोकने के लिए पर्याप्त जेल फोम तैयार किया जाना चाहिए। दूसरा, अनुप्रस्थ साइनस के ठीक ऊपर हड्डी को हटाते समय एंजियोरेहेक्सिस का एक अच्छा मौका होता है। समस्या निवारण के लिए, एक वैकल्पिक दृष्टिकोण अंडाकार के अंदर हड्डी को पतला करना और इसे टुकड़ा-दर-टुकड़ा निकालना है। एक और चाल यह है कि हड्डी से ड्यूरा की टुकड़ी को आसान बनाने और रक्तस्राव को रोकने के लिए उठाने से पहले हड्डी को भिगोना है।

एक और महत्वपूर्ण कदम चरण 5.4 में प्लग आरोपण है, जिसके लिए पूरी प्रक्रिया 1-2 मिनट तक चलनी चाहिए। समस्या निवारण के लिए, कोई पहले माइक्रोमैनिपुलेटर के साथ प्लग को एसीएसएफ में एक उपयुक्त स्थिति में ले जा सकता है और प्लग की अंतिम स्थिति निर्धारित कर सकता है। फिर, सिलिकॉन चिपकने वाला जोड़ें और प्लग को अंतिम स्थिति में उचित गति से ले जाएं।

अर्थ
इस प्रोटोकॉल के दो गुण हैं। सबसे पहले, यह जंगली-प्रकार के चूहों में एक बरकरार कॉर्टेक्स के साथ एकल-कोशिका रिज़ॉल्यूशन पर पश्च-उपचारात्मक एससी की इमेजिंग के लिए विवरण प्रदान करता है, जबकि पिछली रिपोर्टों में पूर्वकाल-पार्श्व एससी को उजागर करने के लिए ओवरलेइंग कॉर्टेक्स को एस्पिरेटेड किया गया था। दूसरा, यह विस्तृत क्षेत्र कैल्शियम इमेजिंग तकनीक का उपयोग करके आंशिक-कॉर्टेक्स उत्परिवर्ती चूहों के पूरे एससी को चित्रित करने का विवरण देता है। इन दो दृष्टिकोणों को विभिन्न पैमानों पर जानवरों के व्यवहार में अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों की छवि के लिए लागू किया जा सकता है।

कॉर्टेक्स15,16 को हटाने के बिना पश्च-मध्यवर्ती एससी को चित्रित करने के लिए दो वैकल्पिक तरीकों की सूचना दी गई है। श्रोडर एट अल के पास एक गोलाकार 4 मिमी क्रैनियोटॉमी था और एससी16 को उजागर करने के लिए प्रत्येक छोर पर एक वॉशर और एक ग्लास कवरस्लिप के साथ एक स्टेनलेस-स्टील ट्यूब लगाया गया था। हमारे द्वारा उपयोग की जाने वाली तुलना में बड़े क्रैनियोटॉमी और अधिक कठोर सामग्री, आरोपण के दौरान रक्तस्राव का कारण बनने की अधिक संभावना है। इसके अलावा, क्योंकि स्टेनलेस स्टील बायोकंपैटिबल नहीं है, इसलिए यह क्रोनिक इमेजिंग के लिए संक्रमण पैदा करने की अधिक संभावना है। इसी तरह, सेवियर एट अल में इस्तेमाल किया जाने वाला ग्लास कवरस्लिप भी अधिक कठोर था और जैव-संगत नहीं था, और रक्तस्रावऔर संक्रमण का कारण बनने की अधिक संभावना थी। इन दो तरीकों से एक और अंतर यह है कि हमारी वायरल इंजेक्शन साइट इमेजिंग विंडो के बाहर है, और इस प्रकार इंजेक्शन साइट पर संभावित क्षति से इमेजिंग गुणवत्ता कम प्रभावित होती है (चित्रा 5)।

प्रोटोकॉल की सीमाएँ
यह प्रोटोकॉल एससी की सतही परत में इमेजिंग कैल्शियम प्रतिक्रियाओं के लिए विवरण प्रदान करता है। इमेजिंग गहरी परतें, उदाहरण के लिए प्रिज्म26 का उपयोग करके, कवर नहीं किया गया है। दो-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग दृष्टिकोण का उपयोग पश्च-मध्यवर्ती एससी में तंत्रिका गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए किया जाता है और पूर्वकाल-पार्श्व एससी 7,13 को कवर नहीं करता है। वाइड-फील्ड माइक्रोस्कोपी के साथ संपूर्ण एससी कैल्शियम इमेजिंग उत्परिवर्ती आंशिक-कॉर्टेक्स चूहों पर लागू की गई थी। वाइड-टाइप चूहों के पूरे एससी की इमेजिंग के लिए, किसी को ओवरलेइंग कॉर्टेक्स को एस्पिरेट करने की आवश्यकता होती है। वायरल इंजेक्शन के बिना पूरे एससी को छवि बनाने का एक वैकल्पिक तरीका, आंतरिक इमेजिंग तकनीक है; हालांकि, इसमें सिग्नल-टू-शोर अनुपात 6,8 कम है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

यह काम चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (32271060) द्वारा समर्थित है। वाई-टीएल ने अनुसंधान को डिजाइन किया, प्रयोग किया, डेटा का विश्लेषण किया, और पांडुलिपि लिखी। जेडएल और आरडब्ल्यू ने प्रयोग किया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16x objective Nikon
50-mm lens Computar M5018-MP2
5-mm coverslip Warner instruments CS-5R
bandpass filter Chroma Technology HQ575/250 m-2p
butyl cyanoacrylate Vetbond, World Precision Instruments
camera for monitoring pupil FLIR BFS-U3-04S2M-CS
camera for widefield imaging Basler acA2000-165µm
corona treater Electro-Technic Products BD-20AC
dichroic Chroma Technology T600/200dcrb 
galvanometers Cambridge Technology
glass bead sterilizer RWD RS1502
microdrill RWD 78001
micromanipulator Sutter Instruments QUAD
photomultiplier tube Hamamatsu R3896
rotory encoder USdigital MA3-A10-125-N
self-curing dental adhesive resin cement  SuperBond C&B, Sun Medical Co, Ltd. Moriyama, Japan
thermostatic heating pad  RWD 69020
Ti:Sapphire laser Spectra-Physics Mai Tai HP DeepSee
translucent silicone adhesive  Kwik-Sil, World Precision Instruments
treadmill Xinglin Biology
Virus Strains
rAAV2/9-hsyn-Gcamp6m Vector Core at Chinese Institute for Brain Research, Beijing
Animals
C57BL/6J wild type Laboratory Animal Resource Center at Chinese Institute for Brain Research, Beijing
Emx1-Cre The Jackson Laboratory  5628
Pals1flox/wt Christopher A. Walsh Lab
Software
ImageJ NIH Image
Labview National Instruments
MATLAB Mathworks

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. May, P. J. The mammalian superior colliculus: laminar structure and connections. Progress in Brain Research. 151, 321-378 (2006).
  2. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  3. Ohki, K., Chung, S., Ch'ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex. Nature. 433 (7026), 597-603 (2005).
  4. Ratzlaff, E. H., Grinvald, A. A tandem-lens epifluorescence macroscope: Hundred-fold brightness advantage for wide-field imaging. Journal of Neuroscience Methods. 36 (2-3), 127-137 (1991).
  5. de Vries, S. E. J., et al. A large-scale standardized physiological survey reveals functional organization of the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 23 (1), 138-151 (2020).
  6. Mrsic-Flogel, T. D., et al. Altered map of visual space in the superior colliculus of mice lacking early retinal waves. The Journal of Neuroscience. 25 (29), 6921-6928 (2005).
  7. Cang, J., Wang, L., Stryker, M. P., Feldheim, D. A. Roles of ephrin-as and structured activity in the development of functional maps in the superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 28 (43), 11015-11023 (2008).
  8. Feinberg, E. H., Meister, M. Orientation columns in the mouse superior colliculus. Nature. 519 (7542), 229-232 (2015).
  9. Ahmadlou, M., Heimel, J. A. Preference for concentric orientations in the mouse superior colliculus. Nature Communications. 6, 6773 (2015).
  10. de Malmazet, D., Kühn, N. K., Farrow, K. Retinotopic separation of nasal and temporal motion selectivity in the mouse superior colliculus. Current Biology. 28 (18), 2961-2969 (2018).
  11. Li, Y. T., Turan, Z., Meister, M. Functional architecture of motion direction in the mouse superior colliculus. Current Biology. 30 (17), 3304-3315 (2020).
  12. Gribizis, A., et al. Visual cortex gains independence from peripheral drive before eye opening. Neuron. 104 (4), 711-723 (2019).
  13. Inayat, S., et al. Neurons in the most superficial lamina of the mouse superior colliculus are highly selective for stimulus direction. The Journal of Neuroscience. 35 (20), 7992-8003 (2015).
  14. Barchini, J., Shi, X., Chen, H., Cang, J. Bidirectional encoding of motion contrast in the mouse superior colliculus. eLife. 7, 35261 (2018).
  15. Savier, E. L., Chen, H., Cang, J. Effects of locomotion on visual responses in the mouse superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 39 (47), 9360-9368 (2019).
  16. Schröder, S., et al. Arousal modulates retinal output. Neuron. 107 (3), 487-495 (2020).
  17. Ge, X., et al. Retinal waves prime visual motion detection by simulating future optic flow. Science. 373 (6553), (2021).
  18. Chen, H., Savier, E. L., DePiero, V. J., Cang, J. Lack of evidence for stereotypical direction columns in the mouse superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 41 (3), 461-473 (2021).
  19. Kasai, M., Isa, T. Effects of light isoflurane anesthesia on organization of direction and orientation selectivity in the superficial layer of the mouse superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 42 (4), 619-630 (2022).
  20. Kim, S., et al. The apical complex couples cell fate and cell survival to cerebral cortical development. Neuron. 66 (1), 69-84 (2010).
  21. Kaifosh, P., Zaremba, J. D., Danielson, N. B., Losonczy, A. S. I. M. A. Python software for analysis of dynamic fluorescence imaging data. Frontiers in Neuroinformatics. 8, 80 (2014).
  22. Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. NoRMCorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data. Journal of Neuroscience Methods. 291, 83-94 (2017).
  23. Kerlin, A. M., Andermann, M. L., Berezovskii, V. K., Reid, R. C. Broadly tuned response properties of diverse inhibitory neuron subtypes in mouse visual cortex. Neuron. 67 (5), 858-871 (2010).
  24. Göbel, W., Helmchen, F. In vivo calcium imaging of neural network function. Physiology. 22 (6), 358-365 (2007).
  25. Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
  26. Evans, D. A., et al. A synaptic threshold mechanism for computing escape decisions. Nature. 558 (7711), 590-594 (2018).

Tags

तंत्रिका विज्ञान अंक 194
माउस सुपीरियर कोलिकुलस में कैल्शियम इमेजिंग
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, Z., Wu, R., Li, Y. t. Calcium… More

Li, Z., Wu, R., Li, Y. t. Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus. J. Vis. Exp. (194), e65181, doi:10.3791/65181 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter