Summary
מאמר זה מתאר שיטה פשוטה וזולה לתיעוד התנהגות הימנעות מדשאה של Caenorhabditis elegans, באמצעות פריטים זמינים כגון טלפון חכם וקופסת אור פולטת אור (LED). אנו מספקים גם סקריפט Python לעיבוד קובץ הווידאו לפורמט נוח יותר לספירה.
Abstract
כאשר היא נחשפת לחיידקים רעילים או פתוגניים, הנמטודה Caenorhabditis elegans מפגינה התנהגות נלמדת של הימנעות מדשאה, שבה התולעים עוזבות בהדרגה את מקור המזון שלהן ומעדיפות להישאר מחוץ למדשאת החיידקים. הבדיקה היא דרך קלה לבחון את יכולתן של התולעים לחוש רמזים חיצוניים או פנימיים כדי להגיב כראוי לתנאים מזיקים. למרות שמדובר בבדיקה פשוטה, הספירה גוזלת זמן, במיוחד עם דגימות מרובות, ומשכי הבדיקה הנמשכים לילה אינם נוחים לחוקרים. מערכת הדמיה שיכולה לצלם לוחות רבים לאורך תקופה ארוכה היא שימושית אך יקרה. כאן, אנו מתארים שיטת הדמיה מבוססת סמארטפון לתיעוד הימנעות מדשאה ב- C. elegans. השיטה דורשת רק טלפון חכם וקופסת אור של דיודה פולטת אור (LED), שישמשו כמקור אור משודר. באמצעות יישומי מצלמה ללא קיטועי זמן, כל טלפון יכול לצלם עד שש לוחות, עם חדות וניגודיות מספיקות כדי לספור תולעים באופן ידני מחוץ לדשא. הסרטים המתקבלים מעובדים לקבצי 10 s audio video interleave (AVI) עבור כל נקודת זמן של שעה, ולאחר מכן נחתכים כדי להציג כל צלחת בודדת כדי להפוך אותם לנוחים יותר לספירה. שיטה זו היא דרך חסכונית עבור אלה המעוניינים לבחון פגמים הימנעות וניתן להרחיב אותה לבדיקות C. elegans אחרות.
Introduction
בין היתרונות הרבים של חקר C. elegans, מערכת העצבים הפשוטה שלה מציעה הזדמנות לחקור כיצד שינויים ברמה הגנטית והתאית משפיעים על תפקוד הרשת ועל התפוקה ההתנהגותית. למרות שיש להם מספר מוגבל של נוירונים, C. elegans מציגים מגוון רחב של התנהגויות מורכבות. אחד מהם הוא הימנעות מדשאה, שבה הנמטודה החיידקית מגיבה למקור מזון מזיק על ידי עזיבת הדשא החיידקי. C. elegans נמנעים ממדשאות של חיידקים פתוגניים 1,2,3, מדשאות של חיידקים המייצרים רעלים או מתובלים ברעלים1,4, ואפילו חיידקים מבטאי RNAi שהשמדת גן המטרה שלהם מזיקה לבריאות התולעים 4,5. מחקרים הראו כי תולעים מגיבות לרמזים חיצוניים כגון מטבוליטים המיוצרים על ידי חיידקים פתוגניים 1,6, או רמזים פנימיים המצביעים על כך שהמזון גורם להם לחלות 4,7. רמזים אלה מעובדים באמצעות מסלולי איתות שמורים, כגון מסלול חלבון קינאז המופעל על ידי מיטוגן (MAPK) ומסלול בטא גורם גדילה משתנה (TGFβ), ודורשים תקשורת בין המעי למערכת העצבים 4,6,7,8.
למרות שהבדיקה פשוטה, ההתנהגות הנלמדת מתפתחת במשך שעות רבות, לעתים קרובות בן לילה. בעוד שישנם מוטנטים שאינם מסוגלים לעזוב, ובמקרה זה די בניקוד הימנעות בנקודת זמן אחת בלבד כדי להדגים את הפגם, מוטנטים רבים אכן עוזבים בסופו של דבר אך הם איטיים יותר לצאת. עבור אלה, התנועה של התולעים צריך להיות מעקב כל כמה שעות, אשר יכול להיות קשה לעשות בן לילה. גם הספירה עצמה לוקחת זמן, מה שיוצר זמן השהיה בין הלוחות, ובכך מגביל את מספר הצלחות שניתן לבדוק בו זמנית. שימוש במערך הדמיה כדי להקליט לוחות רבים בו זמנית למשך כל תקופת הבדיקה יהיה שימושי מאוד, אך עלות ההתקנה יכולה להיות אסורה, בהתאם למצב המימון של מעבדת המחקר.
כדי להתמודד עם זה, פיתחנו שיטה פשוטה מאוד המשתמשת בסמארטפונים כדי להקליט מבחני הימנעות. כל טלפון יכול להקליט סרטוני קיטועי זמן של עד שש לוחיות בדיקה. כדי לספק אור משודר, אנו משתמשים בקופסת אור של דיודה פולטת אור (LED) שניתן לרכוש בקלות באינטרנט. לוחות Assay ממוקמים על פלטפורמה מוגבהת, הנתמכת על ידי מנהרות מלבניות חלולות, הממקדות את האור הנכנס ויוצרות ניגודיות. אנו מספקים גם סקריפט Python הממיר את הסרטונים לקבצי Audio Video interleave (AVI) המציגים קליפים של 10 שניות של כל נקודת זמן לשעה. לאחר מכן הסרטונים נחתכים ללוחות נפרדים ונשמרים בקבצים נפרדים לשימוש לספירה ידנית.
השיטה מספקת הליך בעלות נמוכה כי הוא גם קל מאוד לשימוש, באמצעות פריטים זמינים עבור רוב האנשים. כאן, אנו מתארים את השיטה באמצעות בדיקת הימנעות דשא מבוססת היטב נגד הפתוגן האנושי Pseudomonas aeruginosa (PA14), שהפרוטוקול שלו תואר בעבר 2,9. לבסוף, אנו סוקרים גם את השיקולים והמגבלות של שיטת ההדמיה עבור אלה שרוצים ליישם אותה בניסויי התנהגות אחרים של C. elegans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הגדרת מכשיר הדימות (איור 1A-E)
- ודא שמצלמת טלפון חכם עם דרישות המינימום הבאות זמינה:
12 מגה פיקסל (MP) מצלמה
וידאו ברזולוציית 1080p
שטח אחסון של 5 GB (וידאו של 20 דקות הוא 3-4 Gb)
אפליקציית וידאו עם קיטועי זמן מחנות האפליקציות (אפליקציות זמינות בחינם) - מקם את תיבת תאורת ה- LED על המדף התחתון של האינקובטור בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס שבו תתבצע הבדיקה.
- כדי להסתיר את התבנית המנוקדת על משטח תאורת ה-LED, פרשו שתי יריעות של רקמות כדי לכסות את כל פני השטח של קופסת ה-LED.
- צרו שלב מוגבה עבור הדגימה (איור 1A,D). השלב המוגבה הוא יריעת פלסטיק שקופה הנתמכת על ידי מנהרות מלבניות חלולות. מנהרות מתפקדות כמו מעבה כדי למקד אור, ומספקות ניגודיות טובה יותר לדגימה (איור 1C). ודאו שדפנות המנהרה חשוכות במקצת כדי למזער את פיזור האור. במחקר זה נעשה שימוש בקופסאות נייר חומות. מידות המנהרה 5.5 ס"מ x 17 ס"מ x 4.5 ס"מ (רוחב x אורך x גובה). תיבת תאורת הלד יכולה להכיל עד חמש מנהרות.
- מקם מדף נוסף מעל הבמה כדי למקם את הטלפונים להקלטה (איור 1B,E). כל טלפון יקליט שלוש עד שש צלחות (שורה אחת עד שתיים של שלוש צלחות), לכן התאם את גובה ארון התקשורת בהתאם. זה יהיה בערך 15 ס"מ מעל הדגימה (איור 1B).
- שים מפצל חשמל בתוך האינקובטור כדי לחבר את הטלפונים במהלך הקלטת הלילה.
2. הכנת מאגרים ומדיה
- הכינו את מאגר M9 על ידי הוספת 3 גרם של KH 2 PO 4, 6 גרם של Na 2 HPO4 ו-5 גרם של NaCl ל-1 ליטר של H2O מזוקק. יש לעקר על ידי אוטוקלאבינג ב-121°C למשך 20 דקות. מצננים את המאגר ולאחר מכן מוסיפים 1 מ"ל של 1 M MgSO4.
- הכן מאגר KPO 4 של 1 M על ידי הוספת 108.3 גרם של KH 2 PO 4 ו- 35.6 גרם של K 2 HPO4 עד 1 L של H 2O. התאם את ה- pH ל- 6.0 על ידי הוספת KOH. לעקר על ידי autoclaving.
- הכינו תמיסת הלבנת תולעים על ידי ערבוב 1 מ"ל אקונומיקה, 0.4 מ"ל של 1 מ"ל NaOH ו-2.6 מ"ל של H2O.
- הכינו צלחות אגר של מדיה לגידול נמטודות (NGM).
- הוסף 3 גרם של NaCl, 2.5 גרם של פפטון bacto, ו 17 גרם של אגר bacto בבקבוק 3 L. מוסיפים 975 מ"ל מים מזוקקים ומכניסים מוט ערבוב.
- יש לעקר על ידי אוטוקלאבינג, ואז לקרר ל-55°C ולהוסיף 1 מ"ל כולסטרול (5 מ"ג/מ"ל באתנול), 1 מ"ל של 1 M CaCl2, 1 מ"ל של 1 M MgSO 4 ו-25 מ"ל של 1 M KPO4 buffer (pH 6.0). מערבבים לערבוב טוב. יוצקים לצלחות בקוטר 6 ס"מ. תנו לצלחות להתייבש לפחות יומיים.
- זרע צלחות אגר NGM עם OP50 E. coli על ידי pipeting כ 1 מ"ל של תרבית לילה של OP50 כדי ליצור דשא של חיידקים. יש להשאיר בטמפרטורת החדר (RT) עד לשימוש מוכן.
3. הכנת לוחות NGM עתירי פפטון (עבור PA14)
הערה: לוחות אלה צריכים להיעשות לפחות 5 ימים לפני הבדיקה.
- מייצרים גז טבעי טבעי המכיל 0.35% פפטון. מערבבים 0.3 גרם של NaCl, 0.35 גרם של בקטו פפטון, ו 1.7 גרם של אגר bacto בבקבוק Erlenmeyer 250 מ"ל. מוסיפים 97.5 מ"ל מים מזוקקים ומכניסים מוט ערבוב.
- מכסים את הפה של בקבוק עם רדיד אלומיניום autoclave ב 121 ° C במשך 20 דקות.
- יש לקרר עד 55°C ולהוסיף 0.1 מ"ל כולסטרול (5 מ"ג/מ"ל באתנול), 0.1 מ"ל של 1 M CaCl 2, 0.1 מ"ל של 1 M MgSO 4,ו-2.5 מ"ל של 1 M KPO4 buffer (pH 6.0). מערבבים לערבוב טוב.
- מוזגים גז טבעי עתיר פפטון לצלחות פטרי בקוטר 35 מ"מ.
- יבש את הצלחות לפחות 2 ימים.
4. סנכרון תולעים על ידי הלבנה
הערה: התחל שלב זה 3 ימים לפני הבדיקה.
- קח צלחות עם תולעים בוגרות gravid ולאסוף אותם לתוך microtube 1.7 מ"ל על ידי שטיפת הצלחות עם חיץ M9.
- מוציאים כמה שיותר נוזלים, ואז מוסיפים 400 מיקרוליטר של תמיסת הלבנה. ממתינים כ-4-5 דקות עם מערבולות לסירוגין, עד שגופי התולעים הבוגרות נשברים ומשחררים את הביצים.
- הוסף חיץ M9 כדי למלא את שאר המיקרו-צינורית כדי לדלל את תמיסת ההלבנה. סחרור במהירות מרבית (12,000 עד 13,000 x גרם) למשך 1-2 שניות. הסירו את הסופרנאטנט ושטפו שלוש פעמים נוספות עם חיץ M9.
- מעבירים את הביצים לצלחת פטרי ריקה בקוטר 35 מ"מ המכילה חיץ M9. תן את הביצים לבקוע לילה ב 20 °C (75 °F). בהיעדר מזון, התולעים שבקעו יעצרו בשלב הזחל L1, ויסנכרנו את השלב ההתפתחותי של כל התולעים.
הערה: ציפוי צלחת פטרי 35 מ"מ בתמיסת ג'לטין (0.05% ג'לטין במים אוטוקלאביים) יכול למנוע מהביצים להידבק לתחתית ולמזער את אובדן הביצים. - למחרת, העבירו תולעים בשלב L1 לצלחות NGM עם זרעי OP50.
- דוגרים על התולעים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 53-54 שעות עד שהתולעים מגיעות לשלב הזחל L4.
5. הכנת חיידקים (Pseudomonas aeruginosa, PA14)
הערה: התחל שלב זה 4 ימים לפני הבדיקה.
- פסים חיידקים מופשרים מ -80 ° C על צלחת אגר לוריא ברטאני (LB) ללא כל אנטיביוטיקה לדגור לילה ב 37 ° C.
הערה: יש להשתמש תמיד בחיידקים טריים. צלחות פסים יש לאחסן ב 4 ° C במשך לא יותר מ 1 שבוע. - לחסן מושבה אחת לתוך 3 מ"ל של מרק המלך ולגדל לילה באינקובטור 37 מעלות צלזיוס.
- למחרת, זרעו 7 מיקרוליטר של תרבית הלילה על צלחות NGM עתירות פפטון ודגרו בטמפרטורה של 37°C במשך 24 שעות.
- העבירו את צלחות הזרעים ל-RT ודגרו עוד 24 שעות לפני השימוש. ברגע שאתה מוכן, השתמש בצלחת תוך 24 שעות.
6. הכנה להקלטה
הערה: בצע פעולה זו ממש לפני הבדיקה.
- חבר את הטלפון החכם למפצל החשמל המחובר לשקע חשמל. הקפד להשבית את הגדרת הנעילה האוטומטית כדי למנוע מהטלפון לחזור למסך הנעילה בזמן ההקלטה.
- פתח את אפליקציית המצלמה עם קיטועי הזמן והגדר את מרווח הזמן של קיטועי הזמן ל- 2 שניות. הגדר את איכות הווידאו ל- 1080p ב- 30 fps.
- מקם את הטלפון החכם כשהמסך פונה כלפי מעלה כדי להקליט באמצעות המצלמה הפונה לאחור. בדוק את המסך כדי לוודא שתעלות קופסת הנייר מתאימות לשדה הראייה.
7. בדיקת הימנעות מדשאה
- באמצעות פיק חוטי פלטינה, מעבירים 30 תולעי שלב L4 מסונכרנות (53-54 שעות מ-L1) לצלחת PA14. הניחו את התולעים במרכז מדשאת החיידקים. עבור כל מצב במחקר זה, נבדקו שתי לוחיות (כלומר, 60 תולעים לכל מצב).
- הניחו את שתי הצלחות על השלב המוגבה של מכשיר ההקלטה כשהמכסה פונה כלפי מטה. הצד עם האגר יפנה כלפי מעלה לכיוון המצלמה.
- במסך הטלפון החכם, הקש במקום שבו נמצאת הצלחת, כך שהמצלמה תוכל להתמקד בלוחות הבדיקה. זה עוזר שיש תווית או כיתוב על הצלחת כמו המצלמה יכולה להשתמש בזה כדי להתמקד כראוי.
הערה: כתיבה בתחתית הלוחות אינה מפריעה להדמיה של תולעים כל עוד היא בכיוון הקצה. למרבה המזל, תולעים נשארות ליד המדשאה גם לאחר שהן עוזבות, כך שיש צורך בתצפית ללא הפרעה רק על האזור המיידי המקיף את המדשאה. - התחל את ההקלטה.
- לאחר תחילת ההקלטה, הוסף צלחות נוספות לבמה. ייתכן שיש זמן פיגור משמעותי בין הצלחות בגלל הזמן שלוקח להעביר תולעים על ידי קטיף. שים לב לזמן ההשהיה לאחר מכן, כך שניתן יהיה לספור כל תנאי בזמן שהוא התחיל.
- הקלט במשך 20 שעות מהסט האחרון של צלחות שהונחו על הבמה. בסרטון האחרון בהילוך מהיר, 20 שעות של הקלטה יובילו לסרטון באורך 20 דקות.
הערה: ייתכן שכדאי לספור את התולעים ישירות מהלוחות לאחר הבדיקה, לפחות בהתחלה בהזדמנויות הראשונות. ניתן להשוות זאת לערכים המתקבלים באמצעות הדמיית וידאו כדי להבטיח שהם מניבים מספרים דומים.
8. עיבוד וידאו באמצעות סקריפט Python
- העבר את קובץ הסרט למחשב לצורך עיבוד. התוסף יהיה קובץ MOV (iPhone) או MP4 (Android).
- השתמש בקוד Python כדי לעבד את הסרטונים. ניתן למצוא את הקוד בכתובת github.com/khyoon201/wormavoid.
- כדי להפעיל את הסקריפטים של Python, ודא שהפריטים הבאים מותקנים מראש במחשב: ffmpeg, כלי להמרת קבצי וידאו (הוראות להתקנה ניתן למצוא באתר האינטרנט שלו, ffmpeg.org/download), ואת חבילות Python os, pandas, tkinter ו- ffmpeg-python.
- מצא את המידות והקואורדינטות של כל לוח באמצעות סקריפט extract_frame.py .
- הפעל את קובץ ה- Script של extract_frame.py . יופיע חלון לבחירת קובץ הווידאו המאוחסן במחשב. לאחר השלמת ההפעלה, קובץ jpeg עם אותו שם יופיע באותה ספרייה.
- פתח את קובץ ה- jpeg ב- ImageJ (imagej.org).
- מהתפריט, בחרו ' נתח' >'קבע מדידות'. ודא שהתיבה תווית תצוגה מסומנת (איור 2A). סגור את החלון.
- בעזרת הכלי קו ישר , מדדו את קוטר הלוח באמצעות ציור קו לרוחבו, ולאחר מכן בחרו באפשרות 'נתח > מדידה' מהתפריט. אם הסרטון הוא ברזולוציה של 1080p, רוחבו של כל לוח יהיה כ-480 פיקסלים. רשום מידע זה וסגור את החלון תוצאות .
- בעזרת הכלי ריבוי נקודות, סמנו נקודות בצד שמאל העליון של כל לוח. הנקודות האלה יהפכו לפינה השמאלית העליונה של הסרטונים החתוכים (איור 2B). הסדר חשוב; סמן לפי סדר התחלת הצלחות. לאחר יצירת נקודה לכל הלוחות, בחרו ' נתח > מדידה' מהתפריט. מדידות, כולל קואורדינטות X ו- Y של הנקודות, יופיעו בחלון תוצאות.
- כדי לעבד סרטונים מרובים, חזור על התהליך ב- ImageJ עם קובצי jpeg אחרים. כל הקואורדינטות X ו- Y יופיעו באותו חלון תוצאות .
- שמור את החלון תוצאות בקובץ csv. יש לשמור את הקובץ באותה ספרייה כמו קובצי הסרט.
- מצא את זמן ההתחלה עבור כל צלחת.
- הפעל את הסרט, במחשב או בטלפון, ושים לב לזמני ההתחלה של כל סט צלחות המונחות מתחת למצלמה.
- פתח את הקובץ תוצאות.csv עם הקואורדינטות והוסף עמודת "התחל". עבור כל שורה המתאימה ללוחות בודדים, הזן את שעת ההתחלה המתאימה, תוך שניות, תחת העמודה "התחל" (לדוגמה, אם שעת ההתחלה היא 0:00:08, הזן 8). שמר.
הערה: שם העמודה חייב להיות "התחל" (באותיות קטנות, ללא מרכאות) כדי להיות מזוהה על-ידי הסקריפט הבא עבור חיתוך וחיתוך.
- חתוך וחתוך את הסרטונים.
- הפעל את קובץ ה- Script של crop_n_trim.py .
- כשתתבקש, בחר את הקובץ תוצאות.csv .
הערה: ודא שהקובץ תוצאות.csv וכל קבצי הסרט נמצאים באותה ספרייה. - הזן את מידות הצלחת. הזן את ערך הפיקסל שצוין קודם לכן.
הערה: הסקריפט יקרא כעת כל שורה בקובץ Results.csv כדי למצוא את קובץ הסרט הנכון על-ידי קריאת שם הקובץ בעמודה "label", ויחתוך בהתאם לקואורדינטות המצוינות בעמודות "X" ו- "Y". זמן ההתחלה של כל צלחת ייקבע לפי הזמן המצוין בעמודה "התחלה". לאחר שהתסריט יסיים לפעול, תופיע תיקייה עם אותו שם כמו הסרט, ואחריה שעת ההתחלה (למשל, "Movie1_8"), שבה יישמרו סרטונים של 10 שניות המתאימים לכל נקודת זמן של שעה בבדיקה.
9. ספירה ידנית באמצעות ImageJ
- פתח כל קובץ AVI ב- ImageJ.
- ספרו את התולעים שנראות מחוץ לדשא. תולעים החופפות במסגרת אחת בדרך כלל מתרחקות זו מזו במסגרת אחרת כדי שניתן יהיה לספור אותן כראוי.
- חישוב שיעור התפוסה עבור כל נקודת זמן:
שיעור תפוסה = (סה"כ תולעים - מספר התולעים מחוץ לדשא)/סה"כ תולעים
הערה: התולעים ינועו פנימה והחוצה מהדשא במהלך הסרטון, אך הדבר לא ישנה באופן משמעותי את התוצאות. נסו ללכת עם המספר שנראה כמו הממוצע, או מספר התולעים בנקודת הזמן השעתית המדויקת (5 שניות לתוך הסרטון).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הסרטון הראשון שהופק על ידי התסריט הוא 1 שעה מתחילת הבדיקה. הווידאו במשך 0 שעות אינו נשמר, כמו תולעים להתחיל את הבדיקה בתוך הדשא, ולכן שיעור התפוסה הוא תמיד 100%.
תולעי N2 מסוג פרא מושוות למוטנטים מסוג npr-1, שפגם בהימנעות מדשאה שלהם מבוסס היטב בספרות 6,10 (איור 3A-E). כפי שניתן לראות בסוג הבר, תולעים עוזבות בהדרגה את מדשאות החיידקים ונשארות בחוץ (איור 3A,B). התוצאות משורטטות בגרף כדי להראות את השינוי בשיעור התפוסה לאורך זמן (איור 3B). תולעים בחוץ נראות בבירור בווידיאו, אולם קשה יותר להבחין בתולעים בתוך מדשאה חיידקית עבה (איור 3D,E). עם זאת, מכיוון שיש בדיוק 30 תולעים בכל צלחת, ניתן לחשב את מספר התולעים שעדיין בתוך המדשאה על ידי הפחתת התולעים שנספרו מ-30 בסך הכל.
למרות שהנחה זו עלולה לגרום לטעויות ספירה, במיוחד אם חלק מהתולעים מגיעות בסופו של דבר ליד קירות הצלחת שם קשה לראות, זה לא היה חשש משמעותי. כאשר הספירות שנעשו ישירות מהלוחות הושוו לספירות מתולעים מצולמות, ספירות מתולעים מצולמות התבררו כמדויקות ביותר. כאשר בוצעו בממוצע שלושה ניסויים עבור כל זן יחד, הזנים N2 ו-npr-1 הניבו דיוק של 99.5% ו-96.2%, בהתאמה (איור 3B,C). יש לציין כי הייתה נטייה מעט גבוהה יותר להחמיץ כמה תולעי npr-1 בשל תנועתיות גבוהה11, בעוד שתולעים מסוג בר נטו להישאר ליד המדשאה.
איור 1: מכשיר הדמיה. (A) תצוגה סכמטית של מערך ההדמיה. (B) מכשיר הדמיה שהוקם בתוך אינקובטור שנקבע ל-25°C עבור בדיקות PA14 למניעת דשא. (C) השוואה בין תולעים שצולמו עם המנהרה או בלעדיה. (D) מבט מקרוב על אופן התקנת הלוחות על גבי המנהרות. (E) גובה הטלפון מותאם כך שעד שישה לוחות של 35 מ"מ יוכלו להיכנס למסך. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: קביעת קואורדינטות לוחות באמצעות ImageJ. (A) בניתוח > קביעת מדידות, יש לסמן את התיבה תווית תצוגה (תיבה אדומה מנוקדת). (B) פריים בודד שחולץ מהסרטון משמש להתוויית קואורדינטות המשמשות לחיתוך. נקודות שנוצרו באמצעות הכלי Multi-point הן בצבע צהוב. אלה משמשים כפינות השמאליות העליונות של הסרטונים האחרונים שנחתכו (מסומנים כקופסה לבנה מנוקדת). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תמונה מייצגת ותוצאות בדיקה. (A) לאחר מספר שעות של חשיפה ל-PA14, רוב התולעים עוזבות את המדשאה ונשארות בחוץ. (ב) תוצאות מייצגות של בדיקת הימנעות מדשאה. תנועת התולעים עוקבת אחר כל שעה כדי לקבוע את שיעור התפוסה. הריבועים הפתוחים בנקודת הזמן של 20 שעות מציינים את הערך הממוצע שנקבע מספירה ישירה מלוחות מ-C. (C) כדי להעריך את דיוק הספירות שבוצעו באמצעות הווידאו, התולעים נספרו גם ישירות בסוף הבדיקה והושוו לערכים שהתקבלו באמצעות הדמיית וידאו. הערכים מציינים את מספרי התולעים בתוך / מחוץ לדשא. (ד,ה) תולעי L4 נראות בבירור מחוץ למדשאת החיידקים (ראש חץ שחור), בעוד שתולעים בפנים קשות יותר לראייה (ראש חץ לבן). תולעים החופפות בפריים אחד ניתנות בדרך כלל להבדלה בפריים אחר מאותו סרט (ראש חץ שחור עם קווי מתאר). המספר בפינה השמאלית התחתונה מציין את מספר המסגרת מתוך סך כל הפריימים של סרטון הווידאו בן 10 השניות (30 פריימים לשנייה). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הדמיה של התנהגות בעלי חיים, במקום להסתמך על תצפית ישירה, היא לא רק נוחה אלא גם בעלת יתרון של השארת תיעוד חזותי. זה מאפשר ניתוח עיוור על ידי אדם שלישי אובייקטיבי, או אפילו יכול לשמש לניתוח אוטומטי באמצעות טכניקות זיהוי תמונה. למרות היתרונות, הציוד הסטנדרטי המוצע בדרך כלל הוא בעלות גבוהה, ולכן אדם מחויב להתקנה לאחר הרכישה.
שימוש בסמארטפונים לאיסוף הקלטות וידאו של התנהגות פשוטה של C. elegans מציע מספר יתרונות. הוא דורש היכרות מינימלית עם ידע טכנולוגי וקל מאוד להתקנה, תוך שימוש בפריטים שניתן לרכוש בקלות ובזול. יתרון נוסף הוא הניידות של הטלפון החכם - הוא יכול להתאים לחללים קטנים, ומכיוון שיש לו אחסון משלו, הוא לא צריך להיות מחובר בחזרה למחשב. זה מאפשר למקם את ההתקנה בכל מקום, גם כאשר השטח מוגבל ביותר. העברת קבצי הווידאו המוקלטים למחשב נוחה - הקבצים אינם כה גדולים מכיוון שהם מקודדים בפורמט MPEG-4 דחוס. העברת קבצים נוחה במיוחד כאשר אפשרויות אלחוטיות של העברת קבצים זמינות.
מכיוון שהתולעים מצולמות ללא כל הגדלה, התולעים שנלכדו בסרטונים מורכבות מפיקסלים בודדים בלבד. תולעי L4 גדולות מספיק כדי להילכד ללא הגדלה, אך גודל הפיקסלים הקטן מגביל את השימוש בהן לזיהוי תמונה באיכות גבוהה ומעקב אחר תנועה. שימוש בעדשת הזום המוצעת על ידי דגמים עדכניים יותר או חיבור מתאם עדשת זום עשויים לסייע בקבלת תמונות מפורטות יותר, אם כי לא ניסינו זאת בעצמנו. עם זאת, זה גם יפחית את שדה הראייה ואת מספר הלוחות שניתן לצלם בו זמנית.
כדי להקל על הספירה, הסרטונים נחתכים כדי להציג לוחות בודדים, ונחתכים לסרטונים של 10 שניות המתאימים לכל שעה של הבדיקה. זה חשוב גם מכיוון שהמרת הסרטונים לפורמט AVI מגדילה משמעותית את גודל הקובץ, וחיתוך וחיתוך הסרטונים מבטיחים שגדלי הקבצים ניתנים לניהול יותר. קבצי ה- AVI החתוכים יכולים לשמש גם לספירת התולעים באופן אוטומטי באמצעות אלגוריתם זיהוי תמונה. עבור הזן הפראי, מצאנו כי צורה גסה של ספירה אוטומטית אפשרית ב- ImageJ, באמצעות סף פשוט. עם זאת, כאשר משתמשים במוטנטים עם גודל גוף קטן יותר, ספירות אוטומטיות מייצרות יותר שגיאות.
נעשו מאמצים רבים לצלם תולעים ולהפוך ניתוחים לאוטומטיים. באופן מסורתי, תולעים תועדו באמצעות מצלמה המחוברת למיקרוסקופ מנתח, אשר בדרך כלל מאפשר רק הדמיה של כמה תולעים בבת אחת בשל שדה הראייה המוגבל שלה. הצורך לצלם יותר תולעים בו זמנית לצורך ניתוח תפוקה גבוהה יותר דחף חוקרים לפתח גישות הדמיה יצירתיות. דרך אחת הייתה להשתמש בסורקים שטוחים שעברו שינוי כדי לצלם מבחני תוחלת חיים, כגון WormScan או Lifespan Machine12,13. סורק ברזולוציה גבוהה יכול לצלם תולעים כך שניתן יהיה להבחין בין תולעים חיות נעות לבין תולעים מתות שאינן זזות.
למעקב אחר תנועות תולעים בקצב fps גבוה יותר, מצלמה מחוברת לעדשה, ותולעים מצולמות ללא מיקרוסקופ14,15. Churgin et al., שפיתחו את WorMotel14, שיטה להדמיה ארוכת טווח של תולעים בודדות הגדלות בצלחת מרובת בארות פולידימתילסילוקסאן (PDMS), מספקים הסברים מפורטים על גורמים שיש לקחת בחשבון בעת בחירת המצלמה והעדשה16 הנכונות. לשיטה זו יש גם יתרון נוסף של עלות צנועה יחסית.
לכידת תולעים ללא מיקרוסקופ מביאה בהכרח לתמונות חסרות את הרזולוציה לניתוח מפורט על התנועה או ההליכה של תולעים. כדי לתקן זאת, בארלו ועמיתיו השתמשו באסטרטגיה של שימוש בשש מצלמות המסודרות במערך של שלוש על שתיים כדי ללכוד צלחת אחת בת 96 בארות17. כל מצלמה מוגדרת לצלם רק ארבע x ארבע בארות של לוח 96 בארות, וכתוצאה מכך גודל ורזולוציה גבוהים בהרבה של התולעים המצולמות.
מכיוון של- C. elegans יש גוף שקוף, יש להתאים גם את התאורה כדי לספק ניגודיות מהרקע. השיטה שלנו השתמשה בתאורה מקופסת תאורת לד שטוחה, שעברה דרך מנהרה צרה כדי למקד את האור. המידות נקבעו על פי גודל הלוח המצולם; רוחב 5.5 ס"מ התאים ללוח 35 מ"מ המשמש לבדיקת ההימנעות. כדי לצלם שטח גדול יותר, המנהרה תצטרך להיות רחבה יותר, אבל גילינו שגם את הגובה צריך להגדיל כדי לקבל את אותו אפקט מיקוד. החיסרון הוא שעם מנהרות גבוהות יותר, ניתן לראות יותר מהקירות דרך הצלחת, מה שחוסם את הנוף בקצה הצלחת. אסטרטגיה נוספת שניתן להשתמש בה היא להשתמש בנורות מחרוזת LED המסודרות בטבעת עגולה (טבעת LED). האור, המגיע מכיוונים רבים, מתפזר על פני גוף התולעת, ויוצר תולעים בהירות על רקע כהה14,16,18. זה יכול לעבוד לא רק עבור לוחות גדולים יותר, אלא גם עבור הדמיה בחללים קטנים יותר שאינם יכולים להתאים לקופסת תאורת LED.
עם אסטרטגיות הדמיה זמינות רבות שפותחו על ידי קהילת התולעים, החוקרים עשויים לרצות לנסות כמה אפשרויות כדי למצוא את הנכון המתאים לצורך שלהם. שיטת ההדמיה המתוארת כאן זולה ונגישה מספיק כדי שניתן יהיה להשתמש בה בקלות בכיתות לתואר ראשון, או כפתרון זמני לפני השקעה במערך לטווח ארוך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לא הוכרז על ניגוד עניינים.
Acknowledgments
אנו מודים לדאוק ג'ונג לי על קריאה ביקורתית של כתב היד ובדיקת קוד פייתון. מחקר זה נערך בחסות קרן המחקר הלאומית של קוריאה 2017R1A5A2015369 (K.-h.Y.) ו-2019R1C1C1008708 (K.-h.Y).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Petri dish | SPL | #10035 | |
| Bacto agar | BD | #214010 | |
| Bacto Peptone | BD | #211677 | |
| CaCl2 | DAEJUNG | 2507-1400 | |
| Cholesterol | BioBasic | CD0122 | |
| Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4) | JUNSEI | 84120-0350 | |
| Glycerol | BioBasic | GB0232 | |
| King B Broth | MB cell | MB-K0827 | |
| LED light box multi-pad | Artmate | N/A | This is a USB powered, LED light pad for tracing and drawing purposes. Artmate is a Korean brand, but searching for "LED light box for tracing" in any search engine should yield numerous options from other brands. Overall dimension is around 9" x 12" (A4 size). For example, from amazon US: https://www.amazon.com/LITENERGY-Ultra-Thin-Adjustable-Streaming-Stenciling/dp/B07H7FLJX1/ref=sr_1_5?crid=YMYU0VYY226R&keywords= LED%2Blight%2Bbox&qid=1674183224&sprefix =led%2Blight%2Bbo%2Caps%2C270&sr=8-5&th=1 |
| MgSO4 | DAEJUNG | 5514-4400 | |
| Plastic paper sleeve (clear) | Smead | #85753 | Any clear plastic sheet with a bit of stiffness can be used as stage. For example, from Amazon US: https://www.amazon.com/Smead-Organized-Translucent-Project-85753/dp/B07HJTRCT7/ref=psdc_1069554_t3_B09J48GXQ 8 |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | JUNSEI | 84185-0350 | |
| Power strip | To accommodate 3 phones and one LED box, you need at least 4 outlets. | ||
| Smartphone | N/A | N/A | Minimum requirement: 12MP wide camera, 1080p HD video recording at 30fps |
| Sodium chloride(NaCl) | DAEJUNG | #7548-4100 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | YAKURI | #31727 |
References
- Pradel, E., et al. Detection and avoidance of a natural product from the pathogenic bacterium Serratia marcescens by Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (7), 2295-2300 (2007).
- Reddy, K. C., Hunter, R. C., Bhatla, N., Newman, D. K., Kim, D. H. Caenorhabditis elegans NPR-1-mediated behaviors are suppressed in the presence of mucoid bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (31), 12887-12892 (2011).
- Hao, Y., et al. Thioredoxin shapes the C. elegans sensory response to Pseudomonas produced nitric oxide. eLife. 7, 36833 (2018).
- Liu, Y., Samuel, B. S., Breen, P. C., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans pathways that surveil and defend mitochondria. Nature. 508 (7496), 406-410 (2014).
- Melo, J. A., Ruvkun, G. Inactivation of conserved C. elegans genes engages pathogen- and xenobiotic-associated defenses. Cell. 149 (2), 452-466 (2012).
- Meisel, J. D., Panda, O., Mahanti, P., Schroeder, F. C., Kim, D. H. Chemosensation of bacterial secondary metabolites modulates neuroendocrine signaling and behavior of C. elegans. Cell. 159 (2), 267-280 (2014).
- Singh, J., Aballay, A. Intestinal infection regulates behavior and learning via neuroendocrine signaling. eLife. 8, 50033 (2019).
- Lee, K., Mylonakis, E. An intestine-derived neuropeptide controls avoidance behavior in Caenorhabditis elegans. Cell Reports. 20 (10), 2501-2512 (2017).
- Singh, J., Aballay, A. Bacterial lawn avoidance and bacterial two choice preference assays in Caenorhabditis elegans. Bio-Protocol. 10 (10), 3623 (2020).
- Reddy, K. C., Andersen, E. C., Kruglyak, L., Kim, D. H. A polymorphism in npr-1 is a behavioral determinant of pathogen susceptibility in C. elegans. Science. 323 (5912), 382-384 (2009).
- de Bono, M., Bargmann, C. I. Natural variation in a neuropeptide Y receptor homolog modifies social behavior and food response in C. elegans. Cell. 94 (5), 679-689 (1998).
- Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: a technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 7 (3), 33483 (2012).
- Stroustrup, N., et al. The Caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
- Marquina-Solis, J., et al. Peptidergic signaling controls the dynamics of sickness behavior in Caenorhabditis elegans. bioRxiv. , (2022).
- Churgin, M. A., Fang-Yen, C. An imaging system for monitoring C. elegans behavior and aging. Methods in Molecular Biology. 2468, 329-338 (2022).
- Barlow, I. L., et al. Megapixel camera arrays enable high-resolution animal tracking in multiwell plates. Communications Biology. 5 (1), 253 (2022).
- Kawazoe, Y., Yawo, H., Kimura, K. D. A simple optogenetic system for behavioral analysis of freely moving small animals. Neuroscience Research. 75 (1), 65-68 (2013).
