Summary
Denne artikkelen beskriver en enkel, rimelig metode for å registrere plenen unngåelse atferd av Caenorhabditis elegans, ved hjelp av lett tilgjengelige elementer som en smarttelefon og en lysdiode (LED) lysboks. Vi tilbyr også et Python-skript for å behandle videofilen til et format som er mer egnet for telling.
Abstract
Når den blir utsatt for giftige eller patogene bakterier, viser nematoden Caenorhabditis elegans en lært plenunngåelsesadferd, der ormene gradvis forlater matkilden og foretrekker å forbli utenfor bakterieplenen. Analysen er en enkel måte å teste ormenes evne til å føle eksterne eller interne signaler for å reagere riktig på skadelige forhold. Selv om det er en enkel analyse, er telling tidkrevende, spesielt med flere prøver, og analysevarigheter som spenner over natten er ubeleilig for forskere. Et avbildningssystem som kan avbilde mange plater over en lang periode er nyttig, men kostbart. Her beskriver vi en smarttelefonbasert bildebehandlingsmetode for å registrere plenunngåelse i C. elegans. Metoden krever bare en smarttelefon og en lysdiode (LED) lysboks, for å fungere som en overført lyskilde. Ved hjelp av gratis tidsforkortede kameraprogrammer kan hver telefon vise opptil seks plater, med tilstrekkelig skarphet og kontrast til å telle ormer utenfor plenen manuelt. De resulterende filmene blir behandlet i 10 s audio video interleave (AVI) filer for hvert timetidspunkt, deretter beskåret for å vise hver enkelt plate for å gjøre dem mer mottagelige for telling. Denne metoden er en kostnadseffektiv måte for de som ønsker å undersøke unngåelsesfeil og kan potensielt utvides til andre C. elegans-analyser.
Introduction
Blant de mange fordelene ved å studere C. elegans, tilbyr det enkle nervesystemet muligheten til å studere hvordan endringer på genetisk og cellulært nivå påvirker nettverksfunksjon og atferdsutgang. Til tross for å ha et begrenset antall nevroner, viser C. elegans et bredt spekter av komplekse atferd. En av disse er plenunngåelse, der den bakterielle nematoden reagerer på en skadelig matkilde ved å forlate bakterieplenen. C. elegans unngår plener av patogene bakterier 1,2,3, plener av bakterier som produserer giftstoffer eller er pigget med giftstoffer1,4, og til og med RNAi-uttrykkende bakterier hvis målgenknockdown er skadelig for ormens helse 4,5. Studier har vist at ormer reagerer på eksterne signaler som metabolitter produsert av de patogene bakteriene 1,6, eller interne signaler som indikerer at maten gjør dem syke 4,7. Disse signalene behandles gjennom konserverte signalveier, for eksempel mitogenaktivert proteinkinase (MAPK) -banen og transformerende vekstfaktor beta (TGFβ) -banen, og krever kommunikasjon mellom tarmen og nervesystemet 4,6,7,8.
Selv om analysen er enkel, utvikler den lærte oppførselen seg over mange timer, ofte over natten. Mens det er mutanter som ikke er i stand til å forlate, i hvilket tilfelle unngåelse av å score på bare ett tidspunkt er tilstrekkelig til å demonstrere feilen, forlater mange mutanter til slutt, men er tregere til å komme ut. For disse må bevegelsen av ormene spores noen få timer, noe som kan være vanskelig å gjøre over natten. Selve tellingen tar også tid, skaper en lagtid mellom platene, og begrenser dermed antall plater som kan testes samtidig. Å bruke et bildebehandlingsoppsett for å registrere mange plater samtidig i hele analysens varighet ville være svært nyttig, men kostnaden for oppsett kan være uoverkommelig, avhengig av finansieringssituasjonen til forskningslaboratoriet.
For å løse dette utviklet vi en veldig enkel metode som bruker smarttelefoner til å registrere unngåelsesanalyser. Hver telefon kan ta opp time-lapse-videoer med opptil seks analyseplater. For å levere overført lys bruker vi en lysdiode (LED) lysboks som enkelt kan kjøpes online. Analyseplater er plassert på en forhøyet plattform, støttet av hule rektangulære tunneler, som fokuserer det innkommende lyset og skaper kontrast. Vi tilbyr også et Python-skript som konverterer videoene til AVI-filer (audio video interleave) som viser 10 s klipp av hvert timetidspunkt. Videoene blir deretter beskåret til individuelle plater og lagret i separate filer for bruk til manuell telling.
Metoden gir en rimelig prosedyre som også er ekstremt enkel å bruke, ved hjelp av varer som er lett tilgjengelige for folk flest. Her beskriver vi metoden ved hjelp av den veletablerte plenunngåelsesanalysen mot det humane patogenet Pseudomonas aeruginosa (PA14), hvis protokoll tidligere er beskrevet 2,9. Til slutt gjennomgår vi også hensynene og begrensningene til bildebehandlingsmetoden for de som ønsker å bruke den på andre C. elegans atferdseksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Oppsett av bildeapparatet (figur 1A-E)
- Forsikre deg om at et smarttelefonkamera med følgende minimumskrav er tilgjengelig:
12 megapiksler (MP) kamera
Video med 1080p-oppløsning
5 GB lagringsplass (20 min video er 3-4 GB)
Time-lapse-videoapp fra applikasjonsbutikken (gratis programmer tilgjengelig) - Plasser LED-lysboksen på nederste rille i 25 °C-inkubatoren der analysen skal finne sted.
- For å skjule det stiplede mønsteret på LED-lysoverflaten, spre to ark med vev for å dekke hele overflaten av LED-boksen.
- Lag et forhøyet stadium for prøven (figur 1A,D). Det forhøyede trinnet er et klart plastark støttet av hule rektangulære tunneler. Tunneler fungerer som en kondensator for å fokusere lys, noe som gir bedre kontrast til prøven (figur 1C). Sørg for at tunnelens vegger er noe mørke for å minimere lysspredning. Denne studien brukte brune papirbokser. Tunnelens dimensjoner er 5,5 cm x 17 cm x 4,5 cm (B x L x H). LED-lysboksen har plass til opptil fem tunneler.
- Plasser et annet stativ over scenen for å plassere telefonene for opptak (figur 1B,E). Hver telefon vil ta opp tre til seks plater (en til to rader med tre plater), så juster rackhøyden tilsvarende. Dette vil være ca. 15 cm over prøven (figur 1B).
- Sett et grenuttak inne i inkubatoren for å koble til telefonene under opptak over natten.
2. Klargjøring av buffere og medier
- Forbered M9-buffer ved å tilsette 3 g KH 2 PO 4, 6 g Na 2 HPO4 og 5 g NaCl til 1 l destillert H2O. Steriliser ved autoklavering ved 121 ° C i 20 minutter. Avkjøl bufferen og tilsett deretter 1 ml 1 M MgSO4.
- Forbered 1 M KPO 4 buffer ved å tilsette 108,3 g KH 2 PO 4 og 35,6 g K 2 HPO4 til 1 L H2O. Juster pH til 6,0 ved å legge til KOH. Steriliser ved autoklavering.
- Forbered ormblekingsoppløsning ved å blande 1 ml blekemiddel, 0,4 ml 1 M NaOH og 2,6 mlH2O.
- Forbered nematode vekstmedier (NGM) agarplater.
- Tilsett 3 g NaCl, 2,5 g bacto-pepton og 17 g bacto-agar i en 3 L-kolbe. Tilsett 975 ml destillert vann og sett inn en rørestang.
- Steriliser ved autoklavering, avkjøl deretter til 55 ° C, og tilsett 1 ml kolesterol (5 mg / ml i etanol), 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO 4 og 25 ml 1 M KPO4 buffer (pH 6,0). Rør for å blande godt. Hell i 6 cm plater. La platene tørke i minst 2 dager.
- Frø NGM-agarplater med OP50 E. coli ved å pipetere ca. 1 ml av en nattkultur av OP50 for å danne en plen av bakterier. La stå i romtemperatur (RT) til den er klar til bruk.
3. Fremstilling av høypepton NGM-plater (for PA14)
MERK: Disse platene skal lages minst 5 dager før analysen.
- Lag NGM som inneholder 0,35% pepton. Bland 0,3 g NaCl, 0,35 g bacto-pepton og 1,7 g bacto-agar i en 250 ml Erlenmeyer-kolbe. Tilsett 97,5 ml destillert vann og sett inn en rørestang.
- Dekk kolbens munning med aluminiumsfolie og autoklav ved 121 °C i 20 minutter.
- Avkjøl til 55 °C og tilsett 0,1 ml kolesterol (5 mg/ml i etanol), 0,1 ml 1 M CaCl 2, 0,1 ml 1 M MgSO 4 og2,5 ml 1 M KPO4 buffer (pH 6,0). Rør for å blande godt.
- Hell høy-pepton NGM i 35 mm petriskåler.
- Tørk platene i minst 2 dager.
4. Synkronisering av ormer ved bleking
MERK: Start dette trinnet 3 dager før analysen.
- Ta plater med gravide voksne ormer og samle dem inn i et 1,7 ml mikrorør ved å vaske platene med M9-buffer.
- Fjern så mye væske som mulig, og tilsett deretter 400 μL blekeoppløsning. Vent ca 4-5 min med intermitterende vortexing, til de voksne ormlegemene går i stykker og slipper eggene.
- Tilsett M9-buffer for å fylle resten av mikrorøret for å fortynne blekeløsningen. Spinn med maksimal hastighet (12 000 til 13 000 x g) i 1-2 s. Fjern supernatanten og vask ytterligere tre ganger med M9 buffer.
- Overfør eggene til en tom 35 mm petriskål inneholdende M9 buffer. La eggene klekkes over natten ved 20 °C. I fravær av mat vil klekkede ormer arrestere på L1 larvalstadiet, synkronisere utviklingsstadiet av alle ormer.
MERK: Belegg av 35 mm petriskål med gelatinløsning (0,05% gelatin i autoklavert vann) kan forhindre at eggene fester seg til bunnen og minimere eggtap. - Neste dag, overfør L1-trinnormer til OP50-frøede NGM-plater.
- Inkuber ormene ved 20 °C i 53-54 timer til ormene når larvstadiet L4.
5. Fremstilling av bakterier ( Pseudomonas aeruginosa, PA14)
MERK: Start dette trinnet 4 dager før analysen.
- Stripete tinte bakterier fra -80 °C på en Luria Bertani (LB) agarplate uten antibiotika og ruges over natten ved 37 °C.
MERK: Bruk alltid ferske bakterier. Stripete plater bør oppbevares ved 4 °C i høyst 1 uke. - Inokuler en enkelt koloni i 3 ml kongebuljong og vokse over natten i en 37 °C ristende inkubator.
- Neste dag frøs 7 μL av nattkulturen på NGM-platene med høy pepton og ruges ved 37 °C i 24 timer.
- Flytt de frøede platene til RT og inkuber i ytterligere 24 timer før bruk. Når du er klar, bruk platen innen de neste 24 timene.
6. Forbered deg på å spille inn
MERK: Gjør dette rett før analysen.
- Koble smarttelefonen til grenuttaket som er koblet til et strømuttak. Sørg for å deaktivere innstillingen for automatisk låsing for å forhindre at telefonen kommer tilbake til låseskjermen under opptak.
- Åpne time-lapse-kameraappen og sett intervallet for tidsforløp til 2 s. Sett videokvaliteten til 1080p ved 30 bilder per sekund.
- Plasser smarttelefonen med skjermen vendt opp for å ta opp med det bakovervendte kameraet. Kontroller skjermen for å forsikre deg om at papirbokstunnelene passer innenfor synsfeltet.
7. Analyse av unngåelse av plen
- Bruk en platinatrådplukk til å overføre 30 synkroniserte L4-trinnormer (53-54 timer fra L1) til PA14-platen. Plasser ormene midt på bakterieplenen. For hver tilstand i denne studien ble to plater testet (dvs. 60 ormer per tilstand).
- Plasser de to platene på det forhøyede trinnet i opptaksapparatet med lokket vendt ned. Siden med agar vil vende opp mot kameraet.
- På smarttelefonskjermen trykker du på hvor platen er, slik at kameraet kan fokusere på analyseplatene. Det hjelper å ha en etikett eller skrift på platen, da kameraet kan bruke det til å fokusere riktig.
MERK: Skrift på bunnen av platene forstyrrer ikke avbildning av ormer så lenge det er mot kanten. Heldigvis holder ormer seg nær plenen selv etter at de forlater, så en uhindret utsikt er bare nødvendig med det umiddelbare området rundt plenen. - Start opptaket.
- Når innspillingen har startet, legger du til flere plater på scenen. Det kan være en betydelig lagtid mellom platene på grunn av tiden det tar å overføre ormer ved å plukke. Legg merke til forsinkelsen etterpå, slik at hver tilstand kan telles på det tidspunktet den begynte.
- Ta opp i 20 timer fra det siste settet med plater plassert på scenen. I den endelige timelapse-videoen vil 20 timers opptak resultere i en 20 minutter lang video.
MERK: Det kan lønne seg å telle ormene direkte fra platene etter analysen, i hvert fall i begynnelsen for de første anledningene. Dette kan sammenlignes med verdier oppnådd gjennom videoavbildning for å sikre at de gir lignende tall.
8. Behandling av video ved hjelp av Python-skript
- Overfør filmfilen til en datamaskin for behandling. Utvidelsen vil være en MOV (iPhone) eller MP4-fil (Android).
- Bruk en Python-kode for å behandle videoene. Koden finner du på github.com/khyoon201/wormavoid.
- Hvis du vil kjøre Python-skriptene, må du kontrollere at følgende er forhåndsinstallert på datamaskinen: ffmpeg, et verktøy for konvertering av videofiler (instruksjoner for installasjon finner du på nettstedet, ffmpeg.org/download), og Python-pakkene os, pandas, tkinter og ffmpeg-python.
- Finn dimensjonene og koordinatene til hver plate ved hjelp av extract_frame.py-skriptet .
- Kjør det extract_frame.py skriptet. Et vindu vises for å velge videofilen som er lagret på datamaskinen. Etter at kjøringen er fullført, vises en jpeg-fil med samme navn i samme katalog.
- Åpne jpeg-filen i ImageJ (imagej.org).
- Fra menyen velger du Analyser > Angi mål. Kontroller at det er merket av for Vis etikett (figur 2A). Lukk vinduet.
- Bruk verktøyet for rett linje til å måle diameteren på en plate ved å tegne en linje over den, og deretter velge Analyser > mål på menyen. Hvis videoen er i 1080p, vil hver plate være omtrent 480 piksler bred. Skriv ned denne informasjonen og lukk resultatvinduet .
- Bruk flerpunktsverktøyet til å markere punkter øverst til venstre på hver plate. Disse punktene blir øvre venstre hjørne av de beskårne videoene (figur 2B). Rekkefølgen betyr noe; Merk i rekkefølge etter når platene ble startet. Når du har opprettet et punkt for alle platene, velger du Analyser > mål fra menyen. Målinger, inkludert X- og Y-koordinatene til punktene, vises i resultatvinduet.
- For å behandle flere videoer, gjenta prosessen i ImageJ med andre jpeg-filer. Alle X- og Y-koordinater vises i samme resultatvindu.
- Lagre resultatvinduet i en csv-fil. Filen skal lagres i samme katalog som filmfilene.
- Finn starttidspunktet for hver plate.
- Spill av filmen, enten på datamaskinen eller telefonen, og noter starttidene for hvert sett med plater som er plassert under kameraet.
- Åpne filen Resultater.csv med koordinatene og legg til en "start" -kolonne. For hver rad som tilsvarer individuelle plater, skriv inn riktig starttid, i sekunder, under "start" -kolonnen (f.eks. hvis starttiden er 0:00:08, skriv inn 8). Lagre.
MERK: Kolonnenavnet må være "start" (med små bokstaver, uten anførselstegn) for å bli gjenkjent av det neste skriptet for beskjæring og beskjæring.
- Beskjær og trim videoene.
- Kjør det crop_n_trim.py skriptet.
- Når du blir bedt om det, velger du filen Resultater.csv .
MERK: Kontroller at Resultater.csv filen og alle filmfilene er i samme katalog. - Angi platedimensjonene. Skriv inn bildepunktverdien som ble notert tidligere.
MERK: Skriptet vil nå lese hver rad i Resultater.csv filen for å finne riktig filmfil ved å lese filnavnet i "label"-kolonnen, og beskjære i henhold til koordinatene som er angitt i kolonnene "X" og "Y". Starttiden for hver plate bestemmes av tiden som er angitt i "start" -kolonnen. Etter at skriptet er ferdig, vises en mappe med samme navn som filmen, etterfulgt av starttidspunktet (f.eks. "Movie1_8"), der 10 s videoer som tilsvarer hvert timepunkt i analysen vil bli lagret.
9. Manuell telling ved hjelp av ImageJ
- Åpne hver AVI-fil i ImageJ.
- Tell ormene som er synlige utenfor plenen. Ormer som overlappes i én ramme, flyttes vanligvis fra hverandre i en annen ramme, slik at de kan telles riktig.
- Beregn beleggsprosenten for hvert tidspunkt:
Beleggsprosent = (totalt antall ormer - antall utenfor plenen)/totalt antall ormer
MERK: Ormene beveger seg inn og ut av plenen under videoen, men dette vil ikke endre resultatene vesentlig. Prøv å gå med tallet som ser ut til å være gjennomsnittet, eller antall ormer på det nøyaktige timepunktet (5 s inn i videoen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den første videoen produsert av manuset er 1 time fra starten av analysen. Videoen i 0 timer lagres ikke, da ormer starter analysen inne i plenen, så beleggsprosenten er alltid 100%.
Villtype N2-ormer sammenlignes med npr-1-mutanter, hvis plenunngåelsesdefekt er veletablert i litteraturen 6,10 (figur 3A-E). Som det kan ses i den ville typen, forlater ormer gradvis bakterieplenen og holder seg ute (figur 3A,B). Resultatene er plottet i en graf for å vise endringen i beleggsprosent over tid (figur 3B). Ormer utenfor er tydelig sett i videoen, men ormer inne i den tykke bakterieplenen er vanskeligere å skille (figur 3D,E). Men fordi det er nøyaktig 30 ormer i hver plate, kan antall ormer som fortsatt er inne i plenen beregnes ved å trekke de telte ormene fra totalt 30.
Selv om denne antagelsen potensielt kan introdusere tellefeil, spesielt hvis noen ormer havner nær veggene på platen der det kan være vanskelig å se, var dette ikke en betydelig bekymring. Når tellinger gjort direkte fra platene ble sammenlignet med tellinger fra avbildede ormer, viste tellinger fra avbildede ormer seg å være svært nøyaktige. Når tre forsøk for hver stamme ble gjennomsnittet sammen, ga N2- og npr-1-stammene henholdsvis 99,5% og 96,2% nøyaktighet (figur 3B,C). Merk at det var en litt høyere tendens til å savne noen få npr-1 ormer på grunn av sin høye motilitet11, mens villtype ormer hadde en tendens til å holde seg nær plenen.
Figur 1: Bildeapparat. (A) En skjematisk visning av bildeoppsettet. (B) Bildebehandlingsapparat satt opp inne i en inkubator satt til 25 ° C for PA14 plenunngåelsesanalyser. (C) Sammenligning av ormer avbildet med eller uten tunnel. (D) Et nærbilde av hvordan platene er montert på toppen av tunnelene. (E) Høyden på telefonen justeres slik at opptil seks 35 mm plater får plass i skjermen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Bestemme platekoordinater ved hjelp av ImageJ. (A) I Analyser > angi mål må det være merket av for Vis etikett (rød prikket boks). (B) En enkelt ramme hentet fra videoen brukes til å plotte koordinater som brukes til beskjæring. Punkter som er laget med flerpunktsverktøyet , er i gult. Disse fungerer som øvre venstre hjørne av de endelige beskårne videoene (merket som en stiplet hvit boks). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative bilde- og analyseresultater. (A) Etter flere timer med PA14-eksponering forlater de fleste ormer plenen og holder seg ute. (B) Representative resultater av analysen for å unngå plen. Bevegelsen av ormer følges hver time for å bestemme belegget. De åpne rutene ved 20 timers tidspunkt angir gjennomsnittsverdien bestemt fra direkte telling fra plater fra C. (C) For å vurdere nøyaktigheten av tellingene som ble gjort gjennom videoen, ble ormene også talt direkte på slutten av analysen og sammenlignet med verdiene oppnådd gjennom videoavbildning. Verdier angir ormetallene innenfor/utenfor plenen. (D,E) L4-ormer ses tydelig utenfor bakterieplenen (svart pilspiss), mens ormer inne er vanskeligere å se (hvit pilspiss). Ormer som overlappes i ett bilde, kan vanligvis skilles fra hverandre i et annet bilde fra samme film (pilspiss med svart omriss). Tallet nederst til høyre indikerer bildenummeret ut av de totale rammene i 10 s videoklippet (30 bilder / s). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Imaging dyreadferd, i stedet for å stole på direkte observasjon, er ikke bare praktisk, men har også fordelen av å forlate visuell dokumentasjon. Dette muliggjør blind analyse av en objektiv tredje person, eller kan til og med brukes til automatisert analyse ved hjelp av bildegjenkjenningsteknikker. Til tross for fordelene er standardutstyret som vanligvis tilbys høyt i pris, så man er forpliktet til oppsettet når det er kjøpt.
Bruk av smarttelefoner for å samle videoopptak av enkel C. elegans oppførsel gir flere fordeler. Det krever minimal kjennskap til teknisk kunnskap og er ekstremt enkelt å sette opp, ved hjelp av elementer som kan anskaffes enkelt og billig. En annen fordel er bærbarheten til en smarttelefon - den kan passe i små mellomrom, og siden den har egen lagring, trenger den ikke å kobles tilbake til en datamaskin. Dette gjør at oppsettet kan plasseres hvor som helst, selv når plassen er ekstremt begrenset. Det er praktisk å flytte de innspilte videofilene til datamaskinen - filene er ikke så store siden de er kodet i et komprimert MPEG-4-format. Å flytte filer er spesielt praktisk når trådløse alternativer for filoverføring er tilgjengelige.
Fordi ormene er avbildet uten forstørrelse, består ormene som er tatt i videoene, av bare noen få piksler. L4-ormer er akkurat store nok til å bli tatt uten forstørrelse, men den lille pikselstørrelsen begrenser bruken til bildegjenkjenning og bevegelsessporing av høy kvalitet. Å bruke zoomobjektivet som tilbys av nyere modeller eller feste en zoomobjektivadapter kan bidra til å få mer detaljerte bilder, selv om vi ikke har prøvd dette selv. Dette vil imidlertid også redusere synsfeltet og antall plater som kan avbildes samtidig.
For å gjøre tellingen enklere, blir videoene beskåret for å vise individuelle plater, og trimmet til 10 s videoer som tilsvarer hver time av analysen. Dette er også viktig ettersom konvertering av videoene til AVI-format øker filstørrelsen betydelig, og beskjæring og trimming av videoene sikrer at filstørrelsene er mer håndterbare. De beskårne AVI-filene kan også potensielt brukes til å telle ormene automatisk med en bildegjenkjenningsalgoritme. For villtypestammen fant vi ut at en grov form for automatisert telling er mulig i ImageJ, ved hjelp av enkel terskelverdi. Men når mutanter med mindre kroppsstørrelse brukes, gir automatiserte tellinger flere feil.
Det har vært mange forsøk på å avbilde ormer og automatisere analyser. Tradisjonelt ble ormer registrert gjennom et kamera festet til et dissekerende mikroskop, som vanligvis bare tillater avbildning av noen få ormer samtidig på grunn av det begrensede synsfeltet. Behovet for å avbilde flere ormer samtidig for høyere gjennomstrømningsanalyser presset forskere til å utvikle kreative bildebehandlingsmetoder. En måte var å bruke modifiserte planskannere til å avbilde levetidsanalyser, for eksempel WormScan eller Lifespan Machine12,13. En høyoppløselig skanner kan avbilde ormer slik at bevegelige levende ormer kan skilles fra ubevegelige døde ormer.
For å spore ormbevegelser med høyere fps-hastighet, er et kamera festet til et objektiv, og ormer avbildes uten mikroskop14,15. Churgin et al., som utviklet WorMotel14, en metode for langsiktig avbildning av individuelle ormer dyrket i en polydimetylsiloksan (PDMS) flerbrønnsplate, gir detaljerte forklaringer på faktorer du bør vurdere når du velger riktig kamera og objektiv16. Denne metoden har også den ekstra fordelen av å være relativt beskjeden i pris.
Å fange ormer uten mikroskop resulterer uunngåelig i bilder som mangler oppløsningen for detaljert analyse av ormens bevegelse eller gangart. For å bøte på dette benyttet Barlow et al. en strategi om å bruke seks kameraer arrangert i en tre av to array for å fange en enkelt 96-brønns plate17. Hvert kamera er satt opp til å vise bare fire x fire brønner av 96-brønnsplaten, noe som resulterer i en mye høyere størrelse og oppløsning på de avbildede ormene.
Fordi C. elegans har en klar kropp, må belysningen også justeres for å gi kontrast fra bakgrunnen. Vår metode brukte belysning fra en flat LED-lysboks, passert gjennom en smal tunnel for å fokusere lyset. Dimensjonene ble bestemt av størrelsen på platen som ble avbildet; Bredden på 5,5 cm passer til 35 mm-platen som brukes til unngåelsesanalysen. For å avbilde et større område må tunnelen være bredere, men vi fant ut at høyden også må økes for å oppnå samme fokuseringseffekt. Ulempen er at med høyere tunneler kan flere av veggene ses gjennom platen, og hindrer utsikten på kanten av platen. En annen strategi som kan brukes er å bruke LED-strenglys arrangert i en sirkulær ring (LED-ring). Lyset, som kommer fra mange retninger, sprer seg på overflaten av ormens kropp, og skaper lyse ormer mot en mørk bakgrunn14,16,18. Dette kan fungere ikke bare for større plater, men for bildebehandling i mindre rom som ikke passer til en LED-lysboks.
Med mange tilgjengelige bildebehandlingsstrategier utviklet av ormsamfunnet, kan forskere kanskje prøve ut noen alternativer for å finne den rette som passer deres behov. Bildebehandlingsmetoden beskrevet her er billig og tilgjengelig nok til at den enkelt kan brukes i klasserom, eller som en midlertidig løsning før du investerer i et langsiktig oppsett.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter oppgitt.
Acknowledgments
Vi takker Deok Joong Lee for kritisk lesing av manuskriptet og testing av Python-koden. Denne forskningen ble sponset av National Research Foundation of Korea 2017R1A5A2015369 (K.-h.Y.) og 2019R1C1C1008708 (K.-h.Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Petri dish | SPL | #10035 | |
| Bacto agar | BD | #214010 | |
| Bacto Peptone | BD | #211677 | |
| CaCl2 | DAEJUNG | 2507-1400 | |
| Cholesterol | BioBasic | CD0122 | |
| Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4) | JUNSEI | 84120-0350 | |
| Glycerol | BioBasic | GB0232 | |
| King B Broth | MB cell | MB-K0827 | |
| LED light box multi-pad | Artmate | N/A | This is a USB powered, LED light pad for tracing and drawing purposes. Artmate is a Korean brand, but searching for "LED light box for tracing" in any search engine should yield numerous options from other brands. Overall dimension is around 9" x 12" (A4 size). For example, from amazon US: https://www.amazon.com/LITENERGY-Ultra-Thin-Adjustable-Streaming-Stenciling/dp/B07H7FLJX1/ref=sr_1_5?crid=YMYU0VYY226R&keywords= LED%2Blight%2Bbox&qid=1674183224&sprefix =led%2Blight%2Bbo%2Caps%2C270&sr=8-5&th=1 |
| MgSO4 | DAEJUNG | 5514-4400 | |
| Plastic paper sleeve (clear) | Smead | #85753 | Any clear plastic sheet with a bit of stiffness can be used as stage. For example, from Amazon US: https://www.amazon.com/Smead-Organized-Translucent-Project-85753/dp/B07HJTRCT7/ref=psdc_1069554_t3_B09J48GXQ 8 |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | JUNSEI | 84185-0350 | |
| Power strip | To accommodate 3 phones and one LED box, you need at least 4 outlets. | ||
| Smartphone | N/A | N/A | Minimum requirement: 12MP wide camera, 1080p HD video recording at 30fps |
| Sodium chloride(NaCl) | DAEJUNG | #7548-4100 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | YAKURI | #31727 |
References
- Pradel, E., et al. Detection and avoidance of a natural product from the pathogenic bacterium Serratia marcescens by Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (7), 2295-2300 (2007).
- Reddy, K. C., Hunter, R. C., Bhatla, N., Newman, D. K., Kim, D. H. Caenorhabditis elegans NPR-1-mediated behaviors are suppressed in the presence of mucoid bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (31), 12887-12892 (2011).
- Hao, Y., et al. Thioredoxin shapes the C. elegans sensory response to Pseudomonas produced nitric oxide. eLife. 7, 36833 (2018).
- Liu, Y., Samuel, B. S., Breen, P. C., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans pathways that surveil and defend mitochondria. Nature. 508 (7496), 406-410 (2014).
- Melo, J. A., Ruvkun, G. Inactivation of conserved C. elegans genes engages pathogen- and xenobiotic-associated defenses. Cell. 149 (2), 452-466 (2012).
- Meisel, J. D., Panda, O., Mahanti, P., Schroeder, F. C., Kim, D. H. Chemosensation of bacterial secondary metabolites modulates neuroendocrine signaling and behavior of C. elegans. Cell. 159 (2), 267-280 (2014).
- Singh, J., Aballay, A. Intestinal infection regulates behavior and learning via neuroendocrine signaling. eLife. 8, 50033 (2019).
- Lee, K., Mylonakis, E. An intestine-derived neuropeptide controls avoidance behavior in Caenorhabditis elegans. Cell Reports. 20 (10), 2501-2512 (2017).
- Singh, J., Aballay, A. Bacterial lawn avoidance and bacterial two choice preference assays in Caenorhabditis elegans. Bio-Protocol. 10 (10), 3623 (2020).
- Reddy, K. C., Andersen, E. C., Kruglyak, L., Kim, D. H. A polymorphism in npr-1 is a behavioral determinant of pathogen susceptibility in C. elegans. Science. 323 (5912), 382-384 (2009).
- de Bono, M., Bargmann, C. I. Natural variation in a neuropeptide Y receptor homolog modifies social behavior and food response in C. elegans. Cell. 94 (5), 679-689 (1998).
- Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: a technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 7 (3), 33483 (2012).
- Stroustrup, N., et al. The Caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
- Marquina-Solis, J., et al. Peptidergic signaling controls the dynamics of sickness behavior in Caenorhabditis elegans. bioRxiv. , (2022).
- Churgin, M. A., Fang-Yen, C. An imaging system for monitoring C. elegans behavior and aging. Methods in Molecular Biology. 2468, 329-338 (2022).
- Barlow, I. L., et al. Megapixel camera arrays enable high-resolution animal tracking in multiwell plates. Communications Biology. 5 (1), 253 (2022).
- Kawazoe, Y., Yawo, H., Kimura, K. D. A simple optogenetic system for behavioral analysis of freely moving small animals. Neuroscience Research. 75 (1), 65-68 (2013).
