Summary
Den här artikeln beskriver en enkel, billig metod för att registrera beteendet för att undvika gräsmatta hos Caenorhabditis elegans, med hjälp av lättillgängliga föremål som en smartphone och en ljusdiod (LED) ljuslåda. Vi tillhandahåller också ett Python-skript för att bearbeta videofilen till ett format som är mer mottagligt för räkning.
Abstract
När den utsätts för giftiga eller patogena bakterier uppvisar nematoden Caenorhabditis elegans ett inlärt gräsmattundvikande beteende, där maskarna gradvis lämnar sin matkälla och föredrar att stanna utanför bakteriegräsmattan. Analysen är ett enkelt sätt att testa maskarnas förmåga att känna av externa eller interna signaler för att korrekt reagera på skadliga förhållanden. Även om det är en enkel analys är räkningen tidskrävande, särskilt med flera prover, och analyslängder som sträcker sig över natten är obekväma för forskare. Ett bildsystem som kan avbilda många plattor under lång tid är användbart men kostsamt. Här beskriver vi en smartphone-baserad bildmetod för att spela in gräsmatta undvikande i C. elegans. Metoden kräver endast en smartphone och en ljusdiod (LED) ljuslåda för att fungera som en överförd ljuskälla. Med hjälp av gratis time-lapse-kameraapplikationer kan varje telefon avbilda upp till sex plattor, med tillräcklig skärpa och kontrast för att manuellt räkna maskar utanför gräsmattan. De resulterande filmerna bearbetas till 10 s ljudvideointerfolieringsfiler (AVI) för varje timmes tidpunkt och beskärs sedan för att visa varje enskild platta för att göra dem mer mottagliga för räkning. Denna metod är ett kostnadseffektivt sätt för dem som vill undersöka undvikande defekter och kan potentiellt utvidgas till andra C. elegans-analyser.
Introduction
Bland de många fördelarna med att studera C. elegans erbjuder dess enkla nervsystem möjlighet att studera hur förändringar på genetisk och cellulär nivå påverkar nätverksfunktion och beteendeproduktion. Trots att ha ett begränsat antal nervceller, C. elegans visar ett brett spektrum av komplexa beteenden. En av dessa är gräsmatta undvikande, där den bakterivorösa nematoden svarar på en skadlig matkälla genom att lämna bakteriell gräsmatta. C. elegans undviker gräsmattor av patogena bakterier 1,2,3, gräsmattor av bakterier som producerar toxiner eller är spetsade med toxiner 1,4, och till och med RNAi-uttryckande bakterier vars målgenknockdown är skadlig för maskarnas hälsa 4,5. Studier har visat att maskar svarar på externa signaler som metaboliter som produceras av de patogena bakterierna1,6, eller interna signaler som indikerar att maten gör dem sjuka 4,7. Dessa signaler bearbetas genom bevarade signalvägar, såsom mitogenaktiverat proteinkinas (MAPK) -vägen och transformationstillväxtfaktorn beta (TGFβ) -vägen, och kräver kommunikation mellan tarmen och nervsystemet 4,6,7,8.
Även om analysen är enkel utvecklas det inlärda beteendet under många timmar, ofta över natten. Även om det finns mutanter som inte kan lämna, i vilket fall poängundvikande vid bara en tidpunkt är tillräckligt för att visa defekten, lämnar många mutanter så småningom men är långsammare att komma ut. För dessa måste maskarnas rörelse spåras med några timmars mellanrum, vilket kan vara svårt att göra över natten. Att räkna sig själv tar också tid, vilket skapar en fördröjningstid mellan plattorna och begränsar därmed antalet plattor som kan testas samtidigt. Att använda en bildinställning för att spela in många plattor samtidigt under hela analysens varaktighet skulle vara mycket användbart, men kostnaden för installationen kan vara oöverkomlig, beroende på forskningslaboratoriets finansieringssituation.
För att ta itu med detta utformade vi en mycket enkel metod som använder smartphones för att spela in undvikande analyser. Varje telefon kan spela in time-lapse-videor på upp till sex analysplattor. För att tillhandahålla överfört ljus använder vi en ljusdiod (LED) ljuslåda som enkelt kan köpas online. Analysplattor placeras på en upphöjd plattform, som stöds av ihåliga rektangulära tunnlar, som fokuserar det inkommande ljuset och skapar kontrast. Vi tillhandahåller också ett Python-skript som konverterar videorna till AVI-filer (Audio Video Interleave) som visar 10 s-klipp av varje timme. Videorna beskärs sedan till enskilda plattor och sparas i separata filer för manuell räkning.
Metoden ger en billig procedur som också är extremt lätt att använda, med hjälp av objekt som är lättillgängliga för de flesta. Här beskriver vi metoden med hjälp av den väletablerade gräsmatteundvikande analysen mot den humana patogenen Pseudomonas aeruginosa (PA14), vars protokoll tidigare har beskrivits 2,9. Slutligen granskar vi också överväganden och begränsningar av avbildningsmetoden för dem som vill tillämpa den på andra C. elegans beteendeexperiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Inställning av bildåtergivningsapparaten (figur 1A–E)
- Se till att en smarttelefonkamera med följande minimikrav är tillgänglig:
12 megapixelkamera (MP)
Video med 1080p-upplösning
5 GB lagringsutrymme (20 min video är 3-4 GB)
Time-lapse videoapp från applikationsbutiken (gratis applikationer tillgängliga) - Placera LED-ljuslådan på bottenstället på 25 °C inkubatorn där analysen kommer att äga rum.
- För att dölja det prickade mönstret på LED-ljusytan, sprid två ark vävnader för att täcka hela ytan på LED-lådan.
- Gör ett upphöjt stadium för provet (figur 1A, D). Det förhöjda steget är ett klart plastark som stöds av ihåliga rektangulära tunnlar. Tunnlar fungerar som en kondensor för att fokusera ljus, vilket ger bättre kontrast till provet (figur 1C). Se till att tunnelns väggar är något mörka för att minimera ljusspridning. Denna studie använde bruna papperslådor. Tunnelns mått är 5,5 cm x 17 cm x 4,5 cm (B x L x H). LED-ljuslådan kan passa upp till fem tunnlar.
- Placera ett annat rack ovanför scenen för att placera telefonerna för inspelning (bild 1B, E). Varje telefon spelar in tre till sex plattor (en till två rader med tre plattor), så justera rackhöjden därefter. Detta kommer att vara ungefär 15 cm över provet (figur 1B).
- Sätt en strömuttag inuti inkubatorn för att ansluta telefonerna under inspelning över natten.
2. Förberedelse av buffertar och medier
- Bered M9-buffert genom att tillsätta 3 g KH 2 PO 4, 6 g Na2HPO4 och 5 g NaCl till 1 l destillerat H2O. Sterilisera i autoklav vid121°Ci 20 minuter. Kyl bufferten och tillsätt sedan 1 ml 1 MMgSO4.
- Bered 1 M KPO 4-buffert genom att tillsätta 108,3 g KH 2 PO 4 och 35,6 g K 2 HPO 4 till 1 L H2O. Justera pH till 6,0 genom att tillsättaKOH. Sterilisera genom autoklavering.
- Förbered maskblekningslösning genom att blanda 1 ml blekmedel, 0,4 ml 1 M NaOH och 2,6 mlH2O.
- Förbered agarplattor för nematodtillväxtmedier (NGM).
- Tillsätt 3 g NaCl, 2,5 g bactopepton och 17 g bactoagar i en 3 L kolv. Tillsätt 975 ml destillerat vatten och sätt i en omrörningsstång.
- Sterilisera i autoklavering, kyl sedan till 55 °C och tillsätt 1 ml kolesterol (5 mg/ml i etanol), 1 ml 1 MCaCl2, 1 ml 1 MMgSO4 och 25 ml 1 M KPO4-buffert (pH 6,0). Rör om för att blanda väl. Häll i 6 cm tallrikar. Låt plattorna torka i minst 2 dagar.
- Utsäde NGM-agarplattor med OP50 E. coli genom pipettering av cirka 1 ml av en nattkultur av OP50 för att bilda en gräsmatta av bakterier. Låt stå i rumstemperatur (RT) tills den ska användas.
3. Beredning av NGM-plattor med hög pepton (för PA14)
OBS: Dessa plattor bör göras minst 5 dagar före analysen.
- Gör NGM som innehåller 0,35% pepton. Blanda 0,3 g NaCl, 0,35 g bactopepton och 1,7 g baktoagar i en 250 ml Erlenmeyerkolv. Tillsätt 97,5 ml destillerat vatten och sätt i en omrörningsstång.
- Täck kolvens mynning med aluminiumfolie och autoklav vid 121 °C i 20 minuter.
- Kyl ner till 55 °C och tillsätt 0,1 ml kolesterol (5 mg/ml i etanol), 0,1 ml 1 MCaCl2, 0,1 ml 1 MMgSO4 och 2,5 ml 1 M KPO4-buffert (pH 6,0). Rör om för att blanda väl.
- Häll NGM med hög pepton i 35 mm petriskålar.
- Torka plattorna i minst 2 dagar.
4. Synkronisera maskar genom blekning
Starta detta steg 3 dagar före analysen.
- Ta tallrikar med gravida vuxna maskar och samla dem i ett 1,7 ml mikrorör genom att tvätta plattorna med M9-buffert.
- Ta bort så mycket vätska som möjligt och tillsätt sedan 400 μL blekmedel. Vänta ca 4-5 min med intermittent virvelning, tills de vuxna maskkropparna bryts och släpper äggen.
- Tillsätt M9-buffert för att fylla resten av mikroröret för att späda bleklösningen. Snurra med maximal hastighet (12 000 till 13 000 x g) i 1-2 sekunder. Ta bort supernatanten och tvätta ytterligare tre gånger med M9-buffert.
- Överför äggen till en tom 35 mm petriskål som innehåller M9-buffert. Låt äggen kläckas över natten vid 20 °C. I avsaknad av mat kommer kläckta maskar att arrestera vid L1-larvstadiet och synkronisera utvecklingsstadiet för alla maskar.
OBS: Beläggning av 35 mm petriskålen med gelatinlösning (0,05% gelatin i autoklaverat vatten) kan förhindra att äggen fastnar i botten och minimera äggförlusten. - Nästa dag, överför L1-stegsmaskar till OP50-sådda NGM-plattor.
- Inkubera maskarna vid 20 °C i 53–54 timmar tills maskarna når larvstadiet L4.
5. Beredning av bakterier ( Pseudomonas aeruginosa, PA14)
Starta detta steg 4 dagar före analysen.
- Strimma tinade bakterier från -80 °C på en Luria Bertani (LB) agarplatta utan antibiotika och inkubera över natten vid 37 °C.
OBS: Använd alltid färska bakterier. Streckade plattor ska förvaras vid 4 °C i högst 1 vecka. - Inokulera en enda koloni i 3 ml King's buljong och odla över natten i en 37 ° C skakande inkubator.
- Nästa dag ympas 7 μl av nattkulturen på NGM-plattorna med hög pepton och inkuberas vid 37 °C i 24 timmar.
- Flytta de fröade plattorna till RT och inkubera i ytterligare 24 timmar före användning. När du är klar, använd plattan inom de närmaste 24 timmarna.
6. Förberedelser för inspelning
OBS: Gör detta precis före analysen.
- Anslut smarttelefonen till grenuttaget som är anslutet till ett eluttag. Se till att inaktivera inställningen för automatisk låsning för att förhindra att telefonen återgår till låsskärmen under inspelning.
- Öppna time-lapse-kameraappen och ställ in tidsfördröjningsintervallet till 2 s. Ställ in videokvaliteten på 1080p vid 30 fps.
- Placera smarttelefonen med skärmen uppåt för att spela in med den bakåtvända kameran. Kontrollera skärmen för att se till att papperslådans tunnlar passar inom synfältet.
7. Analys av gräsmatta för att undvika gräsmatta
- Använd en platinatrådplockning och överför 30 synkroniserade L4-stegsmaskar (53-54 timmar från L1) till PA14-plattan. Placera maskarna i mitten av bakteriegräsmattan. För varje tillstånd i denna studie testades två plattor (dvs 60 maskar per tillstånd).
- Placera de två plattorna på registreringsapparatens upphöjda scen med locket nedåt. Sidan med agarn kommer att vara vänd upp mot kameran.
- På smartphone-skärmen trycker du där plattan är så att kameran kan fokusera på analysplattorna. Det hjälper att ha en etikett eller skrift på plattan eftersom kameran kan använda den för att fokusera korrekt.
OBS: Skrift på botten av plattorna stör inte avbildningen av maskar så länge den är mot kanten. Lyckligtvis stannar maskar nära gräsmattan även efter att de lämnat, så en fri utsikt behövs bara över det omedelbara området som omger gräsmattan. - Starta inspelningen.
- När inspelningen har börjat, lägg till fler plattor på scenen. Det kan finnas en betydande fördröjningstid mellan plattorna på grund av den tid det tar att överföra maskar genom att plocka. Notera fördröjningstiden efteråt så att varje villkor kan räknas när det började.
- Spela in i 20 timmar från den sista uppsättningen plattor som placerades på scenen. I den slutliga time-lapse-videon kommer 20 timmars inspelning att resultera i en 20 min lång video.
OBS: Det kan vara värt att räkna maskarna direkt från plattorna efter analysen, åtminstone i början för de första tillfällena. Detta kan jämföras med värden som erhållits genom videoavbildning för att säkerställa att de ger liknande siffror.
8. Bearbetning av video med Python-skript
- Överför filmfilen till en dator för bearbetning. Tillägget kommer att vara en MOV (iPhone) eller MP4-fil (Android).
- Använd en Python-kod för att bearbeta videorna. Koden finns på github.com/khyoon201/wormavoid.
- För att köra Python-skripten, se till att följande är förinstallerade på datorn: ffmpeg, ett verktyg för att konvertera videofiler (anvisningar för installation finns på dess webbplats, ffmpeg.org/download) och Python-paketen os, pandas, tkinter och ffmpeg-python.
- Hitta måtten och koordinaterna för varje platta med hjälp av skriptet extract_frame.py .
- Kör skriptet extract_frame.py . Ett fönster visas för att välja videofilen som är lagrad på datorn. När körningen är klar visas en jpeg-fil med samma namn i samma katalog.
- Öppna jpeg-filen i ImageJ (imagej.org).
- På menyn väljer du Analysera > Ange mått. Kontrollera att rutan Visningsetikett är markerad (bild 2A). Stäng fönstret.
- Använd verktyget Rak linje och mät diametern på en platta genom att rita en linje över den och sedan välja Analysera > mäta på menyn. Om videon är i 1080p kommer varje platta att vara cirka 480 pixlar bred. Skriv ner den här informationen och stäng fönstret Resultat .
- Använd flerpunktsverktyget och markera punkter längst upp till vänster på varje platta. Dessa punkter blir det övre vänstra hörnet av de beskurna videorna (figur 2B). Ordningen är viktig; Markera i ordning efter när plattorna startades. När du har skapat en punkt för alla plattor väljer du Analysera > mäta på menyn. Mått, inklusive x- och y-koordinaterna för punkterna, visas i fönstret Resultat.
- För att bearbeta flera videor, upprepa processen i ImageJ med andra jpeg-filer. Alla X- och Y-koordinater visas i samma resultatfönster .
- Spara resultatfönstret i en csv-fil. Filen ska sparas i samma katalog som filmfilerna.
- Hitta starttiden för varje platta.
- Spela filmen, antingen på datorn eller telefonen, och notera starttiderna för varje uppsättning plattor placerade under kameran.
- Öppna filen Resultat.csv med koordinaterna och lägg till en "start" -kolumn. För varje rad som motsvarar enskilda skyltar anger du lämplig starttid i sekunder under kolumnen "start" (t.ex. om starttiden är 0:00:08 anger du 8). Spara.
OBS: Kolumnnamnet måste vara "start" (i gemener, utan citattecken) för att kännas igen av nästa skript för beskärning och trimning.
- Beskär och trimma videorna.
- Kör skriptet crop_n_trim.py .
- När du uppmanas till det väljer du filen Resultat.csv .
Se till att Results.csv filen och alla filmfiler finns i samma katalog. - Ange plattans mått. Ange pixelvärdet som antecknades tidigare.
Skriptet läser nu varje rad i filen Resultat.csv för att hitta rätt filmfil genom att läsa filnamnet i kolumnen "etikett" och beskära enligt koordinaterna som anges i kolumnerna "X" och "Y". Starttiden för varje platta bestäms av den tid som anges i kolumnen "start". När skriptet har körts visas en mapp med samma namn som filmen, följt av starttiden (t.ex. "Movie1_8"), där 10 s-videor som motsvarar varje timtid för analysen sparas.
9. Manuell räkning med ImageJ
- Öppna varje AVI-fil i ImageJ.
- Räkna maskarna som är synliga utanför gräsmattan. Maskar som överlappar varandra i en ram flyttas vanligtvis isär i en annan ram så att de kan räknas korrekt.
- Beräkna beläggningsgraden för varje tidpunkt:
Beläggningsgrad = (totalt antal maskar - antal maskar utanför gräsmattan)/totalt antal maskar
OBS: Maskarna kommer att röra sig in och ut ur gräsmattan under videon, men detta kommer inte att väsentligt förändra resultaten. Försök att gå med det nummer som verkar vara genomsnittet, eller antalet maskar vid den exakta timtiden (5 s in i videon).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den första videon som produceras av manuset är 1 h från början av analysen. Videon i 0 timmar sparas inte, eftersom maskar startar analysen inuti gräsmattan, så beläggningsgraden är alltid 100%.
Vildtyp N2-maskar jämförs med npr-1-mutanter, vars gräsmatta undvikande defekt är väl etablerad i litteraturen 6,10 (figur 3A-E). Som framgår av den vilda typen lämnar maskar gradvis bakteriegräsmattan och stannar utanför (figur 3A, B). Resultaten ritas i ett diagram för att visa förändringen i beläggningsgrad över tid (figur 3B). Maskar utanför syns tydligt i videon, men maskar inuti den tjocka bakteriegräsmattan är svårare att urskilja (figur 3D,E). Men eftersom det finns exakt 30 maskar i varje platta kan antalet maskar som fortfarande är inne i gräsmattan beräknas genom att subtrahera de räknade maskarna från totalt 30.
Även om detta antagande potentiellt kan införa räknefel, särskilt om vissa maskar hamnar nära plattans väggar där det kan vara svårt att se, var detta inte ett betydande problem. När räkningar gjorda direkt från plattorna jämfördes med räkningar från avbildade maskar, visade sig räkningar från avbildade maskar vara mycket exakta. När tre försök för varje stam medelvärde beräknades tillsammans gav N2- och npr-1-stammarna 99,5% respektive 96,2% noggrannhet (figur 3B, C). Observera att det fanns en något högre tendens att missa några npr-1-maskar på grund av dess höga rörlighet11, medan vildtypsmaskar tenderade att stanna nära gräsmattan.
Figur 1: Bildåtergivningsapparat . (A) En schematisk bild av bildbehandlingsinställningen. b) Bildåtergivningsapparat inrättad i en inkubator inställd på 25 °C för PA14-tester för undvikande av gräsmatta. (C) Jämförelse av maskar avbildade med eller utan tunneln. (D) En närbild av hur plattorna är monterade ovanpå tunnlarna. (E) Telefonens höjd justeras så att upp till sex 35 mm plattor får plats på skärmen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Bestämning av plattkoordinater med hjälp av ImageJ. (A) I Analysera > Ställ in mått måste rutan Displayetikett vara markerad (röd prickad ruta). (B) En enda bildruta extraherad från videon används för att rita koordinater som används för beskärning. Punkter som görs med flerpunktsverktyget är gula. Dessa fungerar som de övre vänstra hörnen av de slutliga beskurna videorna (markerade som en prickad vit ruta). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Representativa bild- och analysresultat. (A) Efter flera timmars PA14-exponering lämnar de flesta maskar gräsmattan och stannar ute. (B) Representativa resultat av testet för undvikande av gräsmatta. Maskarnas rörelse följs varje timme för att bestämma beläggningsgraden. De öppna rutorna vid 20 timmars tidpunkt anger medelvärdet bestämt genom direkt räkning från plattor från C. (C) För att bedöma noggrannheten i de räkningar som gjordes genom videon räknades maskarna också direkt i slutet av analysen och jämfördes med de värden som erhållits genom videoavbildning. Värden anger masknumren innanför/utanför gräsmattan. (D,E) L4-maskar ses tydligt utanför bakteriegräsmattan (svart pilspets), medan maskar inuti är svårare att se (vit pilspets). Maskar som överlappar varandra i en bildruta kan vanligtvis skiljas åt i en annan bildruta från samma film (svart konturpilspets). Siffran längst ned till höger anger bildrutenumret av de totala bildrutorna i 10 s-videoklippet (30 bilder/s). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Att avbilda djurbeteende, snarare än att förlita sig på direkt observation, är inte bara bekvämt utan har också fördelen att lämna visuell dokumentation. Detta möjliggör blindanalys av en objektiv tredje person, eller kan till och med användas för automatiserad analys med hjälp av bildigenkänningstekniker. Trots fördelarna är standardutrustningen som vanligtvis erbjuds hög i kostnad, så man är engagerad i installationen när den har köpts.
Att använda smartphones för att samla in videoinspelningar av enkla C. elegans beteende erbjuder flera fördelar. Det kräver minimal förtrogenhet med teknisk kunskap och är extremt lätt att installera, med hjälp av föremål som kan anskaffas enkelt och billigt. En annan fördel är bärbarheten hos en smartphone - den kan passa i små utrymmen, och eftersom den har sin egen lagring behöver den inte anslutas tillbaka till en dator. Detta gör att installationen kan placeras var som helst, även när utrymmet är extremt begränsat. Att flytta inspelade videofiler till datorn är bekvämt - filerna är inte så stora eftersom de är kodade i ett komprimerat MPEG-4-format. Att flytta filer är särskilt praktiskt när trådlösa alternativ för filöverföring är tillgängliga.
Eftersom maskarna avbildas utan förstoring består maskarna som fångas i videorna bara av några pixlar. L4-maskar är bara tillräckligt stora för att fångas utan förstoring, men den lilla pixelstorleken begränsar dess användning för högkvalitativ bildigenkänning och rörelsespårning. Att använda zoomobjektivet som erbjuds av nyare modeller eller fästa en zoomobjektivadapter kan hjälpa till att få mer detaljerade bilder, även om vi inte har provat detta själva. Detta skulle dock också minska synfältet och antalet plattor som kan avbildas samtidigt.
För att göra räkningen enklare beskärs videorna för att visa enskilda plattor och trimmas till 10 s videor som motsvarar varje timme av analysen. Detta är också viktigt eftersom konvertering av videorna till AVI-format ökar filstorleken avsevärt, och beskärning och trimning av videorna säkerställer att filstorlekarna blir mer hanterbara. De beskurna AVI-filerna kan också potentiellt användas för att räkna maskarna automatiskt med en bildigenkänningsalgoritm. För vildtypsstammen fann vi att en grov form av automatiserad räkning är möjlig i ImageJ, med enkel tröskel. Men när mutanter med mindre kroppsstorlek används, ger automatiserade räkningar fler fel.
Det har gjorts många ansträngningar för att avbilda maskar och automatisera analyser. Traditionellt spelades maskar in genom en kamera fäst vid ett dissekeringsmikroskop, vilket vanligtvis bara tillåter avbildning av några maskar samtidigt på grund av dess begränsade synfält. Behovet av att avbilda fler maskar samtidigt för högre genomströmningsanalyser drev forskare att utveckla kreativa bildmetoder. Ett sätt var att använda modifierade flatbäddsskannrar för att avbilda livslängdsanalyser, till exempel WormScan eller Lifespan Machine12,13. En högupplöst skanner kan avbilda maskar så att rörliga levande maskar kan särskiljas från orörliga döda maskar.
För att spåra maskrörelser med högre fps-hastighet är en kamera ansluten till en lins och maskar avbildas utan mikroskop14,15. Churgin et al., som utvecklade WorMotel14, en metod för långsiktig avbildning av enskilda maskar odlade i en polydimetylsiloxan (PDMS) flerbrunnsplatta, ger detaljerade förklaringar om faktorer att tänka på när du väljer rätt kamera och objektiv16. Denna metod har också den extra fördelen att den är relativt blygsam i kostnad.
Att fånga maskar utan mikroskop resulterar oundvikligen i bilder som saknar upplösningen för detaljerad analys av maskens rörelse eller gång. För att råda bot på detta använde Barlow et al. en strategi att använda sex kameror arrangerade i en tre och två matris för att fånga en enda 96-brunnsplatta17. Varje kamera är inställd på att avbilda endast fyra x fyra brunnar på 96-brunnsplattan, vilket resulterar i en mycket högre storlek och upplösning av de avbildade maskarna.
Eftersom C. elegans har en klar kropp måste belysningen också justeras för att ge kontrast från bakgrunden. Vår metod använde belysning från en platt LED-ljuslåda, passerade genom en smal tunnel för att fokusera ljuset. Måtten bestämdes av storleken på den avbildade plattan; Bredden på 5,5 cm passar 35 mm-plattan som används för undvikande analys. För att avbilda ett större område måste tunneln vara bredare, men vi fann att höjden också måste ökas för att få samma fokuseringseffekt. Nackdelen är att med högre tunnlar kan fler av väggarna ses genom plattan, vilket hindrar utsikten vid plattans kant. En annan strategi som kan användas är att använda LED-stränglampor anordnade i en cirkulär ring (LED-ring). Ljuset, som kommer från många håll, sprider sig på ytan av maskens kropp och skapar ljusmaskar mot en mörk bakgrund14,16,18. Detta kan fungera inte bara för större plattor, utan för avbildning i mindre utrymmen som inte kan passa en LED-ljuslåda.
Med många tillgängliga bildstrategier som utvecklats av masksamhället kanske forskare vill prova några alternativ för att hitta rätt som passar deras behov. Bildmetoden som beskrivs här är billig och lättillgänglig nog att den enkelt kan användas i grundutbildningsklassrum eller som en tillfällig lösning innan du investerar i en långsiktig installation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklarerade.
Acknowledgments
Vi tackar Deok Joong Lee för kritisk läsning av manuskriptet och testning av Python-koden. Denna forskning sponsrades av National Research Foundation of Korea 2017R1A5A2015369 (K.-h.Y.) och 2019R1C1C1008708 (K.-h.Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Petri dish | SPL | #10035 | |
| Bacto agar | BD | #214010 | |
| Bacto Peptone | BD | #211677 | |
| CaCl2 | DAEJUNG | 2507-1400 | |
| Cholesterol | BioBasic | CD0122 | |
| Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4) | JUNSEI | 84120-0350 | |
| Glycerol | BioBasic | GB0232 | |
| King B Broth | MB cell | MB-K0827 | |
| LED light box multi-pad | Artmate | N/A | This is a USB powered, LED light pad for tracing and drawing purposes. Artmate is a Korean brand, but searching for "LED light box for tracing" in any search engine should yield numerous options from other brands. Overall dimension is around 9" x 12" (A4 size). For example, from amazon US: https://www.amazon.com/LITENERGY-Ultra-Thin-Adjustable-Streaming-Stenciling/dp/B07H7FLJX1/ref=sr_1_5?crid=YMYU0VYY226R&keywords= LED%2Blight%2Bbox&qid=1674183224&sprefix =led%2Blight%2Bbo%2Caps%2C270&sr=8-5&th=1 |
| MgSO4 | DAEJUNG | 5514-4400 | |
| Plastic paper sleeve (clear) | Smead | #85753 | Any clear plastic sheet with a bit of stiffness can be used as stage. For example, from Amazon US: https://www.amazon.com/Smead-Organized-Translucent-Project-85753/dp/B07HJTRCT7/ref=psdc_1069554_t3_B09J48GXQ 8 |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | JUNSEI | 84185-0350 | |
| Power strip | To accommodate 3 phones and one LED box, you need at least 4 outlets. | ||
| Smartphone | N/A | N/A | Minimum requirement: 12MP wide camera, 1080p HD video recording at 30fps |
| Sodium chloride(NaCl) | DAEJUNG | #7548-4100 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | YAKURI | #31727 |
References
- Pradel, E., et al. Detection and avoidance of a natural product from the pathogenic bacterium Serratia marcescens by Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (7), 2295-2300 (2007).
- Reddy, K. C., Hunter, R. C., Bhatla, N., Newman, D. K., Kim, D. H. Caenorhabditis elegans NPR-1-mediated behaviors are suppressed in the presence of mucoid bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (31), 12887-12892 (2011).
- Hao, Y., et al. Thioredoxin shapes the C. elegans sensory response to Pseudomonas produced nitric oxide. eLife. 7, 36833 (2018).
- Liu, Y., Samuel, B. S., Breen, P. C., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans pathways that surveil and defend mitochondria. Nature. 508 (7496), 406-410 (2014).
- Melo, J. A., Ruvkun, G. Inactivation of conserved C. elegans genes engages pathogen- and xenobiotic-associated defenses. Cell. 149 (2), 452-466 (2012).
- Meisel, J. D., Panda, O., Mahanti, P., Schroeder, F. C., Kim, D. H. Chemosensation of bacterial secondary metabolites modulates neuroendocrine signaling and behavior of C. elegans. Cell. 159 (2), 267-280 (2014).
- Singh, J., Aballay, A. Intestinal infection regulates behavior and learning via neuroendocrine signaling. eLife. 8, 50033 (2019).
- Lee, K., Mylonakis, E. An intestine-derived neuropeptide controls avoidance behavior in Caenorhabditis elegans. Cell Reports. 20 (10), 2501-2512 (2017).
- Singh, J., Aballay, A. Bacterial lawn avoidance and bacterial two choice preference assays in Caenorhabditis elegans. Bio-Protocol. 10 (10), 3623 (2020).
- Reddy, K. C., Andersen, E. C., Kruglyak, L., Kim, D. H. A polymorphism in npr-1 is a behavioral determinant of pathogen susceptibility in C. elegans. Science. 323 (5912), 382-384 (2009).
- de Bono, M., Bargmann, C. I. Natural variation in a neuropeptide Y receptor homolog modifies social behavior and food response in C. elegans. Cell. 94 (5), 679-689 (1998).
- Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: a technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 7 (3), 33483 (2012).
- Stroustrup, N., et al. The Caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
- Marquina-Solis, J., et al. Peptidergic signaling controls the dynamics of sickness behavior in Caenorhabditis elegans. bioRxiv. , (2022).
- Churgin, M. A., Fang-Yen, C. An imaging system for monitoring C. elegans behavior and aging. Methods in Molecular Biology. 2468, 329-338 (2022).
- Barlow, I. L., et al. Megapixel camera arrays enable high-resolution animal tracking in multiwell plates. Communications Biology. 5 (1), 253 (2022).
- Kawazoe, Y., Yawo, H., Kimura, K. D. A simple optogenetic system for behavioral analysis of freely moving small animals. Neuroscience Research. 75 (1), 65-68 (2013).
