Summary
Vi beskriver en protokol til isolering af murin, tyndtarmkrypter og dyrkning af intestinale 3D-organoider fra krypterne. Derudover beskriver vi en metode til at generere organoider fra en enkelt tarmstamcelle i fravær af en subepitelcellulær niche.
Abstract
På nuværende tidspunkt udgør organoidkultur et vigtigt redskab til in vitro-undersøgelser af forskellige biologiske aspekter og sygdomme i forskellige organer. Murin tyndtarmkrypter kan danne organoider, der efterligner tarmepitelet, når de dyrkes i en 3D ekstracellulær matrix. Organoiderne er sammensat af alle celletyper, der opfylder forskellige intestinale homeostatiske funktioner. Disse omfatter Paneth-celler, enteroendokrine celler, enterocytter, bægerceller og tuftceller. Velkarakteriserede molekyler tilsættes i kulturmediet for at berige tarmstamcellerne (ISC'er) mærket med leucinrige gentagelser indeholdende G-proteinkoblet receptor 5 og bruges til at drive differentiering ned ad specifikke slægter; disse molekyler omfatter epidermal vækstfaktor, Noggin (et knoglemorfogenetisk protein) og R-spondin 1. Derudover er en protokol til generering af organoider fra en enkelt erythropoietinproducerende hepatocellulær receptor B2 (EphB2)-positiv ISC også detaljeret. I denne metodeartikel beskrives teknikker til isolering af tyndtarmskrypter og en enkelt ISC fra væv og sikring af effektiv etablering af organoider.
Introduction
Intestinale organoider, som først blev etableret i 2009, har vist sig som et kraftfuldt in vitro-værktøj til at studere tarmbiologi på grund af deres morfologiske og funktionelle lighed med modne væv. For nylig har teknologiske fremskridt inden for dyrkede organoider afledt af stamceller fra voksenvæv muliggjort langsigtet dyrkning af tarmstamceller (ISC'er) med selvfornyelses- og differentieringspotentiale. Disse organoider er blevet anvendt i vid udstrækning til grundlæggende og translationelle forskningsundersøgelser af gastrointestinal fysiologi og patofysiologi 1,2,3,4,5,6. De 3D-organoider, der er udviklet af Clevers-gruppen, giver et kraftfuldt værktøj til at studere tarmepitelet med forbedret fysiologisk relevans7. Da intestinale organoider er afledt af vævsstamceller og består af flere celletyper, rekapitulerer de funktionaliteten af tarmepitelet. Bemærk, at en enkeltsorteret leucinrig gentagelsesholdig G-proteinkoblet receptor 5-positiv (Lgr5+) stamcelle også kan generere 3D-organoider uden nogen Paneth-celler eller en ISC-niche såsom epitelnichen eller stromalnichen7. Imidlertid er den organoiddannende kapacitet for enkeltsorterede Lgr5+ celler lav sammenlignet med krypt- og ISC-paneth-celledubletter8.
Et stigende antal undersøgelser har vist, at metoderne til ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) inkubation eller kollagenasedissociation forårsager løsning i epitelet og frigivelse af krypter. Da enzymatisk dissociation kan have en effekt på krypternes celletilstand, anvendes normalt en mekanisk isoleringsmetode til at dissociere vævet. Selvom mekanisk fordøjelse er en hurtig teknik, kan denne metode være forbundet med inkonsekvente kryptudbytter eller dårlig cellelevedygtighed9. Derfor kan EDTA-behandling og mekanisk dissociation kombineres for at generere bedre kryptudbytter. Et træk ved metoden vist i denne artikel er brugen af kraftig omrystning af vævsfragmenterne efter EDTA-chelation10. Kraftig omrystning tillader effektiv isolering af krypter fra krypt-villus-komplekser i tyndtarmen. Graden af manuel omrystning bestemmer adskillelsen. Således er opnåelse af krypter fra komplekser vigtigt for eksperimenter på dette område. Derudover kan korrekt dygtighed reducere villusforurening til et minimum og øge antallet af krypter.
Derfor kan denne eksperimentelle protokol, der anvender murinafledte tyndtarmorganoider, bedre isolere krypter med fysisk kraft efter behandling med EDTA til dissociation. Det er kendt, at ekspressionsmønsteret af erythropoietinproducerende hepatocellulær receptor B2 (EphB2) delvis afspejler kryptmiljøet. For eksempel er EphB2-positive celler organiseret fra bund til top11. Fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) blev udført baseret på EphB2-ekspressionen, og de opnåede celler blev opdelt i fire grupper: EphB2høj, EphB2med, EphB2lav og EphB2neg. Derefter blev organoidvæksten fra enkeltsorterede EphB2høje celler i vildtypemus (WT) demonstreret.
Protocol
Alle museforsøg blev godkendt af Suntory Animal Ethics Committee (APRV000561), og alle dyr blev opretholdt i overensstemmelse med komitéens retningslinjer for pasning og brug af forsøgsdyr. Der blev anvendt en standard WT-stamme af Mus musculus (C57BL6/J). Både han- og hunmus fra 10 uger til 20 uger blev brugt. Musene blev aflivet med CO2 kvælning.
1. Isolering af tyndtarmen
- Punktafgifter tyndtarmen, herunder tolvfingertarmen og den proksimale halvdel af jejunum, med laboratoriesaks.
- Overfør vævet til en petriskål, og skyl tyndtarmen med 5 ml kold PBS-ABx (PBS + penicillin-streptomycin [1%] + gentamicin [0,5%]) i en 5 ml sprøjte for at fjerne luminalindholdet.
- Skær vævet åbent på langs med laboratoriesaks, og vask manuelt med kold PBS-ABx, mens du ryster.
BEMÆRK: Ved at skrabe villi ud med et dias kan villusforurening reduceres12. - Saml ca. 5 mm x 5 mm stykker af tarmsegmentet ved hjælp af laboratoriesaks. Overfør fragmenterne til et 50 ml rør med pincet, og tilsæt 25 ml kold PBS-ABx.
- Fragmenterne vaskes ved at omrøre 10x frem og tilbage med 25 ml kold PBS-ABx for at fjerne tarmindholdet i 50 ml røret.
2. Krypt isolering
- Stykkerne inkuberes i PBS-ABx indeholdende 2 mM EDTA i 30 minutter på is uden omrystning.
- For let størkning af den ekstracellulære matrix (ECM) inkuberes en 24-brønds plade i en 37 °C vævskulturinkubator på forhånd.
- Opsug EDTA-opløsningen fra cellekultursystemet med en vakuumpumpe, tilsæt 25 ml frisk, kold PBS-ABx, og ryst derefter stykkerne kraftigt op og ned i hånden 30x-40x for at frigøre krypt-villus-komplekserne.
BEMÆRK: De adskilte krypter og villi kan kontrolleres ved mikroskopisk observation af en 25 μL dråbe fra suspensionen ved 4x forstørrelse. - Derefter filtreres suspensionen gennem en 70 μm sil en gang.
- Suspensionen centrifugeres ved 390 × g i 3 minutter ved 4 °C.
- Kryptpellet resuspenderes i 20 ml sorbitol DMEM (avanceret DMEM / F12 + penicillin-streptomycin [1%] + gentamicin [0,5%] + føtalt bovint serum [1%] + sorbitol [2%]) med pipettering, og overfør kryptsuspensionen til to nye 15 ml rør til opdeling i to 10 ml opløsninger til centrifugering ved lav hastighed.
BEMÆRK: Den store cellemasse og celler/snavs kan adskilles ved hjælp af lavhastighedscentrifugering. Den store cellemasse er i pelleten, og celler/snavs er i supernatanten. - De to kryptsuspensioner centrifugeres ved 80 × g i 3 minutter ved 4 °C, hvorefter supernatanten suges forsigtigt.
BEMÆRK: Da pelletdannelsen er svag, må du ikke aspirere for meget. Der efterlades 2 ml supernatant i hvert glas. - Tilsæt 10 ml sorbitol DMEM til hvert rør igen. Suspensionen centrifugeres ved 80 × g i 3 minutter ved 4 °C.
- Efter opsugning af supernatanten, hvor der efterlades 2 ml supernatant i hvert glas, tilsættes 10 ml sorbitol DMEM til resuspension, og kryptsuspensionen centrifugeres ved 80 × g i de sidste 3 minutter ved 4 °C.
- Efter opsugning af supernatanten, hvor der efterlades 2 ml supernatant i hvert glas, tilsættes 10 ml komplet DMEM (avanceret DMEM/F12 + penicillinstreptomycin [1%] + gentamicin [0,5%] + føtalt bovint serum [1%]) til resuspension af pelleten ved pipettering op og ned, og lad det stå i 1 min.
BEMÆRK: Vent i 1 minut for at få de flydende krypter effektivt. - Efter 1 minut opsamles hver 10 ml suspension i alt 20 ml og filtreres en gang med en 70 μm cellesi for at rense krypterne.
- Før såning af hovedsageligt rene krypter tælles antallet af krypter i den filtrerede komplette DMEM, og centrifugeres derefter ved 290 × g i 3 minutter ved 4 °C.
- Dryp 25 μL dråber i en 6 cm skål på tre punkter. Tæl antallet af krypter under et mikroskop ved 4x forstørrelse, og beregn koncentrationen af krypter pr. 25 μL dråbe.
- Suspender 100 krypter med 40 μL ECM pr. Brønd. Pipet op og ned 5x-10x for at opnå en homogen suspension af krypter i ECM, og derefter frø i en 37 °C forvarmet 24-brønds plade.
BEMÆRK: Hold altid ECM på is for at undgå polymerisation. Pipetten pipetteres omhyggeligt for at undgå at lave luftbobler i ECM. - Der inkuberes 24-brøndpladen i 15 minutter i en 5 % CO2 -inkubator med 37 °C til polymerisation af ECM.
- Endelig dækkes ECM med 500 μL dyrkningsmedium indeholdende museepidermal vækstfaktor (EGF), rekombinant mus R-spondin 1 og rekombinant muse Noggin ved stuetemperatur. Den endelige koncentration af materialer pr. brønd er som følger: penicillin-streptomycin (1%), 50 E / ml hver; gentamicin (0,5%), 25 μg/ml; EGF, 20 ng/ml Noggin, 100 ng/ml; R-spondin 1, 500 ng / ml; L-glutamin, 2 mM.
- Start kryptkulturen ved 37 °C i en 5% CO2 inkubator.
BEMÆRK: For dyrkningsmediet for organoider i en plade med 24 brønde, se tabel 1. - Udfør langsigtet levende billeddannelse for at observere organoid morfogenese med et optagelses time-lapse-billedmikroskop udstyret med et 20x mål hver 3. time i op til 7 dage. Hent serielle z-stablede billeder ved z-trin på 1 μm (1 μm x fem trin).
- Skift mediet hver anden dag.
3. Fluorescensaktiveret cellesortering (FACS)
- Isoler krypter fra musene (se punkt 2).
- De isolerede krypter behandles med 2 ml trypsin i 30 minutter ved 37 °C.
- Stop reaktionen med 10 ml PBS, og passér derefter gennem en 20 μm cellesi.
- Opløsningen centrifugeres ved 390 × g i 3 minutter ved 4 °C, og opslæmmes igen med 100 μl komplet DMEM.
- Der tilsættes anti-EphB2 APC-konjugeret antistof (1/50), og inkuberes i 30 minutter på is.
- Vask cellerne 3x med PBS, og tilsæt til sidst 7-amino-actinomycin D (7-AAD) (1/100).
- Sorter de farvede celler via FACS.
- Juster områdeskaleringsfaktoren, og sorter efter cellestørrelse (fremadrettet spredning, FSC-A) versus granularitet (sidespredning, SSC-A).
- Sorter 7-AAD negative og positive celler for levedygtighed med laseren indstillet til en bølgelængde på 488 nm og 50 mV effekt.
- Afgræns portene for at sortere EphB2-høj (EphB2høj), EphB2-medium (EphB2 med), EphB2-lav (EphB2lav) og EphB2-negativ (EphB2neg) cellermed laseren indstillet til en bølgelængde på 640 nm og 100 mV effekt.
- StartEphB2 højcellekulturen ved 37 °C i en 5% CO2 inkubator.
4. Enkeltcellede dyrkede organoider
- Udfør celleisoleringsmetoden i henhold til graduerede EphB2-overfladeniveauer11, og opnå derefter fire forskellige populationer (høj, medium, lav og negativ).
- Opsamles, pellet med centrifugering ved 390 × g i 3 minutter ved 4 °C, og de enkeltsorterede EphB2-høje celler indlejres i ECM ved pipettering efterfulgt af såning på en plade med 24 huller (100 singlets/40 μL ECM/brønd).
- Som i trin 2.14 skal du lade ECM polymerisere og dække ECM med et dyrkningsmedium indeholdende en Rho-associeret kinase (ROCK) hæmmer (10 μM) i de første 2 dage for at opretholde EphB2-høje celler.
BEMÆRK: ROCK-hæmmeren er effektiv mod anoikis. - Kontroller cellerne manuelt ved hjælp af et omvendt mikroskop ved 40x forstørrelse, og observer levedygtige organoider med sfærisk dannelse og kryptfremspring.
Representative Results
For at generere tyndtarmsorganoider hos mus kan en kombination af EDTA-behandling og en mekanisk isoleringsmetode bruges til effektivt at isolere krypter10,13. Resultaterne af denne undersøgelse viste, at næsten alle de isolerede krypter straks blev forseglet og syntes kegleformede, efter at de blev presset ud af epitelnicherne (figur 1A). For at minimere villusforurening blev den resulterende suspension passeret gennem en 70 μm cellesil, og derefter blev filtratet centrifugeret. Da nogle krypter forstyrres under filtrering og suspension, skal disse trin udføres omhyggeligt. Resultaterne viste, at næsten alle krypter i den endelige fraktion var integrerede og egnede til brug i kultur (figur 1B). For at visualisere alle de belagte krypter individuelt blev 100 krypter pr. Brønd belagt (figur 1C). Efter tilsætning af det specifikke kryptkulturmedium (figur 1D) blev udviklingen af organoider overvåget med et mikroskop dagligt. Desuden blev organoidvækst fra krypterne observeret ved time-lapse-billeder for at overvåge deres udvikling (figur 1E og supplerende video S1). De kultiverede krypter opførte sig på en stereotyp måde. Organoidens indre lumen blev fyldt med en masse apoptotiske celler. Aktiv spredning og differentiering af ISC'er forekom i kryptområdet med spirende (figur 1E og supplerende video S1). Spirende blev kombineret med ISC-migration og spredning og Paneth-celledifferentiering. De differentierede Paneth-celler var altid placeret på det spirende sted (supplerende figur S1). Da organoiderne blev bekræftet at være stabile i kultur ved hjælp af et omvendt mikroskop ved 10x forstørrelse, kunne teknikken bruges til at undersøge kryptdannelse i tyndtarmen under udvikling og til at bestemme kapaciteten til vævsregenerering og ISC langsigtet overlevelse til produktion af nye tarmepitelceller14,15,16.
Lgr5 er defineret som en ISC-markør, og murin Lgr5+-celler danner 3D-organoider7. Men da celleoverfladetætheden af LGR5-protein er lav, og der mangler anti-LGR5-antistoffer med høj affinitet, er det udfordrende effektivt at isolere murin ISC'er ved hjælp af FACS. EphB2 er tidligere blevet identificeret som overflademarkør for oprensning af murin og humane ISC'er fra tarmvæv17,18. Ekspressionsmønsteret for EphB2 øger kompleksiteten involveret i ISC-markører. EphB2-positive celler er organiseret i hele det proliferative rum og topper i bunden af krypterne, mens de falder i en gradient mod toppen af krypterne11. Panethceller og stamceller er også lokaliseret i krypten. Panethceller udtrykker hovedsageligt EphB3, hvilket er nødvendigt for deres positionering, og stamcellerne over dem i krypten udtrykker hovedsageligt EphB2. Således kan kontaminering af begge celletyper forekomme under ISC-oprensning under anvendelse af anti-EphB2-antistoffet. Derfor bør deres markørgenekspression og den organoiddannende kapacitet af celler, der isoleres ved hjælp af EphB2 ved hjælp af FACS, vurderes.
Baseret på disse fakta kan EphB2 overflademærkede celler ved hjælp af FACS-analyse isoleres fra WT-krypter19. Det er blevet undersøgt, om EphB2-ekspression kan skelne mellem fire grupper med ekspression af specifikke markører, såsom ISC-specifikke markørgener (Lgr5, Ascl2 og Olfm4) og stamcellespecifikke markørgener (Ki67, Myc og FoxM1). Dette eksperiment viste, at EphB2-højceller overvejende var ISC'er, i modsætning til EphB2-medceller20,21. Endelig blev de opnåede celler baseret på celleisoleringsmetoden opdelt i fire grupper (EphB2høj, EphB2med, EphB2lav og EphB2negceller) (figur 2). Derefter blev enkeltceller, der udtrykte høje niveauer af EphB2 sorteret efter FACS, dyrket til organoid vækst. En enkelt EphB2høj celle kan uafhængigt anvendes til lokaliseret behandling og genskabe selvorganiserende krypt-villøse strukturer, der minder om den normale tyndtarm (figur 3). Imidlertid genererer cellerne afledt af andre grupper (EphB2med, EphB2lav og EphB2neg) ikke organoider20.
I en tidligere undersøgelse var ~ 6% af enkeltsorterede Lgr5-GFPhi-celler i stand til at indlede krypt-villøse organoider7. Imidlertid var de resterende celler ikke i stand til at generere organoider og døde inden for de første 12 timer7. Forfatterne formodede, at dette var resultatet af fysisk og/eller biologisk stress, der var forbundet med isolationsproceduren7. Mindre end 6% organoid vækst blev også opnået fra enkeltsorterede EphB2høje celler i WT-mus. Ved dag 5 af kulturen dannede sfæroidlignende strukturer (figur 3). Fra dag 7 til dag 9 forekom evagination af pletterne til dannelse af krypter (figur 3). Det er vigtigt, at anvendelsen af en udvalgt ROCK-hæmmer på de enkeltsorterede EphB2-høje celler mindskede dissociationsinduceret apoptose og øgede effektiviteten af organoidvækst.
Figur 1: Dannelse af tyndtarmsorganoider hos mus. A) Krypter fremstillet ved en kombination af EDTA-chelation og mekanisk dissociation. (B) Resulterende rensede krypter. (C) Krypter indlejret i den ekstracellulære matrix. (A-C) De sorte pile angiver krypter. (D) Tredimensionel kultur af krypter og organoider. (E) Repræsentative billeder af en voksende organoid afledt af en krypt. De hvide pile indikerer kryptspirende. Skalastænger = (A-C) 100 μm og (E) 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Flowcytometrigatingstrategi for at opnå en population af EphB2-positive (EphB2+) celler i vildtypemus. (A) Fremadrettede og sidespredte plots bruges til at adskille cellerne efter henholdsvis deres størrelse og granularitet. (B) Fluorescensspredning bruges til at adskille levedygtige celler i henhold til cellernes 7-AAD (PerCP) fluorescensintensitet. Porten til den 7-AAD-negative cellepopulation blev valgt. (C) Portene til EphB2-høje (EphB2høje), EphB2-medium (EphB2med), EphB2-lav (EphB2lav) og EphB2-negative (EphB2neg) cellepopulationer blev valgt. Forkortelser: FSC-A = fremadrettet spredningstopareal; SSC-A = side scatter-peak område; 7-AAD = 7-amino-actinomycin D. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Tidsforløb for enkeltsorteret EphB2højcelleorganoid vækst i vildtypemus. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Dyrkningsmedium til en plade med 24 brønde. Klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende video S1: Time-lapse-billeder af en voksende organoid. Skalabjælke = 50 μm. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S1: Repræsentativt billede af anti-lysozym-antistoffarvning i en organoid. De hvide pile angiver Paneth-celler. Forkortelse: DIC = differentiel interferens kontrastmikroskop. Skalabjælke = 10 μm. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Denne protokol beskriver en metode til konsekvent isolering af tyndtarmkrypter og den efterfølgende kultur af 3D-organoider. For at forbedre kryptfrigivelseshastigheden blev der etableret en mekanisk isoleringsmetode, der involverede kraftig omrystning efter behandling med EDTA. Mediumsammensætningen er forskellig fra den oprindelige protokol fra Sato et al.7. Det originale medium er relativt dyrt. Således er et dyrkningsmedium og tilpassede medier til murine tyndtarmorganoider indeholdende farmakologiske hæmmere, rekombinante vækstfaktorer og/eller konditionerede medier vist i tabel 1. Wnt3A og N-acetylcystein er ikke inkluderet i dyrkningsmediet i denne protokol. Da Paneth-celler udtrykker Wnt3, producerer cellerne Wnt3 og understøtter ISC-vedligeholdelse. Derudover anvendes det konditionerede medium ikke i løbet af kryptisoleringen. Organoidmodellen er dynamisk og har cellulær og strukturel heterogenitet (Paneth-celler, enterocytter, bægerceller, enteroendokrine celler, tuftceller og ISC'er). Derfor kan disse organoider bruges i skala til at studere grundlæggende spørgsmål om organoidbiologi.
EphB2-gradienten opretholder ISC-stammen og spredning langs krypt-villus-aksen i den voksne tyndtarm18. Fordelen ved at lave organoider fra en enkelt EphB2-celle sammenlignet med isolerede krypter vedrører forståelsen af biologien af murine ISC'er, da ISC'er spiller nøgleroller i forskellige humane tarmlidelser. Enkelt EphB2 ISC'er medhøjt udtryk kan dyrkes til dannelse af organoider på samme måde som udviklingen af organoider fra enkelte Lgr5-ekspressive ISC'er. Det vigtigste trin er præcist at opdele cellerne i fire grupper (EphB2høj, EphB2med, EphB2lav og EphB2neg) i henhold til EphB2-udtrykket i krypterne ved hjælp af FACS. Fremad versus side scatter (FSC vs. SSC) plots bruges almindeligvis til at identificere celler af interesse baseret på deres størrelse og granularitet. FSC angiver cellestørrelsen, og SSC vedrører kompleksiteten eller granulariteten af cellen i P0-porten (figur 2A). I dette arbejde blev cellerne, der faldt inden for den definerede port (P0), efterfølgende analyseret for levedygtighed. Dernæst blev deres levedygtighed bestemt i henhold til de negative og positive populationer af 7-AAD fluorescenssignaler. Grænsen mellem de 7-AAD-negative og -positive celler blev strengt besluttet for at få de negative med minimal positiv celleforurening. EphB2-portene blev groft indstillet baseret på EphB2-gradueret udtryk.
For at bekræfte, at de fire grupper var præcist opdelt, blev mRNA-ekspressionen af udvalgte gener analyseret. MRNA-niveauerne af ISC-markører er høje i EphB2-høje celler20. Derudover er mRNA-niveauerne af stamcellespecifikke markører relativt høje i EphB2-medceller20. Imidlertid er EphB2-eksdpression i EphB2lave og EphB2neg-celler lav eller negativ sammenlignet med EphB2høj og EphB2med celler20. De foregående foranstaltninger bør træffes for at sikre berigelse afEphB2-højcellepopulationen før plettering. Imidlertid kan organoidvækst på mindre end 6% fra EphB2-højceller skyldes stamcellernes død under dyrkningsprocessen, ikke den kraftige rystelse under kryptisoleringen. Det har vist sig, at anvendelsen af en selektiv Rho-associeret kinase (ROCK) hæmmer på humane embryonale stamceller markant mindsker dissociationsinduceret apoptose22. Som en teknisk ændring er det således værd at forsøge at tilføje ROCK-hæmmeren i en højere koncentration og med en længere inkubation for at forbedre levedygtigheden.
Wnt3A-udskillende Paneth-celler ved siden af ISC'er giver vigtig støtte til ISC'erne8. Faktisk viser ISC-Paneth-celledubletter en stærkt øget organoiddannende kapacitet sammenlignet med enkelte ISC'er8. Desuden har tilsætning af Wnt3A i koncentrationen på 100 ng/ml i de første 3 dage af dyrkningen vist sig at øge den organoiddannende kapacitet8. Som en anden teknisk ændring kunne tilføjelse af eksogen Wnt3A således forbedre den organoiddannende kapacitet af enkelt EphB2ISC'er med højt udtryk.
Sammenlignet med in vivo-tilgange kan organoider let anvendes til genetisk manipulation, analyse af malignitetsfænotyper og lægemiddelscreening20,23. En kombination af EDTA-chelation og en mekanisk isoleringsmetode er effektiv, reproducerbar og tidseffektiv til at skabe tyndtarmsorganoider fra krypter og kan let følges af laboratoriepersonale uden nogen avanceret erfaring. Tilsætningen af den mekaniske isolering med kraftig omrystning efter behandling med EDTA kan således effektivt etablere murine tyndtarmsorganoider ex vivo og tilvejebringe et potentielt værktøj til organoid dyrkning og sygdomsmodellering af andre voksne epitelvæv.
Intestinale epitelceller polariseres og orienteres med den apikale side rettet mod lumen. Imidlertid er den apikale side, der vender mod lumen af 3D-organoider, i deres indre. Således forhindrer denne organisation adgang til den apikale side, hvilket er et problem, når man studerer virkningerne af luminale komponenter, såsom næringsstoffer, mikrober og metabolitter på epitelceller. For at omgå denne ulempe er der udviklet en kultur af organoidceller som 2D-monolag24. Med hensyn til fremtidige anvendelser vil kulturen af organoidcellemonolag blive udnyttet, da dette repræsenterer det mest effektive og medgørlige system.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud til videnskabelig forskning (C) til T.T. (bevillingsnumre JP17K07495 og JP20K06751). Vi takker professor Mineko Kengaku for brugen af udstyr til langtids-time-lapse-billeddannelse (LCV100; Olympen).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Eppendorf | 0030 125.215 | |
| 5 mL syringe | TERUMO | SS-05SZ | |
| 15 mL Falcon tube | Iwaki | 2325-015 | |
| 20 μm cell strainer | Sysmex | 04-004-2325 | |
| 24-well plate | Iwaki | 3820-024 | |
| 50 mL Falcon tube | Iwaki | 2345-050 | |
| 60 mm tissue culture dish | FALCON | 353002 | |
| 70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| 100 mm Petri dish | Iwaki | 3020-100 | |
| 7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A-11004 | |
| Anti-EphB2 APC-conjugated antibody | BD Biosciences | 564699 | |
| C57BL6/J mice | Japan SLC, Inc. | ||
| Clean bench | HITACHI | CCV-1306E | |
| Confocal laser scanning microscope | Olympus | FV3000 | |
| EDTA (0.5 mol/L) | Nacalai Tesque | 06894-14 | 2 mM |
| FACSMelody | BD Life Sciences-Biosciences | 661762 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | 173012 | 1% (v/v) |
| Fiji (software) | https://fiji.sc/ | ||
| Gentamicin (10 mg/mL) | Nacalai Tesque | 16672-04 | 25 μg/mL |
| Hammacher laboratory scissor | SANSYO | 91-1538 | |
| Incubator | Panasonic | MCO-170-PJ | |
| Laboratory tweezer | AS-ONE | 7-164-04 | |
| L-Glutamine 200 mM | Gibco | 25030081 | 2 mM |
| Matrigel | BD Biosciences | 354230 | ECM for 3D organoids |
| Mouse Anti-Human Lysozyme | LSBio | LS-B8704-100 | |
| Murine EGF (20 μg/mL stock solution) | PeproTech | 315-09 | 20 ng/mL |
| PBS 1x | Gibco | 10010-023 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | 50 U/mL |
| Pipetman (10 μL, 20 μL, 200 μL, and 1,000 μL) | GILSON | 1-6855-12, -13, -15, and -16 | |
| Recombinant murine Noggin (20 μg/mL stock solution | R&D Systems | 1967-NG-025 | 100 ng/mL |
| Recombinant murine R-Spondin 1 (250 μg/mL stock solution) | R&D Systems | 3474-RS-050 | 500 ng/mL |
| Sorbitol | Nacalai Tesque | 32021-95 | 2% (w/v) |
| TE2000-S (inverted microscope) | Nikon | 24131 | |
| Time-lapse image microscope | Olympus | LCV100 | |
| TrypLE Express 1x | Gibco | 12605-010 | |
| ULVAC | ULVAC KIKO Inc. | 100073 | |
| Y-27632 | Fujifilm | 331752-47-7 | 10 μM |
References
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Seidlitz, T., et al. Human gastric cancer modelling using organoids. Gut. 68 (2), 207-217 (2019).
- Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).
- Artegiani, B., Clevers, H. Use and application of 3D-organoid technology. Human Molecular Genetics. 27, R99-R107 (2018).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. Organoid models of human gastrointestinal development and disease. Gastroenterology. 150 (5), 1098-1112 (2016).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469 (7330), 415-418 (2011).
- Aronowitz, J. A., Lockhart, R. A., Hakakian, C. S. Mechanical versus enzymatic isolation of stromal vascular fraction cells from adipose tissue. Springerplus. 4 (1), 713 (2015).
- Takahashi, T. New trends and perspectives in the function of non-neuronal acetylcholine in crypt-villus organoids in mice. Methods in Molecular Biology. 1576, 145-155 (2019).
- Batlle, E., et al. β-catenin and TCF mediate cell positioning in the intestinal epithelium by controlling the expression of EphB/ephrinB. Cell. 111 (2), 251-263 (2002).
- Baghdadi, M. B., Kim, T. -H. Analysis of mouse intestinal organoid culture with conditioned media isolated from mucosal enteric glial cells. STAR Protocols. 3 (2), 101351 (2022).
- Takahashi, T., et al. Non-neuronal acetylcholine as an endogenous regulator of proliferation and differentiation of Lgr5-positive stem cells in mice. FEBS Journal. 281 (20), 4672-4690 (2014).
- Barker, N. Adult intestinal stem cells: Critical drivers of epithelial homeostasis and regeneration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 19-33 (2014).
- Fordham, R. P., et al. Transplantation of expanded fetal intestinal progenitors contributes to colon regeneration after injury. Cell Stem Cell. 13 (6), 734-744 (2013).
- Miyoshi, H., et al. Wnt5a potentiates TGF-β signaling to promote colonic crypt regeneration after tissue injury. Science. 338 (6103), 108-113 (2012).
- Jung, P., et al. Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells. NatureMedicine. 17 (10), 1225-1227 (2011).
- Merlos-Suárez, A., et al. The intestinal stem cell signature identifies colorectal cancer stem cells and predicts disease relapse. Cell Stem Cell. 8 (5), 511-524 (2011).
- Mao, W., et al. EphB2 as a therapeutic antibody drug target for the treatment of colorectal cancer. Cancer Research. 64 (3), 781-788 (2004).
- Takahashi, T., et al. Muscarinic receptor M3 contributes to intestinal stem cell maintenance via EphB/ephrin-B signaling. Life Science Alliance. 4 (9), e202000962 (2021).
- Jung, P., et al. Isolation of human colon stem cells using surface expression of PTK7. Stem Cell Reports. 5 (6), 979-987 (2015).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Schulte, L., Hohwieler, M., Müller, M., Klaus, J. Intestinal organoids as a novel complementary model to dissect inflammatory bowel disease. Stem Cells International. 2019, 8010645 (2019).
- Puzan, M., Hosic, S., Ghio, C., Koppes, A. Enteric nervous system regulation of intestinal stem cell differentiation and epithelial monolayer function. Scientific Reports. 8 (1), 6313 (2018).
