Summary
We beschrijven een protocol om murine dunne darmcrypten en kweekdarm 3D-organoïden uit de crypten te isoleren. Daarnaast beschrijven we een methode om organoïden te genereren uit een enkele darmstamcel in afwezigheid van een sub-epitheliale cellulaire niche.
Abstract
Op dit moment is organoïdecultuur een belangrijk hulpmiddel voor in vitro studies van verschillende biologische aspecten en ziekten in verschillende organen. Murine dunne darmcrypten kunnen organoïden vormen die het darmepitheel nabootsen wanneer ze worden gekweekt in een 3D extracellulaire matrix. De organoïden zijn samengesteld uit alle celtypen die verschillende intestinale homeostatische functies vervullen. Deze omvatten Paneth-cellen, entero-endocriene cellen, enterocyten, bokaalcellen en plukjescellen. Goed gekarakteriseerde moleculen worden toegevoegd aan het kweekmedium om de intestinale stamcellen (ISC's) te verrijken, gelabeld met leucinerijke herhalingen die G-eiwit-gekoppelde receptor 5 bevatten en worden gebruikt om differentiatie naar specifieke afstammingslijnen te drijven; deze moleculen omvatten epidermale groeifactor, Noggin (een botmorfogenetisch eiwit) en R-spondin 1. Bovendien wordt ook een protocol beschreven om organoïden te genereren uit een enkele erytropoëtine-producerende hepatocellulaire receptor B2 (EphB2)-positieve ISC. In dit artikel worden technieken beschreven om dunne darmcrypten en een enkele ISC uit weefsels te isoleren en de efficiënte vestiging van organoïden te garanderen.
Introduction
Intestinale organoïden, die voor het eerst werden opgericht in 2009, zijn naar voren gekomen als een krachtig in vitro hulpmiddel voor het bestuderen van darmbiologie gezien hun morfologische en functionele gelijkenis met volwassen weefsels. Onlangs hebben technologische ontwikkelingen in gekweekte organoïden afgeleid van volwassen weefselstamcellen de langetermijnkweek van darmstamcellen (ISC's) met zelfvernieuwing en differentiatiepotentieel mogelijk gemaakt. Deze organoïden zijn op grote schaal gebruikt voor fundamentele en translationele onderzoeken naar gastro-intestinale fysiologie en pathofysiologie 1,2,3,4,5,6. De 3D-organoïden ontwikkeld door de Clevers-groep bieden een krachtig hulpmiddel om het darmepitheel te bestuderen met verbeterde fysiologische relevantie7. Omdat darmorganoïden zijn afgeleid van weefselstamcellen en zijn samengesteld uit meerdere celtypen, recapituleren ze de functionaliteit van het darmepitheel. Van belang is dat een enkelgesorteerde leucine-rijke herhalingen-bevattende G-eiwit-gekoppelde receptor 5-positieve (Lgr5 +) stamcel ook 3D-organoïden kan genereren zonder Paneth-cellen of een ISC-niche zoals de epitheliale niche of stromale niche7. De organoïdevormende capaciteit van enkelgesorteerde Lgr5+ cellen is echter laag in vergelijking met die van crypte en ISC-Paneth-celdoubletten8.
Een toenemend aantal studies hebben aangetoond dat de methoden van ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) incubatie of collagenasedissociatie losraken in het epitheel en het vrijkomen van crypten veroorzaken. Omdat enzymatische dissociatie een effect kan hebben op de celtoestand van crypten, wordt meestal een mechanische isolatiemethode gebruikt om het weefsel te dissociëren. Hoewel mechanische vertering een snelle techniek is, kan deze methode worden geassocieerd met inconsistente crypteopbrengsten of slechte levensvatbaarheid van cellen9. Daarom kunnen EDTA-behandeling en mechanische dissociatie worden gecombineerd om betere crypteopbrengsten te genereren. Een kenmerk van de methodologie die in dit artikel wordt getoond, is het gebruik van krachtig schudden van de weefselfragmenten na EDTA-chelatie10. Krachtig schudden maakt de efficiënte isolatie van crypten van crypt-villuscomplexen in de dunne darm mogelijk. De mate van handmatig schudden bepaalt de scheiding. Het verkrijgen van crypten uit complexen is dus belangrijk voor experimentatoren op dit gebied. Bovendien kan de juiste vaardigheid de besmetting van villus tot een minimum beperken en het aantal crypten verhogen.
Vandaar dat dit experimentele protocol, dat murine-afgeleide organoïden uit de dunne darm gebruikt, crypten beter kan isoleren met fysieke kracht na behandeling met EDTA voor dissociatie. Het is bekend dat het expressiepatroon van erytropoëtine-producerende hepatocellulaire receptor B2 (EphB2) gedeeltelijk de crypteomgeving weerspiegelt. EphB2-positieve cellen zijn bijvoorbeeld georganiseerd van onder naar boven11. Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) werd uitgevoerd op basis van de EphB2-expressie en de verkregen cellen werden verdeeld in vier groepen: EphB2hoog, EphB2med, EphB2laag en EphB2neg. Vervolgens werd de organoïde groei van enkelgesorteerde EphB2hoge cellen in wild-type (WT) muizen aangetoond.
Protocol
Alle muizenexperimenten werden goedgekeurd door de Suntory Animal Ethics Committee (APRV000561) en alle dieren werden onderhouden in overeenstemming met de richtlijnen van de commissie voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Er werd een standaard WT-stam van Mus musculus (C57BL6/J) gebruikt. Zowel mannelijke als vrouwelijke muizen van 10 weken tot 20 weken oud werden gebruikt. De muizen werden geëuthanaseerd met CO 2-verstikking.
1. Isolatie van de dunne darm
- Snijd de dunne darm, inclusief de twaalfvingerige darm en de proximale helft van het jejunum, met een laboratoriumschaar.
- Breng het weefsel over in een petrischaaltje en spoel de dunne darm met 5 ml koude PBS-ABx (PBS + penicilline-streptomycine [1%] + gentamicine [0,5%]) in een spuit van 5 ml om de luminale inhoud te verwijderen.
- Knip het weefsel in de lengte open met een laboratoriumschaar en was het handmatig met koude PBS-ABx tijdens het schudden.
OPMERKING: Door de villi met een glaasje uit te schrapen, kan villusbesmetting worden verminderd12. - Verzamel ongeveer 5 mm x 5 mm stukjes van het darmsegment met behulp van een laboratoriumschaar. Breng de fragmenten over in een buis van 50 ml met een pincet en voeg 25 ml koude PBS-ABx toe.
- Was de fragmenten door 10x heen en weer te roeren met 25 ml koude PBS-ABx om de darminhoud in de buis van 50 ml te verwijderen.
2. Crypt isolatie
- Incubeer de stukken in PBS-ABx met 2 mM EDTA gedurende 30 minuten op ijs zonder schudden.
- Voor eenvoudige stolling van de extracellulaire matrix (ECM), incubeer vooraf een 24-well plaat in een 37 °C weefselkweekincubator.
- Zuig de EDTA-oplossing uit het celkweeksysteem op met een vacuümpomp, voeg 25 ml verse, koude PBS-ABx toe en schud de stukken vervolgens krachtig op en neer met de hand 30x-40x om de crypt-villuscomplexen vrij te geven.
OPMERKING: De gescheiden crypten en villi kunnen worden gecontroleerd door de microscopische waarneming van een druppel van 25 μL uit de suspensie bij 4x vergroting. - Filter vervolgens de suspensie eenmaal door een zeef van 70 μm.
- Centrifugeer de suspensie gedurende 3 minuten bij 390 × g bij 4 °C.
- Resuspendeer de cryptpellet in 20 ml sorbitol DMEM (geavanceerde DMEM / F12 + penicilline-streptomycine [1%] + gentamicine [0,5%] + foetaal runderserum [1%] + sorbitol [2%]) met pipetteren en breng de cryptuspensie over naar twee nieuwe buizen van 15 ml voor verdeling in twee oplossingen van 10 ml om met lage snelheid te centrifugeren.
OPMERKING: De grote celmassa en cellen/puin kunnen worden gescheiden met behulp van centrifugatie met lage snelheid. De grote celmassa zit in de pellet en cellen/puin zitten in het supernatant. - Centrifugeer de twee crypte suspensies bij 80 × g gedurende 3 minuten bij 4 °C en zuig het supernatant vervolgens voorzichtig op.
OPMERKING: Aangezien de pelletvorming zwak is, moet u niet te veel opzuigen. Laat 2 ml supernatant in elke buis. - Voeg 10 ml sorbitol DMEM opnieuw toe aan elke buis. Centrifugeer de suspensie gedurende 3 minuten bij 4 °C bij 80 × g .
- Voeg na het opzuigen van het supernatant, waarbij 2 ml supernatant in elke buis achterblijft, 10 ml sorbitol DMEM voor resuspensie en centrifugeer de cryptuspensie bij 80 × g gedurende een laatste 3 minuten bij 4 °C.
- Voeg na het aanzuigen van het supernatant, waarbij 2 ml supernatant in elke buis achterblijft, 10 ml volledige DMEM (geavanceerde DMEM / F12 + penicilline-streptomycine [1%] + gentamicine [0,5%] + foetaal runderserum [1%]) voor resuspensie van de pellet door op en neer te pipetteren en laat het 1 min.
OPMERKING: Wacht 1 minuut om de drijvende crypten efficiënt te verkrijgen. - Verzamel na 1 minuut elke suspensie van 10 ml voor een totaal van 20 ml en filter eenmaal met een celzeef van 70 μm om de crypten te zuiveren.
- Voordat u in wezen zuivere crypten zaait, telt u het aantal crypten in de gefilterde volledige DMEM en centrifugeert u vervolgens gedurende 3 minuten bij 4 °C bij 290 × g .
- Druppel 25 μL druppels in een schaal van 6 cm op drie punten. Tel het aantal crypten onder een microscoop bij 4x vergroting en bereken de concentratie van crypten per druppel van 25 μL.
- Suspenseer 100 crypten met 40 μL ECM per put. Pipetteer 5x-10x op en neer om een homogene suspensie van crypten in de ECU te verkrijgen, en zaai vervolgens in een voorverwarmde 24-putplaat van 37 °C.
OPMERKING: Houd de ECU altijd op ijs om polymerisatie te voorkomen. Pipetteer voorzichtig om te voorkomen dat er luchtbellen in de ECU ontstaan. - Incubeer de 24-well plaat gedurende 15 minuten in een 37 °C, 5% CO2 incubator voor de polymerisatie van de ECM.
- Bedek ten slotte de ECM met 500 μL kweekmedium dat de epidermale groeifactor (EGF) van de muis, recombinant R-spondin 1 en de recombinante muis Noggin bij kamertemperatuur bevat. De uiteindelijke concentratie van materialen per put is als volgt: penicilline-streptomycine (1%), 50 U / ml elk; gentamicine (0,5%), 25 μg/ml; EFG, 20 ng/ml; Noggin, 100 ng / ml; R-spondin 1, 500 ng / ml; L-glutamine, 2 mM.
- Start de crypte cultuur bij 37 °C in een 5% CO2 incubator.
OPMERKING: Voor het kweekmedium voor organoïden in een plaat met 24 putten, zie tabel 1. - Voer langdurige live beeldvorming uit om organoïde morfogenese te observeren met een opname-time-lapse-beeldmicroscoop uitgerust met een 20x-objectief om de 3 uur gedurende maximaal 7 dagen. Verkrijg seriële z-gestapelde beelden bij z-stappen van 1 μm (1 μm x vijf stappen).
- Verander het medium om de dag.
3. Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS)
- Isoleer crypten van de muizen (zie rubriek 2).
- Behandel de geïsoleerde crypten met 2 ml trypsine gedurende 30 minuten bij 37 °C.
- Stop de reactie met 10 ml PBS en ga vervolgens door een celzeef van 20 μm.
- Centrifugeer de oplossing gedurende 3 minuten bij 4 °C bij 390 × g en resuspensie met 100 μl volledige DMEM.
- Voeg anti-EphB2 APC-geconjugeerd antilichaam (1/50) toe en incubeer gedurende 30 minuten op ijs.
- Was de cellen 3x met PBS en voeg ten slotte 7-amino-actinomycine D (7-AAD) (1/100) toe.
- Sorteer de gekleurde cellen via FACS.
- Pas de gebiedsschaalfactor aan en sorteer op celgrootte (voorwaartse verstrooiing, FSC-A) versus granulariteit (zijverstrooiing, SSC-A).
- Sorteer 7-AAD negatieve en positieve cellen op levensvatbaarheid met de laser ingesteld op een golflengte van 488 nm en 50 mV vermogen.
- Baken de poorten af om de EphB2-high (EphB2high), EphB2-medium (EphB2med), EphB2-low (EphB2low) en EphB2-negative (EphB2neg) cellen te sorteren met de laser ingesteld op een golflengte van 640 nm en 100 mV vermogen.
- Start de EphB2high cell culture bij 37 °C in een 5% CO2 incubator.
4. Eencellige gekweekte organoïden
- Voer de celisolatiemethode uit volgens gegradeerde EphB2-oppervlakteniveaus11 en verkrijg vervolgens vier verschillende populaties (hoog, gemiddeld, laag en negatief).
- Verzamel, pellet met centrifugatie bij 390 × g gedurende 3 minuten bij 4 °C en sluit de enkelgesorteerde EphB2-hoge cellen in de ECU in door pipetteren, gevolgd door zaaien op een plaat met 24 putten (100 singlets / 40 μL ECU / put).
- Laat de ECM net als in stap 2.14 polymeriseren en bedek de ECM met een kweekmedium dat een Rho-geassocieerde kinase (ROCK)-remmer (10 μM) bevat gedurende de eerste 2 dagen om de EphB2hoge cellen te behouden.
OPMERKING: De ROCK-remmer is effectief tegen anoikis. - Inspecteer de cellen handmatig met behulp van een omgekeerde microscoop bij 40x vergroting en observeer levensvatbare organoïden met sferoïdevorming en crypte-uitsteeksel.
Representative Results
Om muis dunne darm organoïden te genereren, kan een combinatie van EDTA-behandeling en een mechanische isolatiemethode worden gebruikt om crypten10,13 efficiënt te isoleren. De resultaten van deze studie toonden aan dat bijna alle geïsoleerde crypten onmiddellijk werden verzegeld en kegelvormig leken nadat ze uit de epitheelnissen waren geperst (figuur 1A). Om villusbesmetting te minimaliseren, werd de resulterende suspensie door een 70 μm celzeef geleid en vervolgens werd het filtraat gecentrifugeerd. Aangezien sommige crypten worden verstoord tijdens filtratie en suspensie, moeten deze stappen zorgvuldig worden uitgevoerd. De resultaten toonden aan dat bijna alle crypten in de laatste fractie geïntegreerd waren en geschikt voor gebruik in cultuur (figuur 1B). Om alle vergulde crypten afzonderlijk te visualiseren, werden 100 crypten per put verguld (figuur 1C). Na toevoeging van het specifieke cryptkweekmedium (figuur 1D) werd de ontwikkeling van organoïden dagelijks met een microscoop gevolgd. Bovendien werd de organische groei van de crypten waargenomen door time-lapse-beelden om hun ontwikkeling te volgen (figuur 1E en aanvullende video S1). De beschaafde crypten gedroegen zich stereotiep. Het binnenste lumen van de organoïde was gevuld met een massa apoptotische cellen. Actieve proliferatie en differentiatie van ISC's vond plaats in het cryptegebied met ontluiking (figuur 1E en aanvullende video S1). Budding ging gepaard met ISC-migratie en -proliferatie en Paneth-celdifferentiatie. De gedifferentieerde Paneth-cellen bevonden zich altijd op de ontluikende plaats (aanvullende figuur S1). Omdat werd bevestigd dat de organoïden stabiel waren in cultuur met behulp van een omgekeerde microscoop bij 10x vergroting, kon de techniek worden gebruikt om cryptevorming in de zich ontwikkelende dunne darm te onderzoeken en om de capaciteit voor weefselregeneratie en ISC-overleving op lange termijn te bepalen voor de productie van nieuwe darmepitheelcellen14,15,16.
Lgr5 wordt gedefinieerd als een ISC-marker en murine Lgr5+ cellen vormen 3D-organoïden7. Omdat de overvloed aan LGR5-eiwit aan het celoppervlak echter laag is en er een gebrek is aan anti-LGR5-antilichamen met hoge affiniteit, is het een uitdaging om murine ISC's efficiënt te isoleren door FACS. EphB2 is eerder geïdentificeerd als een oppervlaktemarker voor de zuivering van muizen en menselijke ISC's uit darmweefsels17,18. Het expressiepatroon van EphB2 verhoogt de complexiteit van ISC-markers. EphB2-positieve cellen zijn georganiseerd in het proliferatieve compartiment, met een piek aan de onderkant van de crypten, terwijl ze afnemen in een gradiënt naar de bovenkant van de crypten11. Paneth-cellen en voorlopercellen zijn ook gelokaliseerd in de crypte. Paneth-cellen drukken voornamelijk EphB3 uit, wat nodig is voor hun positionering, en de voorlopercellen boven hen in de crypte drukken voornamelijk EphB2 uit. Besmetting van beide celtypen kan dus optreden tijdens de ISC-zuivering met behulp van het anti-EphB2-antilichaam. Dienovereenkomstig moeten hun markergenexpressie en het organoïdevormend vermogen van cellen die met EphB2 door FACS worden geïsoleerd, worden beoordeeld.
Op basis van deze feiten, met behulp van FACS-analyse, kunnen EphB2-oppervlaktegelabelde cellen worden geïsoleerd uit WT-crypten19. Er is onderzocht of EphB2-expressie onderscheid kan maken tussen vier groepen met de expressie van specifieke markers, zoals ISC-specifieke markergenen (Lgr5, Ascl2 en Olfm4) en voorlopercelspecifieke markergenen (Ki67, Myc en FoxM1). Dit experiment toonde aan dat EphB2hoge cellen overwegend ISC's waren, in tegenstelling tot EphB2med cellen20,21. Ten slotte werden de verkregen cellen op basis van de celisolatiemethode verdeeld in vier groepen (EphB2hoog, EphB2med, EphB2laag en EphB2neg-cellen) (figuur 2). Vervolgens werden enkele cellen met hoge niveaus van EphB2 gesorteerd door FACS gekweekt voor organoïde groei. Een enkele EphB2hoge cel kan onafhankelijk worden toegepast voor gelokaliseerde behandeling en zelforganiserende crypt-villous structuren recreëren die doen denken aan de normale dunne darm (figuur 3). De cellen afgeleid van andere groepen (EphB2med, EphB2low en EphB2neg) genereren echter geen organoïden20.
In een eerdere studie was ~6% van de enkelgesorteerde Lgr5-GFPhi-cellen in staat om crypt-villous organoïden te initiëren7. De resterende cellen waren echter niet in staat om organoïden te genereren en stierven binnen de eerste 12 uur7. De auteurs gingen ervan uit dat dit het gevolg was van fysieke en/of biologische stress die inherent is aan de isolatieprocedure7. Minder dan 6% organoïde groei werd ook verkregen uit enkelgesorteerde EphB2hoge cellen in WT-muizen. Op dag 5 van de cultuur vormden zich sferoïde-achtige structuren (figuur 3). Van dag 7 tot dag 9 vond evaginatie van de vlekken plaats om crypten te vormen (figuur 3). Belangrijk is dat de toepassing van een geselecteerde ROCK-remmer op de enkelgesorteerde EphB2-hoge cellen dissociatie-geïnduceerde apoptose verminderde en de efficiëntie van organoïde groei verhoogde.
Figuur 1: Generatie van muis dunne darm organoïden. (A) Crypten bereid door een combinatie van EDTA-chelatie en mechanische dissociatie. (B) Resulterende gezuiverde crypten. (C) Crypten ingebed in de extracellulaire matrix. (A-C) De zwarte pijlen geven crypten aan. (D) Driedimensionale cultuur van crypten en organoïden. (E) Representatieve afbeeldingen van een groeiende organoïde afgeleid van een crypte. De witte pijlen geven crypte ontluiking aan. Schaalstaven = (A-C) 100 μm en (E) 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Flow cytometry gating strategie om een populatie van EphB2-positieve (EphB2+) cellen te verkrijgen in wild-type muizen. (A) Voorwaartse en zijwaartse verstrooiingsplots worden gebruikt om de cellen te scheiden op basis van respectievelijk hun grootte en granulariteit. (B) Fluorescentieverstrooiing wordt gebruikt om levensvatbare cellen te scheiden volgens de 7-AAD (PerCP) fluorescentie-intensiteit van de cellen. De poort voor de 7-AAD-negatieve celpopulatie werd gekozen. (C) De poorten voor de EphB2-high (EphB2high), EphB2-medium (EphB2med), EphB2-low (EphB2low) en EphB2-negatieve (EphB2neg) celpopulaties werden gekozen. Afkortingen: FSC-A = forward scatter-peak area; SSC-A = zijwaarts verstrooid-piekgebied; 7-AAD = 7-amino-actinomycine D. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Tijdsverloop van enkelcellige EphB2hoogcellige organoïde groei bij wild-type muizen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Kweekmedium voor een bord met 24 putten. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullende video S1: Time-lapse beelden van een groeiende organoïde. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S1: Representatief beeld van anti-lysozymantilichaamkleuring in een organoïde. De witte pijlen geven Paneth-cellen aan. Afkorting: DIC = differentiële interferentie contrast microscoop. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Dit protocol beschrijft een methode voor het consequent isoleren van dunne darmcrypten en de daaropvolgende kweek van 3D-organoïden. Om de crypt-releasing rate te verbeteren, werd een mechanische isolatiemethode met krachtig schudden na behandeling met EDTA vastgesteld. De samenstelling van het medium verschilt van het oorspronkelijke protocol van Sato et al.7. Het oorspronkelijke medium is relatief duur. Zo worden een kweekmedium en aangepaste media voor muizen dunne darm organoïden die farmacologische remmers, recombinante groeifactoren en/of geconditioneerde media bevatten, weergegeven in tabel 1. Wnt3A en N-acetylcysteïne zijn niet opgenomen in het kweekmedium in dit protocol. Terwijl Paneth-cellen Wnt3 uitdrukken, produceren de cellen Wnt3 en ondersteunen ze ISC-onderhoud. Bovendien wordt tijdens de crypte-isolatie het geconditioneerde medium niet gebruikt. Het organoïde model is dynamisch en heeft cellulaire en structurele heterogeniteit (Paneth-cellen, enterocyten, bokaalcellen, entero-endocriene cellen, plukcellen en ISC's). Vandaar dat deze organoïden op grote schaal kunnen worden gebruikt om fundamentele kwesties van organoïde biologie te bestuderen.
De EphB2-gradiënt handhaaft de ISC-stam en proliferatie langs de crypt-villus-as in de volwassen dunne darm18. Het voordeel van het maken van organoïden uit één enkele EphB2-cel in vergelijking met geïsoleerde crypten heeft betrekking op het begrijpen van de biologie van muizen-ISC's, omdat ISC's een sleutelrol spelen bij verschillende menselijke darmaandoeningen. Enkele EphB2hoog-tot expressie brengende ISC's kunnen worden gekweekt om organoïden te vormen op een vergelijkbare manier als de ontwikkeling van organoïden uit enkele Lgr5-tot expressie brengende ISC's. De belangrijkste stap is om de cellen precies te verdelen in vier groepen (EphB2hoog, EphB2med, EphB2laag en EphB2neg) volgens de EphB2-expressie in de crypten met behulp van FACS. Forward versus side scatter (FSC vs. SSC) plots worden vaak gebruikt om cellen van belang te identificeren op basis van hun grootte en granulariteit. FSC geeft de celgrootte aan en SSC heeft betrekking op de complexiteit of granulariteit van de cel in de P0-poort (figuur 2A). In dit werk werden de cellen die binnen de gedefinieerde poort (P0) vielen vervolgens geanalyseerd op levensvatbaarheid. Vervolgens werd hun levensvatbaarheid bepaald op basis van de negatieve en positieve populaties van 7-AAD fluorescentiesignalen. De grens tussen de 7-AAD-negatieve en -positieve cellen werd strikt besloten om de negatieve cellen te verkrijgen met minimale positieve celbesmetting. De EphB2-poorten waren ruwweg ingesteld op basis van de EphB2-gegradeerde expressie.
Om te bevestigen dat de vier groepen precies verdeeld waren, werd de mRNA-expressie van geselecteerde genen geanalyseerd. De mRNA-niveaus van ISC-markers zijn hoog in EphB2hoge cellen20. Bovendien zijn de mRNA-niveaus van voorlopercelspecifieke markers relatief hoog in EphB2-medcellen20. EphB2-exdpressie in EphB2-lage en EphB2-neg-cellen is echter laag of negatief in vergelijking met die van EphB2-hogeen EphB2-medcellen20. De voorgaande maatregelen moeten worden genomen om de verrijking van de EphB2-populatiemet hoge cellen vóór plating te waarborgen. Organoïde groei van minder dan 6% vanEphB2 hoge cellen kan echter te wijten zijn aan de dood van stamcellen tijdens het kweekproces, niet aan het krachtige schudden tijdens de crypte-isolatie. Het is aangetoond dat de toepassing van een selectieve Rho-geassocieerde kinase (ROCK) remmer op menselijke embryonale stamcellen de dissociatie-geïnduceerde apoptose aanzienlijk vermindert22. Dus, als een technische verandering, is het de moeite waard om te proberen de ROCK-remmer in een hogere concentratie en met een langere incubatie toe te voegen om de levensvatbaarheid te verbeteren.
Wnt3A-afscheidende Paneth-cellen naast ISC's bieden essentiële ondersteuning aan de ISC's8. Inderdaad, ISC-Paneth-celdoubletten vertonen een sterk verhoogde organoïdevormende capaciteit in vergelijking met enkele ISC's8. Bovendien is aangetoond dat de toevoeging van Wnt3A in een concentratie van 100 ng / ml gedurende de eerste 3 dagen van de kweek de organoïdevormende capaciteit8 verhoogt. Dus, als een andere technische verandering, zou het toevoegen van exogene Wnt3A de organoïdevormende capaciteit van enkele EphB2hoog-tot expressie brengende ISC's kunnen verbeteren.
In vergelijking met in vivo benaderingen kunnen organoïden gemakkelijk worden gebruikt voor genetische manipulatie, de analyse van maligniteitsfenotypen en medicijnscreening20,23. Een combinatie van EDTA-chelatie en een mechanische isolatiemethode is effectief, reproduceerbaar en tijdsefficiënt voor het maken van dunne darmorganoïden uit crypten en kan gemakkelijk worden gevolgd door laboratoriumpersoneel zonder enige geavanceerde ervaring. Zo kan de toevoeging van de mechanische isolatie met krachtig schudden na de behandeling met EDTA efficiënt muriene dunne darmorganoïden ex vivo vaststellen en een potentieel hulpmiddel bieden voor organoïdeteelt en ziektemodellering van andere volwassen epitheelweefsels.
Intestinale epitheelcellen zijn gepolariseerd en georiënteerd met de apicale kant gericht op het lumen. De apicale kant tegenover het lumen van 3D-organoïden bevindt zich echter in hun binnenste. Deze organisatie voorkomt dus toegang tot de apicale kant, wat een probleem is bij het bestuderen van de effecten van luminale componenten, zoals voedingsstoffen, microben en metabolieten op epitheelcellen. Om dit nadeel te omzeilen is een cultuur van organoïde cellen als 2D-monolagen ontwikkeld24. In termen van toekomstige toepassingen zal de cultuur van organoïde cel monolagen worden gebruikt, omdat dit het meest efficiënte en handelbare systeem vertegenwoordigt.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door Grants-in-Aid for Scientific Research (C) to T.T. (subsidienummers JP17K07495 en JP20K06751). Wij danken Prof. Mineko Kengaku voor het gebruik van apparatuur voor de lange termijn time-lapse imaging (LCV100; Olympus).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Eppendorf | 0030 125.215 | |
| 5 mL syringe | TERUMO | SS-05SZ | |
| 15 mL Falcon tube | Iwaki | 2325-015 | |
| 20 μm cell strainer | Sysmex | 04-004-2325 | |
| 24-well plate | Iwaki | 3820-024 | |
| 50 mL Falcon tube | Iwaki | 2345-050 | |
| 60 mm tissue culture dish | FALCON | 353002 | |
| 70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| 100 mm Petri dish | Iwaki | 3020-100 | |
| 7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A-11004 | |
| Anti-EphB2 APC-conjugated antibody | BD Biosciences | 564699 | |
| C57BL6/J mice | Japan SLC, Inc. | ||
| Clean bench | HITACHI | CCV-1306E | |
| Confocal laser scanning microscope | Olympus | FV3000 | |
| EDTA (0.5 mol/L) | Nacalai Tesque | 06894-14 | 2 mM |
| FACSMelody | BD Life Sciences-Biosciences | 661762 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | 173012 | 1% (v/v) |
| Fiji (software) | https://fiji.sc/ | ||
| Gentamicin (10 mg/mL) | Nacalai Tesque | 16672-04 | 25 μg/mL |
| Hammacher laboratory scissor | SANSYO | 91-1538 | |
| Incubator | Panasonic | MCO-170-PJ | |
| Laboratory tweezer | AS-ONE | 7-164-04 | |
| L-Glutamine 200 mM | Gibco | 25030081 | 2 mM |
| Matrigel | BD Biosciences | 354230 | ECM for 3D organoids |
| Mouse Anti-Human Lysozyme | LSBio | LS-B8704-100 | |
| Murine EGF (20 μg/mL stock solution) | PeproTech | 315-09 | 20 ng/mL |
| PBS 1x | Gibco | 10010-023 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | 50 U/mL |
| Pipetman (10 μL, 20 μL, 200 μL, and 1,000 μL) | GILSON | 1-6855-12, -13, -15, and -16 | |
| Recombinant murine Noggin (20 μg/mL stock solution | R&D Systems | 1967-NG-025 | 100 ng/mL |
| Recombinant murine R-Spondin 1 (250 μg/mL stock solution) | R&D Systems | 3474-RS-050 | 500 ng/mL |
| Sorbitol | Nacalai Tesque | 32021-95 | 2% (w/v) |
| TE2000-S (inverted microscope) | Nikon | 24131 | |
| Time-lapse image microscope | Olympus | LCV100 | |
| TrypLE Express 1x | Gibco | 12605-010 | |
| ULVAC | ULVAC KIKO Inc. | 100073 | |
| Y-27632 | Fujifilm | 331752-47-7 | 10 μM |
References
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Seidlitz, T., et al. Human gastric cancer modelling using organoids. Gut. 68 (2), 207-217 (2019).
- Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).
- Artegiani, B., Clevers, H. Use and application of 3D-organoid technology. Human Molecular Genetics. 27, R99-R107 (2018).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. Organoid models of human gastrointestinal development and disease. Gastroenterology. 150 (5), 1098-1112 (2016).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469 (7330), 415-418 (2011).
- Aronowitz, J. A., Lockhart, R. A., Hakakian, C. S. Mechanical versus enzymatic isolation of stromal vascular fraction cells from adipose tissue. Springerplus. 4 (1), 713 (2015).
- Takahashi, T. New trends and perspectives in the function of non-neuronal acetylcholine in crypt-villus organoids in mice. Methods in Molecular Biology. 1576, 145-155 (2019).
- Batlle, E., et al. β-catenin and TCF mediate cell positioning in the intestinal epithelium by controlling the expression of EphB/ephrinB. Cell. 111 (2), 251-263 (2002).
- Baghdadi, M. B., Kim, T. -H. Analysis of mouse intestinal organoid culture with conditioned media isolated from mucosal enteric glial cells. STAR Protocols. 3 (2), 101351 (2022).
- Takahashi, T., et al. Non-neuronal acetylcholine as an endogenous regulator of proliferation and differentiation of Lgr5-positive stem cells in mice. FEBS Journal. 281 (20), 4672-4690 (2014).
- Barker, N. Adult intestinal stem cells: Critical drivers of epithelial homeostasis and regeneration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 19-33 (2014).
- Fordham, R. P., et al. Transplantation of expanded fetal intestinal progenitors contributes to colon regeneration after injury. Cell Stem Cell. 13 (6), 734-744 (2013).
- Miyoshi, H., et al. Wnt5a potentiates TGF-β signaling to promote colonic crypt regeneration after tissue injury. Science. 338 (6103), 108-113 (2012).
- Jung, P., et al. Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells. NatureMedicine. 17 (10), 1225-1227 (2011).
- Merlos-Suárez, A., et al. The intestinal stem cell signature identifies colorectal cancer stem cells and predicts disease relapse. Cell Stem Cell. 8 (5), 511-524 (2011).
- Mao, W., et al. EphB2 as a therapeutic antibody drug target for the treatment of colorectal cancer. Cancer Research. 64 (3), 781-788 (2004).
- Takahashi, T., et al. Muscarinic receptor M3 contributes to intestinal stem cell maintenance via EphB/ephrin-B signaling. Life Science Alliance. 4 (9), e202000962 (2021).
- Jung, P., et al. Isolation of human colon stem cells using surface expression of PTK7. Stem Cell Reports. 5 (6), 979-987 (2015).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Schulte, L., Hohwieler, M., Müller, M., Klaus, J. Intestinal organoids as a novel complementary model to dissect inflammatory bowel disease. Stem Cells International. 2019, 8010645 (2019).
- Puzan, M., Hosic, S., Ghio, C., Koppes, A. Enteric nervous system regulation of intestinal stem cell differentiation and epithelial monolayer function. Scientific Reports. 8 (1), 6313 (2018).
