Summary
Nous décrivons un protocole pour isoler les cryptes de l’intestin grêle murin et cultiver des organoïdes intestinaux 3D à partir des cryptes. De plus, nous décrivons une méthode pour générer des organoïdes à partir d’une seule cellule souche intestinale en l’absence d’une niche cellulaire sous-épithéliale.
Abstract
À l’heure actuelle, la culture organoïde représente un outil important pour les études in vitro de différents aspects biologiques et maladies dans différents organes. Les cryptes de l’intestin grêle murin peuvent former des organoïdes qui imitent l’épithélium intestinal lorsqu’ils sont cultivés dans une matrice extracellulaire 3D. Les organoïdes sont composés de tous les types de cellules qui remplissent diverses fonctions homéostatiques intestinales. Ceux-ci comprennent les cellules de Paneth, les cellules entéroendocrines, les entérocytes, les cellules caliciformes et les cellules de touffe. Des molécules bien caractérisées sont ajoutées dans le milieu de culture pour enrichir les cellules souches intestinales (CSI) marquées avec des répétitions riches en leucine contenant le récepteur 5 couplé à la protéine G et sont utilisées pour conduire la différenciation vers le bas de lignées spécifiques; ces molécules comprennent le facteur de croissance épidermique, Noggin (une protéine morphogénétique osseuse) et la R-spondine 1. De plus, un protocole pour générer des organoïdes à partir d’un seul ISC positif au récepteur hépatocellulaire B2 (EphB2) producteur d’érythropoïétine est également détaillé. Dans cet article sur les méthodes, des techniques permettant d’isoler les cryptes de l’intestin grêle et un seul ISC des tissus et d’assurer l’établissement efficace des organoïdes sont décrites.
Introduction
Les organoïdes intestinaux, qui ont été créés en 2009, sont apparus comme un puissant outil in vitro pour étudier la biologie intestinale compte tenu de leur similitude morphologique et fonctionnelle avec les tissus matures. Récemment, les progrès technologiques dans les organoïdes cultivés dérivés de cellules souches de tissus adultes ont permis la culture à long terme de cellules souches intestinales (CSI) avec un potentiel d’auto-renouvellement et de différenciation. Ces organoïdes ont été largement utilisés pour les études de recherche fondamentale et translationnelle sur la physiologie gastro-intestinale et la physiopathologie 1,2,3,4,5,6. Les organoïdes 3D développés par le groupe Clevers fournissent un outil puissant pour étudier l’épithélium intestinal avec une pertinence physiologique améliorée7. Étant donné que les organoïdes intestinaux sont dérivés de cellules souches tissulaires et sont composés de plusieurs types de cellules, ils récapitulent la fonctionnalité de l’épithélium intestinal. Il convient de noter qu’une cellule souche 5 positive (Lgr5+) riche en leucine contenant des répétitions riches en leucine peut également générer des organoïdes 3D sans cellules de Paneth ou niche ISC telle que la niche épithéliale ou la niche stromale7. Cependant, la capacité de formation d’organoïdes des cellules Lgr5+ triées est faible par rapport à celles des doublets de cellules de crypte et ISC-Paneth8.
Un nombre croissant d’études ont montré que les méthodes d’incubation de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) ou de dissociation de la collagénase provoquent un relâchement de l’épithélium et la libération de cryptes. Comme la dissociation enzymatique peut avoir un effet sur l’état cellulaire des cryptes, une méthode d’isolation mécanique est généralement utilisée pour dissocier le tissu. Bien que la digestion mécanique soit une technique rapide, cette méthode peut être associée à des rendements cryptiques incohérents ou à une faible viabilité cellulaire9. Par conséquent, le traitement à l’EDTA et la dissociation mécanique peuvent être combinés pour générer de meilleurs rendements cryptiques. Une caractéristique de la méthodologie présentée dans cet article est l’utilisation d’une agitation vigoureuse des fragments de tissu après chélation de l’EDTA10. Une secousse vigoureuse permet d’isoler efficacement les cryptes des complexes crypte-villosités dans l’intestin grêle. Le degré d’agitation manuelle détermine la séparation. Ainsi, l’obtention de cryptes à partir de complexes est importante pour les expérimentateurs dans ce domaine. De plus, une bonne habileté peut réduire au minimum la contamination des villosités et augmenter le nombre de cryptes.
Par conséquent, ce protocole expérimental, qui utilise des organoïdes de l’intestin grêle dérivés de la souris, peut mieux isoler les cryptes avec une force physique après un traitement avec de l’EDTA pour la dissociation. On sait que le profil d’expression du récepteur hépatocellulaire B2 producteur d’érythropoïétine (EphB2) reflète en partie l’environnement cryptique. Par exemple, les cellules EphB2-positives sont organisées de bas en haut11. Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) a été effectué sur la base de l’expression EphB2, et les cellules obtenues ont été divisées en quatre groupes: EphB2élevé, EphB2med, EphB2faible et EphB2neg. Ensuite, la croissance organoïde à partir de cellulesélevées EphB2 triées uniques chez des souris de type sauvage (WT) a été démontrée.
Protocol
Toutes les expériences sur les souris ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de Suntory (APRV000561), et tous les animaux ont été maintenus conformément aux lignes directrices du comité pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Une souche WT standard de Mus musculus (C57BL6/J) a été utilisée. Des souris mâles et femelles âgées de 10 semaines à 20 semaines ont été utilisées. Les souris ont été euthanasiées par asphyxie au CO2 .
1. Isolement de l’intestin grêle
- Irritez l’intestin grêle, y compris le duodénum et la moitié proximale du jéjunum, avec des ciseaux de laboratoire.
- Transférer le tissu dans une boîte de Pétri et rincer l’intestin grêle avec 5 ml de PBS-ABx froid (PBS + pénicilline-streptomycine [1%] + gentamicine [0,5%]) dans une seringue de 5 ml pour éliminer le contenu luminal.
- Coupez le tissu ouvert dans le sens de la longueur avec des ciseaux de laboratoire et lavez manuellement avec du PBS-ABx froid tout en secouant.
REMARQUE: En grattant les villosités avec une lame, la contamination des villosités peut être réduite12. - Prélever environ 5 mm x 5 mm de morceaux du segment intestinal à l’aide de ciseaux de laboratoire. Transférer les fragments dans un tube de 50 ml avec une pince à épiler et ajouter 25 ml de PBS-ABx froid.
- Lavez les fragments en agitant 10x d’avant en arrière avec 25 ml de PBS-ABx froid pour enlever le contenu intestinal dans le tube de 50 ml.
2. Isolement de la crypte
- Incuber les morceaux dans du PBS-ABx contenant 2 mM d’EDTA pendant 30 min sur glace sans trembler.
- Pour faciliter la solidification de la matrice extracellulaire (ECM), incuber au préalable une plaque de 24 puits dans un incubateur de culture tissulaire à 37 °C.
- Aspirez la solution d’EDTA du système de culture cellulaire avec une pompe à vide, ajoutez 25 ml de PBS-ABx frais et froid, puis secouez vigoureusement les morceaux de haut en bas à la main 30x-40x pour libérer les complexes crypte-villosités.
REMARQUE: Les cryptes et les villosités séparées peuvent être vérifiées par l’observation microscopique d’une gouttelette de 25 μL de la suspension à un grossissement de 4x. - Ensuite, filtrez une fois la suspension à travers une crépine de 70 μm.
- Centrifuger la suspension à 390 × g pendant 3 min à 4 °C.
- Resuspendre la pastille cryptique dans 20 mL de DMEM de sorbitol (DMEM/F12 avancé + pénicilline-streptomycine [1 %] + gentamicine [0,5 %] + sérum fœtal bovin [1 %] + sorbitol [2 %]) avec pipetage, et transférer la suspension cryptique dans deux nouveaux tubes de 15 mL pour la division en deux solutions de 10 mL pour centrifuger à basse vitesse.
REMARQUE: La grande masse cellulaire et les cellules / débris peuvent être séparés par centrifugation à basse vitesse. La grande masse cellulaire est dans la pastille, et les cellules / débris sont dans le surnageant. - Centrifuger les deux suspensions cryptiques à 80 × g pendant 3 min à 4 °C, puis aspirer doucement le surnageant.
REMARQUE: Comme la formation de granulés est faible, ne pas trop aspirer. Laisser 2 mL de surnageant dans chaque tube. - Ajouter à nouveau 10 mL de DMEM de sorbitol dans chaque tube. Centrifuger la suspension à 80 × g pendant 3 min à 4 °C.
- Après avoir aspiré le surnageant, en laissant 2 mL de surnageant dans chaque tube, ajouter 10 mL de DMEM de sorbitol pour la remise en suspension et centrifuger la suspension cryptique à 80 × g pendant 3 minutes finales à 4 °C.
- Après avoir aspiré le surnageant, en laissant 2 mL de surnageant dans chaque tube, ajouter 10 mL de DMEM complet (DMEM/F12 avancé + pénicilline-streptomycine [1 %] + gentamicine [0,5 %] + sérum fœtal bovin [1 %]) pour remettre en suspension la pastille en pipetant de haut en bas, et laisser agir pendant 1 min.
REMARQUE: Attendez 1 min pour obtenir efficacement les cryptes flottantes. - Après 1 min, prélever chaque suspension de 10 mL pour un total de 20 mL, et filtrer une fois avec une passoire cellulaire de 70 μm pour purifier les cryptes.
- Avant d’ensemencer des cryptes essentiellement pures, compter le nombre de cryptes dans le DMEM complet filtré, puis centrifuger à 290 × g pendant 3 min à 4 °C.
- Égoutter 25 μL de gouttelettes dans une boîte de 6 cm en trois points. Comptez le nombre de cryptes au microscope à un grossissement de 4x et calculez la concentration de cryptes par gouttelette de 25 μL.
- Suspendre 100 cryptes avec 40 μL d’ECM par puits. Pipeter de haut en bas 5x-10x pour obtenir une suspension homogène de cryptes dans l’ECM, puis ensemencer dans une plaque de 24 puits préchauffée à 37 °C.
REMARQUE: Gardez toujours l’ECM sur la glace pour éviter la polymérisation. Pipeter soigneusement pour éviter de faire des bulles d’air dans l’ECM. - Incuber la plaque de 24 puits pendant 15 min dans un incubateur à 37 °C, 5% de CO2 pour la polymérisation de l’ECM.
- Enfin, couvrir l’ECM avec 500 μL de milieu de culture contenant le facteur de croissance épidermique (EGF) de souris, la R-spondine 1 de souris recombinante et le Noggin de souris recombinant à température ambiante. La concentration finale des matières par puits est la suivante : pénicilline-streptomycine (1 %), 50 U/mL chacune; gentamicine (0,5 %), 25 μg/mL; EGF, 20 ng/mL; Noggin, 100 ng/mL; R-spondine 1, 500 ng/mL; L-glutamine, 2 mM.
- Démarrer la culture de cryptes à 37 °C dans un incubateur à 5% de CO2 .
NOTE: Pour le milieu de culture pour les organoïdes dans une plaque de 24 puits, voir le tableau 1. - Réaliser une imagerie en direct à long terme pour observer la morphogenèse organoïde avec un microscope d’images time-lapse d’enregistrement équipé d’un objectif 20x toutes les 3 heures pendant 7 jours maximum. Obtenez des images empilées z en série à des pas z de 1 μm (1 μm x cinq étapes).
- Changez le support tous les deux jours.
3. Tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)
- Isolez les cryptes des souris (voir rubrique 2).
- Traiter les cryptes isolées avec 2 mL de trypsine pendant 30 min à 37 °C.
- Arrêtez la réaction avec 10 mL de PBS, puis passez à travers une crépine cellulaire de 20 μm.
- Centrifuger la solution à 390 × g pendant 3 min à 4 °C et remettre en suspension avec 100 μL de DMEM complet.
- Ajouter l’anticorps conjugué anti-EphB2 APC (1/50) et incuber pendant 30 minutes sur de la glace.
- Laver les cellules 3x avec du PBS, et enfin ajouter la 7-amino-actinomycine D (7-AAD) (1/100).
- Triez les cellules colorées via FACS.
- Ajustez le facteur d’échelle de zone et triez en fonction de la taille de la cellule (diffusion directe, FSC-A) par rapport à la granularité (diffusion latérale, SSC-A).
- Triez les cellules négatives et positives 7-AAD pour la viabilité avec le laser réglé à une longueur d’onde de 488 nm et une puissance de 50 mV.
- Délimitez les portes pour trier les cellules EphB2-high (EphB2high), EphB2-medium (EphB2med), EphB2-low (EphB2low) et EphB2-negative (EphB2neg) avec le laser réglé à une longueur d’onde de 640 nm et une puissance de 100 mV.
- Démarrer la culturecellulaire élevée EphB2 à 37 °C dans un incubateur à 5% de CO2 .
4. Organoïdes unicellulaires en culture
- Effectuer la méthode d’isolement cellulaire selon les niveaux de surface EphB2 gradués11, puis obtenir quatre populations distinctes (élevée, moyenne, faible et négative).
- Collecter, granuler par centrifugation à 390 × g pendant 3 min à 4 °C et incorporer les cellulesEphB2 hautes triées dans l’ECM par pipetage, suivi de l’ensemencement sur une plaque de 24 puits (100 singulets/40 μL d’ECM/puits).
- Comme à l’étape 2.14, laisser l’ECM polymériser et couvrir l’ECM d’un milieu de culture contenant un inhibiteur de la kinase Rho-associée (ROCK) (10 μM) pendant les 2 premiers jours pour maintenir les cellulesélevées d’EphB2.
REMARQUE: L’inhibiteur de ROCK est efficace contre les anoikis. - Inspectez manuellement les cellules à l’aide d’un microscope inversé à un grossissement de 40x et observez les organoïdes viables avec formation de sphéroïdes et protrusion cryptique.
Representative Results
Pour générer des organoïdes intestinaux grêles de souris, une combinaison de traitement à l’EDTA et d’une méthode d’isolement mécanique peut être utilisée pour isoler efficacement les cryptes10,13. Les résultats de cette étude ont montré que presque toutes les cryptes isolées étaient immédiatement scellées et apparaissaient en forme de cône après avoir été extraites des niches épithéliales (Figure 1A). Pour minimiser la contamination des villosités, la suspension résultante a été passée à travers une crépine cellulaire de 70 μm, puis le filtrat a été centrifugé. Comme certaines cryptes sont perturbées lors de la filtration et de la suspension, ces étapes doivent être effectuées avec soin. Les résultats ont montré que presque toutes les cryptes de la fraction finale étaient intégrées et adaptées à une utilisation en culture (Figure 1B). Pour visualiser toutes les cryptes plaquées individuellement, 100 cryptes par puits ont été plaquées (Figure 1C). Après avoir ajouté le milieu de culture cryptique spécifique (Figure 1D), le développement des organoïdes a été surveillé quotidiennement au microscope. De plus, la croissance organoïde des cryptes a été observée par des images accélérées pour surveiller leur développement (Figure 1E et Vidéo supplémentaire S1). Les cryptes cultivées se comportaient de manière stéréotypée. La lumière interne de l’organoïde était remplie d’une masse de cellules apoptotiques. La prolifération active et la différenciation des ISC se sont produites dans la région cryptique avec bourgeonnement (Figure 1E et vidéo supplémentaire S1). Le bourgeonnement a été couplé à la migration et à la prolifération de l’ISC et à la différenciation des cellules de Paneth. Les cellules de Paneth différenciées étaient toujours situées sur le site bourgeonnant (figure supplémentaire S1). Comme la stabilité des organoïdes a été confirmée en culture à l’aide d’un microscope inversé à un grossissement de 10x, la technique a pu être utilisée pour examiner la formation de cryptes dans l’intestin grêle en développement et pour déterminer la capacité de régénération tissulaire et la survie à long terme de l’ISC pour la production de nouvelles cellules épithéliales intestinales14,15,16.
Lgr5 est défini comme un marqueur ISC, et les cellules Lgr5+ murines forment des organoïdes 3D7. Cependant, comme l’abondance de la protéine LGR5 à la surface cellulaire est faible et qu’il y a un manque d’anticorps anti-LGR5 de haute affinité, il est difficile d’isoler efficacement les CSI murins par FACS. EphB2 a déjà été identifié comme un marqueur de surface pour la purification des CSI murins et humains des tissus intestinaux17,18. Le modèle d’expression d’EphB2 augmente la complexité impliquée dans les marqueurs ISC. Les cellules EphB2-positives sont organisées dans tout le compartiment prolifératif, culminant au bas des cryptes, tandis qu’elles diminuent dans un gradient vers le haut des cryptes11. Les cellules de Paneth et les cellules progénitrices sont également localisées dans la crypte. Les cellules de Paneth expriment principalement EphB3, ce qui est nécessaire à leur positionnement, et les cellules progénitrices au-dessus d’elles dans la crypte expriment principalement EphB2. Ainsi, la contamination des deux types de cellules peut se produire au cours de la purification ISC à l’aide de l’anticorps anti-EphB2. En conséquence, leur expression génique marqueur et la capacité de formation organoïde des cellules isolées à l’aide d’EphB2 par FACS doivent être évaluées.
Sur la base de ces faits, en utilisant l’analyse FACS, les cellules marquées en surface EphB2 peuvent être isolées des cryptes WT19. Il a été étudié si l’expression d’EphB2 peut distinguer quatre groupes avec l’expression de marqueurs spécifiques, tels que les gènes marqueurs spécifiques de l’ISC (Lgr5, Ascl2 et Olfm4) et les gènes marqueurs spécifiques des cellules progénitrices (Ki67, Myc et FoxM1). Cette expérience a démontré que les cellulesélevées EphB2 étaient principalement des ISC, contrairement aux cellulesEphB2 med 20,21. Enfin, sur la base de la méthode d’isolement cellulaire, les cellules obtenues ont été divisées en quatre groupes (EphB2haut, EphB2med, EphB2faible et EphB2cellules neg) (Figure 2). Ensuite, des cellules individuelles exprimant des niveaux élevés d’EphB2 triées par FACS ont été cultivées pour la croissance organoïde. Une seule celluleélevée EphB2 peut être appliquée indépendamment pour un traitement localisé et recréer des structures crypto-villeuses auto-organisées rappelant l’intestin grêle normal (Figure 3). Cependant, les cellules dérivées d’autres groupes (EphB2med, EphB2faible, et EphB2neg) ne génèrent pas d’organoïdes20.
Dans une étude précédente, ~6% des celluleshi Lgr5-GFP triées à un seul endroit ont été capables d’initier des organoïdes crypto-villeux7. Cependant, les cellules restantes ont été incapables de générer des organoïdes et sont mortes dans les 12 premières h7. Les auteurs ont supposé que cela résultait d’un stress physique et/ou biologique inhérent à la procédure d’isolement7. Une croissance organoïde inférieure à 6% a également été obtenue à partir de cellulesélevées EphB2 triées en un seul chez des souris WT. Au jour 5 de la culture, des structures de type sphéroïde se sont formées (Figure 3). Du jour 7 au jour 9, l’évagination des taches pour former des cryptes s’est produite (Figure 3). Il est important de noter que l’application d’un inhibiteur ROCK sélectionné aux cellulesélevées EphB2 triées à tri unique a diminué l’apoptose induite par la dissociation et augmenté l’efficacité de la croissance organoïde.
Figure 1 : Génération d’organoïdes intestinaux grêles de souris. (A) Cryptes préparées par une combinaison de chélation de l’EDTA et de dissociation mécanique. (B) Cryptes purifiées résultantes. (C) Cryptes intégrées dans la matrice extracellulaire. (A-C) Les flèches noires indiquent des cryptes. (D) Culture tridimensionnelle de cryptes et d’organoïdes. (E) Images représentatives d’un organoïde en croissance provenant d’une crypte. Les flèches blanches indiquent le bourgeonnement de la crypte. Barres d’échelle = (A-C) 100 μm et (E) 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Stratégie de contrôle par cytométrie en flux pour obtenir une population de cellules EphB2-positives (EphB2+) chez des souris de type sauvage. (A) Des diagrammes de dispersion vers l’avant et sur le côté sont utilisés pour séparer les cellules en fonction de leur taille et de leur granularité, respectivement. (B) La diffusion de fluorescence est utilisée pour séparer les cellules viables en fonction de l’intensité de fluorescence 7-AAD (PerCP) des cellules. La porte pour la population de cellules 7-AAD-négatives a été choisie. (C) Les portes pour les populations cellulaires EphB2-high (EphB2high), EphB2-medium (EphB2med), EphB2-low (EphB2low) et EphB2-negative (EphB2neg) ont été choisies. Abréviations : FSC-A = zone de pic de diffusion vers l’avant; SSC-A = aire de pic de diffusion latérale; 7-AAD = 7-amino-actinomycine D. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Évolution temporelle de la croissance organoïdeà cellules élevées EphB2 triées en un seul chez des souris de type sauvage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Tableau 1 : Milieu de culture pour une plaque de 24 puits. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Vidéo supplémentaire S1 : Images accélérées d’un organoïde en croissance. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire S1 : Image représentative de la coloration d’anticorps anti-lysozyme dans un organoïde. Les flèches blanches indiquent les cellules de Paneth. Abréviation : DIC = microscope à contraste interférentiel différentiel. Barre d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Discussion
Ce protocole décrit une méthode pour isoler systématiquement les cryptes de l’intestin grêle et la culture ultérieure d’organoïdes 3D. Pour améliorer le taux de libération de la crypte, une méthode d’isolation mécanique impliquant des secousses vigoureuses après traitement à l’EDTA a été établie. La composition du milieu est différente du protocole original de Sato et al.7. Le support original est relativement coûteux. Ainsi, un milieu de culture et des milieux personnalisés pour les organoïdes murins de l’intestin grêle contenant des inhibiteurs pharmacologiques, des facteurs de croissance recombinants et/ou des milieux conditionnés sont présentés dans le tableau 1. Wnt3A et N-acétylcystéine ne sont pas inclus dans le milieu de culture de ce protocole. Comme les cellules de Paneth expriment Wnt3, les cellules produisent Wnt3 et prennent en charge la maintenance ISC. De plus, au cours de l’isolement de la crypte, le milieu conditionné n’est pas utilisé. Le modèle organoïde est dynamique et présente une hétérogénéité cellulaire et structurelle (cellules de Paneth, entérocytes, cellules caliciformes, cellules entéroendocrines, cellules touffes et CSI). Par conséquent, ces organoïdes peuvent être utilisés à grande échelle pour étudier les questions fondamentales de la biologie organoïde.
Le gradient EphB2 maintient la tige et la prolifération de l’ISC le long de l’axe crypte-villosités dans l’intestin grêleadulte 18. L’avantage de fabriquer des organoïdes à partir d’une seule cellule EphB2 par rapport aux cryptes isolées est lié à la compréhension de la biologie des ISC murins, car les ISC jouent un rôle clé dans divers troubles intestinaux humains. Les ISC EphB2uniques à haute expression peuvent être cultivés pour former des organoïdes de la même manière que le développement d’organoïdes à partir d’ISC exprimant Lgr5 seuls. L’étape la plus importante consiste à diviser précisément les cellules en quatre groupes (EphB2élevé, EphB2med, EphB2faible et EphB2neg) en fonction de l’expression EphB2 dans les cryptes à l’aide de FACS. Les diagrammes de diffusion vers l’avant par rapport à la diffusion latérale (FSC vs SSC) sont couramment utilisés pour identifier les cellules d’intérêt en fonction de leur taille et de leur granularité. FSC indique la taille de la cellule, et SSC se rapporte à la complexité ou à la granularité de la cellule dans la porte P0 (Figure 2A). Dans ce travail, les cellules qui se trouvaient à l’intérieur de la porte définie (P0) ont ensuite été analysées pour leur viabilité. Ensuite, leur viabilité a été déterminée en fonction des populations négatives et positives de signaux de fluorescence 7-AAD. La frontière entre les cellules 7-AAD-négatives et -positives a été strictement décidée pour obtenir les cellules négatives avec une contamination cellulaire positive minimale. Les portes EphB2 ont été grossièrement définies sur la base de l’expression graduée EphB2.
Pour confirmer que les quatre groupes ont été divisés avec précision, l’expression de l’ARNm de gènes sélectionnés a été analysée. Les niveaux d’ARNm des marqueurs ISC sont élevés dans les cellulesélevées EphB220. De plus, les niveaux d’ARNm des marqueurs spécifiques des cellules progénitrices sont relativement élevés dans les cellulesmédicales EphB220. Cependant, l’exdpression EphB2 dans les cellules EphB2 faible et EphB2neg estfaible ou négative par rapport à celle des cellules EphB2high et EphB2med 20. Les mesures précédentes doivent être prises pour assurer l’enrichissement de la populationcellulaire élevée EphB2 avant le placage. Cependant, la croissance organoïde de moins de 6% à partir de cellulesélevées EphB2 peut être due à la mort des cellules souches pendant le processus de culture, et non à la secousse vigoureuse pendant l’isolement de la crypte. Il a été démontré que l’application d’un inhibiteur sélectif de la kinase associée à Rho (ROCK) aux cellules souches embryonnaires humaines diminue nettement l’apoptose induite par la dissociation22. Ainsi, en tant que changement technique, il vaut la peine d’essayer d’ajouter l’inhibiteur de ROCK à une concentration plus élevée et avec une incubation plus longue pour améliorer la viabilité.
Les cellules de Paneth sécrétant Wnt3A à côté des ISC fournissent un support essentiel aux ISC8. En effet, les doublets cellulaires ISC-Paneth présentent une capacité de formation d’organoïdes fortement accrue par rapport aux ISCs8 simples. De plus, il a été démontré que l’ajout de Wnt3A à la concentration de 100 ng/mL pendant les 3 premiers jours de culture augmente la capacité de formation d’organoïdes8. Ainsi, autre changement technique, l’ajout de Wnt3A exogène pourrait améliorer la capacité de formation d’organoïdes d’ISC EphB2uniques à haute expression.
Par rapport aux approches in vivo, les organoïdes peuvent être facilement utilisés pour la manipulation génétique, l’analyse des phénotypes de tumeurs malignes et le dépistage de médicaments20,23. Une combinaison de chélation de l’EDTA et d’une méthode d’isolement mécanique est efficace, reproductible et rapide pour créer des organoïdes intestinaux grêles à partir de cryptes et peut être facilement suivie par le personnel de laboratoire sans aucune expérience avancée. Ainsi, l’ajout de l’isolement mécanique avec agitation vigoureuse après le traitement par EDTA peut établir efficacement les organoïdes murins de l’intestin grêle ex vivo et fournir un outil potentiel pour la culture organoïde et la modélisation de la maladie d’autres tissus épithéliaux adultes.
Les cellules épithéliales intestinales sont polarisées et orientées avec le côté apical dirigé vers la lumière. Cependant, le côté apical face à la lumière des organoïdes 3D est à l’intérieur. Ainsi, cette organisation empêche l’accès au côté apical, ce qui est un problème lors de l’étude des effets des composants luminaux, tels que les nutriments, les microbes et les métabolites sur les cellules épithéliales. Pour contourner cet inconvénient, une culture de cellules organoïdes sous forme de monocouches 2D a été mise au point24. En termes d’applications futures, la culture de monocouches de cellules organoïdes sera utilisée, car elle représente le système le plus efficace et le plus traitable.
Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par Grants-in-Aid for Scientific Research (C) à T.T. (numéros de subvention JP17K07495 et JP20K06751). Nous remercions le professeur Mineko Kengaku pour l’utilisation de l’équipement pour l’imagerie accélérée à long terme (LCV100; Olympe).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Eppendorf | 0030 125.215 | |
| 5 mL syringe | TERUMO | SS-05SZ | |
| 15 mL Falcon tube | Iwaki | 2325-015 | |
| 20 μm cell strainer | Sysmex | 04-004-2325 | |
| 24-well plate | Iwaki | 3820-024 | |
| 50 mL Falcon tube | Iwaki | 2345-050 | |
| 60 mm tissue culture dish | FALCON | 353002 | |
| 70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| 100 mm Petri dish | Iwaki | 3020-100 | |
| 7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A-11004 | |
| Anti-EphB2 APC-conjugated antibody | BD Biosciences | 564699 | |
| C57BL6/J mice | Japan SLC, Inc. | ||
| Clean bench | HITACHI | CCV-1306E | |
| Confocal laser scanning microscope | Olympus | FV3000 | |
| EDTA (0.5 mol/L) | Nacalai Tesque | 06894-14 | 2 mM |
| FACSMelody | BD Life Sciences-Biosciences | 661762 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | 173012 | 1% (v/v) |
| Fiji (software) | https://fiji.sc/ | ||
| Gentamicin (10 mg/mL) | Nacalai Tesque | 16672-04 | 25 μg/mL |
| Hammacher laboratory scissor | SANSYO | 91-1538 | |
| Incubator | Panasonic | MCO-170-PJ | |
| Laboratory tweezer | AS-ONE | 7-164-04 | |
| L-Glutamine 200 mM | Gibco | 25030081 | 2 mM |
| Matrigel | BD Biosciences | 354230 | ECM for 3D organoids |
| Mouse Anti-Human Lysozyme | LSBio | LS-B8704-100 | |
| Murine EGF (20 μg/mL stock solution) | PeproTech | 315-09 | 20 ng/mL |
| PBS 1x | Gibco | 10010-023 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | 50 U/mL |
| Pipetman (10 μL, 20 μL, 200 μL, and 1,000 μL) | GILSON | 1-6855-12, -13, -15, and -16 | |
| Recombinant murine Noggin (20 μg/mL stock solution | R&D Systems | 1967-NG-025 | 100 ng/mL |
| Recombinant murine R-Spondin 1 (250 μg/mL stock solution) | R&D Systems | 3474-RS-050 | 500 ng/mL |
| Sorbitol | Nacalai Tesque | 32021-95 | 2% (w/v) |
| TE2000-S (inverted microscope) | Nikon | 24131 | |
| Time-lapse image microscope | Olympus | LCV100 | |
| TrypLE Express 1x | Gibco | 12605-010 | |
| ULVAC | ULVAC KIKO Inc. | 100073 | |
| Y-27632 | Fujifilm | 331752-47-7 | 10 μM |
References
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Seidlitz, T., et al. Human gastric cancer modelling using organoids. Gut. 68 (2), 207-217 (2019).
- Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).
- Artegiani, B., Clevers, H. Use and application of 3D-organoid technology. Human Molecular Genetics. 27, R99-R107 (2018).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. Organoid models of human gastrointestinal development and disease. Gastroenterology. 150 (5), 1098-1112 (2016).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469 (7330), 415-418 (2011).
- Aronowitz, J. A., Lockhart, R. A., Hakakian, C. S. Mechanical versus enzymatic isolation of stromal vascular fraction cells from adipose tissue. Springerplus. 4 (1), 713 (2015).
- Takahashi, T. New trends and perspectives in the function of non-neuronal acetylcholine in crypt-villus organoids in mice. Methods in Molecular Biology. 1576, 145-155 (2019).
- Batlle, E., et al. β-catenin and TCF mediate cell positioning in the intestinal epithelium by controlling the expression of EphB/ephrinB. Cell. 111 (2), 251-263 (2002).
- Baghdadi, M. B., Kim, T. -H. Analysis of mouse intestinal organoid culture with conditioned media isolated from mucosal enteric glial cells. STAR Protocols. 3 (2), 101351 (2022).
- Takahashi, T., et al. Non-neuronal acetylcholine as an endogenous regulator of proliferation and differentiation of Lgr5-positive stem cells in mice. FEBS Journal. 281 (20), 4672-4690 (2014).
- Barker, N. Adult intestinal stem cells: Critical drivers of epithelial homeostasis and regeneration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 19-33 (2014).
- Fordham, R. P., et al. Transplantation of expanded fetal intestinal progenitors contributes to colon regeneration after injury. Cell Stem Cell. 13 (6), 734-744 (2013).
- Miyoshi, H., et al. Wnt5a potentiates TGF-β signaling to promote colonic crypt regeneration after tissue injury. Science. 338 (6103), 108-113 (2012).
- Jung, P., et al. Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells. NatureMedicine. 17 (10), 1225-1227 (2011).
- Merlos-Suárez, A., et al. The intestinal stem cell signature identifies colorectal cancer stem cells and predicts disease relapse. Cell Stem Cell. 8 (5), 511-524 (2011).
- Mao, W., et al. EphB2 as a therapeutic antibody drug target for the treatment of colorectal cancer. Cancer Research. 64 (3), 781-788 (2004).
- Takahashi, T., et al. Muscarinic receptor M3 contributes to intestinal stem cell maintenance via EphB/ephrin-B signaling. Life Science Alliance. 4 (9), e202000962 (2021).
- Jung, P., et al. Isolation of human colon stem cells using surface expression of PTK7. Stem Cell Reports. 5 (6), 979-987 (2015).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Schulte, L., Hohwieler, M., Müller, M., Klaus, J. Intestinal organoids as a novel complementary model to dissect inflammatory bowel disease. Stem Cells International. 2019, 8010645 (2019).
- Puzan, M., Hosic, S., Ghio, C., Koppes, A. Enteric nervous system regulation of intestinal stem cell differentiation and epithelial monolayer function. Scientific Reports. 8 (1), 6313 (2018).
