Summary
Murin ince bağırsak kriptlerini ve kültür bağırsak 3D organoidlerini kriptlerden izole etmek için bir protokol tarif ediyoruz. Ek olarak, bir alt epitelyal hücresel nişin yokluğunda tek bir bağırsak kök hücresinden organoidler üretmek için bir yöntem tarif ediyoruz.
Abstract
Günümüzde organoid kültür, farklı organlardaki farklı biyolojik yönlerin ve hastalıkların in vitro çalışmaları için önemli bir araçtır. Murin ince bağırsak kriptleri, 3D hücre dışı bir matriste kültürlendiğinde bağırsak epitelini taklit eden organoidler oluşturabilir. Organoidler, çeşitli bağırsak homeostatik fonksiyonlarını yerine getiren tüm hücre tiplerinden oluşur. Bunlar arasında Paneth hücreleri, enteroendokrin hücreler, enterositler, kadeh hücreleri ve tutam hücreleri bulunur. İyi karakterize edilmiş moleküller, G proteinine bağlı reseptör 5 içeren lösin bakımından zengin tekrarlarla etiketlenmiş bağırsak kök hücrelerini (ISC'ler) zenginleştirmek için kültür ortamına eklenir ve spesifik soylarda farklılaşmayı sağlamak için kullanılır; Bu moleküller epidermal büyüme faktörü, Noggin (bir kemik morfogenetik proteini) ve R-spondin 1'i içerir. Ek olarak, tek bir eritropoietin üreten hepatosellüler reseptör B2 (EphB2)-pozitif ISC'den organoidler üretmek için bir protokol de detaylandırılmıştır. Bu yöntem makalesinde, ince bağırsak kriptlerini ve tek bir ISC'yi dokulardan izole etme ve organoidlerin etkin bir şekilde kurulmasını sağlama teknikleri anlatılmaktadır.
Introduction
İlk olarak 2009 yılında kurulan bağırsak organoidleri, olgun dokulara morfolojik ve fonksiyonel benzerlikleri göz önüne alındığında, bağırsak biyolojisini incelemek için güçlü bir in vitro araç olarak ortaya çıkmıştır. Son zamanlarda, yetişkin doku kök hücrelerinden türetilen kültürlü organoidlerdeki teknolojik gelişmeler, kendini yenileme ve farklılaşma potansiyeline sahip bağırsak kök hücrelerinin (ISC'ler) uzun süreli kültürüne izin vermiştir. Bu organoidler gastrointestinal fizyoloji ve patofizyoloji ile ilgili temel ve translasyonel araştırma çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır 1,2,3,4,5,6. Clevers grubu tarafından geliştirilen 3D organoidler, bağırsak epitelini gelişmiş fizyolojik alaka düzeyi ile incelemek için güçlü bir araç sağlar7. Bağırsak organoidleri doku kök hücrelerinden türetildiğinden ve birden fazla hücre tipinden oluştuğundan, bağırsak epitelinin işlevselliğini özetlerler. Not olarak, G proteinine bağlı reseptör 5-pozitif (Lgr5 +) kök hücre içeren tek sıralı lösin bakımından zengin tekrarlar, herhangi bir Paneth hücresi veya epitel nişi veya stromal niş7 gibi bir ISC nişi olmadan 3D organoidler de üretebilir. Bununla birlikte, tek sıralı Lgr5 + hücrelerinin organoid oluşturma kapasitesi, kript ve ISC-Paneth hücresi8'i ikiye katlar.
Giderek artan sayıda çalışma, etilendiamintetraasetik asit (EDTA) inkübasyonu veya kollajenaz ayrışması yöntemlerinin epitelde gevşemeye ve kriptlerin salınmasına neden olduğunu göstermiştir. Enzimatik ayrışmanın kriptlerin hücre durumu üzerinde bir etkisi olabileceğinden, dokuyu ayırmak için genellikle mekanik bir izolasyon yöntemi kullanılır. Mekanik sindirim hızlı bir teknik olmasına rağmen, bu yöntem tutarsız kript verimi veya zayıf hücre canlılığı ile ilişkilendirilebilir9. Bu nedenle, EDTA tedavisi ve mekanik ayrışma, daha iyi kript verimi elde etmek için birleştirilebilir. Bu makalede gösterilen metodolojinin bir özelliği, EDTA şelasyon10'dan sonra doku parçalarının kuvvetli bir şekilde sallanmasıdır. Güçlü sallama, ince bağırsaktaki kripto-villus komplekslerinden kriptlerin verimli bir şekilde izole edilmesine izin verir. Manuel sallama derecesi ayrımı belirler. Bu nedenle, komplekslerden kript elde etmek, bu alandaki deneyciler için önemlidir. Ek olarak, uygun beceri villus kontaminasyonunu en aza indirebilir ve kript sayısını artırabilir.
Bu nedenle, murin türevi ince bağırsak organoidlerini kullanan bu deneysel protokol, ayrışma için EDTA ile tedaviden sonra kriptleri fiziksel kuvvetle daha iyi izole edebilir. Eritropoietin üreten hepatosellüler reseptör B2'nin (EphB2) ekspresyon paterninin kısmen kript ortamını yansıttığı bilinmektedir. Örneğin, EphB2-pozitif hücreler aşağıdan üst11'e doğru düzenlenir. Floresan ile aktive hücre sıralama (FACS), EphB2 ekspresyonuna dayanarak gerçekleştirildi ve elde edilen hücreler dört gruba ayrıldı: EphB2yüksek, EphB2med, EphB2düşük ve EphB2neg. Daha sonra, vahşi tip (WT) farelerde tek sıralı EphB2yüksek hücrelerinden organoid büyüme gösterilmiştir.
Protocol
Tüm fare deneyleri Suntory Hayvan Etik Komitesi (APRV000561) tarafından onaylanmıştır ve tüm hayvanlar laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için komite kurallarına uygun olarak muhafaza edilmiştir. Standart bir Muş mus küçlüsünün (C57BL6/J) WT suşu kullanıldı. 10 haftalıktan 20 haftaya kadar hem erkek hem de dişi fareler kullanıldı. Fareler CO2 boğulması ile ötenazi yapıldı.
1. İnce bağırsağın izolasyonu
- Duodenum ve jejunumun proksimal yarısı da dahil olmak üzere ince bağırsakları laboratuvar makası ile tüketin.
- Dokuyu bir Petri kabına aktarın ve luminal içeriği temizlemek için ince bağırsakları 5 mL'lik bir şırıngada 5 mL soğuk PBS-ABx (PBS + penisilin-streptomisin [% 1] + gentamisin [% 0.5]) ile yıkayın.
- Dokuyu laboratuvar makası ile uzunlamasına kesin ve çalkalırken soğuk PBS-ABx ile manuel olarak yıkayın.
NOT: Villusun bir slaytla kazınmasıyla, villus kontaminasyonu azaltılabilir12. - Laboratuvar makası kullanarak bağırsak segmentinin yaklaşık 5 mm x 5 mm parçalarını toplayın. Parçaları cımbızla 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve 25 mL soğuk PBS-ABx ekleyin.
- 50 mL tüpteki bağırsak içeriğini çıkarmak için parçaları 25 mL soğuk PBS-ABx ile 10x ileri geri çalkalayarak yıkayın.
2. Kript izolasyonu
- Parçaları 2 mM EDTA içeren PBS-ABx'te buz üzerinde 30 dakika boyunca sarsıntı olmadan inkübe edin.
- Hücre dışı matrisin (ECM) kolay katılaşması için, önceden 37 ° C'lik bir doku kültürü inkübatöründe 24 delikli bir plakayı inkübe edin.
- EDTA çözeltisini hücre kültürü sisteminden bir vakum pompasıyla aspire edin, 25 mL taze, soğuk PBS-ABx ekleyin ve ardından kripto-villus komplekslerini serbest bırakmak için parçaları elle 30x-40x ile kuvvetlice yukarı ve aşağı sallayın.
NOT: Ayrılmış kriptler ve villuslar, süspansiyondan 25 μL'lik bir damlacığın 4x büyütmede mikroskobik gözlemi ile kontrol edilebilir. - Ardından, süspansiyonu 70 μm'lik bir süzgeçten bir kez filtreleyin.
- Süspansiyonu 390 × g'da 4 °C'de 3 dakika boyunca santrifüjleyin.
- 20 mL sorbitol DMEM (gelişmiş DMEM/F12 + penisilin-streptomisin [%1] + gentamisin [%0,5] + fetal sığır serumu [%1] + sorbitol [%2]) içindeki kript peletini pipetleme ile yeniden askıya alın ve kript süspansiyonunu düşük hızda santrifüj yapmak üzere iki adet 10 mL çözeltiye bölmek üzere iki yeni 15 mL tüpe aktarın.
NOT: Büyük hücre kütlesi ve hücreler/döküntüler düşük hızlı santrifüjleme kullanılarak ayrılabilir. Büyük hücre kütlesi pelet içindedir ve hücreler / döküntüler süpernatanttadır. - İki kript süspansiyonunu 80 × g'de 4 ° C'de 3 dakika boyunca santrifüj edin ve ardından süpernatantı yavaşça aspire edin.
NOT: Pelet oluşumu zayıf olduğundan, çok fazla aspire etmeyin. Her tüpte 2 mL süpernatant bırakın. - Her tüpe tekrar 10 mL sorbitol DMEM ekleyin. Süspansiyonu 80 × g'da 4 °C'de 3 dakika boyunca santrifüjleyin.
- Süpernatanı aspire ettikten sonra, her tüpte 2 mL süpernatant bırakarak, yeniden süspansiyon için 10 mL sorbitol DMEM ekleyin ve kript süspansiyonunu 80 × g'da 4 ° C'de son 3 dakika boyunca santrifüj edin.
- Süpernatanı aspire ettikten sonra, her tüpte 2 mL süpernatan bırakarak, peletin yukarı ve aşağı pipetleme yoluyla yeniden süspansiyonu için 10 mL tam DMEM (ileri DMEM / F12 + penisilin-streptomisin [% 1] + gentamisin [% 0.5] + fetal sığır serumu [% 1]) ekleyin ve 1 dakika bekletin.
NOT: Kayan kriptoları verimli bir şekilde elde etmek için 1 dakika bekleyin. - 1 dakika sonra, her 10 mL süspansiyonu toplam 20 mL için toplayın ve kriptleri saflaştırmak için 70 μm hücre süzgeci ile bir kez filtreleyin.
- Esasen saf kriptleri tohumlamadan önce, filtrelenmiş tam DMEM'deki kript sayısını sayın ve ardından 4 ° C'de 3 dakika boyunca 290 × g'da santrifüj yapın.
- 25 μL damlacıkları üç noktada 6 cm'lik bir tabağa damlatın. Mikroskop altındaki kript sayısını 4x büyütmede sayın ve 25 μL damlacık başına kript konsantrasyonunu hesaplayın.
- Kuyu başına 40 μL ECM ile 100 kriptoyu askıya alın. ECM'de homojen bir kript süspansiyonu elde etmek için 5x-10x yukarı ve aşağı borulayın ve ardından 37 °C önceden ısıtılmış 24 delikli bir plakada tohumlayın.
NOT: Polimerizasyonu önlemek için ECM'yi daima buz üzerinde tutun. ECM'de hava kabarcıkları oluşmasını önlemek için pipetleyin. - ECM'nin polimerizasyonu için 24 delikli plakayı 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörde 15 dakika boyunca inkübe edin.
- Son olarak, ECM'yi oda sıcaklığında fare epidermal büyüme faktörü (EGF), rekombinant fare R-spondin 1 ve rekombinant fare Noggin içeren 500 μL kültür ortamı ile örtün. Kuyu başına nihai malzeme konsantrasyonu aşağıdaki gibidir: penisilin-streptomisin (% 1), her biri 50 U / mL; gentamisin (%0,5), 25 μg/mL; EGF, 20 ng/mL; Noggin, 100 ng/mL; R-spondin 1.500 ng/mL; L-glutamin, 2 mM.
- Kript kültürünü 37 °C'de %5 CO2 inkübatörde başlatın.
NOT: 24 delikli bir plakadaki organoidler için kültür ortamı için, Tablo 1'e bakınız. - 7 güne kadar her 3 saatte bir 20x hedefle donatılmış bir kayıt hızlandırılmış görüntü mikroskobu ile organoid morfogenezi gözlemlemek için uzun süreli canlı görüntüleme gerçekleştirin. 1 μm'lik (1 μm x beş adım) z adımlarında seri z yığınlı görüntüler elde edin.
- Ortamı her geçen gün değiştirin.
3. Floresan ile aktive hücre sıralama (FACS)
- Kriptleri farelerden izole edin (bkz. bölüm 2).
- İzole edilmiş kriptleri 37 ° C'de 30 dakika boyunca 2 mL tripsin ile tedavi edin.
- 10 mL PBS ile reaksiyonu durdurun ve ardından 20 μm hücre süzgecinden geçirin.
- Çözeltiyi 390 × g'da 4 ° C'de 3 dakika boyunca santrifüj edin ve 100 μL tam DMEM ile yeniden askıya alın.
- Anti-EphB2 APC konjuge antikor (1/50) ekleyin ve buz üzerinde 30 dakika inkübe edin.
- Hücreleri PBS ile 3 kat yıkayın ve son olarak 7-amino-aktinomisin D (7-AAD) (1/100) ekleyin.
- Boyanmış hücreleri FACS ile sıralayın.
- Alan ölçeklendirme faktörünü ayarlayın ve hücre boyutuna (ileri saçılma, FSC-A) ve ayrıntı düzeyine (yan saçılma, SSC-A) göre sıralayın.
- 488 nm dalga boyunda ve 50 mV gücünde ayarlanmış lazer ile 7-AAD negatif ve pozitif hücreleri canlılık için sıralayın.
- EphB2 yüksek (EphB2yüksek), EphB2-orta (EphB2med), EphB2-düşük (EphB2 düşük) ve EphB2-negatif (EphB2neg) hücreleri 640 nm dalga boyunda ve 100 mV gücünde ayarlanmış lazerle sıralamak için kapıları ayırın.
- EphB2yüksek hücre kültürünü% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de başlatın.
4. Tek hücreli kültürlü organoidler
- Hücre izolasyon yöntemini derecelendirilmiş EphB2 yüzey seviyeleri11'e göre uygulayın ve ardından dört farklı popülasyon (yüksek, orta, düşük ve negatif) elde edin.
- 4 °C'de 3 dakika boyunca 390 × g'da santrifüjleme ile pelet toplayın ve tek sıralı EphB2yüksek hücrelerini pipetleme yoluyla ECM'ye gömün, ardından 24 delikli bir plakaya (100 singlets/40 μL ECM/kuyu) tohumlayın.
- Adım 2.14'te olduğu gibi, ECM'nin polimerize olmasına izin verin ve EphB2yüksek hücrelerini korumak için ECM'yi ilk 2 gün boyunca Rho ile ilişkili kinaz (ROCK) inhibitörü (10 μM) içeren bir kültür ortamı ile örtün.
NOT: ROCK inhibitörü anoikis'e karşı etkilidir. - Hücreleri 40x büyütmede ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak manuel olarak inceleyin ve küresel oluşum ve kript çıkıntısı olan canlı organoidleri gözlemleyin.
Representative Results
Fare ince bağırsak organoidleri üretmek için, kriptleri verimli bir şekilde izole etmek için EDTA tedavisi ve mekanik izolasyon yönteminin bir kombinasyonu kullanılabilir10,13. Bu çalışmanın sonuçları, izole edilmiş kriptlerin hemen hemen hepsinin epitel nişlerinden sıkıldıktan sonra hemen kapatıldığını ve koni şeklinde göründüğünü göstermiştir (Şekil 1A). Villus kontaminasyonunu en aza indirmek için, elde edilen süspansiyon 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirildi ve daha sonra filtrat santrifüj edildi. Bazı kriptler filtreleme ve süspansiyon sırasında bozulduğundan, bu adımlar dikkatli bir şekilde gerçekleştirilmelidir. Sonuçlar, son fraksiyondaki hemen hemen tüm kriptlerin entegre edildiğini ve kültürde kullanıma uygun olduğunu göstermiştir (Şekil 1B). Tüm kaplamalı kriptleri ayrı ayrı görselleştirmek için, kuyu başına 100 kript kaplanmıştır (Şekil 1C). Spesifik kript kültürü ortamı eklendikten sonra (Şekil 1D), organoidlerin gelişimi günlük olarak mikroskopla izlendi. Ayrıca, kriptlerden organoid büyüme, gelişimlerini izlemek için hızlandırılmış görüntülerle gözlenmiştir (Şekil 1E ve Ek Video S1). Kültürlü kriptler basmakalıp bir şekilde davrandılar. Organoidin iç lümeni bir apoptotik hücre kütlesi ile dolduruldu. ISC'lerin aktif çoğalması ve farklılaşması, tomurcuklanma ile birlikte kript bölgesinde meydana geldi (Şekil 1E ve Ek Video S1). Tomurcuklanma, ISC migrasyonu ve proliferasyonu ve Paneth hücre farklılaşması ile birleşti. Farklılaşmış Paneth hücreleri her zaman tomurcuklanma bölgesinde bulunuyordu (Ek Şekil S1). Organoidlerin 10x büyütmede ters çevrilmiş bir mikroskop kullanılarak kültürde stabil olduğu doğrulandığından, teknik, gelişmekte olan ince bağırsakta kript oluşumunu incelemek ve yeni bağırsak epitel hücrelerinin üretimi için doku rejenerasyonu ve ISC uzun süreli sağkalım kapasitesini belirlemek için kullanılabilir14,15,16.
Lgr5 bir ISC belirteci olarak tanımlanır ve murin Lgr5 + hücreleri 3D organoidlerioluşturur 7. Bununla birlikte, LGR5 proteininin hücre yüzeyi bolluğu düşük olduğundan ve yüksek afiniteli anti-LGR5 antikorlarının eksikliği olduğundan, murin ISC'lerini FACS ile verimli bir şekilde izole etmek zordur. EphB2 daha önce murin ve insan ISC'lerinin bağırsak dokularından saflaştırılması için bir yüzey belirteci olarak tanımlanmıştır17,18. EphB2'nin ifade kalıbı, ISC belirteçlerinde yer alan karmaşıklığı arttırır. EphB2-pozitif hücreler proliferatif bölme boyunca organize olurlar, kriptlerin dibinde zirveye ulaşırken, kriptlerin tepesine doğru bir gradyanda azalırlar11. Paneth hücreleri ve progenitör hücreler de kriptte lokalizedir. Paneth hücreleri esas olarak konumlandırmaları için gerekli olan EphB3'ü eksprese eder ve kriptteki üstlerindeki progenitör hücreler esas olarak EphB2'yi eksprese eder. Bu nedenle, anti-EphB2 antikoru kullanılarak ISC saflaştırması sırasında her iki hücre tipinin kontaminasyonu meydana gelebilir. Buna göre, belirteç gen ekspresyonu ve FACS tarafından EphB2 kullanılarak izole edilen hücrelerin organoid oluşturma kapasitesi değerlendirilmelidir.
Bu gerçeklere dayanarak, FACS analizi kullanılarak, EphB2 yüzey etiketli hücreler WT kriptleri19'dan izole edilebilir. EphB2 ekspresyonunun, ISC'ye özgü belirteç genleri (Lgr5, Ascl2 ve Olfm4) ve progenitör hücreye özgü belirteç genleri (Ki67, Myc ve FoxM1) gibi spesifik belirteçlerin ekspresyonu ile dört grup arasında ayrım yapıp yapamayacağı araştırılmıştır. Bu deney, EphB2yüksek hücrelerinin, EphB2med hücreleri20,21'in aksine, ağırlıklı olarak ISC'ler olduğunu göstermiştir. Son olarak, hücre izolasyon yöntemine dayanarak, elde edilen hücreler dört gruba ayrıldı (EphB2yüksek, EphB2med, EphB2düşük ve EphB2neg hücreleri) (Şekil 2). Daha sonra, FACS tarafından sıralanan yüksek EphB2 seviyelerini eksprese eden tek hücreler organoid büyüme için kültürlendi. Tek bir EphB2yüksek hücresi lokalize tedavi için bağımsız olarak uygulanabilir ve normal ince bağırsağı anımsatan kendi kendini organize eden kripto-villöz yapıları yeniden oluşturabilir (Şekil 3). Bununla birlikte, diğer gruplardan (EphB2med, EphB2düşük ve EphB2neg) türetilen hücreler organoidlerüretmez 20.
Önceki bir çalışmada, tek sıralı Lgr5-GFPhi hücrelerinin ~% 6'sı kripto-villöz organoidleri başlatabildi7. Bununla birlikte, kalan hücreler organoidler üretemedi ve ilk 12 saatiçinde öldü 7. Yazarlar bunun, izolasyon prosedürünündoğasında bulunan fiziksel ve / veya biyolojik stresin sonucu olduğunu varsaymışlardır 7. WT farelerde tek sıralı EphB2yüksek hücrelerinden% 6'dan daha az organoid büyüme de elde edildi. Kültürün 5. gününe gelindiğinde, sferoid benzeri yapılar oluşmuştur (Şekil 3). 7. günden 9. güne kadar, lekelerin kript oluşturmak için evaginasyonu meydana geldi (Şekil 3). Önemli olarak, seçilmiş bir ROCK inhibitörünün tek sıralı EphB2yüksek hücrelerine uygulanması, dissosiyasyona bağlı apoptozu azaltmış ve organoid büyümenin etkinliğini arttırmıştır.
Resim 1: Fare ince bağırsak organoidlerinin oluşumu. (A) EDTA şelasyonu ve mekanik ayrışmanın bir kombinasyonu ile hazırlanan kriptler. (B) Ortaya çıkan saflaştırılmış kriptler. (C) Hücre dışı matrise gömülü kriptler. (A-C) Siyah oklar kriptleri gösterir. (D) Kriptlerin ve organoidlerin üç boyutlu kültürü. (E) Bir kriptten türetilen büyüyen bir organoidin temsili görüntüleri. Beyaz oklar kript tomurcuklanmasını gösterir. Ölçek çubukları = (A-C) 100 μm ve (E) 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Vahşi tip farelerde EphB2-pozitif (EphB2+) hücre popülasyonu elde etmek için akış sitometrisi geçit stratejisi. (A) İleri ve yan saçılma grafikleri, hücreleri sırasıyla boyutlarına ve granülerliklerine göre ayırmak için kullanılır. (B) Floresan saçılımı, hücrelerin 7-AAD (PerCP) floresan yoğunluğuna göre canlı hücreleri ayırmak için kullanılır. 7-AAD-negatif hücre popülasyonu için kapı seçildi. (C) EphB2-yüksek (EphB2yüksek), EphB2-orta (EphB2med), EphB2-düşük (EphB2düşük) ve EphB2-negatif (EphB2neg) hücre popülasyonları için kapılar seçildi. Kısaltmalar: FSC-A = ileri saçılma-tepe alanı; SSC-A = yan saçılma-tepe alanı; 7-AAD = 7-amino-aktinomisin D. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Vahşi tip farelerde tek sıralı EphB2yüksek hücreli organoid büyümesinin zaman seyri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: 24 delikli bir plaka için kültür ortamı. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Video S1: Büyüyen bir organoidin hızlandırılmış görüntüleri. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil S1: Bir organoidde anti-lizozim antikor boyamasının temsili görüntüsü. Beyaz oklar Paneth hücrelerini gösterir. Kısaltma: DIC = diferansiyel girişim kontrast mikroskobu. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Bu protokol, ince bağırsak kriptlerini ve ardından 3D organoidlerin kültürünü tutarlı bir şekilde izole etmek için bir yöntemi açıklar. Kript serbest bırakma oranını artırmak için, EDTA ile tedaviden sonra kuvvetli sallamayı içeren mekanik bir izolasyon yöntemi oluşturulmuştur. Orta bileşim, Sato ve ark.7'nin orijinal protokolünden farklıdır. Orijinal ortam nispeten maliyetlidir. Bu nedenle, farmakolojik inhibitörler, rekombinant büyüme faktörleri ve / veya şartlandırılmış ortamlar içeren murin ince bağırsak organoidleri için bir kültür ortamı ve özelleştirilmiş bir ortam Tablo 1'de gösterilmiştir. Wnt3A ve N-asetilsistein bu protokoldeki kültür ortamına dahil değildir. Paneth hücreleri Wnt3'ü eksprese ederken, hücreler Wnt3 üretir ve ISC bakımını destekler. Ek olarak, kript yalıtımı sırasında, koşullu ortam kullanılmaz. Organoid model dinamiktir ve hücresel ve yapısal heterojeniteye sahiptir (Paneth hücreleri, enterositler, kadeh hücreleri, enteroendokrin hücreler, tutam hücreler ve ISC'ler). Bu nedenle, bu organoidler organoid biyolojinin temel konularını incelemek için ölçekte kullanılabilir.
EphB2 gradyanı, yetişkin ince bağırsakta kript-villus ekseni boyunca ISC sapını ve proliferasyonunu korur18. İzole edilmiş kriptlere kıyasla tek bir EphB2 hücresinden organoid yapmanın avantajı, murin ISC'lerinin biyolojisini anlamakla ilgilidir, çünkü ISC'ler çeşitli insan bağırsak bozukluklarında kilit rol oynamaktadır. Tek EphB2yüksek ekspresyonlu ISC'ler, tek Lgr5 eksprese eden ISC'lerden organoidlerin gelişimine benzer şekilde organoidler oluşturmak üzere kültürlenebilir. En önemli adım, FACS kullanan kriptolardaki EphB2 ifadesine göre hücreleri kesin olarak dört gruba (EphB2yüksek, EphB2med, EphB2düşük ve EphB2neg) ayırmaktır. İleriye karşı yan saçılma (FSC ve SSC) grafikleri, ilgilenilen hücreleri boyutlarına ve ayrıntı düzeylerine göre tanımlamak için yaygın olarak kullanılır. FSC, hücre boyutunu gösterir ve SSC, P0 kapısındaki hücrenin karmaşıklığı veya ayrıntı düzeyi ile ilgilidir (Şekil 2A). Bu çalışmada, tanımlanan kapının (P0) içine düşen hücreler daha sonra canlılık açısından analiz edildi. Daha sonra, canlılıkları 7-AAD floresan sinyallerinin negatif ve pozitif popülasyonlarına göre belirlendi. 7-AAD-negatif ve -pozitif hücreler arasındaki sınırın, minimum pozitif hücre kontaminasyonu ile negatif olanları kazanmasına kesin olarak karar verildi. EphB2 kapıları kabaca EphB2 dereceli ifadeye göre ayarlandı.
Dört grubun kesin olarak bölündüğünü doğrulamak için, seçilen genlerin mRNA ekspresyonu analiz edildi. ISC belirteçlerinin mRNA seviyeleri EphB2yüksek hücrelerinde yüksektir20. Ek olarak, progenitör hücreye özgü belirteçlerin mRNA seviyeleri, EphB2med hücrelerinde nispeten yüksektir20. Bununla birlikte, EphB2 düşük ve EphB2negatif hücrelerinde EphB2 ekstresi, EphB2yüksek ve EphB2med hücrelerininkine kıyasladüşük veya negatiftir 20. Kaplamadan önce EphB2yüksek hücre popülasyonunun zenginleştirilmesini sağlamak için yukarıdaki önlemler alınmalıdır. Bununla birlikte, EphB2yüksek hücrelerinden% 6'dan daha az organoid büyüme, kript izolasyonu sırasında kuvvetli sallanmaya değil, kültür işlemi sırasında kök hücrelerin ölümüne bağlı olabilir. İnsan embriyonik kök hücrelerine seçici bir Rho ilişkili kinaz (ROCK) inhibitörünün uygulanmasının, ayrışmaya bağlı apoptoz22'yi belirgin şekilde azalttığı gösterilmiştir. Bu nedenle, teknik bir değişiklik olarak, canlılığı artırmak için ROCK inhibitörünü daha yüksek bir konsantrasyonda ve daha uzun bir inkübasyonla eklemeye değer.
ISC'lerin yanındaki Wnt3A salgılayan Paneth hücreleri, ISC'ler8'e temel destek sağlar. Gerçekten de, ISC-Paneth hücre çiftleri, tek ISC'lere kıyasla güçlü bir şekilde artmış organoid oluşturma kapasitesi gösterir8. Ayrıca, kültürün ilk 3 günü boyunca 100 ng / mL konsantrasyonda Wnt3A ilavesinin organoid oluşturma kapasitesiniarttırdığı gösterilmiştir 8. Bu nedenle, başka bir teknik değişiklik olarak, eksojen Wnt3A eklenmesi, tek EphB2yüksek ekspresyonlu ISC'lerin organoid oluşturma kapasitesini artırabilir.
İn vivo yaklaşımlarla karşılaştırıldığında, organoidler genetik manipülasyon, malignite fenotiplerinin analizi ve ilaç taraması için kolayca kullanılabilir20,23. EDTA şelasyonu ve mekanik izolasyon yönteminin bir kombinasyonu, kriptlerden ince bağırsak organoidleri oluşturmak için etkili, tekrarlanabilir ve zaman açısından verimlidir ve herhangi bir ileri deneyim olmadan laboratuvar personeli tarafından kolayca takip edilebilir. Bu nedenle, EDTA ile tedaviden sonra kuvvetli sallama ile mekanik izolasyonun eklenmesi, murin ince bağırsak organoidlerini ex vivo olarak etkili bir şekilde kurabilir ve diğer yetişkin epitel dokularının organoid ekimi ve hastalık modellemesi için potansiyel bir araç sağlayabilir.
Bağırsak epitel hücreleri polarize olur ve apikal taraf lümene doğru yönlendirilerek yönlendirilir. Bununla birlikte, 3D organoidlerin lümenine bakan apikal taraf iç kısımlarındadır. Bu nedenle, bu organizasyon, besinler, mikroplar ve metabolitler gibi luminal bileşenlerin epitel hücreleri üzerindeki etkilerini incelerken bir sorun olan apikal tarafa erişimi önler. Bu dezavantajı aşmak için, 2D monokatmanlar olarak bir organoid hücre kültürü geliştirilmiştir24. Gelecekteki uygulamalar açısından, organoid hücre monokatmanlarının kültürü, en verimli ve izlenebilir sistemi temsil ettiği için kullanılacaktır.
Disclosures
Yazarların beyan edecekleri çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, T.T.'ye Bilimsel Araştırma için Hibe Yardımları (C) tarafından desteklenmiştir (JP17K07495 ve JP20K06751 hibe numaraları). Prof. Mineko Kengaku'ya uzun süreli hızlandırılmış görüntüleme için ekipman kullanımı için teşekkür ederiz (LCV100; Olympus).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Eppendorf | 0030 125.215 | |
| 5 mL syringe | TERUMO | SS-05SZ | |
| 15 mL Falcon tube | Iwaki | 2325-015 | |
| 20 μm cell strainer | Sysmex | 04-004-2325 | |
| 24-well plate | Iwaki | 3820-024 | |
| 50 mL Falcon tube | Iwaki | 2345-050 | |
| 60 mm tissue culture dish | FALCON | 353002 | |
| 70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| 100 mm Petri dish | Iwaki | 3020-100 | |
| 7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A-11004 | |
| Anti-EphB2 APC-conjugated antibody | BD Biosciences | 564699 | |
| C57BL6/J mice | Japan SLC, Inc. | ||
| Clean bench | HITACHI | CCV-1306E | |
| Confocal laser scanning microscope | Olympus | FV3000 | |
| EDTA (0.5 mol/L) | Nacalai Tesque | 06894-14 | 2 mM |
| FACSMelody | BD Life Sciences-Biosciences | 661762 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | 173012 | 1% (v/v) |
| Fiji (software) | https://fiji.sc/ | ||
| Gentamicin (10 mg/mL) | Nacalai Tesque | 16672-04 | 25 μg/mL |
| Hammacher laboratory scissor | SANSYO | 91-1538 | |
| Incubator | Panasonic | MCO-170-PJ | |
| Laboratory tweezer | AS-ONE | 7-164-04 | |
| L-Glutamine 200 mM | Gibco | 25030081 | 2 mM |
| Matrigel | BD Biosciences | 354230 | ECM for 3D organoids |
| Mouse Anti-Human Lysozyme | LSBio | LS-B8704-100 | |
| Murine EGF (20 μg/mL stock solution) | PeproTech | 315-09 | 20 ng/mL |
| PBS 1x | Gibco | 10010-023 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | 50 U/mL |
| Pipetman (10 μL, 20 μL, 200 μL, and 1,000 μL) | GILSON | 1-6855-12, -13, -15, and -16 | |
| Recombinant murine Noggin (20 μg/mL stock solution | R&D Systems | 1967-NG-025 | 100 ng/mL |
| Recombinant murine R-Spondin 1 (250 μg/mL stock solution) | R&D Systems | 3474-RS-050 | 500 ng/mL |
| Sorbitol | Nacalai Tesque | 32021-95 | 2% (w/v) |
| TE2000-S (inverted microscope) | Nikon | 24131 | |
| Time-lapse image microscope | Olympus | LCV100 | |
| TrypLE Express 1x | Gibco | 12605-010 | |
| ULVAC | ULVAC KIKO Inc. | 100073 | |
| Y-27632 | Fujifilm | 331752-47-7 | 10 μM |
References
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Seidlitz, T., et al. Human gastric cancer modelling using organoids. Gut. 68 (2), 207-217 (2019).
- Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).
- Artegiani, B., Clevers, H. Use and application of 3D-organoid technology. Human Molecular Genetics. 27, R99-R107 (2018).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. Organoid models of human gastrointestinal development and disease. Gastroenterology. 150 (5), 1098-1112 (2016).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469 (7330), 415-418 (2011).
- Aronowitz, J. A., Lockhart, R. A., Hakakian, C. S. Mechanical versus enzymatic isolation of stromal vascular fraction cells from adipose tissue. Springerplus. 4 (1), 713 (2015).
- Takahashi, T. New trends and perspectives in the function of non-neuronal acetylcholine in crypt-villus organoids in mice. Methods in Molecular Biology. 1576, 145-155 (2019).
- Batlle, E., et al. β-catenin and TCF mediate cell positioning in the intestinal epithelium by controlling the expression of EphB/ephrinB. Cell. 111 (2), 251-263 (2002).
- Baghdadi, M. B., Kim, T. -H. Analysis of mouse intestinal organoid culture with conditioned media isolated from mucosal enteric glial cells. STAR Protocols. 3 (2), 101351 (2022).
- Takahashi, T., et al. Non-neuronal acetylcholine as an endogenous regulator of proliferation and differentiation of Lgr5-positive stem cells in mice. FEBS Journal. 281 (20), 4672-4690 (2014).
- Barker, N. Adult intestinal stem cells: Critical drivers of epithelial homeostasis and regeneration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 19-33 (2014).
- Fordham, R. P., et al. Transplantation of expanded fetal intestinal progenitors contributes to colon regeneration after injury. Cell Stem Cell. 13 (6), 734-744 (2013).
- Miyoshi, H., et al. Wnt5a potentiates TGF-β signaling to promote colonic crypt regeneration after tissue injury. Science. 338 (6103), 108-113 (2012).
- Jung, P., et al. Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells. NatureMedicine. 17 (10), 1225-1227 (2011).
- Merlos-Suárez, A., et al. The intestinal stem cell signature identifies colorectal cancer stem cells and predicts disease relapse. Cell Stem Cell. 8 (5), 511-524 (2011).
- Mao, W., et al. EphB2 as a therapeutic antibody drug target for the treatment of colorectal cancer. Cancer Research. 64 (3), 781-788 (2004).
- Takahashi, T., et al. Muscarinic receptor M3 contributes to intestinal stem cell maintenance via EphB/ephrin-B signaling. Life Science Alliance. 4 (9), e202000962 (2021).
- Jung, P., et al. Isolation of human colon stem cells using surface expression of PTK7. Stem Cell Reports. 5 (6), 979-987 (2015).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Schulte, L., Hohwieler, M., Müller, M., Klaus, J. Intestinal organoids as a novel complementary model to dissect inflammatory bowel disease. Stem Cells International. 2019, 8010645 (2019).
- Puzan, M., Hosic, S., Ghio, C., Koppes, A. Enteric nervous system regulation of intestinal stem cell differentiation and epithelial monolayer function. Scientific Reports. 8 (1), 6313 (2018).
