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Biology

ऊतक डिस्सोसिएटर का उपयोग करके मुराइन व्हाइट एडीपोज ऊतक से स्ट्रोमल संवहनी अंश का अर्ध-स्वचालित अलगाव

Published: May 19, 2023 doi: 10.3791/65265
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 2, 2
1Division for Health Service Promotion, The University of Tokyo, 2Department of Diabetes and Metabolic Diseases, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 3The University of Tokyo Excellent Young Researcher Program, The University of Tokyo

Summary

यह प्रोटोकॉल प्रीडिपोसाइट्स प्राप्त करने और विट्रो में एडिपोसाइट्स भेदभाव प्राप्त करने के लिए मुराइन वसा ऊतक से स्ट्रोमल संवहनी अंश (एसवीएफ) के अर्ध-स्वचालित अलगाव का वर्णन करता है। कोलेजनेस पाचन के लिए ऊतक विघटनकारी का उपयोग प्रयोगात्मक भिन्नता को कम करता है और प्रजनन क्षमता बढ़ाता है।

Abstract

सफेद, भूरे और बेज एडिपोसाइट्स भेदभाव का इन विट्रो अध्ययन एडिपोसाइट्स और उनके तंत्र के सेल-स्वायत्त कार्यों की जांच को सक्षम बनाता है। अमर सफेद प्रीडिपोसाइट्स सेल लाइनें सार्वजनिक रूप से उपलब्ध हैं और व्यापक रूप से उपयोग की जाती हैं। हालांकि, बाहरी संकेतों के जवाब में सफेद वसा ऊतक में बेज एडिपोसाइट्स का उद्भव सार्वजनिक रूप से उपलब्ध सफेद एडिपोसाइट्स सेल लाइनों का उपयोग करके पूरी सीमा तक पुन: उत्पन्न करना मुश्किल है। मुराइन वसा ऊतक से स्ट्रोमल संवहनी अंश (एसवीएफ) का अलगाव आमतौर पर प्राथमिक प्रीडिपोसाइट्स प्राप्त करने और एडिपोसाइट्स भेदभाव करने के लिए निष्पादित किया जाता है। हालांकि, हाथ से वसा ऊतक के मिनसिंग और कोलेजनेस पाचन के परिणामस्वरूप प्रयोगात्मक भिन्नता हो सकती है और संदूषण का खतरा होता है। यहां, हम एक संशोधित अर्ध-स्वचालित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो प्रयोगात्मक भिन्नता को कम करने, संदूषण को कम करने और प्रजनन क्षमता बढ़ाने के उद्देश्य से एसवीएफ के आसान अलगाव को प्राप्त करने के लिए कोलेजनेज पाचन के लिए एक ऊतक विघटनकारी का उपयोग करता है। प्राप्त प्रीडिपोसाइट्स और विभेदित एडिपोसाइट्स का उपयोग कार्यात्मक और यांत्रिक विश्लेषण के लिए किया जा सकता है।

Introduction

वसा ऊतक जीव विज्ञान विश्व स्तर पर मोटापे और टाइप 2 मधुमेह के बढ़ते प्रसार के कारण लगातार ध्यान आकर्षित कर रहाहै। एडिपोसाइट्स लिपिड बूंदों के रूप में अतिरिक्त ऊर्जा संग्रहीत करते हैं, जो भुखमरी पर जारी होते हैं। इसके अलावा, वसा ऊतक एक अंतःस्रावी अंग के रूप में सेवा करके और अन्य ऊतकोंके साथ संचार करके प्रणालीगत ऊर्जा होमियोस्टैसिस को बनाए रखता है। दिलचस्प बात यह है कि अतिरिक्त वसा ऊतक (मोटापा) और वसा हानि (लिपोडिस्ट्रॉफी) दोनों इंसुलिन प्रतिरोध और मधुमेह1 से जुड़े हुए हैं। एडिपोसाइट्स को तीन प्रकारों में विभाजित किया गया है: सफेद, भूरा और बेज1। सफेद एडिपोसाइट्स मुख्य रूप से लिपिड के रूप में अतिरिक्त ऊर्जा को संग्रहीत करते हैं, जबकि भूरे और बेज एडिपोसाइट्स माइटोकॉन्ड्रियल अनकपलिंग प्रोटीन -1 (यूसीपी 1)1,4 के माध्यम से गर्मी के रूप में ऊर्जा को नष्ट करते हैं। विशेष रूप से, बेज एडिपोसाइट्स (जिसे "इंड्यूसेबल" ब्राउन एडिपोसाइट्स भी कहा जाता है) ठंड या सहानुभूति उत्तेजना के जवाब में सफेद वसा ऊतक में दिखाई देते हैं और जीन अभिव्यक्ति पैटर्न प्रदर्शित करते हैं जो "शास्त्रीय" ब्राउन एडिपोसाइट्स5 के साथ ओवरलैप होते हैं लेकिन अलग होते हैं। हाल ही में, ब्राउन और बेज एडिपोसाइट्स को "ऊर्जा सेवन को दबाने" के बजाय "ऊर्जा अपव्यय बढ़ाने" के उद्देश्य से एंटी-ओबेसिटी और एंटी-डायबिटीज उपचार के संभावित लक्ष्यों के रूप में अनुमानित किया गया है। सहायक रूप से, मनुष्यों में एफटीओ मोटापा संस्करण आरएस 1421085 का जोखिम एलील, जो सामान्य वेरिएंट 6,7 के बीच उच्च बॉडी मास इंडेक्स (बीएमआई) के साथ सबसे मजबूत संबंध प्रदर्शित करता है और विभिन्न जीन-पर्यावरण इंटरैक्शन8,9 प्रदर्शित करता है, को बेज एडिपोसाइट्स भेदभाव और फ़ंक्शन10 को नकारात्मक रूप से विनियमित करने की सूचना मिली है।. पेरोक्सीसोम प्रोलिफ़ेरेटर-सक्रिय रिसेप्टर γ (पीपीएआरओ) को एडिपोजेनेसिस के मास्टर ट्रांसक्रिप्शनल नियामक के रूप में जाना जाता है और एडिपोसाइट्स भेदभाव11 के लिए आवश्यक और पर्याप्त है। ट्रांसक्रिप्शनल नियामक, जैसे कि पीआरडी 1-बीएफ 1-आरआईजेड 1 समरूप डोमेन जिसमें 16 (पीआरडीएम 16), प्रारंभिक बी सेल फैक्टर 2 (ईबीएफ 2), और परमाणु कारक आई-ए (एनएफआईए) शामिल हैं, ब्राउन और बेज एडिपोसाइट्स भेदभाव और कार्य 12,13,14,15,16,17,18 के लिए महत्वपूर्ण हैं।. दूसरी ओर, सफेद एडिपोसाइट्स जीन प्रोग्रामिंग को ट्रांसक्रिप्शनल नियामकों की आवश्यकता होती है, जैसे कि ट्रांसड्यूसिन जैसे एन्हांसर प्रोटीन 3 (टीएलई 3) और जिंक फिंगर प्रोटीन 423 (जेडएफपी 423)19,20,21।

इन विट्रो मॉडल सिस्टम आणविक अध्ययन करने में सक्षम बनाते हैं जिसका उद्देश्य एडिपोसाइट्स के कार्यों और शिथिलता को अंतर्निहित तंत्र (ओं) की समझ में सुधार करना है। यद्यपि सार्वजनिक रूप से उपलब्ध और अमर प्रीएडिपोसाइट्स सेल लाइनें जैसे 3T3-L1 और 3T3-F442A 22,23,24 मौजूद हैं, प्राथमिक प्रीएडिपोसाइट्स की संस्कृति और एडिपोसाइट्स में भेदभाव विवो एडिपोजेनेसिस में अध्ययन के लिए एक अधिक उपयुक्त मॉडल होगा। मुराइन वसा ऊतक से स्ट्रोमल संवहनी अंश (एसवीएफ) का अलगाव प्राथमिक प्रीएडिपोसाइट्स25,26 प्राप्त करने के लिए एक प्रसिद्ध विधि है। हालांकि, वसा ऊतक का कोलेजनेज पाचन, जो आमतौर पर ट्यूब रैक के साथ एक बैक्टीरियल शेकर का उपयोग करके किया जाता है, प्रयोगात्मक भिन्नता का परिणाम हो सकता है और संदूषण27,28 से ग्रस्त है। यहां, हम एक वैकल्पिक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो एसवीएफ के आसान अलगाव को प्राप्त करने के लिए कोलेजनेज पाचन के लिए एक सौम्य चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एमएसीएस) ऊतक विघटनकारी का उपयोग करता है।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी पशु प्रयोगों को टोक्यो विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था और टोक्यो विश्वविद्यालय के संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया था।

1. एंजाइम समाधान और माध्यम की तैयारी

  1. 7-8 सप्ताह के माउस से इंगुइनल सफेद वसा ऊतक (दाएं और बाईं ओर, लगभग 150 मिलीग्राम) के दोनों किनारों और 2.5 मिलीलीटर एंजाइम समाधान को डिस्सोसिएटर के ट्यूब सी में डालें।
  2. भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) या एंटीबायोटिक दवाओं के बिना डलबेकको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम)/एफ 12 के 3 मिलीलीटर के साथ एंजाइम डी का पुनर्गठन करें, एफबीएस या एंटीबायोटिक दवाओं के बिना डीएमईएम / एफ 12 के 2.7 एमएल के साथ एंजाइम आर, और 1 एमएल बफर ए के साथ एंजाइम ए।
  3. 100 μL एंजाइम D, 50 μL एंजाइम R, 12.5 μL एंजाइम A, और 2.35 mL DMEM/F12 को बिना FBS या एंटीबायोटिक दवाओं के ट्यूब C में जोड़कर 2.5 mL एंजाइम घोल तैयार करें।

2. वसा ऊतक का अलगाव

  1. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा 7-8 सप्ताह के पुरुष C57BL / 6J चूहों (लगभग 20 ग्राम) को इच्छामृत्यु दें।
  2. एक साफ बेंच पर, इनुइनल सफेद वसा ऊतक को अलग करने के लिए, पेट पर और निचले छोरों की ओर कुंद / तेज कैंची से त्वचा को काट लें। तेज कैंची का उपयोग करके जांघों के अंदर से वसा ऊतक को अलग करें। इंगुइनल वसा ऊतक के एक तरफ ~ 75 मिलीग्राम वजन होता है।
  3. बर्फ पर एंजाइम समाधान के साथ ट्यूब सी में पृथक वसा ऊतक डालें, और बाँझपन बनाए रखने के लिए ट्यूब को साफ बेंच के भीतर रखें।

3. वसा ऊतक का मिश्रण और पाचन

  1. साफ बेंच पर, ट्यूब सी में 2.5 एमएल एंजाइम समाधान जोड़ें।
  2. वसा ऊतक को 50 बार तेज/तेज कैंची से काटकर छोटे-छोटे टुकड़ों में काट लें। वसा ऊतक को ~ 2 मिमी2 टुकड़ों में काटें।
  3. ट्यूब सी की टोपी को कसकर बंद करें, ट्यूब को उल्टा करें, और इसे टोपी के साथ ऊतक डिस्सोसिएटर की आस्तीन से संलग्न करें। फिर, 37 डिग्री सेल्सियस पर ~ 40 मिनट के लिए नमूने को पचाएं।
    नोट: इस अध्ययन में हीटर (मिल्टेनी बायोटेक 130-096-427) के साथ जेंटलएमएसीएस ऑक्टो डिस्सोसिएटर का उपयोग किया गया था, और पूर्वस्थापित प्रोग्राम "37C_mr_ATDK_1" का पालन किया गया था।

4. सेल निलंबन का निस्पंदन

  1. एफ 12 जिसमें 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन होता है, 37 डिग्री सेल्सियस तक।
  2. ट्यूब सी को ऊतक विघटनकर्ता से अलग करें और 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त डीएमईएम / एफ 12 के 5 मिलीलीटर को जोड़कर पाचन को रोकें और धीरे से चार बार पाइप करें।
  3. 20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 700 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  4. सेल गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाले को ध्यान से एस्पिरेट करें।
  5. 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त डीएमईएम /एफ 12 के 10 एमएल को जोड़कर और धीरे से पांच बार पाइप िंग करके गोली को फिर से निलंबित करें।
  6. एक नई 50 एमएल ट्यूब पर रखे गए 70 μm व्यास सेल छन्नी के माध्यम से सेल निलंबन को फ़िल्टर करें।
  7. 5 मिनट के लिए 250 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें और 10 मिलीलीटर फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) में गोली को फिर से निलंबित करें।

5. सेल चढ़ाना

  1. 5 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  2. सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त डीएमईएम / एफ 12 के 10 एमएल को जोड़कर गोली को फिर से निलंबित करें और दस बार पाइपिंगकरें।
  3. सेल सस्पेंशन को 10 सेमी कोलेजन-लेपित डिश पर प्लेट करें और व्यंजन को 1-2 घंटे के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) में रखें।
    नोट: कोलेजन-लेपित व्यंजन बिल्कुल आवश्यक नहीं हैं। हालांकि, अनुभव के आधार पर, कोलेजन-लेपित व्यंजन प्रीडिपोसाइट्स के पालन में मदद करते हैं और इस प्रकार कोशिकाओं के अस्तित्व को बढ़ाते हैं।
  4. माध्यम को एस्पिरेट करें और कोशिकाओं को प्रति वॉश 3 एमएल पीबीएस के साथ दो बार धोएं।
  5. एफ 12 के 10 एमएल जोड़ें जिसमें 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन शामिल हैं और व्यंजन ों को सेल-कल्चर इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) में वापस करें।

6. प्रीडिपोसाइट्स का पासिंग

  1. अगले दिन, माध्यम को एस्पिरेट करें (कोशिकाएं अनुयायी होंगी, और इस प्रकार माध्यम को एस्पिरेटेड किया जा सकता है), कोशिकाओं को प्रति वॉश 3 एमएल पीबीएस के साथ दो बार धोएं, और 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त डीएमईएम / एफ 12 के 10 एमएल जोड़ें।
  2. जब कोशिकाएं 80% संगम (आमतौर पर एसवीएफ अलगाव के 4 दिन बाद) तक पहुंच जाती हैं, तो कोशिकाओं को चार 10 सेमी कोलेजन-लेपित व्यंजनों में विभाजित करें।
    1. विशेष रूप से, माध्यम को एस्पिरेट करें, पीबीएस (कमरे के तापमान [आरटी]) के साथ कोशिकाओं को धोएं, पूर्व-गर्म 0.05% ट्रिप्सिन के 1 एमएल जोड़ें, और सेल-कल्चर इनक्यूबेटर में 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. ट्रिप्सिन गतिविधि को बुझाने के लिए 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त डीएमईएम / एफ 12 के 10 एमएल जोड़ें। पाइपिंग के बाद, 5 मिनट के लिए 440 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    3. सतह पर तैरनेवाला को एस्पिरेट करें, 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त डीएमईएम / एफ 12 के 40 एमएल को जोड़कर कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, और कोशिकाओं को चार 10 सेमी कोलेजन-लेपित व्यंजनों में प्लेट करें।
  3. 80% संगम तक पहुंचने पर कोशिकाओं को फिर से पारित करें।

7. प्रीएडिपोसाइट्स (वैकल्पिक) के अमरीकरण के लिए एसवी 40 बड़े टी एंटीजन को व्यक्त करने वाले रेट्रोवायरस की तैयारी

  1. अमरीकरण से कम से कम 3 दिन पहले, प्लेट प्लैटिनम-ई (प्लेट-ई) पैकेजिंग कोशिकाएं29 3.0 x 105 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर डीएमईएम के 2 एमएल में एंटीबायोटिक दवाओं के बिना 10% एफबीएस के साथ। कोशिकाओं की गिनती के लिए एक हेमसाइटोमीटर का उपयोग करें।
  2. अगले दिन, निर्माता के निर्देशों के अनुसार, लिपोफेक्टामाइन 2000 का उपयोग करके पीबीईबीई-नियो लार्जटीसीडीएनए (जीन प्लास्मिड # 1780 जोड़ें) के 4 μg को स्थानांतरित करें।
  3. 24 घंटे के बाद, माध्यम को एस्पिरेट करें और 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ डीएमईएम के 2 एमएल जोड़ें।
  4. अगले दिन, रेट्रोवायरल सुपरनैटेंट की कटाई करें। रेट्रोवायरस का उपयोग तुरंत अमरीकरण के लिए किया जा सकता है या -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

8. एसवी 40 बड़े टी एंटीजन (वैकल्पिक) के साथ प्रीडिपोसाइट्स का अमरीकरण।

  1. एसवीएफ अलगाव के बाद दो बार प्रीडिपोसाइट्स को पारित और विस्तारित करें।
  2. 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ डीएमईएम / एफ 12 के 2 एमएल में 0.5-1.0 x 104 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर 6-वेल प्लेटों में कोशिकाओं को प्लेट करें। कोशिकाओं की गिनती के लिए एक हेमसाइटोमीटर का उपयोग करें।
  3. अगले दिन, 6-वेल प्लेटों के प्रति कुएं में एसवी 40 बड़े टी एंटीजन को व्यक्त करते हुए ताजा या पिघले हुए रेट्रोवायरस के 250 μL तैयार करें। 5 मिनट के लिए 440 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरनेवाला को एक नई ट्यूब में रखें।
  4. काम करने वाले वायरस बनाने के लिए डीएमईएम /एफ 12 के 750 μL जिसमें 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन और 1 μL पॉलीब्राइन प्रति 250 μL रेट्रोवायरल सुपरनैटेंट शामिल हैं।
  5. माध्यम को एस्पिरेट करें और प्रीडिपोसाइट्स युक्त प्रत्येक कुएं में 1,000 μL कार्यशील रेट्रोवायरस जोड़ें।
  6. 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन 4 घंटे बाद 1 एमएल डीएमईएम / एफ 12 जोड़ें।
  7. अगले दिन, संक्रमित प्रीडिपोसाइट्स को 10 सेमी डिश में अलग करें और 10% एफबीएस, 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन और 500 μg / mL neomycin युक्त DMEM / F12 के साथ संक्रमित कोशिकाओं का चयन करें। एंटीबायोटिक ्स चयन की निगरानी के लिए, नियोमाइसिन के साथ असंक्रमित कोशिकाओं का एक पकवान तैयार करें।
  8. संक्रमित कोशिकाओं को निओमाइसिन के साथ पारित करना जारी रखें जब तक कि मॉनिटर डिश में सभी असंक्रमित कोशिकाएं मर न जाएं।

9. एडिपोसाइट्स भेदभाव

  1. कोशिकाओं को प्लेट करें। 12-वेल प्लेटों के लिए, कोशिकाओं को डीएमईएम / एफ 12 के 1 एमएल में 4.0 x10 4 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर प्लेट करें जिसमें 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन शामिल हैं।
  2. जब प्रीडिपोसाइट्स कंफ्लुएंट हो जाते हैं (चढ़ाना के 48-72 घंटे बाद), माध्यम को एस्पिरेट करें और इसे विभेदन माध्यम से बदलें (संरचना के लिए तालिका 1 देखें)।
  3. विभेदन के दिन 2 पर (यानी, विभेदन को प्रेरित करने के 48 घंटे बाद), माध्यम को रखरखाव माध्यम से प्रतिस्थापित करें (संरचना के लिए तालिका 1 देखें)। बाद में, हर 2 दिनों में रखरखाव माध्यम बदलें। टर्मिनल भेदभाव भेदभाव के दिन 7 पर प्राप्त किया जाता है।
  4. तेल लाल और धुंधला
    1. तेल लाल ओ धुंधला होने के लिए, माध्यम को एस्पिरेट करें और कोशिकाओं को प्रति अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर पीबीएस के साथ कुल्ला करें। प्रति कुएं 4% फॉर्मलाडेहाइड के 1 एमएल जोड़कर कोशिकाओं को ठीक करें, और आरटी पर 15 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    2. इनक्यूबेशन के दौरान, डीडीएच2ओ का उपयोग करके 0.5% तेल रेड ओ स्टॉक समाधान (आइसोप्रोपिल अल्कोहल में) को 0.3% तक पतला करें और फ़िल्टर पेपर का उपयोग करके काम करने वाले समाधान को फ़िल्टर करें।
    3. 15 मिनट के इनक्यूबेशन के बाद, फॉर्मलाडेहाइड को हटा दें, 60% आइसोप्रोपिल अल्कोहल के साथ कोशिकाओं को कुल्ला करें, 1 एमएल फ़िल्टर किए गए तेल लाल ओ वर्किंग सॉल्यूशन जोड़ें, और आरटी पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. इनक्यूबेशन के बाद सेल्स को बहते पानी से धो लें। फिर, एक उल्टे माइक्रोस्कोप (आवर्धन: 20x उद्देश्य और 10x आईपीस) के तहत लिपिड-लदी एडिपोसाइट्स का निरीक्षण करें।
  5. एमआरएनए अभिव्यक्ति विश्लेषण
    नोट: इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले प्राइमरों की सूची के लिए तालिका 2 देखें।
    1. मध्यम को एस्पिरेट करें और कुएं में ट्राइज़ोल का 1 एमएल / कुआं जोड़ें।
    2. आरटी पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, पाइपिंग द्वारा कोशिकाओं को अलग करें, और 1.5 एमएल ट्यूबों में नमूने एकत्र करें। आरएनए निष्कर्षण तक नमूने -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जा सकते हैं।
    3. जमे हुए नमूने को आरटी में पिघलाएं, नमूने में क्लोरोफॉर्म के 200 μL जोड़ें, और 15 सेकंड के लिए जोर से हिलाएं।
    4. 3 मिनट के लिए आरटी पर नमूने को इनक्यूबेट करें और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 20,000 एक्स जी पर स्पिन करें।
    5. जलीय चरण (शीर्ष, रंगहीन) को ध्यान से हटा दें और नए ट्यूबों में स्थानांतरित करें। प्रोटीन चरण (मध्य, सफेद) या फिनोल / क्लोरोफॉर्म चरण (नीचे, गुलाबी) को कभी भी स्थानांतरित न करें।
    6. धीरे-धीरे 70% ईटीओएच की बराबर मात्रा जोड़ें और धीरे से मिलाएं। भंवर मत करो।
    7. नमूना (700 μL तक) को एक संग्रह ट्यूब में बैठे आरएनए स्पिन कॉलम में लोड करें। किसी भी अवक्षेप को शामिल करना सुनिश्चित करें जो बन सकता है।
    8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड के लिए 9,000 x g पर स्पिन करें, और फिर प्रवाह-थ्रू को छोड़ दें।
    9. बफर आरडब्ल्यू 1 के 700 μL जोड़ें, 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड के लिए 9,000 x g पर स्पिन करें, और फिर प्रवाह-थ्रू को छोड़ दें।
    10. कॉलम को एक नई संग्रह ट्यूब में स्थानांतरित करें और बफर आरपीई के 500 μL जोड़ें।
    11. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड के लिए 9,000 x g पर स्पिन करें और फिर प्रवाह-थ्रू को छोड़ दें।
    12. बफर आरपीई के 500 μL जोड़ें, 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 9,000 x g पर स्पिन करें, और फिर प्रवाह-थ्रू को छोड़ दें।
    13. कॉलम को एक नई संग्रह ट्यूब में स्थानांतरित करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 1-2 मिनट के लिए 9,000 x g पर (बफर के बिना कॉलम) स्पिन करें।
    14. कॉलम को एक नई 1.5 एमएल संग्रह ट्यूब में स्थानांतरित करें और कॉलम झिल्ली पर सीधे 30 μL RNase-मुक्त पानी जोड़ें।
    15. 1-2 मिनट के लिए आरटी पर नमूने को इनक्यूबेट करें। फिर, आरएनए को अलग करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 9,000 x g पर स्पिन करें।
    16. फ्लोरोस्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करके आरएनए एकाग्रता की जांच करें।
      नोट: यहां एकाग्रता को संरेखित करने की सिफारिश की जाती है।
    17. आरएनए टेम्पलेट के ~ 200 एनजी का उपयोग करके रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन करें। एक वाणिज्यिक मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूपीसीआर-आरटी) किट का उपयोग करें और निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करें। प्रतिक्रिया के बाद, सीडीएनए को 20 बार 200 μL तक पतला करें।
    18. 384-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में 2.0 μL cDNA, 3.0 μL Power Sybr Green Master Mix, 0.018 μL of 100 μM qPCR फॉरवर्ड प्राइमर, 0.018 μL of 100 μM qPCR रिवर्स प्राइमर और 0.96 μL ddH2O जोड़ें।
    19. एक क्यूपीसीआर चलाएं (स्टेज रखें: 2 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस और 2 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस; पीसीआर चरण: 15 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 40 चक्र और 1 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस; पिघल वक्र चरण: 15 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 1 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस और 15 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस)। परिमाणीकरण के लिए मानक वक्र विधि का उपयोग करें।

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Representative Results

यह प्रोटोकॉल एडिपोसाइट्स भेदभाव को प्रेरित करने के 7 दिन बाद पूरी तरह से विभेदित, लिपिड से भरे एडिपोसाइट्स उत्पन्न करता है। एडिपोसाइट्स भेदभाव की डिग्री का मूल्यांकन ट्राइग्लिसराइड्स और लिपिड (चित्रा 1 ए) के तेल लाल ओ धुंधलापन द्वारा किया जा सकता है, या एडिपोसाइट्स जीन के क्यूपीसीआर-आरटी का उपयोग करके एमआरएनए अभिव्यक्ति विश्लेषण, जैसे कि एडिपोजेनेसिस पीपरग के मास्टर नियामक और इसके लक्ष्य फैब4 (चित्रा 1 बी)। विट्रो में बेज एडिपोसाइट्स भेदभाव को प्रेरित करने के लिए, पीपीएआर के थियाज़ोलिडिनडियोन वर्ग, जैसे कि रोज़िग्लिटाज़ोन का उपयोग किया जा सकता है। दरअसल, रोज़िग्लिटाज़ोन के प्रयोगों में, हम भूरे रंग के वसा-विशिष्ट जीन, जैसे कि यूसीपी 1 और पीपीएआरजीसी 1 ए के अभिव्यक्ति स्तर पर 1 μM तक सांद्रता के खुराक-निर्भर प्रभाव का निरीक्षण करते हैं। दूसरी ओर, फैब4 पर रोज़िग्लिटाज़ोन का प्रभाव 0.1 μM (चित्रा 1 सी) की एकाग्रता पर संतृप्त होता है।

इस प्रोटोकॉल द्वारा प्राप्त विभेदित एडिपोसाइट्स का उपयोग विभिन्न कार्यात्मक और यांत्रिक विश्लेषणों के लिए किया जा सकता है, जैसे ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) विश्लेषण16,30 (चित्रा 2 ए) और क्रोमैटिन इम्यूनोप्रेसिटेशन 31 (सीएचआईपी; चित्रा 2 बी)। अमर प्रीडिपोसाइट्स को व्यवहार्यता के नुकसान के बिना एक तरल नाइट्रोजन सेल भंडारण प्रणाली में संग्रहीत किया जा सकता है और प्रयोगों में उपयोग के लिए किसी भी समय पिघलाया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: लिपिड-लदी एडिपोसाइट्स में प्रीडिपोसाइट्स का भेदभाव । (ए) जंगली प्रकार के चूहों के इंगुइनल सफेद वसा ऊतक (आईडब्ल्यूएटी) से एसवीएफ को एडिपोसाइट्स भेदभाव के दिन 0 या 7 पर तेल लाल ओ से दाग दिया गया था। (बी) एडिपोसाइट्स भेदभाव के दिन 0 और दिन 7 पर प्पार्ग और फैब4 के एमआरएनए अभिव्यक्ति स्तर (औसत [एसईएम] की औसत ± मानक त्रुटि); एन = 3)। (सी) सामान्य एडिपोसाइट्स मार्कर फैब4 और ब्राउन वसा-विशिष्ट जीन यूसीपी 1 और पीपीएआरजी1ए की एमआरएनए अभिव्यक्ति एसवीएफ-व्युत्पन्न एडिपोसाइट्स में 0.1, 0.2, 0.5, और 1.0 μM रोज़िग्लिटाज़ोन के साथ भेदभाव और रखरखाव माध्यम के साथ इलाज किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: विभेदित एडिपोसाइट्स के साथ कार्यात्मक और यांत्रिक विश्लेषण के उदाहरण। (ए) आईडब्ल्यूएटी एसवीएफ-व्युत्पन्न एडिपोसाइट्स का ओसीआर विश्लेषण (एन = 10)। (ख) विभेदन के दिन 0 और 7 पर एनफियाफ्लोक्स/फ्लोक्स आईडब्ल्यूएटी एसवीएफ-व्युत्पन्न एडिपोसाइट्स में एच3के27एसी के लिए सीएचआईपी-क्यूपीसीआर। Ins-0.4 kb और Fabp4-13 kb साइट पृष्ठभूमि साइटों के रूप में दिखाए जाते हैं (मतलब ± S.E.M); एन = 2)। दोनों प्रयोगों के लिए, बेज एडिपोसाइट्स भेदभाव को प्रेरित करने के लिए भेदभाव और रखरखाव माध्यम के साथ 1.0 μM रोज़िग्लिटाज़ोन जोड़ा गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: विभेदन और रखरखाव माध्यम की संरचना। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 2: इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले प्राइमरों की सूची। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

यहां, हमने प्रीडिपोसाइट्स प्राप्त करने और विट्रो में एडिपोसाइट्स भेदभाव करने के लिए मुराइन एडीपोज ऊतक से एसवीएफ के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया। कोलेजनेस पाचन के लिए एक ऊतक विघटनकारी के उपयोग ने प्रयोगात्मक भिन्नता को कम कर दिया, संदूषण के जोखिम को कम कर दिया, और प्रजनन क्षमता में वृद्धि की। जबकि यह प्रक्रिया प्रस्तुत प्रोटोकॉल के भीतर एक महत्वपूर्ण कदम है, प्रक्रिया अत्यधिक स्वचालित है और अनुकूलन की आवश्यकता नहीं है। हालांकि, माउस की उम्र और वसा ऊतक डिपो के आधार पर, मिंसिंग का अनुकूलन, उदाहरण के लिए आकार के टुकड़े या काटने का समय, आवश्यक हो सकता है।

एसवीएफ को एक हेटरोजेनस आबादी के रूप में जाना जाता है जिसमें प्रीडिपोसाइट्स, प्रतिरक्षा कोशिकाएं जैसे मैक्रोफेज, एंडोथेलियल कोशिकाएं और अन्य कोशिकाएं शामिल हैं। क्योंकि प्रीडिपोसाइट्स संस्कृति व्यंजनों का पालन करते हैं और धोने और मध्यम परिवर्तनों के प्रति सहनशील होते हैं, वे मार्ग के दौरान सेल आबादी में समृद्ध होते हैं। हालांकि, यह मानना उचित है कि इस प्रोटोकॉल द्वारा प्राप्त "प्रीडिपोसाइट्स" अभी भी विषम हैं। पीडीजीएफआर32 जैसे प्रीएडिपोसाइट्स के पहले से रिपोर्ट किए गए सतह मार्करों के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करके फ्लोरोसेंट-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) को शुद्ध प्रीएडिपोसाइट्स आबादी प्राप्त करने की आवश्यकता होगी।

सारांश में, हमने यहां कोलेजनेस पाचन के लिए ऊतक डिस्सोसिएटर का उपयोग करके एसवीएफ अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया है। यह प्रोटोकॉल ट्यूब रैक के साथ बैक्टीरियल शेकर का उपयोग करके पारंपरिक प्रोटोकॉल की तुलना में एसवीएफ का आसान अलगाव प्रदान करता है, और कम प्रयोगात्मक भिन्नता, कम संदूषण और बढ़ी हुई प्रजनन क्षमता प्रदान करता है16,17,18.

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Disclosures

लेखकों में से किसी के पास इस काम से संबंधित प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है।

Acknowledgments

लेखक ताकाहितो वाडा और साइको योशिदा (टोक्यो विश्वविद्यालय, टोक्यो, जापान) को उनकी प्रयोगात्मक सहायता के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को वाईएच को निम्नलिखित अनुदानों द्वारा वित्त पोषित किया गया था: टोक्यो उत्कृष्ट युवा शोधकर्ता कार्यक्रम विश्वविद्यालय से अनुसंधान अनुदान; जापान सोसाइटी फॉर द प्रमोशन ऑफ साइंस (जेएसपीएस) प्रारंभिक कैरियर वैज्ञानिकों के लिए काकेन्ही अनुदान-सहायता, अनुदान संख्या 19K17976; जापान फाउंडेशन फॉर एप्लाइड एनज़िमोलॉजी से फ्यूचर डायबिटीज रिसर्च (एफएफडीआर) के फ्रंट रनर के लिए अनुदान, अनुदान संख्या 17एफ005; फार्माकोलॉजिकल रिसर्च फाउंडेशन से अनुदान; मोचिदा मेमोरियल फाउंडेशन फॉर मेडिकल एंड फार्मास्युटिकल रिसर्च से अनुदान; एमएसडी लाइफ साइंस फाउंडेशन से अनुदान; दाइवा सिक्योरिटीज हेल्थ फाउंडेशन से अनुदान; टोक्यो बायोकेमिकल रिसर्च फाउंडेशन से अनुदान; टाकेडा साइंस फाउंडेशन से जीवन विज्ञान अनुसंधान अनुदान; और सेनशिन मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन से अनुदान।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm dish Corning 430167
12 well plate Corning 3513
60 mm dish IWAKI 3010-060
Adipose Tissue Dissociation Kit, mouse and rat Miltenyi Biotec 130-105-808 contents: Enzyme D, Enzyme R, Enzyme A and Buffer A
Cell strainer 70 µm BD falcon #352350
Collagen coated dishes, 100 mm BD #356450
Collagen coated dishes, 60 mm BD #354401
Collagen I Coat Microplate 6 well IWAKI 4810-010
Dexamethasone Wako 041-18861
Dissecting Forceps N/A N/A autoclave before use
Dissecting Scissors, blunt/sharp N/A N/A autoclave before use
Dissecting Scissors, sharp/sharp N/A N/A autoclave before use
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement Gibco 10565-042
Fetal Bovine Serum (FBS) N/A N/A
gentleMACS C Tubes Milteny Biotec 130-093-237
gentleMACSOcto Dissociator with Heaters Miltenyi Biotec 130-096-427
Humulin R Injection U-100 Eli Lilly 872492
Indomethacin Sigma I7378-5G
Isobutylmethylxanthine (IBMX) Sigma 17018-1G
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668-019
Neomycin Sulfate Fujifilm 146-08871 
Opti-MEM Invitrogen  31985-062
pBABE-neo largeTcDNA (SV40) Add gene #1780
PBS tablets Takara T900
Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line cell biolab RV-101
Polybrene Nacalai Tesque 12996-81
Power Sybr Green Master Mix Applied Biosystems 4367659
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix TOYOBO #FSQ-201
RNeasy Mini Kit (250) QIAGEN 74106
Rosiglitazone Wako 180-02653
T3 Sigma T2877-100mg
Trypsin-EDTA (0.05%) Gibco 25200-056

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References

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जीव विज्ञान अंक 195
ऊतक डिस्सोसिएटर का उपयोग करके मुराइन व्हाइट एडीपोज ऊतक से स्ट्रोमल संवहनी अंश का अर्ध-स्वचालित अलगाव
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Saito, K., Hiraike, Y., Oguchi, M.,… More

Saito, K., Hiraike, Y., Oguchi, M., Yamauchi, T. Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator. J. Vis. Exp. (195), e65265, doi:10.3791/65265 (2023).

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