Summary
Bu makale, venöz ligasyon elde etmek için vasküler klipsler kullanarak bir fare kanseri modelinde venöz trombozu değerlendirmek için optimize edilmiş bir yöntem sunmayı amaçlamaktadır. Optimizasyon, trombozla ilişkili ölçümlerdeki değişkenliği en aza indirir ve insan kanseriyle ilişkili venöz trombozla alaka düzeyini artırır.
Abstract
Bu metodoloji makalesi, özellikle kanserle ilişkili tromboz (CAT) bağlamında, bir kemirgen venöz tromboz modelinin cerrahi nüanslarını vurgulamaktadır. Derin ven trombozu, kanserden kurtulanlarda sık görülen bir komplikasyondur ve potansiyel olarak ölümcül olabilir. Mevcut murin venöz tromboz modelleri tipik olarak bir sütür kullanılarak inferior vena kavanın (IVC) tam veya kısmi mekanik oklüzyonunu içerir. Bu prosedür, trombogenezi tetikleyen kan ve endotel hasarının tam veya kısmi durgunluğunu indükler. Mevcut modellerin pıhtı ağırlıklarında daha yüksek değişkenlik, önemli mortalite oranı ve uzamış öğrenme eğrisi gibi sınırlamaları vardır. Bu rapor, bu sınırlamaların bazılarını ele almak için vasküler klipsleri kullanan cerrahi iyileştirmeleri tanıtmaktadır. Sinjeneik kolon kanseri ksenogreft fare modeli kullanarak, infrarenal vena kavayı bağlamak için özelleştirilmiş vasküler klipsler kullandık. Bu klipsler, IVC ligasyonlarından sonra 5-0 polipropilen sütüre benzer şekilde rezidüel dudak boşluğuna izin verir. Sütür yöntemi ile fareler kontrol görevi gördü. Vasküler klips yöntemi, sütür yöntemine göre daha az değişkenlik ile tutarlı bir tekrarlanabilir parsiyel damar tıkanıklığı ve daha büyük pıhtı ağırlıkları ile sonuçlandı. Daha büyük pıhtı ağırlıkları, daha büyük pıhtı kütlesi ve IVC luminal yüzey alanına pıhtı, 6-0 polipropilen sütüre kıyasla vasküler kliplerin daha yüksek basınç profili nedeniyle bekleniyordu. Yaklaşım, sütür yöntemine kıyasla vasküler klipsli infrarenal vena kavada sürekli olarak daha fazla pıhtı kitlesi ortaya çıkaran gri skala ultrasonografi ile doğrulandı. Bu gözlemler, immünofloresan boyama ile daha da doğrulandı. Bu çalışma, farelerde bir venöz tromboz modeli oluşturmak için geliştirilmiş bir yöntem sunmaktadır ve bu, CAT'in mekanik anlayışını derinleştirmek için ve ilaç keşfi gibi translasyonel araştırmalarda kullanılabilir.
Introduction
Kanserle ilişkili venöz tromboembolizm (VTE)
Venöz tromboembolizm (VTE) riski, kanserden kurtulanlarda genel popülasyona göre 4 ila 7 kat daha yüksektir 1,2,3. Bu durum kanserli yedi hastadan birinde ölümcüldür. VTE insidansı, kanserin türüne ve tümör yüküne bağlı olarak değişir ve pankreas ve mide kanserli hastalar arasında en yüksektir4.
Kanser hastalarında kanserle ilişkili VTE'nin prognostik önemi vardır. Kanser teşhisinden sonraki ilk yılda, yaş, ırk ve altta yatan kanserin evresine göre ayarlandıktan sonra bile, olumsuz genel sağkalım ile ilişkilidir5. Bu bulgular, kanserle ilişkili VTE'nin incelenmesinin önemini ve bir hayvan modeli kullanarak mekanizmasını araştırma ihtiyacını vurgulamaktadır. Bu alanın translasyonel önemi, kanser hastalarında VTE'nin tromboprofilaksi ve antitrombotik tedavi ile önlenebilir ve tedavi edilebilir olması gerçeğiyle daha da vurgulanmaktadır6.
Kanser ve venöz trombozun hayvan modelleri
Kanser modelleri, geleneksel olarak farelerde kanser hücrelerinin enjeksiyonunu gerektiren ksenogreftler olarak adlandırılır. Kanser hücrelerinin orijini gibi bir bölgeye enjeksiyonu ortotopik model olarak adlandırılırken, farklı bir bölgede (kanat üzerinde deri altı düzlemi) heterotopik model olarak bilinir. Kanser hücrelerinin köken türü, onları HT-29 hücre hattı (insan kolon kanseri) gibi allojenik bir model olarak belirler7,8,9. Aksine, sinjeneik modeller, RenCa ve MC-38 hücre hatları 3,10 dahil olmak üzere murin kanseri hücre hatlarını kullanır.
Literatürde kemirgenlerde arteriyel, venöz ve kapiller tromboz modelleri tanımlanmıştır. Venöz tromboz, inferior vena kavada (IVC) mekanik yaralanma (kılavuz tel) veya tam IVC ligasyonu, kimyasal (Ferrik klorür) veya elektrolitik yaralanma ile indüklenir. Ferrik klorür kaynaklı tromboz veya IVC ligasyonu, tam oklüzyon modellerini temsil eder. Sonuncusu, damarlarda kan ve enflamatuar infiltratların durgunluğuna neden olur11,12,13. Tam ligasyon modeli, farelerin %95 ila %100'ünde yüksek oranda tromboz oluşumu ile sonuçlanır. Parsiyel IVC ligasyon modeli, lateral iliolumbar dalların kesilmesini içerebilir ve IVC12'nin distal hedef noktalarına sütür ligasyonları uygulanarak venöz dönüş ortadan kaldırılır. Bazen, venöz dönüşü kısmen kesmek için bir boşluk tutucu kullanılır. Bununla birlikte, mevcut parsiyel oklüzyon modelinde trombüs ağırlığı tutarsızdır, bu da pıhtı ağırlıklarında ve yüksekliklerinde yüksek değişkenliğe neden olur12,14.
Bu büyük damar mekanik modellerinin her ikisinin de (kısmi ve komple) sınırlamaları vardır. İlk olarak, IVC ligasyonu (staz modeli) sıklıkla hipotansiyona neden olur. Kan, vertebral damarlardan şant edilir. Deneyimli ellerde olmasına rağmen, bu modelde ölüm oranı %5-%30 arasında değişmekte olup, öğrenme eğrisi sırasında daha yüksek oran beklenmektedir. Daha da önemlisi, tam oklüzyon modeli, bir trombüsün tipik olarak tıkayıcı olmadığı insanlarda derin ven trombozunu (DVT) yeniden üretmez. Tam oklüzyonun hemoreolojik faktörleri ve farmakodinamik parametreleri değiştirmesi ve lokal bölgedeki bileşiklerin biyoyararlanımını değiştirmesi muhtemeldir. Bu sınırlamalar nedeniyle, tam oklüzyon modelleri, terapötik amaçlar ve ilaç keşifleri için yeni kimyasal bileşiklerin test edilmesi için uygun olmayabilir12.
Endotel hasarı ile azalmış akışa sahip klinik olarak anlamlı bir venöz tromboz murin modeli sağlamak için, DVT'nin endotel bozulması olmadığında kan akışının kısıtlanmasıyla tetiklendiği bir venöz tromboz modelinin tanıtıldığına dikkat edilmelidir. Model, taramalı elektron mikroskobu15 ile doğrulandı. Klinik olarak anlamlı bir tromboz modeli, ilaç keşiflerini mümkün kılan neredeyse tam trombozlu bir modeldir. Mevcut parsiyel oklüzyon modellerinde pıhtı oluşumu tutarsızdır, bu da pıhtı ağırlığı ve boylarında yüksek değişkenliğe neden olur12,16. Ayrıca, pıhtı ağırlığı geleneksel yöntemlerle değişkendir ve çalışma başına daha fazla fare gerektirir12.
Önceki kanserle ilişkili tromboz modelleri kolon, pankreas ve akciğer kanserine odaklandı ve hepsi tam oklüzyon modelleriydi17,18,19. Bu makale, daha düşük değişkenlik ve fare mortalitesi ile pıhtılar sağlamak için kısmi oklüzyon trombozu modelini değiştirmektedir (Şekil 1). Önceki çalışmalar, immün sistemi baskılanmış timik fareler arka planında allojenik kanser hücre dizilerini kullandı 19,20,21. Bu makale, C57Bl6/J farelerde immünkompetan farelerin kullanımına ve trombogeneze karşı immün bileşenlerin incelenmesine izin veren bir MC-38 hücre sinjeneik ksenogrefti kullanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma için, 8-12 haftalık ve 20 ila 25 g vücut ağırlığına sahip 16 dişi C57Bl6 / J faresi kullanıldı. Fareler standart koşullar altında barındırıldı ve yem ve su ad libitum ile beslendi. Bu çalışma Boston Üniversitesi'nde Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin (IACUC) onayı ile gerçekleştirilmiştir. Burada açıklanan açık prosedürler steril bir durumda gerçekleştirilmiştir.
1. Ksenogreft modeli
- Hücre kültürü
- Heterotopik deri altı implantasyonundan önce, MC-38 hücrelerini tek tabaka olarak% 80 birleşmeye kadar büyütün.
- %10 FBS içeren ortamda tripsinizasyon ve yeniden süspansiyonun ardından, hücreleri 277 x g'da, 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Ardından, serumsuz ortamdaki hücreleri 1 x 104 MC-38 hücre / μL serumsuz ortam konsantrasyonuna yeniden süspanse edin.
- Tripsinizasyon için, MC-38 hücrelerini istenen bir birleşmeye ulaşana kadar (genellikle yaklaşık% 70 -% 80) kültürleyin ve ardından kültür ortamını Petri kabından aspire edin.
- 1 mL tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve ayrılmaya izin vermek için hücreleri tripsin ile 37 ° C'de 1 dakika inkübe edin. Eşit şekilde ayrılmasını sağlamak için Petri kabına hafifçe vurun veya sallayın.
- Aktiviteyi nötralize etmek ve daha fazla hücre ayrışmasını önlemek için serum veya tripsin inhibitörü içeren bir kültür ortamı ekleyin. Ayrılmış hücreleri nötralize tripsin çözeltisi ile birlikte toplayın.
- Yeniden süspansiyon için, hücreler tripsinizasyon yoluyla ayrıldıktan sonra, onları transplantasyon veya daha ileri deneyler için hazırlayın. Hücreleri peletlemek için toplanan hücre süspansiyonunu 277 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı (hücre peletinin üzerindeki sıvı) dikkatlice çıkarın. Transplantasyon veya deney için istenen hücre konsantrasyonunu elde etmek için hücre peletine 9 mL kültür ortamı, tampon veya çözelti ekleyin.
- Yukarı ve aşağı pipetleyerek veya bir kültür şişesi çalkalayıcı kullanarak hücreleri nazikçe yeniden süspanse edin. Hücrelere zarar verebilecek güçlü pipetlemeden kaçının.
NOT: Kullanılan varyanta veya hücre hattına bağlı olarak, implantasyondan sonra oldukça agresif fare hücresi büyümesini ve yayılmasını yavaşlatmak için hücreler 1:1 oranında çözünmüş bazal membran matrisi ve serumsuz ortamda yeniden süspanse edilebilir. Tüm hücre kültürü adımları, özel olarak ayrılmış bir hücre kültüründe tam bir aseptik başlıkta gerçekleştirilmeli ve düzenli olarak mikoplazma için test edilmelidir.
- Hücreleri, sağlanan manuel protokole göre otomatik bir hücre sayacı ile sayın.
- Hücre implantasyonu
- Deney grubuna rastgele sekiz fare ve kontrol grubuna sekiz fare atayın. Kontrol grubunda, MC38 ksenogreftli fareler kullanın ve polipropilen 5-0 sütür ile IVC ligasyonu gerçekleştirin. Deney grubunda, MC38 ksenogreftli fareler kullanın ve özelleştirilmiş bir vasküler klips ile IVC ligasyonu yapın.
- Fareyi sol yanal yaslanacak şekilde yerleştirin ve sağ tarafı ön ayaklar ile arka ayaklar arasında tıraş edin. Bölgeyi enjeksiyona aseptik olarak hazırlamak için dorsal bel bölgesi boyunca alkol ve iyot uygulayın.
- 200 μL besiyerinde hazırlanan 2 x 106 MC-38 hücrelerini yanlara, hayvanın en distal kaburgası ile pelvik eminensi arasında, 27G'lik bir iğne kullanarak hayvanı baskın olmayan elde nazikçe tutarken enjekte edin.
- Enjeksiyondan sonra hayvanları dikkatlice inceleyin ve kafese geri koyun. Hayvanlar aşağıdakiler açısından denetlenmelidir; 1. Farelerin davranışlarındaki, aktivite seviyelerindeki ve genel hareketliliğindeki değişiklikler. Herhangi bir önemli değişiklik, rahatsızlığa veya sağlık sorunlarına işaret edebilir. 2. Kürk kalitesi, tımar alışkanlıkları ve gözle görülür herhangi bir sıkıntı veya anormallik belirtisi dahil olmak üzere farelerin genel fiziksel durumu 3. Gıda tüketimine ve su alımına geri dönün 4. Aktivite düzeylerindeki, duruşlarındaki veya kafes arkadaşlarıyla etkileşimlerindeki herhangi bir değişiklik. Uyuşukluk veya artan saldırganlık sıkıntı belirtileri olabilir.
2. Tümör büyümesinin takibi
- Hayvanları 3-4 hafta boyunca tümör büyüme eğilimleri için iki haftada bir izleyin. Tümörleri bir kumpas ile ölçün ve tümör boyutlarını kaydedin.
- Tümörleri en uzun eksenleri (L) ve uzun eksene dik eksenleri (W) boyunca ölçün. L x (W2) = V denklemini kullanarak tümör hacmini (V) hesaplayın. Tümör boyutu her boyutta 20 mm'yi aşarsa ve/veya tümörde ülserasyon kanıtı varsa, deneyin bitiminden önce hayvanlara ötenazi yapın.
- Tümör hacmi 400mm3'e ulaştığında, fareleri IVC ligasyonu için kullanmayı planlayın.
3. Anestezi ve hazırlık
- Fareyi bir izofluran odasında uyuşturun ve analjezik deri altına enjekte edin: Hayvanı kuyruğun tabanından tutun. Hayvanı baskın olmayan elin dorsum yüzeyinde tutun.
- Hayvanı% 3 -% 4 izofluran ile doldurulmuş sürekli anestezik indüksiyon odasına aktarın. Ayak parmağı kıstırma refleksi olmadan yeterli genel anesteziyi onaylayın. % 1 -% 3 izofluran idame dozu kullanın. Her iki göze de veteriner merhemi sürün.
- Buprenorfin ile deri altı enjeksiyonu (ağrıyı hafifletmek için opioid): 0,03 mg/mL konsantrasyonunu elde etmek için buprenorfin stoğunu %0,9 sodyum klorür (NaCl) içinde 0,3 mg/mL konsantrasyonda çözün.
- Ameliyattan önce 0.05-0.1 mg/kg 0.03 mg/mL buprenorfin dozu ile birlikte 500 μL steril %0.9 NaCl deri altına enjekte edilir. 20 g farede 2 μg veya 66 μL 0.03 mg/mL buprenorfin gereklidir.
- Cilt hazırlığı: Tamamen uyuşturulmuş fareyi ısıtma battaniyesinin üzerine sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Ön karın bölgesini% 0.5 klorheksidin tentürü, 2x ile dezenfekte edin. İşlem sırasında ısıtma battaniyesinin sıcaklığını sık sık kontrol edin ve sıcaklığın düşmediğinden emin olun.
4. IVC ligasyonu
- Orta hat laparotomi
- Karın derisini ksifoidal çıkıntıdan mesaneye kadar ince makasla kesin. Atravmatik forseps ile peritonu cilt insizyonu boyunca yarıya kadar sıkıştırın. Kesi ve üstteki bağırsaklar arasında yeterli boşluk olduğundan emin olun (Şekil 2A).
- Peritonu avasküler linea alba ile birlikte uzunlamasına bir şekilde açın.
- Bağırsakların sağ karın tarafına dışlanması
- Bağırsakları ıslak pamuk uçlarıyla çekin. Bağırsakları tamamen nemli steril bir gazlı bezle örtün. Kapalı bağırsakların mezenterik damarlarda aşırı çekiş olmadan traksiyonsuz bir yönde olduğundan emin olun.
- Sol renal venin IVC'ye birleşmesi de dahil olmak üzere IVC ve dalların tam maruziyeti (Şekil 2B).
- 200-300 μL normal salin damlatın. Üreterlerin, IVC'nin, Aortun ve renal venlerin seyrini keşfedin (Şekil 2).
- İnfra-renal IVC ve sol renal ven birleşme noktasında avasküler düzlem.
- Polipropilen 6-0 sütürü avasküler düzlemden 2x-3x nazikçe kaudalden sefalad'a kapalı uçlu atravmatik forseps hareketleriyle geçirin.
- Herhangi bir minimum sızıntının, pamuk uçlu bir tamponad ile sağlanan hafif basınçla kontrol edildiğinden emin olun. 6-0 polipropilen sütürü kaudalden kraniyal kandial hareketlere hafif hareketlerle geçirerek sağlanan düzlemi genişletin.
- Gonadal ve lomber dalların koterizasyonu (Şekil 2D)
- En fazla 4 posterior veya lomber dal mevcut olabilir. Spinal iskemi ve topallamanın olası komplikasyonlarını önlemek için, mevcut protokolde lomber dalları sağlam bırakın.
- Bilateral uterin horn arteriyel beslemesi ve hipogastrik damarlar dahil olmak üzere 2 ila 3 yan dalın mevcut olup olmadığını kontrol edin. İki taraflı olarak mevcut ilk dalların tutarlı bir şekilde bozulmasını sağlayın. Sol renal ven ve IVC'nin (infra-renal IVC) birleştiği yerin hemen distalinde bilateral dalları koterize edin. Rahim boynuzunun venöz drenaj damarlarının bozulmadığından emin olun.
NOT: Yan dal koterizasyonu tercih edilir çünkü bu yöntem pürüzsüz ve kesintisiz bir yüzey sağlayarak kontrolsüz kanama olasılığını azaltır. Ayrıca koterizasyon, 10-0 sütürlü sütür ligasyonundan daha hızlı ve daha uygulanabilirdir. Bu nedenle, hayvanlar daha kısa ve daha güvenli bir prosedüre maruz kalacaktır.
- Herhangi bir sızıntı veya kasıtsız koterizasyon olmadığından emin olmak için üreterlerin seyrini ve damar sistemini iki kez kontrol edin (Şekil 2C).
- Deney grubunda vasküler klipslerle IVC ligasyonu
- Damar klipslerini atravmatik forseps ile 2-0 naylon sütür genişliğinde özelleştirin. Deney grubundaki özelleştirilmiş vasküler klipsleri infrarenal IVC çevresine çevresel olarak uygulayın.
- Damar klipslerini dikişin üzerine uygulayın. Primer sütür pasajı, iki ila üç titiz kaudal-kraniyal hareketle yeterli bir avasküler düzlem sağlar (Şekil 2E-F).
- Ayrıca vasküler klipsleri hazırlanan düzlemden geçirin. Düzlemi sol renal venin birleştiği yerde hazırlayın ve IVC, sorunsuz bir klip geçişine izin verecek kadar geniştir (Şekil 2E).
- Özelleştirilmiş vasküler klipsi, hazırlanan düzlem boyunca IVC kursuna dik olarak yatay olarak yerleştirin. Yeterli boşluk kalmasını sağlamak için vasküler klipsleri 5-0 polipropilen sütürün üzerine yerleştirin (Şekil 2G).
- Vasküler klips bölgesinde herhangi bir damar hasarını veya kanamayı önlemek için yukarıdaki adımların nazikçe yapıldığından emin olun. Potansiyel sızıntı için cerrahi alanı gözlemleyin. Sızma ihtimaline karşı pamuk ucuyla cerrahi alana hafif bir baskı uygulayın.
- Kontrol grubunda dikişli IVC Ligasyonu
- 6-0 polipropilen sütür ile sütür ligasyonu. Hazırlanan düzlemde 5-0 ipek sütür üzerine intrarenal IVC çevresine cerrahi kare düğüm sütür yapın.
- Dikiş tamamlandıktan sonra, yeterli kalıntı alanı sağlamak için ipek dikişi nazikçe çıkarın.
- Deri altına 200 μL normal salin enjeksiyonu yapın.
NOT: Klemp uygulaması ile parsiyel IVC oklüzyonu için karşılaştırılabilir bir teknik sağlamak için, vasküler klips mevcut çalışmada dudaklar arasında boşluk sağlayacak şekilde özelleştirilmiştir. Vasküler klips daha sonra sol renal ven ve IVC'nin birleştiği yerde hazırlanan avasküler düzleme yerleştirilir. - Laparotomiyi sürekli çalışan 4-0 vicryl sütür ile kapatın.
5. İndeks cerrahisi sonrası takip
- Hayvanı ameliyattan sonra 1 saat boyunca veya denge ve düzeltme kabiliyeti geri gelene kadar sürekli olarak izleyin, tamamen iyileşene kadar izole edilmiş temiz bir kafeste ne olursa olsun.
- Hayvanı 2 gün boyunca günlük olarak izleyin. Hayvan sıkıntılı görünüyorsa, 2 gün boyunca günde iki kez izleyin. Protokol başına postoperatif analjezi ve sıvıları uygulayın.
- 0,03 mg/mL konsantrasyona ulaşmak için buprenorfin stoğunu %0,9 sodyum klorür (NaCl) içinde 0,3 mg/mL konsantrasyonda çözün.
- İndeks ameliyatını takip eden ilk 48 saat boyunca her 8 ila 12 saatte bir 500 μL steril% 0.9 NaCl ile birlikte 0.05-0.1 mg / kg 0.03 mg / mL buprenorfin dozunu deri altına enjekte edin. 20 g'lık bir farede, 2 μg veya 66 μL 0.03 mg/mL buprenorfin gereklidir.
6. Ötenazi ve pıhtı içeren IVC'nin toplanması
- Fareyi bir izofluran odasında uyuşturun, hayvanı kuyruğun tabanından tutun ve hayvanı elinizin dorsum yüzeyinde tutun.
- Hayvanı% 3 -% 4 izofluran ile doldurulmuş sürekli anestezik indüksiyon odasına aktarın. Hayvanı sırtüstü pozisyona getirin.
- Tarif edildiği gibi ksifoidden mesaneye kadar uzun bir orta hat laparotomi yapın.
- Bağırsağı karnın sağ tarafına dışlayın ve klemplenmiş IVC'yi infra-renal IVC derecesine kadar iliak bifurkasyonun distalinde toplayın (Şekil 2G).
- Pıhtı ve tümör hasadını takiben, hayvanı servikal çıkıkla ötenazi yapın.
7. İstatistiksel analiz
- İstatistiksel analizi, ortalama, medyan ve standart sapma (SD) veya ortalamanın (SEM), 25. veya 75. yüzdebirlik dilimin standart hatası veya minimum ve maksimum değerler dahil olmak üzere tüm değer aralığı olarak uygun şekilde sunun. Uygun şekilde bir Öğrenci t-testi ve F-testi gerçekleştirin. İstatistiksel anlamlılığı p <0.05 düzeyinde değerlendirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
8-12 haftalık bir grup dişi C57Bl6/J faresine, hücre büyümesinin logaritmik fazında MC-38 hücreleri enjekte edildi. Ksenogreftler, enjeksiyondan sonraki üçüncü ve dördüncü haftalar arasında hızla büyüdü18. Tümörler ortalama 400mm3 hacme ulaştığında, fareler kontrol ve deney gruplarına randomize edildi. Kontrol grubuna sütür ile IVC ligasyonu uygulanırken, deney farelerine vasküler klips uygulaması ile IVC ligasyonu uygulandı. Kontrol ve deney gruplarındaki tümör hacimleri anlamlı farklılıklar olmaksızın karşılaştırılabilirdi (353 ± 100mm3 vs. 367 ± 46.2 mm3, p = 0.445). Pıhtıyı içeren iliak venlerin bifurkasyon noktasına giden infrarenal IVC'ler 48 saat sonra toplandı ve pıhtı ağırlıkları venöz trombojenitenin biyolojik okuması olarak görev yaptı. Kontrol ve deney gruplarındaki tüm hayvanlarda postoperatif seyir, uterus boynuzu renk değişikliği, kas-iskelet sistemi iskemisi veya alt ekstremitede topallama sorunları kanıtı olmadan sorunsuzdu. İkinci laparotomi sırasında vasküler klips yer değiştirmesi gözlenmedi. Deneylerin sona ermesinden önce mortalite gözlenmedi.
Pıhtı ağırlığının normalleştirilmiş vücut ağırlığına oranı
Ksenogreftli farelerin vücut ağırlığını kaybetmesi muhtemel olduğundan, pıhtı ağırlıkları (mg cinsinden) hasat sırasında toplam vücut ağırlıklarına (her ikisi de mg cinsinden) normalleştirildi. Deney grubundaki farelerde (ortalama ± SEM, 0.002580 ± 0.00098) kontrol farelerine (0.001453 ± 0.002666, P değeri: 0.0019; Şekil 3).
İmmünofloresan testi
Histopatolojik değerlendirmede İVK ve pıhtılar incelendi. İnfrarenal vena kavadan parafine gömülü kesitler anti-CD31 (endotel hücrelerinin bir belirteci)20 ve anti-fibrin ve DAPI ile boyandı (Şekil 4A).
Kontrol farelerinden alınan infrarenal vena kava, damarın lümenini kısmen işgal eden sağlam CD31 boyaması ve fibrin gösterdi. Deney grubunda, CD31 ekspresyonu sağlam değildi, bu da endotel hücre hasarı ve belirgin fibrin ekspresyonu olan büyük bir pıhtı olduğunu düşündürdü. Damar duvarı da fibrin boyaması gösterdi (Şekil 4A).
İmmünofloresan için, fibrin fare monoklonal antikoru 1:1000 seyreltmede kullanıldı ve gece boyunca 4 °C'de inkübe edildi. CD31 için, immünoblot ve IF (4 ° C'de gece boyunca 1:1000 ve 1:100) için doğrulanmış bir tavşan poliklonal anti-CD31 antikoru kullanıldı. Bu antikorun fare, insan ve domuz CD31'e karşı reaksiyona girdiği bilinmektedir. IF için ikincil antikorlar, oda sıcaklığında 45 dakika boyunca 1:250 seyreltmede Alex Fluor 488, 594 ve 647'den oluşuyordu.
Görüntü ölçümü için, tüm slayt motorlu bir sahne sistemi tarafından tarandı. Görüntüler, sinyalin gri tonlamaya dönüştürüldüğü ImageJ'de işlendi ve piksellerin sayısı ve yoğunluğu entegre yoğunluk olarak analiz edildi. Damar alanı ilgilenilen bölge olarak işaretlendi. Tüm görüntülerin entegre yoğunluğu18 alanına normalleştirildi.
Bunların kanserle ilişkili derin ven trombozu modellerinde yukarı regüle edildiği gösterilmiştir. Birkaç görüntünün nicelleştirilmesi, daha önce Resim J18 kullanılarak yapıldığı gibi, entegre yoğunluk analizi kullanılarak gerçekleştirildi. Kontrol grubu, deney grubuna göre anlamlı olarak daha düşük fibrin ekspresyonuna sahipti (p:0.0080; Şekil 4B; 174 ± 104'e karşı 503.5 ± 182.4 ortalama ±SD). Özellikle, Fibrin ekspresyonlarındaki varyanslar deneyde kontrol grubuna göre daha düşüktü (F istatistikleri, DFn, Dfd: 3.074, 4, 4).
Gri tonlamalı ultrasonografi
Ameliyattan 2 gün sonra ve pıhtı alımından hemen önce farelere gri tonlamalı ultrasonografi yapıldı. Her iki gruptaki fareler infrarenal vena kavada pıhtılar gösterdi. Bununla birlikte, vasküler klipsli farelerde pıhtılar daha büyüktü. Temsili ultrasonografi görüntüleri Şekil 5'te gösterilmiştir. Damarın yankısız bir bölgesi, bir patent lümenini düşündürür ve damardaki hiperekoik yoğunluk, organize bir pıhtının göstergesidir. Kontrol grubundan bir farenin bağlanmış frarenal vena kavası, Şekil 5A'da iki sarı ok ucuyla sınırlandırılmış kısmi bir pıhtı göstermektedir. Buna karşılık, Şekil 5B , vasküler bir klips modeli (iki sarı ok ucu ile gösterilen ve beyaz yıldızlarla işaretlenen) ile oluşturulan infrarenal vena kava'yı neredeyse tıkayan büyük bir pıhtı göstermektedir. Dikkat çekici bir şekilde, infrarenal vena kava kontrol grubunda çökerken, deney grubunda genişledi, ikinci gruptaki daha büyük pıhtı yükü ile tutarlı olarak.
Her iki tahlil de (ultrasonografi ve IF), deney grubunun kontrol grubundan sürekli olarak daha büyük pıhtılara sahip olduğunu göstermektedir.
Şekil 1: IVC-Aort'u ve klipsin sol renal ven (LRV)-IVC'nin birleştiği yere uygulanmasını gösteren bir şema. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Klips uygulamalı intraoperatif IVC tromboz modeli . (A) Orta hat laparotomi. (B) Sol renal venin IVC'ye birleşmesi de dahil olmak üzere IVC'nin tam maruziyeti. (C) Üreterin seyrini göstermek ve sol üretere herhangi bir iyatrojenik travmadan kaçınmak. (D) Gonadal dalların koterize edilmesi. (E) IVC'nin sol renal ven birleşme noktasına diseksiyonu. (F) Sütürü geçmek için düzlemi genişletmek için 5-0 polipropilen sütürün diseke düzlemden geçirilmesi. (G) Hazırlanan düzlemden bir vasküler klemp geçirmek. (H) IVC klemplemesinden 48 saat sonra pıhtı oluşumu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Vasküler klips IVC ligasyonu olan fare grubu, normalize pıhtı-vücut ağırlığı oranı daha yüksekti. Ortalama Normalleştirilmiş pıhtı-vücut ağırlığı oranı. Her iki değerin birimi miligram cinsinden ifade edilir. Hata Çubukları = SD. Student's t-testi uygulanmıştır. P <0.0001 Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Vasküler klips IVC ligasyonu olan fare grubunda artmış fibrin ve CD 31 ekspresyonu. Sütür ile IVC ligasyonu yapılan kontrol grubundan ve vasküler klipsli IVC ligasyonu yapılan deney grubundan 100x büyütmede elde edilen temsili immünofloresan görüntüler. Fare başına rastgele seçilen görüntüler gösterilmiştir (N= 4 fare/grup). (A) Kontrol ve deney gruplarında fibrin ve CD31 ekspresyonu. Beyaz yıldızlarla işaretlenmiş iki sarı ok ucu, IVC'yi neredeyse tıkayan büyük pıhtıyı tasvir eder, bu da kısmen tıkalı IVC'yi ima eder. (B) Fibrin'in entegre yoğunluğu: Çizgi medyan değeri temsil eder. Student'a t-testi uygulandı. p değeri = 0.0080. Kontrol ve deney gruplarındaki pıhtılar dahil olmak üzere ve anti-CD31 ve Alexa Fluro sekonder antikorları ile boyanmış temsili infrarenal vena kava görüntülerinin IF boyanması. 400x büyütme gösterilmiştir. Ölçek çubukları = 100 μm. Hata çubukları SEM'e başvurur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Vasküler klips IVC ligasyonu olan fare grubunda kısmen klemplenmiş IVC içinde artan pıhtı yüzey alanı. Kontrol ve deney grubunun temsili gri tonlamalı sonografi görüntüleri. (A) Kontrol grubunun temsili gri tonlamalı Doppler görüntüsü: IVC'nin bir bölgesi, patent lümenini düşündüren yankısız bir bölge gösterir ve diğer kısım, pıhtıyı gösteren hiperekoik bir bölge gösterir. (B) Deney grubunun temsili gri tonlamalı Doppler görüntüsü: IVC içindeki organize pıhtı (beyaz yıldız), sarı ok uçlarıyla gösterildiği gibi, deney grubunda daha belirgindi. Ayrıca, pıhtı sagital bölümde iki farklı şekilde ortaya çıktı. Lümenin önemli kesitini tıkayan bir pıhtı da IVC'nin diğer tarafında tanımlandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sinjeneik ksenogreft kolon kanseri modelinde, deney grubunda kontrol grubuna göre daha yüksek trombojenite ve pıhtılaşma belirteçlerinin ekspresyonlarını gözlemledik. Önemli olarak, tüm bu parametrelerdeki varyans, deney grubunda kontrol grubuna göre daha düşüktü. Modifikasyon, IVC ve sol renal venin birleşme noktasında spesifik bir basınç profiline sahip bir vasküler klipsin yerleştirilmesini içeriyordu. Klips, 5-0 polipropilen sütür olan bir ara parçanın üzerine yerleştirildi. Bu modifikasyon pıhtı boyutu ve tromboz belirteçlerindeki değişkenliği azaltır. Tüm fareler% 100 hayatta kaldı.
Teknik nüanslar
Prosedür, birkaç adıma özel dikkat gerektiriyordu. Laparotomi sonrasında, herhangi bir kaza sonucu yaralanmayı önlemek için her iki üreter de kapsamlı bir şekilde incelendi. Optimal maruziyeti elde etmek için bağırsaklar nemli gazlı bezle kaplandı ve aşırı çekiş olmadan sağ üst kadranda tutuldu. Daha sonra, damarların zarar görmesini önlemek için IVC yan dalları üreterlerden, IVC'den ve aorttan 2 ila 3 mm uzakta koterize edildi. Tam hemostaz sağlandıktan sonra IVC ligasyonu için düzlem hazırlandı. Farelerde aort ve IVC'nin seyri boyunca yakından bağlantılı olduğunu ve bunları incelemeye çalışmanın hayvanın kanamasına ve kaybına yol açabileceğini belirtmek önemlidir. Bunun tek istisnası sol renal ven ve aort birleşme noktası21'dir. Daha sonra forseps ile en fazla üç titiz, keskin ıraksak hareket kullanılarak bir dikiş pasajı hazırlandı.
8 ila 12 haftalık bir farenin IVC çapının yaklaşık 0,3 ila 0,5 mm aralığında olduğu bildirilmektedir. Kısmi IVC ligasyon prosedürü, tam ligasyondan ayırt etmek için yer sağlamalıdır. Bu çalışmada, ara parça için 0,10 ila 0,15 mm'ye karşılık gelen 5-0 sütür kalibresini ele aldık. Bu nedenle, vasküler klips dudak aralığı, 0.3 mm IVC ve 0.1 mm boşluk için yeterli alan sağlamak üzere 2-0 sütür için ayarlandı.
Polipropilen sütür, vasküler klipslerin uygulanmasına uyum sağlamak için düzlemin tekrarlayan kaudal ile kraniyal harekete 1 ila 2 mm daha genişletilmesine izin veren kansız bir kılavuz sağladı. Son olarak, 5-0 polipropilen sütür ile uyumlu dudak kalan boşluğu olan özelleştirilmiş damar klipsleri yerleştirildi.
Kan damarı kapanması için platin gibi asil metal klipslerin seçimi, bu tür malzemenin nispeten inert olması ve spesifik emilebilir ve gecikmeli emilebilir sütürlere kıyasla materyal kaynaklı iltihabı azaltmasıgerçeğinden kaynaklanmaktadır 22,23,24. Bu metal klipsler kimyasal reaksiyonlara karşı dirençlidir ve bu da onları stabil hale getirir. Bu, dikiş materyallerinin kullanımına kıyasla daha düşük inflamasyon riski ile daha güvenli ve daha etkili bir alternatife yol açar.
Modelin öteleme alaka düzeyi
Murin venöz tromboz modelleri, insanlardaki derin ven trombozundan temel olarak farklıdır. İlk olarak, kemirgen modellerinde, pıhtı oluşumu yukarı yönde gözlenir. Bununla birlikte, klinik VT'ler bir nidus25,26'dan aşağı akışta oluşur. İkincisi, insanlar ve fare modelleri arasındaki neden-sonuç ilişkileri farklıdır. İnsanlarda pıhtı oluşumu indeks olayıdır ve bunu kan akımı tıkanıklığı takip eder. Bunun bir istisnası May-Thurner sendromudur. May-Thurner sendromu, omurga ile sağ iliak arter arasında yer alan sol iliak ven üzerindeki artan dış basıncın sol iliak ven trombozu veya sol iliak vende kan pıhtısı riskini artırdığı tıbbi bir durumu ifade eder. Fare modellerinde, venöz akışın tıkanması, yavaş kan akışı ve trombüs oluşumu ile sonuçlanan birincil olaydır25.
Femoral ven elektrolitik yaralanma modeli12 gibi diğer modellerle karşılaştırıldığında, IVC stazı açık bir avantaj sunar. Kan akımı varlığında pıhtı oluşumu için bir ortam sağlayarak IVC filtreleri, kateter yönlendirmeli tromboliz ve endolüminal rekanalizasyon gibi lokal terapötik önlemlerin incelenmesine olanak tanır. Böylece bu modelde endotel yaralanması ve staz olmak üzere iki kol incelenmiştir. IVC'deki pıhtılar ayrıca pulmoner emboli gibi daha yüksek komplikasyon oluşumu ile ilişkilidir. Bir sınırlama, IVC'nin insanlarda DVT için daha az yaygın bir bölge olmasıdır.
İndirgeme-İyileştirme-Değiştirme (3R) çerçevesi
3R çerçevesini hayvan modellerine entegre etmek önemlidir. 3R çerçevesinin entegrasyonu, hayvanların acı çekmesini sınırlar ve etik ve sorumlu hayvan araştırma uygulamalarını teşvik eder. 3R, farelerde mortalite gözlemlemediğimiz için mevcut bulgumuz için geçerlidir. Ayrıca, çalışmalarda daha az hayvan kullanmak mümkündür. Böylece fare sayısı ve maliyet azaltılabilir.
Çalışma sınırlamaları
Klips yönteminin olası bir sınırlaması, test edilen vasküler kliplerin nispeten dar bir basınç profili aralığını içerir. Buna göre, çok çeşitli basınç profilleri ile daha ileri çalışmalar tasarlanabilir. Önceki çalışmalar, bağışıklığı baskılanmış suş farelerinin pıhtı oluşumuna daha duyarlı olduğunu ve pıhtı ağırlıklarının immünokompetan farelerde farklılık gösterebileceğinigöstermiştir 12. Gelecekteki çalışmalar, farklı fare suşu arka planlarında pıhtı ağırlıklarının tutarlılık derecesini incelemek için teşvik edilmektedir.
Son
Mevcut yöntem, kısmi bir IVC ligasyon modeli aracılığıyla venöz tromboz çalışması için daha tutarlı bir ölçüm sağlar. Bu değişikliğin, insan hastalıklarıyla ilgili farklı kanser modelleri kullanarak kanserle ilişkili trombozun sonuçlarını araştırmak için sağlam ve güvenilir fare modellerinin oluşturulmasına izin vereceğini umuyoruz.
Mevcut çalışma özellikle kanserle ilişkili tromboza odaklanırken, gelecekteki çalışma, farklı komorbiditelerin (obezite, kronik böbrek yetmezliği gibi) fare modellerinin ve tromboz riskini artıran normal farelerin kapsamlı bir analizini yapmayı gerektirecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma AHA Kardiyo-onkoloji SFRN CAT-HD Merkezi hibe 857078 (KR, VCC, XY ve SL) ve R01HL166608 (KR ve VCC) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Lab | IMSR_JAX:000664 | |
| Caliper | VWR International, Radnor, PA | 12777-830 | |
| CD31 | Abcam | Ab9498 | |
| Cell Counter | MOXIE | MXZ000 | |
| Clamp | Fine Science Tools | 13002-10 | |
| Clips ASSI.B2V Single Clamp, General Purpose, | Accurate Surgical & Scientific Instruments | PR 2 144.50 289.00 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Fibrin | Millipore | MABS2155-100UG | |
| Fine Scissors - Large Loops | Fine Science Tools | 14040-10 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Hill Hemostat | Fine Science Tools | 13111-12 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | NDC 11695-6777-2 | |
| MC-38 cell | Sigma Aldrich | SCC172 | |
| Microscope | Nikon Eclipse Inverted Microscope | TE2000 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14079-10 | |
| Suture- Vicryl | AD-Surgical | #L-G330R24 | |
| Suture-Nylon 2-0 | Ethilon | 664H | |
| Suture-Prolene 5-0 | Ethicon | 8661G | |
| Suture-Prolene 6-0 | Ethicon | PDP127 | |
| VEV03100 | VisualSonics | FujiFilm | |
| Vitrogel Matrigel Matrix | The Well Bioscience | VHM01 |
References
- Blom, J. W., et al. Incidence of venous thrombosis in a large cohort of 66,329 cancer patients: results of a record linkage study. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 4 (3), 529-535 (2006).
- Gabre, J., et al. Activated protein C accelerates venous thrombus resolution through heme oxygenase-1 induction. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (1), 93-102 (2014).
- Chang, Y. S., et al. Sorafenib (BAY 43-9006) inhibits tumor growth and vascularization and induces tumor apoptosis and hypoxia in RCC xenograft models. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 59 (5), 561-574 (2007).
- Khorana, A. A., Kuderer, N. M., Culakova, E., Lyman, G. H., Francis, C. W. Development and validation of a predictive model for chemotherapy-associated thrombosis. Blood. 111 (10), 4902-4907 (2008).
- Chew, H. K., Wun, T., Harvey, D., Zhou, H., White, R. H. Incidence of venous thromboembolism and its effect on survival among patients with common cancers. Archives of Internal Medicine. 166 (4), 458-464 (2006).
- Leiva, O., Newcomb, R., Connors, J. M., Al-Samkari, H. Cancer and thrombosis: new insights to an old problem. Journal de Medecine Vasculaire. 45 (6S), 6S8-6S16 (2020).
- Chen, N., et al. Bevacizumab promotes venous thromboembolism through the induction of PAI-1 in a mouse xenograft model of human lung carcinoma. Molecular Cancer. 14, 140 (2015).
- Goto, H., et al. Activity of a new vascular targeting agent, ZD6126, in pulmonary metastases by human lung adenocarcinoma in nude mice. Cancer Research. 62 (13), 3711-3715 (2002).
- Jiang, Y., et al. Inhibition of anchorage-independent growth and lung metastasis of A549 lung carcinoma cells by IkappaBbeta. Oncogene. 20 (18), 2254-2263 (2001).
- Salup, R. R., Wiltrout, R. H. Adjuvant immunotherapy of established murine renal cancer by interleukin 2-stimulated cytotoxic lymphocytes. Cancer Research. 46 (7), 3358-3363 (1986).
- Deatrick, K. B., et al. The effect of matrix metalloproteinase 2 and matrix metalloproteinase 2/9 deletion in experimental post-thrombotic vein wall remodeling. Journal of Vascular Surgery. 58 (5), 1375.e2-1384.e2 (2013).
- Diaz, J. A., et al. Choosing a mouse model of venous thrombosis: a consensus assessment of utility and application. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 17 (4), 699-707 (2019).
- Henke, P. K., et al. Toll-like receptor 9 signaling is critical for early experimental deep vein thrombosis resolution. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (1), 43-49 (2011).
- Liu, H., et al. Inferior vena cava stenosis-induced deep vein thrombosis is influenced by multiple factors in rats. Biomedicine & Pharmacotherapy. 128, 110270 (2020).
- von Brühl, M. L., et al. Monocytes, neutrophils, and platelets cooperate to initiate and propagate venous thrombosis in mice in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 209 (4), 819-835 (2012).
- Brill, A., et al. von Willebrand factor-mediated platelet adhesion is critical for deep vein thrombosis in mouse models. Blood. 117 (4), 1400-1407 (2011).
- Stark, K., et al. Distinct Pathogenesis of Pancreatic Cancer Microvesicle-Associated Venous Thrombosis Identifies New Antithrombotic Targets In Vivo. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (4), 772-786 (2018).
- Belghasem, M., et al. Metabolites in a mouse cancer model enhance venous thrombogenicity through the aryl hydrocarbon receptor-tissue factor axis. Blood. 134 (26), 2399-2413 (2019).
- Tracz, A., Mastri, M., Lee, C. R., Pili, R., Ebos, J. M. Modeling spontaneous metastatic renal cell carcinoma (mRCC) in mice following nephrectomy. Journal of Visualized Experiments. (86), e51485 (2014).
- Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31). Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).
- Payne, H., Brill, A. Stenosis of the Inferior Vena Cava: A Murine Model of Deep Vein Thrombosis. Journal of Visualized Experiments. (130), e56697 (2017).
- Yabit, F., Hughes, L., Sylvester, B., Tiesenga, F. Hypersensitivity Reaction Post Laparoscopic Cholecystectomy Due to Retained Titanium Clips. Cureus. 14 (6), e26167 (2022).
- Nagorni, E. A., et al. Post-laparoscopic cholecystectomy Mirizzi syndrome induced by polymeric surgical clips: a case report and review of the literature. Journal of Medical Case Reports. 10, 135 (2016).
- Zemelka-Wiacek, M. Metal Allergy: State-of-the-Art Mechanisms, Biomarkers, Hypersensitivity to Implants. Journal of Clinical Medicine. 11 (23), 6971 (2022).
- Poyyamoli, S., et al.
- Streiff, M. B., et al. NCCN Guidelines Insights: Cancer-Associated Venous Thromboembolic Disease, Version 2.2018. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 16 (11), 1289-1303 (2018).
