Name: Células madre embrionarias-las células endoteliales derivadas de tratamiento de la isquemia Miembro Posterior (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-23T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Aprenda a inyectar células endoteliales derivadas de células madre embrionarias en el miembro posterior isquémico para tratar la enfermedad arterial periférica. Este método utiliza imágenes de bioluminiscencia para rastrear las células in vivo y evaluar su efecto terapéutico.

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Los autores agradecen a Andrea Axtell, Satoshi Itoh, MD, Velotta Jeff, MD, Hoyt Grant, Robert C. Robbins, MD, Yu Jin, MD, Tim Doyle, PhD, y el Stanford pequeño núcleo de imágenes de animales para la asistencia técnica. Los autores también agradecen AM Bickford, Inc. para el apoyo del equipo de veterinarios. Esta investigación fue financiada por becas de investigación de los Institutos Nacionales de Salud (R01 HL-75774, R01 CA098303, R21 HL085743, 1K12 HL087746), el tabaco de California las enfermedades relacionadas con el Programa de Investigación de la Universidad de California (15IT-0257 y 0169-1514RT) , y el Instituto de Medicina Regenerativa de California (RS1-00183). NH es apoyado por una beca de la Asociación Americana del Corazón. puede Heart Association.

1. Diferenciación de los CES murino en células endoteliales <ol><li> El protocolo para la diferenciación de los CES en las células endoteliales se describe en otro lugar y no es el objetivo de este protocolo 2,3. En pocas palabras, las células pueden diferenciarse, y las células que son positivas para los marcadores endoteliales como el CD31 o caderina del endotelio vascular (VE-cadherina) se purifican por clasificación celular activado por fluorescencia (FACS). </li></ol> 2. La construcción de la fusión de genes reportero doble y transducción de lentivirales <ol><li> Bioluminiscencia puede ser usado para rastrear las células que son modificadas para expresar los genes indicadores, tales como luciferasa de luciérnaga (fluctuaciones). Para esta aplicación, las células contienen fluctuaciones y aumento de proteína verde fluorescente (eGFP) gen de fusión bajo el control de un promotor de la ubiquitina interna. Con el fin de modificar las células, el vector transgénico lentiviral que contiene la clave optimizado elementos genéticos para cumplir con los criterios de bioseguridad, así como una mayor eficiencia de transducción, UFP-FG vector desarrollado en nuestro laboratorio que lleva el gen de fusión fluc-eGFP reportero se puede utilizar para estable transducción de las células después de la diferenciación. Esta construcción de fusión permite que tanto la bioluminiscencia y el seguimiento de la fluorescencia de las células trasplantadas. El procedimiento para la generación de partículas del virus, la transducción y la producción de células marcadas que los genes que expresan reportero se describe en otro 4. </li></ol> 3. El trasplante de células derivadas de CES endotelial a las extremidades inferiores isquémicas <ol><li> Iniciar el procedimiento mediante la elaboración de un ratón que ha sido objeto de isquemia miembro posterior para el trasplante de células. Para ello, coloque el ratón en la cámara de inducción de la anestesia que contiene un 1-3% de isoflurano en oxígeno al 100%, con un caudal de 1L/min. </li><li> Deja el ratón en la cámara de inducción hasta que no responde a los estímulos externos. A continuación, retire el animal de la cámara de inducción. </li><li> Luego, coloque el animal en decúbito supino en la mesa de operaciones y conectarlo a un flujo continuo de 1-3% isoflurano en oxígeno al 100%, con un caudal de 1L/min. </li><li> Limpie la piel de las extremidades inferiores con tres alterna matorrales Betadine y alcohol. </li><li> Una vez que se limpia la piel, obtener millón ESC derivados de las células endoteliales en 30 l de tampón fosfato salino (PBS). La carga de estas células en una aguja de calibre 28. </li><li> Cuando las células están listas, levante suavemente y extender las extremidades inferiores para visualizar mejor la ubicación de los músculos gemelos. Mientras se extiende la pierna, insertar la aguja en la piel en el músculo subyacente. Tenga cuidado de no acercarse a los huesos. Suave y lentamente se inyecta la mezcla de 30 l de células en el gemelo. Para la inyección intramuscular, 30 l está cerca de los límites de volumen que se puede inyectar. Por lo tanto, de calibre 28 jeringas de insulina son preferidos porque, según nuestra experiencia, que eliminan la pérdida de volumen en agujas de jeringas. </li><li> Después de la inyección, vuelva el ratón hacia la jaula de recuperación y controlar de forma continua hasta que despierto. Que el animal pueda recuperarse durante varias horas y luego proceder con la de imágenes de bioluminiscencia in vivo de las células trasplantadas. </li></ol> 4. Bioluminiscencia de imágenes de ESC derivados células endoteliales in vivo <ol><li> El trasplantado células derivadas de CES endothelials fueron modificados para expresar tanto la fluctuaciones y el gen de fusión EGFP bajo el control de un promotor de la ubiquitina interna. Por lo tanto, la bioluminiscencia puede ser usado para rastrear las células dentro de la extremidad posterior isquémica. </li><li> Para comenzar este paso, a su vez en el sistema de imágenes de bioluminiscencia y el software de adquisición de imágenes de vida. A continuación, inicializar el sistema de adquisición y especificar las dimensiones del campo de visión. </li><li> Luego, coloque papel negro mate en la caja de imagen para absorber las emisiones de fondo. </li><li> Una vez que el cuadro de imagen esté listo, coloque el ratón en la cámara de inducción de la anestesia que contiene un 1-3% isoflurano en oxígeno en la salida de 1L/min. Deja el ratón en la cámara de inducción hasta que no responde a los estímulos externos. A continuación, retire el animal de la cámara de inducción. </li><li> Quitar el pelo de ambas extremidades posteriores utilizando una máquina de afeitar eléctrica cuando sea necesario. </li><li> Inyectar 10 L de D-luciferina por gramo de peso corporal en el peritoneo. El D-luciferina se prepara con antelación en las soluciones de filtrado de valores de 15 mg / ml en PBS. </li><li> Una vez que la luciferina se inyecta, el lugar del animal en la caja de imágenes sobre el papel negro en posición supina, conectado a un flujo continuo de isoflurano. </li><li> La colocación de animales en la caja de imagen y la conexión con el isoflurano. </li><li> Comienzan a adquirir las imágenes de 10 a 60 segundos con el fin de determinar un tiempo de exposición óptimo para que la imagen no está saturado. Si la imagen se satura, reducir el tiempo de exposición. Si la señal de bioluminiscencia es muy débil, aumentar el tiempo de exposición. </li><li> Usíng el tiempo de exposición óptimo, continuar adquiriendo imágenes cada 1-3 minutos hasta que la señal llega al máximo y luego se desvanece. Cuando la adquisición se haya completado, guarde el archivo. </li><li> Para analizar los datos, seleccionar las regiones de interés (ROI) que cubren el sitio de la inyección. Como control negativo, un retorno de la inversión similar puede ser seleccionado para la pierna que no funciona. Usando el software, medir la radiación total, que se expresa en unidades de fotones / segundo / cm 2 / estereorradián (p / s / cm 2 / sr), para el rendimiento de la inversión para cada punto de tiempo. El valor máximo debe ser utilizado en los datos finales. Los datos también pueden ser exportados a Excel para su uso futuro. </li><li> Una vez que todos los datos adquiridos, devolver el animal a la jaula de recuperación y seguimiento continuo hasta que la despierta animal. </li><li> Repita este procedimiento para realizar un seguimiento de las células a través del tiempo. </li><li> En un momento de tiempo deseado, el animal puede ser sacrificado para la evaluación de la función del tejido. </li></ol> 5. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/old/1034_2009_1_22_4/figure 1.png" alt="Figura 1" width="600" height="600" /> Una imagen de bioluminiscencia representante de las células trasplantadas en la extremidad posterior izquierda isquémica se muestra en la Figura 1. Durante la adquisición de la bioluminiscencia, la intensidad aumentará con el tiempo, y el valor máximo obtenido durante el transcurso del tiempo debe ser reportado como el valor final.

<ol><li>Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M., Cooke, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+model+of+hindlimb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Murine model of hindlimb ischemia.</a> JoVE. , (2008).</li>
<li>Levenberg, S., Golub, J. S., Amit, M., Itsakovitz-Eldor, J., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells derived from human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 4391-4396 (2002).</li>
<li>Yamashita, J., Itoh, H., Hirashima, M., Ogawa, M., Nishikawa, S., Yurugi, T., Naito, M., Nakao, K., Nishikawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flk1-positive+cells+derived+from+embryonic+stem+cells+serve+as+vascular+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Flk1-positive cells derived from embryonic stem cells serve as vascular progenitors.</a> Nature. 408, 926-926 (2000).</li>
<li>De, A., Yaghoubi, S. S., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+lentiviral+vectors+in+noninvasive+molecular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Applications of lentiviral vectors in noninvasive molecular imaging.</a> Methods Mol Biol. 433, 177-202 (2008).</li>
<li>Niiyama, H., Kai, H., Yamamoto, T., Shimada, T., Sasaki, K., Murohara, T., Egashira, K., Imaizumi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+endogenous+monocyte+chemoattractant+protein-1+in+ischemia-induced+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Roles of endogenous monocyte chemoattractant protein-1 in ischemia-induced neovascularization.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 44, 661-666 (2004).</li>
<li>Cook, M. J. The anatomy of the laboratory mouse. , Academic Press. New York. (1976).</li>
<li>Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+indicators+in+living+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Med%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent indicators in living mammals.</a> Nature Med. 4, 245-247 (1998).</li>
<li>Ray, P., De, A., Min, J. J., Tsien, R. Y., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tri-fusion+multimodality+reporter+gene+expression+in+living+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects.</a> Cancer Res. 64, 1323-1330 (2004).</li>
<li>Huang, N. F., Lee, R. J., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+physical+regulation+of+stem+cells+and+progenitor+cells%3A+potential+for+cardiovascular+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Chemical and physical regulation of stem cells and progenitor cells: potential for cardiovascular tissue engineering.</a> Tissue Eng. 13, 1809-1823 (2007).</li>
<li>Cao, F., Lin, S., Xie, X., Ray, P., Patel, M., Zhang, X., Drukker, M., Dylla, S. J., Connolly, A. J., Chen, X., Weissman, I. L., Gambhir, S. S., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+visualization+of+embryonic+stem+cell+survival%2C+proliferation%2C+and+migration+after+cardiac+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">In vivo visualization of embryonic stem cell survival, proliferation, and migration after cardiac delivery.</a> Circulation. 113, 1005-1114 (2006).</li>
<li>Wilson, K., Yu, J., Lee, A., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+bioluminescence+reporter+gene+imaging+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo bioluminescence reporter gene imaging of human embryonic stem cells.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
</ol>

CES es una fuente de células prometedoras para el tratamiento de la isquemia tisular, debido a su plasticidad de diferenciación y su capacidad de dar lugar a linajes de células que comprende las tres capas germinales, incluyendo las células endoteliales. Para superar los problemas éticos asociados con la CES, células madre pluripotentes inducidas (CMPi) puede ser una madre pluripotentes alternativa fuente de células que supera las preocupaciones éticas. Además de los CES, las células madre adultas, como las células progenitoras endoteliales...

<table><tbody><tr><td>Herramientas quirúrgicas</td><td>Herramienta</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aguja de jeringa</td><td>Herramienta</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Se prefiere una jeringa de insulina de 28G</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-luciferina</td><td>Reactivo</td><td>Biosynth International, Inc</td><td></td><td>Preparar D-luciferina con antelación en soluciones stock filtradas de 15 mg/mL en PBS</td></tr><tr><td>Sistema de imagen de bioluminiscencia IVIS 200 y software de adquisición</td><td>Equipo</td><td><a href="http://www.perkinelmer.com/Catalog/Category/ID/IVIS%20Series" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Xenogen Corporation</a></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

células madre embrionarias-las células endoteliales derivadas de tratamiento de la isquemia miembro posterior

Embryonic Stem Cell-Derived Endothelial Cells for Treatment of Hindlimb Ischemia

Enfermedad arterial periférica (PAD) se debe a un estrechamiento de las arterias periféricas que irrigan sangre oxigenada y nutrientes a las piernas y los pies, esta patología provoca síntomas como la claudicación intermitente (dolor al caminar), dolorosas úlceras isquémicas, o incluso gangrena del miembro en peligro. Se cree generalmente que el endotelio vascular, una monocapa de células endoteliales, que invierte la superficie luminal de los vasos sanguíneos y linfáticos, juega un papel dominante en la homeostasis vascular y la regeneración vascular. Como resultado, las células madre basado en la regeneración del endotelio puede ser un enfoque prometedor para el tratamiento de PAD. En este vídeo, se demuestra el trasplante de células madre embrionarias (ESC)-derivados de las células endoteliales para el tratamiento de la isquemia hindimb unilateral como un modelo de PAD, seguido por el seguimiento no invasivo de homing de las células y la supervivencia de imágenes de bioluminiscencia. Los materiales y procedimientos específicos para la entrega de la celda y las imágenes se describen. Este protocolo sigue a otra publicación en la descripción de la inducción de isquemia extremidades inferiores por Niiyama et al 1.

El procedimiento quirúrgico para el suministro de células madre embrionarias derivadas de las células endoteliales de las extremidades inferiores isquémicas se demuestra, con no invasiva de seguimiento por imágenes de bioluminiscencia.

Células madre embrionarias-las células endoteliales derivadas de tratamiento de la isquemia Miembro Posterior

La enfermedad arterial periférica (EAP) es consecuencia del estrechamiento de las arterias periféricas que suministran sangre oxigenada y nutrientes a las piernas y los pies. Esta...

Enfermedad arterial periférica. La EAP resulta de un estrechamiento de las arterias periféricas que suministran sangre y oxígeno a las piernas y los pies, lo que conduce a una disfunción vascular. Para determinar si las células madre pueden utilizarse para tratar la EAP, inyectamos células endoteliales derivadas de células madre embrionarias en la extremidad trasera tras la inducción de isquemia.Dado que estas células han sido modificadas para expresar luciferasa de luciérnaga, se pueden rastrear mediante imágenes de bioluminiscencia para determinar si migran al sitio de la lesión y tienen un efecto terapéutico. Hola, soy John Cook. Soy profesor de medicina en la división de Medicina Cardiovascular de la Universidad de Stanford.Nuestro laboratorio tiene interés en la angiogénesis y la regeneración vascular. En este video, dos de mis becarios postdoctorales, la Dra. Nan Wong y Hir Niyama, les presentarán los procedimientos para el trasplante terapéutico de células en isquemia de extremidad hind y la obtención de imágenes no invasivas de la supervivencia celular. Estos procedimientos incluyen los siguientes pasos: la administración de células madre embrionarias directamente y células

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El procedimiento quirúrgico para la inducción de isquemia miembro posterior unilateral se demuestra, con la confirmación de la isquemia por imágenes de perfusión Doppler láser.

Modelo murino de isquemia Miembro Posterior

Un método para la siembra de titanio contacto con la sangre de biomateriales con células autólogas y las pruebas de biocompatibilidad se describe. Este método utiliza células progenitoras endoteliales y los tubos de titanio, cabeza de serie en cuestión de minutos de implantación quirúrgica en porcino venas cavas. Esta técnica se puede adaptar a muchos otros dispositivos biomédicos implantables.

Autólogo de células progenitoras endoteliales-Siembra Tecnología y las pruebas de biocompatibilidad para dispositivos cardiovasculares en el modelo animal de gran

Las células endoteliales formadoras de colonias (ECFCs) son las células endoteliales circulantes con un robusto potencial de proliferación clonal que deben mostrarse...

Caracterización fenotípica y funcional de las células endoteliales Formadoras de Colonias derivados de la sangre del cordón umbilical

Se describe el método de las células madre de programación para sobreexpresar factores terapéuticos para la angiogénesis usando nanopartículas poliméricas biodegradables. Procesos descritos incluyen la síntesis de polímeros, la transfección de células madre derivadas de tejido adiposo in vitro, y la validación de la eficacia de las células madre programado para promover la angiogénesis en un modelo de isquemia de las extremidades posteriores murino.

Células Madre Programación para Terapéutico Angiogénesis Uso Biodegradable polimérico nanopartículas

A continuación, presentamos un protocolo para generar ingeniería tisular injertos de vasos que son funcionales para el injerto en ratones por doble siembra de células madre pluripotentes inducidas parcialmente (PIPSC) - deriva células musculares lisas y PIPSC - células endoteliales derivadas de un biorreactor andamio buque descelularizado.

Generación y Acrecentamiento de buques de ingeniería de tejidos en un modelo de ratón

Presentamos tres protocolos nuevos y más eficientes para la diferenciación de células madre pluripotentes inducidos por el hombre en cardiomiocitos, células endoteliales, y células del músculo liso y un método de entrega que permite mejorar el injerto de las células transplantadas mediante la combinación de la inyección de células con la entrega de citoquinas parche mediada.

Pluripotentes células madre derivadas de células cardiacas para la reparación del miocardio

El objetivo de este protocolo es aislar las células progenitoras endoteliales de cordón umbilical. Algunas de las aplicaciones incluyen el uso de estas células como un biomarcador para identificar pacientes con riesgo cardiovascular, tratamiento de enfermedades isquémicas, y construye creando ingeniería de tejido vascular y del corazón la válvula.

Aislamiento de células endoteliales progenitoras de la sangre de cordón Umbilical humano

Describimos un procedimiento quirúrgico utilizado para inducir isquemia periférica en conejos con hiperlipidemia y diabetes. Esta cirugía actúa como un modelo preclínico para afecciones experimentadas en la enfermedad arterial periférica en pacientes. La angiografía también se describe como un medio para medir la magnitud de la isquemia introducida y la recuperación de la perfusión.

Modelo preclínico de isquemia de extremidades traseras en conejos diabéticos

Aquí, se presenta un modelo experimental crítico de isquemia de la extremidad posterior seguido de una batería de pruebas funcionales, histológicas y moleculares para evaluar la eficacia de las terapias angiogénicas.

Evaluación de la angiogénesis terapéutica en un modelo murino de isquemia de las extremidades posteriores

Aquí se presenta un protocolo simple para la diferenciación dirigida de células endoteliales hemogénicas de células madre pluripotentes humanas en aproximadamente 1 semana.

Diferenciación dirigida de células endoteliales hemogénicas de células madre pluripotentes humanas

El presente protocolo describe un estudio clínico prospectivo, aleatorizado y controlado que evalúa una inyección de células madre mesenquimales del cordón umbilical humano para el tratamiento de las úlceras crónicas del pie diabético.

Estudio prospectivo, aleatorizado y controlado de una inyección de células madre mesenquimales del cordón umbilical humano para el tratamiento de las úlceras del pie diabético

Aprenda a inyectar células endoteliales derivadas de células madre embrionarias en el miembro posterior isquémico para tratar la enfermedad arterial periférica. Este método utiliza imágenes de bioluminiscencia para rastrear las células in vivo y evaluar su efecto terapéutico.

Células madre embrionarias-las células endoteliales derivadas de tratamiento de la isquemia Miembro Posterior

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