Meme Görüntüleme Penceresi yoluyla Dendra2 Photoswitching

Bu video, tümör hücre hattını eksprese eden bir floresan proteinin fare meme yağ yastığına enjekte edilmesiyle başlayan bir protokolü göstermektedir. İn vivo görüntüleme için özel bir oda inşa edilir ve daha sonra hayvana cerrahi olarak implante edilir ve bu noktada görüntüleme verileri elde edilebilir. Merhaba, ben Albert Einstein Tıp Fakültesi Biyofotonik Merkezi'nden Dr.John Condi ve Dr.Jeffrey Siegel'in laboratuvarından Dr.Vic

Bugün size, bellek görüntüleme penceresi aracılığıyla iki etiketli kanser hücresinin intravital fotoğraf değiştirme ve görüntüleme prosedürü göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarımızda, tümör mikroçevresinin tümör hücrelerinin motilitesi üzerindeki etkisini incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse yapalım Lateks eldiven giyiyor.

Beş ila 10 santimetrelik bir doku kültürü kabını ısıtarak ve bir inçlik Dremel ucu gibi yuvarlak bir sert nesneyi tabağa doğru iterek kavisli bir yüzey oluşturarak meme görüntüleme penceresinin veya MIW'nin imalatına başlayın. Isıtılmış bir tıraş bıçağı kullanarak yemeğin ortasını kesin. Şimdi kubbe şeklindeki plastik tabanın ortasında altı ila yedi milimetre çapında bir delik açmak için koni şeklinde küçük bir dremmel ucu kullanın.

Plastik tabanın kenarlarını Dremel ile zımparalayarak ve daha fazla törpüleyerek tamamen pürüzsüz hale getirin. Cam kapak kayması için düz bir yüzey oluşturmak için plastik tabanın üst kısmını törpüleyin. Dosyalanmış düz yüzeyin çapı dokuz ila 10 milimetre olmalıdır.

Ardından, sekiz milimetre dairesel cam kapağı yapıştırın. Süper yapıştırıcı kullanarak düzleştirilmiş yüzeye kaydırın ve 15 dakika kurumasını bekleyin. Isıtılmış 26 G'lik bir iğne kullanarak, tabanın dışından içine doğru delerek sekiz dikiş deliği açın, delikler kapağın etrafına eşit olarak dağıtılmalıdır.

Kapak kaymasının kenarından nwt 0.5 ila bir milimetre uzağa kaydırın. MIW'yi deiyonize suyla ve ardından tekrar% 70 etanol ile yıkayın. Camı tamamen şeffaf olana kadar temizlemek için bir Q ucu kullanın.

Tutkal buharından kalan sisli noktaları çıkarmak için aseton kullanın. Son olarak, MIW'yi her iki tarafta üç saat boyunca ultra fileto ışığına maruz bırakarak sterilize edin. MIW'yi yerleştirmeden önce, dördüncü meme ucunun etrafındaki alan, tümör hücrelerinin enjeksiyonunun bir sonucu olarak beş ila yedi milimetre çapında küçük bir tümör geliştirmiş olmalıdır.

Birinci bölümde: Tümörün gözle görülür şekilde nekrotik olmadığından emin olmak için kontrol edin. Etrafındaki alanda kıllı sağlam bir cilt olmalıdır. Başlamak için, steril bir başlığın içine bir parça steril bez koyarak ameliyat için steril bir alan hazırlayın.

Ortasına bir parça steril gazlı bez koyun ve ameliyat için ihtiyaç duyacağınız eşyaları toplayın. Bir çift küçük ve bir çift büyük diseksiyon, yaylı makas, mikro diseksiyon cımbızı ve forseps ve bir iğne tutucuya ihtiyacınız olacak Fareyi %2,5 oranında anestezi uyguladıktan sonra, tümörün üzerindeki alanı tıraş etmek için küçük bir hayvan tıraş makinesi kullanın. Tüylerin geri kalanını çıkarmak ve cildi temizlemek için tüy dökücü kremlerini kullanın.

Etanole batırılmış Q-uçları kullanarak. Hayvanı steril gazlı bez üzerine aktarın ve kurumasını ve enfekte olmasını önlemek için gözlere oftalmik merhem sürün. Cildi Betadine ile sterilize edin ve ardından% 70 etanol ile temizleyin.

Yıllık ve steril cerrahi bez ile cildi forseps kullanarak hemen meme ucunun medialine çekin ve yaklaşık iki milimetrelik bir kesi kesin. Diseksiyon, makas ve forseps kullanarak alttaki meme yağ pedini deriden ayırın. Ayrıldığında, deri ve delik, MIW'nin yerleştirilmesine uyum sağlayacak bir boyuta gerilir.

MIW'yi, MIW tabanının üstünde deri olacak şekilde yerleştirin ve yerine dikin. Dikiş deliklerini doldurmak ve MIW'yi cilde sabitlemek için doku yapıştırıcısı veya siyanoakrilat kullanın. Hayvan şimdi, ilk görüntüleme seansı gerçekleşmeden önce önümüzdeki üç ila dört gün boyunca iyileşmeye bırakılmalıdır.

Görüntüleme seansına hazırlanırken, görüntüleme kutusunu kullanmak için görüntüleme kutusunu tanımlayabiliriz. İlk olarak, hayvanı flor ile uyuşturun ve gözlere oftalmik merhem sürün. Anestezi makinesinden gelen flor egzozunu görüntüleme kutusunun önüne takın.

Giriş deliğinin dış tarafında. Görüntüleme kutusunun çıkış deliğine ikinci bir tüp takın. Bu tüp gaz filtresine ve daha sonra vakuma takılmalıdır.

Ardından, hayvanı MIW dibe bakacak şekilde yerleştirin. Kutuyu tutun ve alt kapıları, MIW tabanı aralarında tutulacak ve hareketsiz hale getirilecek şekilde ayarlayın. MIW tabanı, görüntüleme kutusu kapıları ile aynı seviyede olmalıdır.

MIW kapak kızağının bu seviyenin sadece birkaç milimetre altında olması gerekirken, MIW'nin alt sürgülü kapılar arasındaki konumunun, kapak sürgüsünün kutunun alt kapılarına paralel olarak düz bir şekilde uzanmasını sağladığından emin olun. Bu, kutuyu mikroskop aşamasının üzerine yerleştirmek için alana izin vermek için mikroskop objektifini alçaltarak düzgün odaklanmaya izin verecektir. Sahneyi, MIW kapak kayması, objektifin üzerinde olacak şekilde ayarlayın.

Artık hedefe odaklanabilir ve görüntülemeye başlayabiliriz. Burada açıklanan görüntüleme prosedürü, Leica SP beş konfokal mikroskop içindir ve kullanılan belirli bir mikroskopla deneyi optimize etmek için bir kılavuz olarak kullanılmalıdır. Tümörü yeşil bir floresan filtre ile göz merceğinden gözlemleyerek başlayın.

Aynı odak düzleminde gözle görülür şekilde akan ve düz duran ana kan damarlarını bulun. Gemilerden birini sahanın ortasına yerleştirin ve PMT algılamaya geçin. İki kanal için sıralı görüntüleme koleksiyonu kuracağız.

Bir kanal 488 nanometre lazer çizgisini kullanır ve hücre dışı matristen saçılmayı ve dendra iki'nin yeşil formundan gelen emisyonu toplar. İkinci kanal 543 nanometre lazer çizgisini kullanır ve dendranın kırmızı formundan emisyonu toplar. İki. Fotoğraf değiştirmeden önce 3D görüntüler toplayın.

Ardından, 405 nanometre lazer çizgisiyle seçilen bir hücre popülasyonunun fotoğrafını değiştirmek için ilgilenilen bölge tarama seçeneğini kullanın. Anahtarlamayı izlemek için proteinin kırmızı formundan emisyonu toplayın. Şimdi, geçiş sonrası 3D görüntüleri, ön anahtarlama görüntülerinin toplandığı yöntemle toplayın.

Pekala, UV'de% 20 lazer gücü kullanarak, bu alanı tümörde birden fazla bölgeye gitmek veya fotoğrafa dönüştürmek için, hem yeşil hem de kırmızı kanallarda bir dijital kamera kullanarak oküler aracılığıyla fotoğraf çekin. Bu, sonraki görüntüleme oturumları sırasında oryantasyona yardımcı olacaktır. Bu görüntüde, floresan göstermeyen ve kan damarına göre ortogonal olarak yönlendirilmiş dikdörtgen bir foto anahtarı gözlemlenmektedir.

Foto olmayan anahtar hücreleri yeşil görünürken, hücre dışı matristen gelen saçılma mor renktedir. Görüntü, Z ekseni boyunca dört görüntünün maksimum yoğunluk projeksiyonudur. Bellek görüntüleme penceresinden RA aracı etiketli hücreleri nasıl fotoğraflayacağınızı ve görüntüleyeceğinizi

Bu prosedürü kullanmak, tümörün farklı bölgelerindeki tümör hücrelerinin günler içindeki davranışlarını karşılaştırmak için önemlidir. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve denemenizde iyi şanslar.