Name: 在活细胞荧光蛋白的双探头光学突出纯净的光转化的 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-26T23:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: 学习使用mOrange2和Dronpa荧光蛋白进行活细胞双探针光学突出技术，通过488纳米和800纳米激光实现四种细胞群体的选择性标记，为细胞生物学动态研究提供先进成像方法。

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感谢佛罗里达州立大学的 Mike W. Davidson 提供编码荧光蛋白的质粒DNA。本研究由美国国立卫生研究院基金项目GM72048（资助给D.W.P.）支持。

1. 荧光蛋白液滴样品的制备
荧光蛋白液滴样品由1-辛醇/水乳液组成，其中荧光蛋白位于水相中。该乳液被夹在显微镜载玻片与一块22 mm见方的盖玻片之间，用于显微镜观察。
<ol>
<li>在制备荧光蛋白液滴样品之前，需要对显微镜载玻片和盖玻片进行清洁，并用疏水剂进行包被。</li>
<li>用丙酮清洗玻璃器皿5分钟，然后自然晾干。（可选：清洁后可将玻璃器皿在等离子清洗仪中处理30秒，以获得最佳的包被效果）。</li>
<li>在丙酮中配制2%的甲基三甲氧基硅烷溶液，并将玻璃器皿浸入该溶液中孵育2分钟以完成包被。包被后将玻璃器皿从溶液中取出，自然晾干，然后用喷瓶喷洒70%乙醇冲洗，再次晾干。（可选：此时可将玻璃器皿在80°C下烘烤1小时，使包被层与玻璃器皿发生共价结合）。包被后的玻璃器皿可至少保存一个月。</li>
<li>荧光蛋白以His6标签蛋白的形式从E. Coli中纯化1。测定纯化蛋白的吸收光谱，并用STE缓冲液（150 mM NaCl，10 mM Tris-HCl pH 8，1 mM EDTA）配制蛋白储备稀释液，使其光密度值约为0.1，同时加入0.1%牛血清白蛋白（BSA）。另外，在15 ml锥形管中配制10 ml的1-辛醇与STE缓冲液1:1混合液，剧烈震荡混匀。混匀后静置至相分离完全，上层为1-辛醇。（注意：由于1-辛醇气味强烈，所有接触过1-辛醇的废弃物必须使用密闭废液容器收集）。</li>
<li>在微量离心管中加入45 μl 1-辛醇和5 μl荧光蛋白溶液以制备乳剂。用手指轻弹管壁数次以初步乳化，随后将离心管放入超声水浴中处理30秒。在此期间，准备好已包被的显微镜载玻片和盖玻片。超声处理后，乳剂应完全呈浑浊状。超声结束后立即从离心管中部吸取4 μl乳剂，滴加到已包被的显微镜载玻片上，并用已包被的盖玻片覆盖。</li>
<li>若操作正确，乳剂应在载玻片与盖玻片之间均匀铺展。数分钟内样品将趋于稳定，形成厚度约为10 μm、直径各异的荧光液滴。较大的液滴靠近样品中心，较小的液滴则分布于边缘区域。</li>
</ol>
 2. 设置光转化实验
 以下步骤是进行荧光蛋白光转化实验的一般策略。该方法适用于纯化的蛋白质以及活细胞。
 <ol>
 <li>以下参数可为您的光转化实验设置提供一个通用的起始点： 
 40倍，1.3NA油浸物镜 
 图像尺寸 = 512 × 512 像素 
 扫描缩放 = 4 
 
 像素驻留时间 = 6 μsec 
 Z轴分辨率（针孔大小）= 3 μm</li>
 <li>为初始荧光和光转化后的荧光配置两个检测通道，并设置一个“光转化通道”。在本示例中，我们将使用纯化的mOrange2蛋白，这是一种由橙色转化为红色的光转化荧光蛋白。橙色形式通过561 nm激发光检测，荧光信号收集范围为570 nm至630 nm；光转化后的红色形式通过633 nm激发光检测，荧光信号收集范围为640 nm至700 nm。对于“光转化通道”，选择488 nm激发光，并收集490 nm至540 nm之间的荧光。（注意：成像光转化通道并非绝对必要。）</li>
 <li>使用初始荧光成像通道并以连续扫描方式调整激光功率和探测器增益，以获得最佳图像质量。</li>
 <li>激活光转化通道，并选择较低的激光功率。开始采集时间序列图像，逐步增加光转化激光强度，直至观察到初始荧光出现明显漂白。持续扫描，直到初始荧光强度大约漂白至原来的25%。</li>
 <li>关闭光转化通道，激活用于检测光转化后荧光的检测通道。以高探测器增益和低激光功率开始成像，逐步提高激光功率，直至检测到光转化后的荧光信号。一旦检测到光转化荧光，即可调整激光功率和探测器增益以获得最佳图像质量。</li>
 <li>最后，需优化用于光转化的激光功率及其照射时间。提高光转化激光功率可加快光转化速率，但过高的激光功率会导致蛋白发生光漂白。</li>
 <li>当确定了最佳的光转化激光功率和照射时间后，即可利用这些参数配置标准的光漂白或FRAP模块，此后不再需要“光转化通道”。</li>
 </ol>
 3. 使用 mOrange2 和 Dronpa 进行双探针光学标记
 由于具有红移的光谱特性，mOrange2 可与绿色光可逆开关荧光蛋白 Dronpa 联合使用，进行双探针光学标记，从而实现对 4 个独立细胞（细胞器）群体的选择性标记。
 <ol>
 <li>细胞在玻璃底 MatTek 培养皿中培养，并在成像前 24 小时使用标准的 Lipofectamine2000 转染方法进行转染1。</li>
 <li>按照第 2 节所述设置显微镜以进行 mOrange2 的光转化。</li>
 <li>配置显微镜以实现 Dronpa 的光开关。Dronpa 荧光可使用 mOrange2 的“光转化通道”进行成像（见步骤 2.2）。注意：用于成像 Dronpa 的激光功率应尽量降低，因为过高的激光功率会导致 Dronpa 失活。添加一个用于 Dronpa 光激活的通道。我们使用 800 nm 的双光子激发进行光激活，但也可使用 405 nm 激发实现。确定 Dronpa 荧光成像、光激活和光失活所需的激光功率。</li>
 <li>警告：mOrange2 的光转化和 Dronpa 的失活均可由 488 nm 激发引起。由于 mOrange2 光转化需要较高的激光功率，这将同时导致 Dronpa 荧光的失活。另一方面，Dronpa 的失活在较低激光功率下即可发生，可在不引起显著 mOrange2 光转化的情况下完成。</li>
 <li>在设定好 mOrange2 光转化和 Dronpa 光开关的参数后，通过以下步骤实现双探针光学标记：首先，使用低功率 488 nm 激发使整个视野中的 Dronpa 荧光失活；其次，选择一个感兴趣区域，并使用高功率 488 nm 激发对 mOrange2 进行光转化；最后，选择另一个感兴趣区域以激活 Dronpa 荧光。</li>
</ol>
4. 代表性结果
<img src="/files/ftp_upload/1995/1995fig1.jpg" alt="共聚焦显微镜成像分析囊泡融合，示意图显示脂质结构。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 液滴样品制备。 A) 正确制备的液滴样品。B) 未对载玻片和盖玻片进行包被处理而制备的样品。C) 未添加0.1% BSA而制备的样品。
<img src="/files/ftp_upload/1995/1995fig2.jpg" alt="光转化荧光图；橙色和红色发射光谱；数据分析；科学结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 图 2. 光转化激光功率和持续时间对 mOrange2 光转化的影响。 使用不同强度的 488 nm 激光对含有 mOrange2 蛋白的单个液滴进行连续光转化。用于光转化的相对激光功率分别为 10%（实线）、25%（虚线）和 100%（点线）。A）橙色荧光物质。B）光转化后的红色荧光物质。
<img src="/files/ftp_upload/1995/1995fig3.jpg" alt="细胞成像，荧光显微镜，绿色、橙色、红色显示的细胞结构；显微镜结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 图3. 使用 mOrange2 和 Dronpa 进行双探针光学标记。 A) 表达 mOrange2-Histone H2B 和 Dronpa-Mito 的细胞在光转化前的图像，显示细胞核中呈橙色荧光，线粒体中呈绿色荧光。B) 使用低功率 488 nm 激光激发关闭 Dronpa 荧光，此过程对 mOrange2 的光转化影响极小。C) 使用高功率 488 nm 激光激发将 mOrange2 光转化为红色荧光。D) 使用 800 nm 双光子激发再次激活 Dronpa 荧光。各图均为荧光图像与微分干涉差显微图像的叠加图。

<ol><li>Kremers, G. J., Hazelwood, K. L., Murphy, C. S., Davidson, M. W., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoconversion+in+orange+and+red+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Photoconversion in orange and red fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 6, 355-358 (2009).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

纯化的荧光蛋白液滴样品是一种非常便捷的样品形式，适用于荧光蛋白的光物理特性表征，例如研究光漂白动力学和光转化动力学。极小的液滴体积（约20皮升）有利于开展光漂白和光转化实验，而这类实验在基于比色皿的系统中往往难以实施。此外，如本文所示，液滴样品非常适用于构建共聚焦显微镜的光转化实验体系。疏水涂层和牛血清白蛋白（BSA）的存在对于获得均一液滴至关重要。若无涂层，液滴容易被压扁贴附于玻璃表面之一；若无BSA，荧光蛋白倾向于在1-辛醇/水界面处聚集，形成荧光晕环（图1）。
荧光蛋白光转化常被视为荧光漂白后荧光恢复（FRAP）的一种替代方法，其优势在于可以追踪光转化后的产物。然而，必须注意的是，光转化效果在很大程度上依赖于所使用的激光功率。过高的光转化激光功率或过长的照射时间将导致光漂白而非光转化，从而减少光转化荧光的信号量（图2）。
mOrange2 及其光转化物种的红移光谱特性允许使用绿色荧光光学标记物进行双探针光学标记。此处展示的是使用光可逆开关荧光蛋白（Dronpa），也可选择使用光激活荧光蛋白，例如 PA-GFP。Dro...

<table><tbody><tr><td>显微镜载玻片</td><td>VWR international</td><td>48312-003</td><td></td></tr><tr><td>22 mm 盖玻片</td><td>Corning</td><td>2940-245</td><td></td></tr><tr><td>1-辛醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4500</td><td></td></tr><tr><td>甲基三甲氧基硅烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6420</td><td></td></tr><tr><td>MatTek 培养皿</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr></tbody></table>

纯化荧光蛋白的光转化及活细胞中双探针光学标记

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

光可转换荧光蛋白（pc-FPs）是一类具有“光学标记”能力的荧光蛋白，其荧光颜色可通过特定波长的光照进行改变。光学标记可对荧光分子的亚群进行非侵入性标记，因此非常适合用于单个细胞或细胞器的追踪。
影响高效光转化的关键参数包括光转化光源的强度和照射时间。如果光强过低，光转化将变得缓慢甚至无法发生；反之，光强过高或照射时间过长则可能导致蛋白质发生光漂白，从而降低光转化的效率。
本方案描述了如何为 pc-FP 光转化应用设置共聚焦激光扫描显微镜的一般方法。首先，我们介绍制备纯化蛋白质液滴样品的步骤。这种样品形式非常便于在显微镜下研究荧光蛋白的光物理行为。其次，我们将利用蛋白质液滴样品展示如何配置显微镜以实现光转化。最后，我们将展示如何在活细胞中进行光学标记，包括使用 mOrange2 和 Dronpa 进行双探针光学标记。

本方案描述了在共聚焦激光扫描显微镜上进行荧光蛋白光转化的一般方法。我们介绍了纯化蛋白样品的光转化步骤，以及在活细胞中利用mOrange2和Dronpa进行双探针光学标记的实验流程。

光可转换荧光蛋白（pc-FPs）是一类具有“光学标记”能力的荧光蛋白，意味着其荧光颜色可在特定波长光照下发生改变……

以下实验的总体目标是利用荧光蛋白M orange two和ron作为双探针光学标记，选择性地标记四个独立的细胞群体或细胞区室。该方法首先用低强度488纳米激发光照射细胞，使所有绿色荧光蛋白的荧光信号失活；第二步，用高强度488纳米激发光照射细胞，使M orange荧光发生光转化，转变为红色荧光。接下来，细胞暴露于800纳米的双光子激发下，以开启dral荧光。结果再次表明，基于M Orange 2与drawn ppa的双探针光学标记，可实现四种不同组合的细胞标记。该方法相较于现有的亚细胞分级分离等实验的主要优势在于，其可在活细胞中进行。该实验流程有助于解答β细胞生物学中的关键问题，例如为何仅有少量胰岛素囊泡被分泌。尽管该流程可用于研究β细胞功能，也可应用于其他系统。例如，可用于活体中癌细胞的示踪。一种荧光蛋白液滴样本由八水乳液构成，其中荧光蛋白位于水相中。该乳液被夹在显微镜载玻片和一块22毫米见方的盖玻片之间，用于显微镜观察。在本实验开始前，必须将显微镜载玻片和盖玻片清洗干净，并涂覆疏水剂。通过用丙酮清洗五分钟来清洁玻璃器皿。清洗后，将玻璃器皿静置晾干。接着，配制2%的甲基三甲氧基硅烷丙酮溶液，并将玻璃器皿浸入该溶液中涂层2分钟。涂层完成后，将玻璃器皿从溶液中取出，静置使其干燥。然后用喷瓶中的70%乙醇冲洗玻璃器皿。冲洗后，让玻璃器皿再次自然晾干，并去除残留液体。使用加压空气干燥后，包被的玻璃器皿可保存至少一个月。玻璃器皿准备就绪后，获取先前已从大肠杆菌中纯化并带有组氨酸标签的荧光蛋白。测定纯化蛋白的吸收光谱。用 pH 为 8、含 0.1% 牛血清白蛋白的 Tris 缓冲盐溶液配制储备稀释液，使其光密度值约为 0.1。此外，在一个15毫升的锥形管中，准备10毫升的1:1混合液，包含正辛醇和Tris缓冲盐溶液，并剧烈混合。混合后，静置混合物直至相分离完全。上层相为正辛醇，用于制备乳液，用移液器将45微升正辛醇和5微升荧光蛋白加入一个epi管中。轻轻敲击试管数次以开始乳液的形成，然后将试管置于超声波清洗仪中处理30秒。同时，在超声处理期间准备好已包被的显微镜载玻片和盖玻片。乳液应完全呈浑浊状。立即用移液器从管中乳液的中部吸取四微升，滴加到经包被的显微镜载玻片上，并用经包被的盖玻片覆盖。乳液应在载玻片与盖玻片之间均匀铺展。数分钟内，样品即可保持稳定。以下步骤是在共聚焦激光扫描显微镜上建立荧光蛋白光转化实验的一般策略。该步骤既可用于纯化的蛋白质，也可用于活细胞。本实验以含有纯化 m orange two 蛋白的液滴样品作为光转化实验的通用起始材料。按如下方式设置共聚焦激光扫描显微镜：使用40倍、数值孔径1.3的油浸物镜，图像尺寸设为512×512像素。将像素驻留时间设为6微秒，扫描缩放倍数设为4，并增大针孔尺寸，使Z轴分辨率匹配为3微米。为初始荧光和光转化后的荧光设置两个检测通道，同时设置一个光转化通道。使用561纳米激发光观察橙色荧光信号，并收集570至630纳米之间的荧光。使用633纳米激发光检测光转化后的红色荧光信号，并收集640至700纳米之间的荧光。对于光转换通道，选择488纳米激光线，并收集490至540纳米之间的荧光信号。成像。光转换通道并非绝对必要，但可能有助于实验。开始实验时，使用检测通道通过连续扫描对初始荧光进行成像，以调节激光功率和检测器增益，获得最佳图像质量。然后激活光转换通道并选择低激光功率。开始成像时间序列，并逐步增加光转换激光强度，直至观察到初始荧光出现明显漂白。持续扫描，直到初始荧光强度大约漂白至75%。接下来，关闭光转换通道，并激活用于检测光转换后荧光的检测通道。在低激光功率下以高探测器增益开始成像，然后逐步提高激光功率，直至检测到光转换后的荧光信号。检测到信号后，调整激光功率以及检测增益以获得最佳图像质量。最后，优化用于光转化的激光功率及其照射时间。增加激光功率将加快光转化速率。然而，过高的激光功率会导致蛋白质发生光漂白。在确定最佳的光转化条件、激光功率和照射时间后，可利用这些参数来配置标准的光漂白模块或光漂白后荧光恢复模块。由于M orange two具有红移光谱特性，此后将不再需要光转化通道。可将该方法与绿色光可切换荧光蛋白 drawn PU 联用，实现双探针光学标记。开始双探针光学标记时，先在玻璃底 MatTek 培养皿中培养 HeLa 细胞，并在成像前 24 小时使用标准的 LIPECTOMY 2000 转染法将编码荧光蛋白的质粒转染至细胞中。将活细胞置于共聚焦激光扫描显微镜上，并按照之前所述设置显微镜以进行M orange双光转换。然后配置显微镜以实现DPA光切换。DPA由488纳米光激发，其荧光可使用M orange双光转换通道进行成像。务必尽量降低用于成像 MPA 的激光功率，因为过高的激光功率会导致 mpa 失活。添加一个用于 MPA 光激活的通道，使用 800 纳米双光子激发，随后确定成像、光激活和 OFA 荧光光失活所需的激光功率。该实验步骤中最困难的部分之一是在不光转化 M orange 的情况下使 RPA 失活，因为这两个过程发生在相同的波长下。为防止此情况发生，仔细优化光转化条件至关重要。激光功率与持续时间需谨慎设置，以实现M orange two的光转化。在使用488纳米光激发以失活PU时，需避免发生显著的M orange two光转化。一旦确定了M orange two光转化和DPA光开关的参数，应使用较低的激光功率。可实现双探针光学标记。首先，使用低功率488纳米激发光使整个视野中的DPA荧光失活；然后选择感兴趣区域，并使用高功率488纳米激发光将mOrange2进行转化。最后，选择一个感兴趣区域，并使用800纳米双光子激发激活DPA荧光。荧光蛋白液滴样品非常适合用于建立共聚焦显微镜的光转化应用。当液滴样品制备得当时，液滴呈现高度均一的形态。然而，当制备样品时未在载玻片上涂覆盖玻片，所制备样品中的液滴往往会受到其中一个玻璃表面的挤压而变形。在缺乏0.1% BSA的情况下，荧光蛋白倾向于在八烷与水的界面处聚集。荧光光转化形成的光环效果在很大程度上依赖于激光功率和照射时间。激光功率过高或曝光时间过长会导致光漂白，从而引起光转化后红色荧光的减弱。M orange two 与 PHO 独特的光谱特性允许在光转化前进行双探针光学标记；表达 M orange two、组蛋白 H two B 和 DPA mito 的细胞在细胞核中显示橙色荧光，在线粒体中显示绿色荧光。当使用低功率 488 纳米激发光关闭所有荧光时，M orange 的光转化程度最小。两个M橙色荧光蛋白可通过高强度488纳米激发光转化为红色。一旦M橙色荧光蛋白完成光转化，即可使用800纳米双光子激发重新开启囊泡荧光。通过双探针光学标记技术，细胞可被四种不同的方式标记。利用该技术，可特异性地标记四种不同的细胞群体。如您所见，该实验操作中最困难的环节之一是在不发生mOrange光转化的情况下使MPA失活。一旦掌握此项技术，便可利用该系统开展进一步的实验，例如，在胰腺β细胞中同时追踪多个细胞群体。以上就是全部内容。希望本次讲解对您有所帮助，祝您的实验顺利成功。

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Biology

生物学

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