Techniques for Imaging Ca ^{2 +} Signaling in menschlichen Spermien

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Bildserien von immobilisierten menschlichen Spermien zu erhalten, die mit einem fluoreszierenden Kalzium-Reporterchip I First markiert wurden. Motilzellen werden aus Samenplasma isoliert, indem sie in das Inkubationsmedium geschwommen werden. Nach der Kapazitation werden die Zellen mit einem fluoreszierenden Kalziumindikator markiert und dann in eine schmelzbare Bildgebungskammer überführt, die auf einem inversen Fluoreszenzmikroskop montiert ist.

Die Reaktionen der Kalziumionenkonzentration werden als Zeitraffer-Bildserie erfasst und analysiert, um die Reaktionen einzelner Zellen zu extrahieren. Hallo, ich bin Edwin Andres Morales Garcia aus dem Labor von Dr. Steven J. Public Cova an der School of Biosciences an der University of Birmingham UK. Ich bin Katherine Nash, ebenfalls von Public Overlap.

Und ich bin Jennifer Morris von The Public Overlap. Heute zeigen wir Ihnen Ihr Verfahren zur Abbildung intrazellulärer Kalziumreaktionen in individuellem menschlichen Perato-Boden. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Regulation der Spermienaktivitäten anhand von Reizen zu untersuchen, die von der Eizelle und der weiblichen Falle abgeleitet werden.

Also lasst uns loslegen. Lagern Sie Samenproben ab dem Zeitpunkt der Entnahme nicht länger als 30 Minuten bei 37 Grad Celsius, um Motorzellen aus dem Samenplasma PET zu isolieren: einen Milliliter L'S-Bilanzsalzlösungen, ergänzt mit 0,3 % BSA, abgekürzt als S-E-B-S-S, in eine Reihe von fünf Millilitern Polystyrol-Rundbodenröhrchen. Legen Sie das S-E-B-S-S vorsichtig mit 0,3 Millilitern Sperma in jedes Röhrchen und verschließen Sie das Röhrchen locker.

Inkubieren Sie die Röhrchen eine Stunde lang in einem 45-Grad-Winkel bei 37 Grad Celsius und 6 % Kohlendioxid. Damit bewegliche Zellen in das S-E-B-S-S aufschwimmen können, klopfen Sie uns vorsichtig die oberen 0,7 Milliliter der Lösung ab und ziehen Sie die Lösung aus allen Röhrchen in ein sauberes 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen aus Polystyrol. Schütteln Sie vorsichtig, um Zählzellen, die mit Formalin immobilisiert wurden, in einer neuen Darmzählkammer zu mischen.

Bringen Sie die Konzentration auf 6 Millionen Zellen pro Milliliter in S-E-B-S-S und teilen Sie das Sperma in 200 Mikroliter Aliquots in fünf Milliliter Polystyrol-Rundbodenröhrchen auf. Locker verschließen. Wenn die Reaktion kapazitiver Zellen untersucht wird, inkubieren Sie die Röhrchen fünf bis sechs Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 6 % Kohlendioxid, um die Kapazitation zu ermöglichen. Tragen Sie 10 Mikroliter 10 % Polylysin als eine Anzahl kleiner Tropfen in die Mitte eines 22 x 50 Millimeter großen Bereichs auf.

Decken Sie Nummer eins ab und lassen Sie es vollständig trocknen. Verwenden Sie Vakuumfett, um das Deckglas mit der behandelten Seite nach oben an einer gebauten schmelzbaren Bildgebungskammer zu befestigen. Für den Zweck.

Wählen Sie für jedes Bildgebungsexperiment ein einzelnes Röhrchen mit kapazitiven Zellen aus und fügen Sie 1,2 Mikroliter à 2,5 Milligramm pro Milliliter hinzu. Calciumabhängiges Organgrün gelöst in DMSO für eine Endkonzentration von 10 Mikromolaren. Inkubieren Sie das Röhrchen 40 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 6 % Kohlendioxid.

Entfernen Sie mit einem 200-Mikroliter-Pepto und einer P 200-Spitze die gesamte Lösung vollständig aus der Tube. Füllen Sie die Kammer, indem Sie vorsichtig in die Zulauföffnung injizieren. Kippen Sie die Kammer so, dass Blasen durch den Abfluss entweichen.

Stellen Sie die gesamte Kammer in den Inkubator und inkubieren Sie weitere 20 Minuten bei 37 Grad Celsius und 6 % Kohlendioxid. Damit die Spermien an dem Poly-D-Lysin haften können. Montieren Sie die Kammer an das inverse Fluoreszenzmikroskop und verbinden Sie sie mit dem Perfusionsgerät.

Lassen Sie das Präparat mindestens 10 Minuten im Dunkeln, damit die Durchblutung abfliegt. Lose Zellen und extrazelluläre Zellen sterben unter Phasenkontrast bei 40-facher oder 60-facher Vergrößerung ab, wählen Sie ein Sichtfeld, bei dem der Zellabstand ausreichend ist, um die Fluoreszenz jeder Zelle separat beurteilen zu können. Die Zellen sollten ausreichend befestigt sein, vorzugsweise aber eine deutliche Fledger-Aktivität aufweisen.

Schalten Sie das Mikroskop auf den grünen Fluoreszenzkanal um. Halten Sie die Belichtungszeiten auf das Minimum, das für ein klares Fluoreszenzbild erforderlich ist. Zur Reduzierung von Photobleaching in der IQ-Software.

Aktivieren Sie die Zeitreihenbilderfassung. Nehmen Sie Bilder mit 0,1 Hertz auf und verwenden Sie einen softwaregesteuerten Verschluss, um die Beleuchtung zu begrenzen. Anfängliche Aufzeichnung für einen Kontrollzeitraum von drei bis fünf Minuten, Manipulation der Kalziumkonzentration der Kochsalzlösung und Anwendung von Medikamenten durch Wechseln der Kochsalzlösung am Kopf des Perfusionssystems.

Notieren Sie sich die Zeit, zu der jeder Stimulus zum Kopf hinzugefügt wird, und berechnen Sie seine Ankunftszeit in der Kammer, wie im schriftlichen Teil dieses Protokolls beschrieben. Um Bilder offline zu analysieren, verwenden Sie eines der Zeichenwerkzeuge, um einen Bereich von Interesse oder ROI um jede Zelle oder jeden Teil einer Zelle zu skizzieren, den hinteren Spermienkopf, da das in diesem Bereich mobilisierte Kalzium gespeichert ist. Scrollen Sie mit dem Schieberegler, um die Bildserie zu überprüfen.

Identifizieren und entfernen Sie Zellen, die nicht vollständig innerhalb des ROI bleiben, andere Zellen überlappen oder den großen und schnellen Anstieg gefolgt von einem starken Abfall der Fluoreszenzintensität gezeigt haben, der für den Zelltod charakteristisch ist. Verwenden Sie die Analysefunktion, um für jeden ROI eine Zeitfluoreszenzintensitätsreihe zu generieren. Die Daten können dann exportiert und in einem Tabellenblatt analysiert werden.

Diese Bilder stammen aus einer Serie, die während der Stimulation mit drei mikromolaren Progesteron aufgenommen wurde. Die untere Reihe wurde mit Pseudofarbe beschichtet. Um die relativen Intensitätsänderungen besser veranschaulichen zu können, gelangte hier Progesteron in die Kammer. Hier.

Diese Ergebnisse werden in einem Zeitraffervideo animiert. Beachten Sie den schnellen Anstieg der Fluoreszenzintensität, gefolgt von einem langsamen Anstieg, der auf entsprechende Veränderungen der intrazellulären Kalziumspiegel hinweist. Diese Daten werden hier aus den durchschnittlichen Intensitäten des hinteren Kopfes von drei Zellen quantifiziert.

Drei mikromolare Progesterone wurden zu dem durch den Pfeil markierten Zeitpunkt zugesetzt. Die gestrichelte Linie zeigt die mittlere Kontrollfluoreszenz. Heute haben wir Ihnen gerade gezeigt, wie Sie Zellen von guter Qualität isolieren, sie mit einem kalziumempfindlichen Farbstoff beladen und die Reaktion einzelner Zellen auf Stimulation überwachen können.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die bestmögliche Zellpopulation zu verwenden, auch die Beleuchtung der Zellen zu minimieren, um Lichtschäden zu vermeiden, und den Farbstoff auszuwählen, der am besten zu den Reaktionen passt, die Sie betrachten. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.