Name: 인간 신경 줄기 세포를 Passaging (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 배우세요 인간 신경 줄기/전구세포(hNSPCs)의 체외 배양 및 패싱 방법을. 피브로넥틴 코팅과 세포 분리 버퍼를 활용한 이 기술은 신경 발달 연구와 재현성 향상에 필수적입니다.

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저자는 기꺼이 어린이 병원, 그들의 culturing에 hNSPCs과 초기 교육을 제공하는 오렌지 카운티 연구소 국립 인간 신경 줄기 세포 자원의 박사 필립 H. 슈워츠 인정합니다.

참고 : 일주일에 한번씩 우리 hNSPCs의 일상 culturing 들어, 우리가 매일하고 일반적으로 통로를 1시 2분 미디어 50-100%을 변경합니다. F12 기지 미디어 : 문화 미디어는 20 %의 비트 9500 DMEM에 1X 항생제 / antimycotic 및 성장 요인을 (EGF, FGF 및 PDGF 40 NG / ML 각)이 포함되어 있습니다. 코팅 휴대용 술병을 준비하고 세포를 Dissociating <ol><li> 37 10 μg / 야간 4 시간 또는 EMEM에 ML 인간 fibronectin과 passaged 세포, 코트 T25 flasks, ° C 조직 문화의 인큐베이터에 대한 새로운 flasks를 준비합니다. 오른쪽 세포를 passaging 전에 fibronectin 솔루션을 제거하고 PBS로 flasks을 씻어. </li><li> 새로운 fibronectin - 코팅 flasks (각 플라스크에 대한 미디어의 절반 최종 볼륨이 &quot;시설&quot;미디어된다는 등)에 passaged 수 세포에서 오래된 &quot;시설&quot;미디어를 전송합니다. 이러한 culturing 조건들은 undifferentiated 상태에서 이러한 세포를 유지 도움이됩니다. </li><li> 일단 미디어의 모든 passaged 수 세포에서 제거, PBS로 한번 세포를 씻어. 세포를 건조하지 않도록 조심 해요. </li><li> 직접 세포 (T25 플라스크에 대한 1.0-1.5 ML)에 셀 분리 버퍼 (CDB)를 추가합니다. 실온에서 약 5 분 동안 버퍼에 세포를 품어. 부드럽게 휴대용 술병을 감청하는 것은 세포 분리 속도를 도움이 될 것입니다. </li></ol> , Centrifuging Resuspending 및 도금 세포 <ol><li> 분리된 세포와 술병을 (CDB의 ~ 3 배 볼륨을 사용) : 혈청 함유 미디어 (F12 10 %로 열 inactivated 태아 소 혈청 DMEM)을 추가합니다. 15 ML 원뿔 관에 미디어 및 세포를 제거합니다. 플라스크를 씻어 잔류 세포를 복구하는 신선한 혈청 함유 미디어의 작은 볼륨을 사용합니다. </li><li> 5 분 1,000 RPM (~ 200xg)에서 미디어 및 세포를 원심 분리기. </li><li> 혈청 함유 미디어에서 흡입 및 단일 세포 현탁액을하고 위아래로 pipetting, 신선한 문화 매체에있는 세포를 resuspend. </li><li> 1시 2분 분할에 대한 새로운 각 플라스크에 resuspended 세포의 절반을 전송합니다. 플라스크에있는 새로운 통로 번호를 적어 둡니다. </li></ol>

<ol><li>Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+neural+precursor+cells+by+laminin+and+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins.</a> J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).</li>
<li>Nethercott, H. N., Maxwell, H., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Stem+Cell+Manual%3A+A+Laboratory+Guide%22%5BJournal%5D)">Neural stem cell culture.</a> Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. , Elsevier/Cell Press. (2007).</li>
<li>Palmer, T. D., Schwartz, P. H., Taupin, P., Kaspar, B., Stein, S. A., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture.+Progenitor+cells+from+human+brain+after+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell culture. Progenitor cells from human brain after death.</a> Nature. 411, 42-43 (2001).</li>
<li>Schwartz, P. H., Bryant, P. J., Fuja, T. J., Su, H., O'Dowd, D. K., Klassen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+neural+progenitor+cells+from+post-mortem+human+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of neural progenitor cells from post-mortem human cortex.</a> J Neurosci Res. 74, 838-851 (2003).</li>
</ol>

우리는이 프로토콜 hNSPCs의 신뢰할 수있는 문화를 제공하는 것으로 나타났습니다. 우리의 세포에 대한 하나의 중요한 요소들은 상당히 밀도 문화로 보관하고 세포가 스파스되는 시점 passaged 수 없습니다 필요합니다. 우리 손에, 스파스 문화는 매우 느리게 성장 또는 완전히 분열 중지. 문화가 매우 밀도 때 이러한 이유로, 우리는 보통 우리 문화 1시 2분 또는 1시 3분 분할. 그것이 좋은 세포 부착 및 마이 그 레이션을 촉진하지만, laminin 달리, 그것은 또한 세포를 분리하기 위해 셀 분리 버퍼 (CDB)의 사용을 허용 이후 fibronectin과 문화 요리의 코팅 표면은 중요합니다. laminin에 세포 부착이 너무 강해이며 세포 분리를위한 proteolytic 효소 (예 : 트립신)의 사용이 필요합니다. 비 효소 CDB는 세포 표면 단백질의 proteolytic 절단은 시간이 지남에 따라 hNSPCs의 형태학의 변화로 이어질 수 있기 때문에 트립신을 선호합니다. 또한, 에어컨 미디어 culturing의 hNSCPs들은 undifferentiated ...

<table><tbody><tr><td>BIT-9500 (BSA, Insulin, Transferrin)</td><td>시약</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>09500</td><td></td></tr><tr><td>항생제-항진균제 (Antibiotic-Antimycotic)</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>DMEM:F12 (1X)</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>EMEM (1X)</td><td>시약</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>MT-10-010-CV</td><td>표시된 카탈로그 번호로 Fisher를 통해 공급됨</td></tr><tr><td>소태아혈청 (Fetal Bovine Serum)</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>FGF, human basic recombinant</td><td>시약</td><td>PeproTech Inc</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-AB</td><td>시약</td><td>PeproTech Inc</td><td>100-00AB</td><td></td></tr><tr><td>EGF, human recombinant</td><td>시약</td><td>BD Biosciences</td><td>CB40052</td><td>표시된 카탈로그 번호로 Fisher를 통해 공급됨</td></tr><tr><td>세포 배양 플라스크, 25 cm2</td><td>도구</td><td>Corning</td><td>10-126-28</td><td>표시된 카탈로그 번호로 Fisher를 통해 공급됨</td></tr><tr><td>피브로넥틴 (Fibronectin), human, natural</td><td>시약</td><td>BD Biosciences</td><td>CB40008A</td><td>표시된 카탈로그 번호로 Fisher를 통해 공급됨</td></tr><tr><td>인간 신경줄기/전구세포 (Human Neural Stem/Precursor Cells)</td><td>세포</td><td>National Human Neural Stem Cell Resource</td><td></td><td></td></tr><tr><td>세포 해리 버퍼 (Cell Dissociation Buffer)</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>13150-016</td><td></td></tr></tbody></table>

인간 신경 줄기 세포를 passaging

Passaging Human Neural Stem Cells

체외에서 인간의 신경 줄기 / 전구체 세포 (hNSPCs)를 조작하는 능력은 치료 목적을 위해 세포 이식으로 자신의 유틸리티를 조사할뿐만 아니라 인간의 신경 발달과 병리 많은 근본적인 과정을 탐구하는 수단을 제공합니다. 이 프로토콜은이 기술을 표준화하고 인간의 줄기 세포 연구의 재현성을 증가 기대에 culturing 및 passaging hNSPCs의 간단한 방법을 제공합니다. 우리가 사용하는 hNSPCs은 국립 인간 신경 줄기 세포 자원에 의해 시체 같은 출생 후의 두뇌 cortices으로부터 격리 및 flasks에 점착 성의 문화가 fibronectin (팔머 외, 2001..; 슈워츠 외, 2003)와 코팅으로 성장했다. DMEM에 우리 문화는 우리 hNSPCs : F12 혈청이없는 미디어 EGF, FGF 및 PDGF와 함께 보충 및 통로들을 1시 2분 약 매 칠일. 이러한 조건을 사용하여 문화의 세포의 대부분은 바이폴라 형태를 유지하고 undifferentiated 신경 줄기 세포 (예 : nestin 및 sox2 등)의 마커를 표현한다.

체외에서 인간의 신경 줄기 / 전구체 세포 (hNSPCs)를 조작하는 능력은 치료 목적을 위해 세포 이식으로 자신의 유틸리티를 조사하고 인간의 신경 발달을 탐험하실 수 있습니다. 이 프로토콜은 인간의 줄기 세포 연구의 증가 재현성의 희망에 culturing 및 passaging hNSPCs의 방법을 보여줍니다.

인간 신경 줄기 세포를 Passaging

인체 신경 줄기/전구 세포(hNSPCs)를 체외(in vitro)에서 조작할 수 있는 능력은 ...을 위한 세포 이식제로서의 유용성을 조사할 수 있는 수단을 제공합니다.

안녕하세요, 저는 Steve입니다. 저는 UC Irvine 병리학과의 Dr.Flanagan 연구실에서 근무하고 있습니다. 오늘은 인간 신경 전구 세포를 분할하는 방법을 보여드리겠습니다.이 기술은 새로운 플라스크를 인간 fibronectin 용액으로 코팅하고, 세포 해리 완충액을 사용하여 세포를 떼어낸 후, 10% 혈청 용액으로 세포 해리 완충액을 중화시키고, 세포 현탁액을 원심 분리한 다음, 세포를 신선한 배지에 다시 현탁하여 새로운 플라스크로 옮기는 과정을 포함합니다. 저희 실험실에서는 이틀마다 배지의 절반을 교체하여 인간 신경 전구 세포를 배양하며, 약 일주일마다 1:2 비율로 분할하여 계대 배양합니다. 세포를 계대 배양할 때, 면역 화학 실험에 사용하거나 핵 효과 인자를 이용한 형질 전환을 수행하려는 경우에는 세포 수를 측정하기도 합니다.세포를 패키징할 때 세포 해리 버퍼를 사용하는 것이 중요한데, 그 이유는 첫째로 트립신과 달리 비효소성 제품이며 세포에 훨씬 더 부드럽게 작용하기 때문입니다. 안녕하세요, 현재 조직 배양실에 나와 있습니다. 이제 합류(confluent) 상태의 인간 전구 세포 플라스크가 어떤 모습인지 보여드리기 전에, 먼저 조직 배양 준비를 하겠습니다. 우선 UV 램프를 끄고, 전등과 공기 흐름 장치를 켜겠습니다.다음으로, 페이퍼 타월에 70% ethanol을 뿌려 후드를 닦아내어 소독하겠습니다. 후드 내부에 70% ethanol을 직접 분사하면 매우 고가인 HEPA 필터가 손상될 수 있으므로, 반드시 페이퍼 타월에 70% ethanol을 뿌려 닦아내는 것이 중요합니다. 이어서 모든 시약과 기구에 소독액을 분사하겠습니다.마지막으로 진공 호스에 스프레이를 뿌리면 모든 준비가 끝납니다. 이제 세포들을 살펴보겠습니다. 세포들의 합쳐짐 정도(confluency)가 약 80% 정도로 보입니다.이 세포들은 인간 태아에서 분리한 인간 신경 전구세포이며, T 25 플라스크에서 배양합니다. 약 일주일마다 1:2 비율로 계대 배양합니다. 이제 세포를 계대 배양할 준비가 되었습니다.먼저 BD biosciences의 human fibronectin으로 4시간 동안 코팅한 새로운 T 25 플라스크를 준비하겠습니다. fibronectin 용액을 제거한 후, 세포를 플라스크로 옮기기 전에 BBS로 이 플라스크를 헹구겠습니다.이제 37°C 인큐베이터에서 세포를 꺼내겠습니다. 여기 있습니다. 이제 human fibro

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연구

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생물학

셀에 관심 유전자를 소개하면 생체내 년에 기능을 elucidating위한 강력한 방법입니다. 이 프로토콜은 Amaxa 만든 Nucleofector electroporation 장치를 사용하여 인간의 신경 줄기 / 전구체 세포 (hNSPCs)의 문화를 transfecting의 효율적인 방법을 설명합니다.

Amaxa Nucleofector과 인간 신경 줄기 세포를 Transfecting

가능한 세포의 정확한 수를 지식은 많은 조직 문화 조작이 필요합니다. 이 프로토콜은 살고 죽은 세포 사이의 차별과 hemacytometer를 사용하여 세포를 계량하는 방법에 대해 설명합니다. 그것이 인간의 신경 줄기 / 전구체 세포 (hNSPCs)를 계산 설명하지만, 그것은 다른 세포 유형에 사용할 수 있습니다.

인간 신경 줄기 세포를 계산

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성인 Hippocampal 북극 그라운드 다람쥐 신경 줄기 세포의 성장과 분화

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폐기 인간 태아 두피 조직에서 신경 줄기 세포의 생성

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인간 신경 줄기 세포를 신경 및 성상 세포 전구 세포로 분화

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성인 쥐의 뇌의 기존 및 비 인습적 인 지역에서 신경 줄기 세포 성장

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분화된 인간 신경 줄기세포(hNSCs)에서 miRNA의 변화를 특성화하기 위한 목적으로 3차원 시스템에서의 hNSC 분화, miRNA PCR 어레이에 의한 microRNA 발현 변화 평가, miRNA 표적 예측을 위한 컴퓨터 분석 및 이중 루시페라제 분석에 의한 검증에 대해 설명합니다.

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인간 신경 줄기 세포를 Passaging

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