Génération expérimentale de carcinome Associated fibroblastes (CAF) à partir des fibroblastes mammaires

Cette vidéo décrit une procédure permettant de générer des fibroblastes ou des veaux associés au carcinome à partir de mémoire humaine cultivée primaire. Les carcinomes des fibroblastes sont des tissus complexes composés de cellules néoplasiques et d’un compartiment non cancéreux appelé stromer. Le stroma S associé à la tumeur se compose d’une matrice extracellulaire et d’une variété de cellules stromales, y compris des fibroblastes, des myofibroblastes, des cellules endothéliales, des parasites et des fibroblastes associés au carcinome leucocytaire riches en myofibroblastes, une caractéristique des fibroblastes activés présents dans la tumeur.

Stromer joue un rôle majeur dans la progression de la tumeur. Ceux-ci peuvent être générés in vitro en isolant d’abord des fibroblastes mammaires humains primaires à partir de tissu mammaire sain obtenu par mammoplastie de réduction. Le tissu obtenu est dissocié en une suspension cellulaire unique, puis mortalisé par transduction virale et modifié pour exprimer la GFP et un gène de résistance à la mycine puram.

Les cellules sont ensuite co-injectées avec un carcinome du sein humain. MCF sept cellules RA par voie sous-cutanée dans une souris immunodéficiente. Les fibroblastes à mémoire humaine injectés évolueront en myofibroblastes de veau favorisant les tumeurs.

Ensuite, les fibroblastes mammaires de l’humeur parentale sont extraits des xénogreffes tumorales et cultivés en présence de mycine pure. L’analyse immunohistochimique révèle que les fibroblastes à mémoire humaine normale initialement présents évoluent en myofibroblastes de veau au sein de la xénogreffe tumorale qui ont acquis la capacité de favoriser la genèse tumorale. Le principal avantage de cette technique par la méthode existante comme l’extraction avec des cals primaires d’une patiente atteinte d’un cancer du sein est que nous sommes éligibles pour générer expérimentalement des veaux à partir de fibroblastes mammaires humains en utilisant une tumeur coimplantatoire.

Kar, boursier postdoctoral dans mon laboratoire, et Ahmed Kar, étudiant au doctorat dans le laboratoire, seront présents. Commencez par un gramme de tissu mammaire humain sain disséqué lors d’une mammoplastie de réduction. Lavez le mouchoir plusieurs fois dans du PBS, puis placez-le dans une boîte pétro de 15 centimètres et utilisez une lame de rasoir stérile pour le couper en petits fragments de moins de 1,5 millimètre cube.

Ensuite, utilisez la lame de rasoir pour transférer les fragments de tissu dans un tube conique de 15 millilitres contenant 10 millilitres de tampon de dissociation cellulaire pour chaque demi-gramme de tissu. Puis vortex pendant une minute à vitesse maximale. Placez le tube sur une bascule dans un incubateur à 37 degrés Celsius et laissez les fragments de tissu digérer pendant 12 à 18 heures.

Le lendemain, il restera encore de nombreux morceaux de fragments de tissus non digérés dans le vortex tubulaire. Tout d’abord, à vitesse maximale, placez le tube sur la paillasse et incubez pendant cinq minutes à température ambiante sans agitation. Après l’incubation, à l’aide d’une pipette physiologique de cinq millilitres, transférez le NATANT de SUP enrichi en cellules stromales dans un nouveau tube conique.

Ensuite, centrifugez la fraction stromale pendant cinq minutes à 250 fois la gravité. Après avoir essoré, suspendez à nouveau la cellule pelus dans PBS, puis centrifugez votre gain pendant cinq minutes à 250 fois la gravité. Ensuite, mettez à nouveau le granulé en suspension dans du DMEM complété par 10 % de FCS et transférez-le dans une boîte de Pétri de 15 centimètres.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Après huit à 10 jours, la cellule devrait être confluente. À ce stade, les cellules sont récoltées et peuvent être congelées pour un stockage à long terme.

Pour immortaliser les fibroblastes primaires à mémoire normale humaine isolés, introduisez un vecteur MIG P rétroviral exprimant à la fois la culture H turt et GFP, les cellules pendant quatre à cinq jours, puis triez les cellules positives à la GFP à l’aide de la cytométrie en flux. Introduire une construction rétrovirale P babe puro codant pour un gène de résistance à la mycine pure dans la culture de fibroblastes immortalisés marqués à la GFP. Les cellules pendant cinq à sept jours en présence de mycine pure à une concentration finale d’un microgramme par millilitre.

Pour isoler les fibroblastes à mémoire humaine immortalisés résistants aux mycines résistantes à la GFP GFP. Ensuite, il s’agit d’examiner si les fibroblastes produisent des virus actifs, ce qui peut conduire au transfert horizontal de gènes codant pour la GFP et la résistance à la mycine pure. Cultivez 2,5 fois 10 pour atteindre les cinq fibroblastes de mémoire humaine immortalisés résistants aux mycines pures dans une boîte de Pétri de six centimètres pendant deux jours.

Prélevez et filtrez le milieu conditionné aux fibroblastes à l’aide d’un filtre à seringue de 0,45 micron. Ajoutez ensuite à 10 t et demi de cellules de fibroblastes de souris et cultivez pendant 12 heures en présence de cinq microgrammes par millilitre de sulfate de protéines, ce qui augmente l’efficacité de l’infection virale après 12 heures. Changer le milieu pour du DMEM complété par 10 % de FCS et de la culture pendant deux jours supplémentaires.

Examinez les cellules par microscopie à fluorescence. 10 cellules T et demie infectées par le virus GFP seront positives pour la GFP. Changez maintenant de milieu pour traiter les cellules avec un microgramme par millilitre.

Pur mycine pendant cinq à sept jours. Encore une fois, observez les cellules par microscopie à fluorescence pour déterminer si des cellules résistantes à la mycine pure ont formé des colonies. Notez que le transfert horizontal de gènes par des virus actifs produits par les fibroblastes mammaires humains parentaux résistants à la GFP et marqués à la mycine pure pourrait rendre les cellules murines et les cellules de carcinome sensibles à la mycine pure environnante.

Pur résistant à la mycine et GFP positif au sein de la xénogreffe tumorale. Cela peut entraver le processus d’isolement des fibroblastes mammaires humains purs résistants à la mycine marqués à la GFP injectés de la xénogreffe tumorale pour générer expérimentalement des fibroblastes associés au carcinome à injecter chez une souris immunodéficiente. Commencez par la trypsine et comptez la lignée cellulaire mammaire humaine qui vient d’être préparée avec la lignée cellulaire de carcinome du sein humain MCF, sept AR dans de nouveaux tubes à micro-déchets.

Reus suspendre une fois 10 aux six mc sept sept RA cellules de carcinome du sein humain et trois fois 10 aux six GFP marqués pur mycine résistant immortalisé. Fibroblastes mammaires humains dans 400 microlitres de milieu de culture avec 50 % de matrigel par injection. Placez les tubes sur de la glace comme contrôle.

Préparez également les mêmes fibroblastes mammaires humains sans les sept cellules MCF RA. Ensuite, à l’aide d’une aiguille de calibre 27, injectez le mélange cellulaire dans un site sous-cutané d’une souris nude immunodéficiente pour examiner la variation intratumorale des phénotypes de veaux. Isolez les veaux et contrôlez les fibroblastes de quelques xénogreffes tumorales différentes.

Ensuite, implantez chaque mélange dans les longueurs droite et gauche de chaque souris. Laissez la tumeur ou les fibroblastes se développer pendant 42 jours après l’injection. La période d’incubation des fibroblastes dans la xénogreffe tumorale doit être optimisée en fonction du phénotype des myofibroblastes acquis dans les fibroblastes parentaux de la tumeur.

Pour extraire les veaux ou contrôler les fibroblastes de la souris euthanasiée, placez au moins 0,5 gramme de tissu xénogreffé et au moins 0,1 gramme de tissu xénogreffe de fibroblastes dans des boîtes séparées. Ensuite, utilisez une lame de rasoir stérile pour hacher le tissu en petits fragments de tissu de moins de 1,5 millimètre cube. Ensuite, utilisez la lame de rasoir pour transférer les fragments de tissu dans un tube conique de 15 millilitres contenant le tampon de dissociation cellulaire et le vortex pendant une minute À vitesse maximale, incubez la suspension cellulaire pendant trois heures à 37 degrés Celsius avec une centrifugeuse à agitation lente continue à la suspension cellulaire.

Dissocié soit d’une tumeur, soit d’une greffe de sano en fibre de verre pendant cinq minutes à 250 fois la gravité après la rotation. Remettez en suspension la pastille cellulaire dans le PBS et répétez la centrifugation. Ensuite, réintroduisez la palette cellulaire résultante dans du DMEM complété par 10 % de FCS pour isoler la culture de fibroblastes mammaires humains parentaux résistants à la mycine pure.

Les cellules dérivées de la tumeur ou des fibroblastes se regroupent dans une boîte de Pétri de 15 centimètres en présence d’un microgramme par millilitre. La mycine Puram a 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Cela éliminera toutes les cellules de carcinome et / ou les souris contaminantes.

Les cellules stromales propagent les cellules jusqu’à ce qu’elles soient cofluentes, stockent les cellules à moins 80 degrés Celsius à l’aide d’un moyen de congélation. Notez que les cellules résultantes résistantes à la mycine pure désignées veau XP un ou les cellules de contrôle du fibroblaste un sont immortelles et positives pour la GFP Les fibroblastes à mémoire humaine augmentent leur phénotype myofibroblastique favorisant la tumeur au sein de la xénogreffe tumorale en interagissant avec les cellules du carcinome pendant la progression tumorale. Mélanger une fois 10 aux six cellules MCF sept cellules RA et trois fois 10 au veau P de 6 42 jours.

Une cellule dans 400 microlitres de milieu de culture avec une injection de puissance matrigel à 50 % dans un tube à orph de 1,5 millilitre. Préparez également trois fois 10 à 6 42 jours de contrôle des fibroblastes une cellule sans cellules de carcinome dans un tube einor pour stimuler davantage les phénotypes myofibroblastiques favorisant la tumeur de exp veau une cellules injecter un mélange de ces cellules avec des cellules CF sept RA par voie sous-cutanée dans une souris nue. Injectez également des fibroblastes de contrôle, une cellule seule, sans cellules cancéreuses, pour préparer les cellules de contrôle si nécessaire.

Incuber exp veau one cellules pendant des périodes supplémentaires de 200 jours au sein de la xénogreffe tumorale pour générer exp C deux cellules pour améliorer le phénotype myofibroblastique favorisant la tumeur. Générez également du contrôle. Fibroblastes deux cellules comme contrôle contre exp veau deux cellules en injectant des fibroblastes de contrôle une cellule sans cellules de carcinome dans une souris, enlever les tumeurs et les placer dans des boîtes de culture tissulaire.

Disséquez et dissociez la greffe de sérum de tumeur ou de fibroblaste en une suspension et une culture de cellule unique. Les cellules d’une boîte pétroélectrique de 15 centimètres avec 10 % F-C-S-D-M-E-M en présence de mycine pure propagent les cellules jusqu’à ce qu’elles soient complémentaires des yeux trypsine et stockent les cellules à moins 80 degrés Celsius à l’aide d’un moyen de congélation. Les cellules résistantes à la mycine pure résultantes sont nommées veau exp 242 jours deux cellules ou fibroblastes de contrôle deux cellules marquées par GFP exp veau deux et fibroblastes de contrôle deux cellules extraites de xénogreffes de tumeur du sein ont été analysées chimiquement immunohisto comme le montre cette image, les cellules se colorent fortement pour les marqueurs mésenchymateux, y compris la fermentation spécifique humaine prolo quatre hydroxylase collagène un A fibronectine S 100, Un quatre, et les fibroblastes protéine de surface.

Ces résultats indiquent une origine humaine et une nature mésenchymateuse de ces cellules. En revanche, la cytokératine, un marqueur des cellules épithéliales, n’a pas été colorée dans ces fibroblastes positifs à la GFP pris ensemble. Ces résultats suggèrent que les cellules EXP C deux et les fibroblastes témoins deux proviennent des fibroblastes mammaires humains parentaux initialement introduits dans les xénogreffes de souris.

Il est important de noter qu’il y a eu une augmentation considérable du nombre de cellules XP deux chez les veaux colorés pour l’alpha SMA et la glycoprotéine de la matrice extracellulaire pour la nasine C, qui sont toutes deux des marqueurs des myofibroblastes par rapport aux cellules témoins des fibroblastes deux. Notez qu’une proportion plus élevée de myofibroblastes alpha smma positifs est présente dans les cellules du veau deux exp par rapport à celle observée dans les cellules du veau 1 de 42 jours. Ces données démontrent que les fibroblastes à mémoire humaine résident s’impliquent progressivement dans les myofibroblastes de veau au sein des xénogreffes tumorales au cours de la progression tumorale après son développement.

Le modèle de xénogreffe tumorale de complémentation a ouvert la voie aux chercheurs travaillant sur le microenvironnement tumoral pour étudier les processus d’évolution du fibroblaste normal vers le cancer. C’est ce que disent les fibroblastes.