Las respuestas de imagen neuronal en los preparativos de la rebanada del órgano vomeronasal Expresando un sensor de calcio genéticamente codificados

El objetivo general de este procedimiento es ilustrar cómo preparar cortes de tejido vivo para obtener imágenes de las respuestas a las feromonas en las neuronas de los órganos nasales de MRO. Esto se logra preparando primero cortes vivos de MRO, órgano nasal o tejido VNO de ratones que expresan un indicador genético de calcio GCaMP dos. El siguiente paso es configurar el sistema de perfusión en la etapa del microscopio para mantener el corte, aplicar estímulos e imágenes.

La respuesta. A continuación, se realiza un experimento de imágenes de lapso de tiempo con varios estímulos de feromonas, seguido de un análisis de datos de los resultados de las imágenes. En última instancia, se obtienen los patrones de respuesta de las neuronas VNO a diferentes estímulos de feromonas.

La principal ventaja de esta técnica o de los métodos existentes, como la carga de calcio D o la obtención de imágenes en células disociadas, es que podemos preservar la morfología intacta de las células, mantener mejor la salud de los cortes y obtener una señal más fuerte. Este método puede ayudarnos a responder algunas de las preguntas clave en los estudios del sistema nasal caliente, como la identificación de los ligandos y sus receptores y el perfil de las respuestas individuales de las neuronas nasales del gusano. Este método también se puede aplicar a otros sistemas como la psoriasis olfativa, sérica o cerebral.

En general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades debido a la dificultad para obtener una buena psoriasis y establecer el sistema de profusión. Antes de comenzar este procedimiento, prepare las soluciones requeridas, incluido el ratón, la solución de timbre de líquido cefalorraquídeo artificial, aros de bajo punto de fusión al 4% y estímulos de feromonas de acuerdo con el manuscrito adjunto. A continuación, coloque dos tubos de aros de bajo punto de fusión en un bloque de calor.

Ajuste la temperatura a más de 60 grados centígrados para derretir los aros. Una vez que el gel se licúa, transfiera los tubos a un bloque de calor de 37 grados centígrados. Para preparar los segmentos de VNO.

Después de decapitar a un ratón GCaMP dos sacrificado, corte los huesos de la mandíbula con unas tijeras para extirpar la mandíbula inferior. A continuación, retire el tejido estriado del paladar superior para exponer la cavidad nasal. A continuación, separe los huesos maxilares insertando una cuchilla quirúrgica entre los dos incisivos frontales.

Retire con cuidado la mandíbula para exponer el VNO. En este punto, levante todo el VNO de la cavidad nasal sosteniendo el coxis. Transfiera el VNO al ratón oxigenado frío, una solución de líquido cefalorraquídeo.

Inmediatamente debajo del endoscopio de disección, separe los dos vno deslizando suavemente las puntas de las pinzas a lo largo de la pared del hueso septal. Pele el hueso vulnerador que recubre el tejido VNO. A continuación, levante suavemente todo el tejido VI NO de la cavidad ósea.

Se debe tener mucho cuidado en este paso para evitar dañar el epitelio neuro. A continuación, retire por completo los pequeños fragmentos de hueso que quedan en la superficie del tejido. Antes de incrustar los fragmentos, se dejan activados.

El tejido puede ser atrapado por la cuchilla de corte que sacaría el tejido del bloque de aros. Después de eso, use las pinzas para sujetar el extremo posterior del tejido VNO y sumérjalo suavemente en el aro derretido. Enfríe rápidamente el tubo con hielo.

Para solidificar los aros, el proceso de incrustación y enfriamiento debería tomar menos de dos minutos. A continuación, recorta el bloque aros que contiene el VNO y pégalo al soporte de pañuelos. A continuación, inserte el soporte de papel en el cilindro metálico y llene la cámara restante con aros adicionales de bajo punto de fusión.

Una vez que el aros de bajo punto de fusión se solidifique en hielo, se proceda al corte inmediatamente y se suministra un líquido cefalorraquídeo oxigenado en frío a la cámara de corte de la cortadora de tejidos, y se cortan las rodajas de 180 a 200 micras de espesor cada una. A continuación, recoja y transfiera las rodajas de la sección a la cámara de incubación. Las rodajas son viables durante seis a ocho horas en el líquido cefalorraquídeo A de ratón oxigenado a temperatura ambiente.

En este procedimiento, primero coloque un corte de VNO en el centro de la cámara de perfusión y sostenga el corte con un anclaje de corte. Los hilos del ancla solo deben presionar contra la parte de bajo punto de fusión de la rebanada, pero no contra el tejido VNO. A continuación, administre el líquido cefalorraquídeo A oxigenado del ratón a la cámara de perfusión a través del puerto de entrada a unos 100 microlitros por segundo.

El líquido se drena a través de una aguja de succión a través del puerto de salida para proporcionar un flujo continuo de CSF A de ratón fresco. A continuación, llene una jeringa de 30 mililitros con solución de timbre y sujétela a la bomba de jeringa. Ajuste la velocidad de la bomba a 300 a 600 microlitros por minuto.

Para proporcionar un flujo continuo de solución de timbre sobre el corte, conecte la salida de los timbres al circuito de inyección A-H-P-L-C. El control de bucle de inyección tiene dos rutas de flujo. En la posición de carga, cargue la muestra de orina de ratón en el circuito de muestra con una jeringa de precisión Hamilton.

El exceso de muestra sale del circuito de muestra a través de la salida de residuos. La solución de Ringer inyectada por la bomba de jeringa evita el circuito de muestra y va directamente a la salida, que está conectada a la punta de perfusión en la posición de inyección. La solución de la bomba fluye a través del circuito de muestra y empuja los estímulos de feromonas hacia la salida.

Antes del experimento de imagen. Retire las burbujas de aire para asegurar un flujo suave del fluido de perfusión. A continuación, ajuste la punta de perfusión debajo de una lente de cinco o 10 x para que la punta quede aproximadamente a un milímetro de distancia de la rebanada de vien O.

Para medir el tiempo de retardo de la muestra y la duración con una carga de tinte fluorescente 0.1% rho domine seis G de colorante en el bucle de muestra. A continuación, coloque la válvula en la posición de inyección. Cinco segundos después del inicio de la adquisición de la imagen, detecte la señal fluorescente entre 10 y 30 segundos.

La curva suave de la señal fluorescente también indica que se genera poca turbulencia debajo de la lente de inmersión y que la perfusión adecuada del LCR A de ratón oxigenado llega al corte en nuestro laboratorio. El microscopio Zeiss Axio FS dos con una lente de inmersión en agua de 10 x o 20 x se utiliza para la obtención de imágenes de lapso de tiempo para detectar señales GAMP dos. Se utiliza el filtro de paso de banda GFP estándar de 450 a 490 nanómetros.

Las imágenes epifluorescentes son adquiridas por una cámara CCD con un giro de uno en uno o de dos en dos, dependiendo de los niveles de expresión de GCaMP dos. En primer lugar, establezca la velocidad de adquisición en un fotograma por segundo. Ajuste la intensidad de la luz para minimizar el blanqueo de las señales GCaMP dos y el daño fotográfico a las células.

A continuación, cambie la válvula a la posición de inyección en un punto de tiempo específico para que se obtengan retrasos de tiempo consistentes en todos los ensayos dentro de un conjunto de experimentos. Ahora, realice una prueba utilizando la solución de Ringer como estímulo para reajustar la configuración de perfusión si se introduce un artefacto de movimiento durante la inyección de la muestra. Después de eso, realice una prueba de control positivo con la orina de ratón diluida de uno a 100 en solución para evitar la contaminación cruzada entre diferentes muestras.

Lave la jeringa Hamilton con solución de timbre al menos tres veces después de cargar un estímulo. Del mismo modo, lave el bucle de muestra con la solución de ringer al menos tres veces entre diferentes estímulos antes de aplicar. El siguiente estímulo espera de cuatro a 10 minutos para que las neuronas sensoriales nasales MRO se recuperen para realizar el registro de imágenes de todas las imágenes adquiridas de un corte.

Se utiliza un script de VBA escrito a medida en Avision para automatizar este proceso. En este caso, todos los fotogramas de imagen dentro del mismo experimento se registran en un fotograma de referencia común elegido con elastic para realizar la sustracción de imágenes e identificar las celdas que responden. Las macros escritas personalizadas en la imagen J versión 1.42 se utilizan para automatizar este proceso.

Se genera una imagen de proyección mínima para cada pila y las celdas que responden emergen después de restar la proyección mínima de las pilas sin procesar. A continuación, identifique la región de interés de las pilas sustraídas y obtenga las coordenadas de ROI utilizando el complemento de medición múltiple de la imagen J. Luego procese todas las pilas para un experimento y guarde todas las coordenadas de ROI en una lista maestra de ROI. Después de eso, use la lista maestra de ROI para medir las respuestas de las celdas de las pilas de imágenes sin procesar con un complemento de macro y medición múltiple escrito a medida de la imagen J. Luego trace las curvas de respuesta y el mapa de calor en matlab.

Aquí se muestra un ejemplo del experimento de imágenes VNO utilizando las muestras de orina recolectadas de cuatro ratones individuales. Alrededor de 80 células muestran respuesta a al menos uno de los estímulos urinarios y su respuesta delta F dividida por los valores F se representan en el mapa de calor. Aquí están los rastros de respuesta de las celdas uno, dos y tres, que muestran el curso del tiempo de activación por estímulos urinarios.

Mientras que la celda dos muestra los patrones opuestos de activación y responde a ambas muestras masculinas. Solo la célula tres es activada por muestras individuales de machos y hembras. Una vez en el mástil, el corte se puede preparar en 30 minutos y las neuronas del piano se pueden mantener vivas durante seis a ocho horas si se realiza correctamente.

Al intentar este método, es importante recordar que debe utilizar reactivos de grado de cultivo de tejidos y evitar que los reactivos de fijación de tejidos entren en contacto con las preparaciones de tejidos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar la psoriasis de tejido vivo para obtener imágenes de respuestas térmicas en neuronas de Viena utilizando la expresión de ratones G Camp.