Name: Peptid: MHC-Tetramer-basierte Anreicherung von Epitop-spezifischer T-Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 58 s
Description: Lernen Sie die Isolierung seltener epitop-spezifischer T-Zellen aus Mäusen mittels Peptid:MHC-Tetramern und magnetischen Mikroperlen. Diese Methode ermöglicht die Analyse natürlicher polyklonaler T-Zellpopulationen durch Flusszytometrie.

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Die Autoren bedanken sich bei Andre Han und Lawrence Yen für die technische Unterstützung, und die Mitglieder der Jenkins Labor für Hilfe bei der Entwicklung dieses Protokolls danken.

Ein. Zellisolation von Lymphgewebe <ol><li> 1 ml eiskaltem cEHAA (EHAA + 10% FBS, Pen / Strep, Gentamycin, 2 mM L-Glutamin, 55 mM 2-Mercaptoethanol) oder andere gleichwertige T-Zell-Medium auf eine 60 mm Kulturschale, die ein kleines Quadrat aus 100 mu m Nylon-Mesh und auf Eis stellen. </li><li> Einschläfern Maus. </li><li> Entfernen Sie die Milz und so viele leicht zugängliche Lymphknoten wie möglich. Diese sollten mindestens die Leistengegend, Achsel, brachial, Gebärmutterhals-und mesenterialen Lymphknoten. Legen Sie sie auf der Oberseite des Nylon-Mesh in der Kulturschale. </li><li> Mit der flachen Oberseite eines geschlossenen 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, das Lymphgewebe sanft Maische über die Nylon-Mesh-Lymphozyten zu befreien. Hinzufügen 1 ml cEHAA angesetzt und nach oben und unten, um Zellen in einer Suspension zu arbeiten. Übertragen der Zellen durch ein anderes Stück Nylon Netzgewebe über der Oberseite einer 15 ml Polypropylen-Zentrifugenröhrchen gegeben. Spülen Sie das Geschirr und Mesh mit einem anderen 1 ml eiskaltem cEHAA, poOling die Volumina in das gleiche Rohr. Wiederholen, um einen endgültigen Zellsuspension Volumen von 4 ml zu erreichen. </li><li> Hinzufügen kalten Sortierer (PBS + 2% FBS, 0,05% Azid) auf ein Endvolumen von 15 ml und zentrifugieren das Röhrchen 5 min bei 300 × g, 4 ° C </li><li> Sorgfältig Überstand absaugen und sicherstellen, keine Flüssigkeitströpfchen auf den Seiten des Rohres verbleiben. Zellpellet in Fc-Block (Sorter Puffer + 2.4G2 Antikörper) auf ein Endvolumen gleich ungefähr das Doppelte des Pellets selber. Zum Beispiel können die Milz und Lymphknoten eines naiven Maus erzeugt gewöhnlich eine Zellpellet von etwa 100 ul. In diesem Fall fügen Sie 100 ul Fc-Block, um die Lautstärke zu 200 ul zu bringen. Wenn ein hohes Maß an Zelle Verklumpung aufgetreten ist, entfernen Sie vorsichtig die Zellklumpen an dieser Stelle mit einer Pipettenspitze. </li></ol> 2. Tetramerfärbung <ol><li> Hinzufügen PE-oder APC-markierten Tetramer pMHC zu einer Endkonzentration von 10 nM (oder empirisch optimiert Konzentration). </li><li> Mix und Gründerzentrente für 1 Stunde bei Raumtemperatur (oder empirisch optimiert Zeit und Temperatur). </li><li> Hinzufügen kalten Sortierer Puffer auf ein Volumen von 15 ml und zentrifugieren das Röhrchen 5 min bei 300 × g, 4 ° C Die Proben auf Eis oder bei 4 ° C von nun an. </li><li> Sorgfältig Überstand absaugen und sicherstellen, keine Flüssigkeitströpfchen auf den Seiten des Rohres verbleiben. Zellpellet im Sortierer-Puffer auf ein Endvolumen von 200 ul. Für Doppel-Tetramer Bereicherung, resuspendieren auf ein Endvolumen von 150 ul. </li></ol> 3. Magnetische Anreicherung <ol><li> Fügen Sie 50 ul Miltenyi anti-PE-oder Anti-APC Mikrokügelchen. Für Doppel-Tetramer Bereicherung, werden 50 ul von beidem. </li><li> Mischen und inkubieren für 20 min bei 4 ° C. </li><li> Hinzufügen kalten Sortierer Puffer auf ein Volumen von 15 ml und zentrifugieren das Röhrchen 5 min bei 300 × g, 4 ° C </li><li> Während der Wartezeit, die Einrichtung eines Miltenyi LS magnetischen Säule auf einem MidiMACS oder QuadroMACS Magnet. Positionieren Sie eine offene 15 ml Polypropylen-Zentrifugenröhrchen auf einemRack direkt unterhalb der Säule. </li><li> 3 ml der Sortierer Puffer zu dem oberen Ende der Säule, so dass sie in den 15 ml-Röhrchen abzulassen. </li><li> Legen Sie eine 100 mu m Nylon-Mesh Quadrat auf der Säule. </li><li> Wenn die Zellen fertig sind Spinnen, sorgfältig absaugen Überstand und das Pellet in 3 ml Sortierer Puffer. </li><li> Übertragen der Zellsuspension durch die Nylonnetz auf den Kopf der Kolonne. </li><li> Wenn der Zellsuspension vollständig in der Säule abgelassen, spült das Originalbild mit einem anderen Rohr 3 ml Puffer Sortierer und übertragen die Puffer durch das Nylonnetz in die Kolonne, Spülen, die Maschen des Prozesses. Entsorgen Sie die Nylon Mesh. </li><li> Wenn der Puffer in die Säule vollständig entleert, einen weiteren 3 ml Sortierer Puffer auf die Säule. </li><li> Wiederholen Schritt 10 für insgesamt 3 x 3 ml Wäschen. </li><li> Entfernen Sie die Säule vom Magneten und sich über einen neuen 15 ml Polypropylen-Zentrifugenröhrchen. </li><li> 5 ml Sortierer Puffer ter Spalte. </li><li> Sofort übernehmen den Kolben in den Kopf der Kolonne und in einer kontinuierlichen Bewegung, drücken den Kolben ganz nach unten, wodurch der Puffer aus der Kolonne in die Röhre. </li><li> Die Röhrchen enthaltend das eluierte gebundenen Fraktion und die Durchströmung ungebundenen Fraktion für 5 min bei 300 × g, 4 ° C </li><li> Sorgfältig Aspiration des Überstands von der gebundenen Fraktion, wodurch sicher, dass keine Flüssigkeitströpfchen auf den Seiten des Rohres verbleiben. Zellpellet in Sortierer Puffer auf ein Endvolumen von genau 95 ul. Ansaugen und resuspendieren ungebundene Fraktion auf ein Endvolumen von 2 ml. </li></ol> 4. Durchflusszytometrie <ol><li> Für jede Fraktion, entfernen 5 ul und in 200 ul Zählen Wülste (eingestellt auf eine Konzentration von 200.000 / ml in Sortierer Puffer) in einem 5 ml FACS-Röhrchen. Beiseite bei 4 ° C für eine spätere Analyse. Um Zeit zu sparen, können Perlen beschrifteten Röhrchen werden vor dem Beginn des Experiments vor-aliquotiert. </li><li> Bereiten Uhraster Mischung von Antikörpern zu färben Oberflächenmarker auf den Zellen (Tabelle 1). Um Zeit zu sparen, kann diese vor dem Beginn des Experiments durchgeführt werden. </li><li> Für die gebundene Fraktion, einen Dosis von Antikörper-Cocktail direkt mit dem ~ 90 ul Zellen in der Röhre. Wenn eine Analyse der ungebundenen Fraktion gewünscht wird, können 90 ul Zellen zu einem 5 ml FACS-Röhrchen und fügen Sie eine Dosis von Antikörper-Cocktail. </li><li> Einsetzung eines Panels von einfarbigen Entschädigung Kontrollen für das Durchflusszytometer. Für jedes Fluorochrom verwendet werden, mischen 50 ul übriggebliebene ungebundenen Fraktion Zellen in einem 5 ml FACS-Röhrchen mit 1 ul des anti-CD4-Antikörper, konjugiert mit dem entsprechenden Fluorochrom ist. Denken Sie daran, Einrichten eines ungefärbten Kontrolle. </li><li> Wirbel und inkubieren alle Proben für 30 min bei 4 ° C. </li><li> 5 ml Sortierer Puffer zu jedem Röhrchen und Zentrifuge 5 min bei 300 × g, 4 ° C </li><li> Für die gebundene Fraktion, sorgfältig absaugen Überstand und Zellen in 200 ul Sortierer buffer. Übertragen der Zellen in einem 1,2 ml Microtube FACS. Spülen Sie das Rohr mit einem anderen 200 ul Sorter-Puffer und Pool in der gleichen Mikroröhrchen. Wenn Zellklumpen offensichtlich sind, passieren die Zellen durch ein 50 um-Filter. </li><li> Für die ungebundene Fraktion und Entschädigung Kontrollen, dekantieren oder absaugen Überstand und resuspendieren in 2 ml Sortierer Puffer. </li><li> Einrichten des Durchflusszytometer unter Verwendung der Single-Farbkompensation Kontrollen. Wählen Seitenstreuung-Breite (SSC-W) als ein zusätzlicher Parameter aufgezeichnet werden. </li><li> Analysieren der gefärbten Proben unter Verwendung einer Sequenz von aufeinanderfolgenden Aufnahme Gates an CD4 identifizieren + oder CD8 + T-Zellen wie in den 1 und 2 dargestellt. Bei gebundenen Fraktionen, sammeln Sie so viele Zellen wie möglich bis zu einem Maximum von 2.000.000 insgesamt Veranstaltungen. Für ungebundenen Fraktionen sammeln 1.000.000 insgesamt Veranstaltungen. Halten Sie die Akquisition bei oder unterhalb von 3.000 Ereignisse pro Sekunde. </li><li> Mit den gleichen Geräteeinstellungen, analysieren die Zählung bead Proben. Sammle 10.000 insgesamt Veranstaltungen. &lt;/ Li&gt; <li> Speichern Sie alle Daten, wie FCS-Dateien. </li></ol> 5. Data Analysis <ol><li> Analysieren FCS Datendateien für die Zählung bead Proben mit FlowJo Software. Plot Vorwärtsstreuung von FITC und setzen ein Tor aroung die Zählergebnisse Perlen (siehe Abbildungen 1 und 2). Ermitteln der Gesamtanzahl der Zählung Wülste in jeder Probe detektiert. Subtrahieren von der Gesamtanzahl der erfassten Ereignisse, die Anzahl der gesammelten Ereignisse Zelle zu bestimmen. </li><li> Berechne die Anzahl aller Zellen in jeder Probe unter Verwendung der Gleichungen, die in Kasten 1 dargelegt. </li><li> Analysieren FCS-Dateien für den gefärbten gebundenen und ungebundenen Fraktion Proben. Einrichten einer Abfolge von aufeinanderfolgenden Aufnahme Tore zu lymphoiden +, Side-Scatter-Breiten-lo, dump-, CD3 +, CD4 + oder CD8 +, Tetramer +-T-Zellen in jeder Probe wie in den 1 und 2 dargestellt. Identifizieren </li><li> Multiplizieren die Gesamtzahl der Zellen in der Probe durch die Frequenzen jedes der Aufnahme-Gatter verwendet werden, um CD4 + definieren Tetramer+ Oder CD8 +-Tetramer +-Zellen, um die Gesamtzahl von Epitop-spezifischen T-Zellen (Kasten 1) zu berechnen. </li></ol>

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die pMHC Tetramer basierte Anreicherung von Zellen-Methode von diesem Protokoll vorgestellt ist ein leistungsfähiges Werkzeug für das Studium Epitop-spezifischer T-Zellen aus körpereigenen T-Zellen Repertoires. Die Verwendung von Tetrameren pMHC ermöglicht Nachweis Epitop-spezifischer T-Zellen direkt auf die Fähigkeit ihrer TCRs auf artverwandten pMHC Liganden binden. Die Anreicherung stellt einen Grad der Empfindlichkeit derart, dass extrem selten Populationen von Antigen-spezifischen T-Zellen aus endogenen Repertoires...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Reagent</strong</td&gt;<td<strong&gt; Hersteller</strong</td&gt;<td<strong&gt; Katalog-Nummer</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PE oder APC konjugierten pMHC Tetramer (oder Multimer)</td&gt;<td&gt; By Ermittler Made, erhalten aus der NIH Tetramer Kern oder gekauft aus kommerziellen Quellen</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-PE konjugierte magnetische Mikrobeads</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-048-801</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-APC konjugierten magnetischen Mikrokügelchen</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-090-855</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; LS magnetischen Säulen</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-042-401</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MidiMACS oder QuadroMACS Magneten</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-042-302 oder 130-090-976</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Zellzählung Perlen</td&gt;<td&gt; Life Technologies</td&gt;<td&gt; PCB-100</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

peptid: mhc-tetramer-basierte anreicherung von epitop-spezifischer t-zellen

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

Eine Grundvoraussetzung für die Forscher studieren adaptiven Immunität in vivo experimentellen Modellen ist die Fähigkeit, T-Zellen auf ihren T-Zell-Antigenrezeptor (TCR)-Spezifität zu identifizieren. Viele indirekte Methoden zur Verfügung, in denen ein Schüttgut Population von T-Zellen in vitro mit einem Antigen und Epitop-spezifischer T-Zellen werden durch die Messung einer funktionalen Antwort wie Proliferation, Zytokinproduktion, oder Expression der Aktivierungsmarker 1 identifiziert wird angeregt. Jedoch sind diese Methoden nur identifizieren Epitop-spezifischen T-Zellen, die eine von vielen möglichen Funktionen, und sie sind nicht empfindlich genug, um Epitop-spezifischer T-Zellen bei naiven Vorstufe Frequenzen zu detektieren. Eine beliebte Alternative ist die TCR-transgene adoptiven Transfer Modell, in dem monoklonalen T-Zellen aus einem transgenen Maus TCR in histokompatiblen Hosts ausgesät, um eine große Population von Vorläufer-Epitop-spezifische T-Zellen, die easi sein könnenly mit der Verwendung eines kongenen Markerantikörper 2,3 nachverfolgt. Wenn leistungsfähig leidet dieses Verfahren aus experimentellen Artefakte mit der unphysiologischen Häufigkeit von T-Zellen mit einer Spezifität für ein einzelnes Epitop 4,5 zugeordnet. Darüber hinaus kann dieses System nicht verwendet, um die funktionelle Heterogenität der Epitop-spezifische T-Zell-Klone in einer polyklonalen Population untersuchen. Der ideale Weg zur adaptiven Immunität studieren sollte den direkten Nachweis Epitop-spezifischer T-Zellen aus dem endogenen T-Zell-Repertoire mit einer Methode, TCR Aspekt unterscheidet ausschließlich durch dessen Bindung an cognate Peptid: MHC (pMHC)-Komplexe. Die Verwendung von Tetrameren pMHC und Durchflusszytometrie erreicht dieses 6, jedoch wird auf die Erfassung von hochfrequenten Populationen von Epitop-spezifischer T-Zellen nur gefunden folgenden antigeninduzierte klonale Expansion begrenzt. In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode, die die Verwendung von pMHC Tetramere koordiniert und magnetic Zellanreicherung Technologie, um Erkennung von extrem niederfrequenten Epitop-spezifischer T-Zellen aus der Maus Lymphgewebe 3,7. Mit dieser Technik kann ein umfassender verfolgen gesamte epitopspezifischen Populationen von endogenen T-Zellen in Mäusen in allen Stadien der Immunantwort.

1 zeigt repräsentativ Durchflusszytometrie Parzellen pMHCII Tetramer angereicherten Milz und Lymphknoten-Proben von naiven Mäusen, während 2 zeigt repräsentative Daten für Mäuse zuvor mit dem jeweiligen Peptid + CFA immunisiert. Serielle Gating entfernt Autofluoreszenzlichtbild und andere unerwünschte Ereignisse aus der Analyse der CD4 + T-Zellpopulationen. Die CD8 + T-Zell-Population dient als nützliche interne negative Kontrolle für pMHCII Tetramerfärbung von CD4 + T-Zellen. Beachten ...

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Peptid: MHC-Tetrameren und magnetische Mikrobeads zur niederfrequenten Populationen von Epitop-spezifischen T-Zellen zu isolieren und zu analysieren durch Durchflusszytometrie. Dieses Verfahren ermöglicht die direkte Untersuchung von endogenen T-Zell-Populationen von Interesse<em&gt; In vivo</em&gt; Experimentellen Systemen.

Peptid: MHC-Tetramer-basierte Anreicherung von Epitop-spezifischer T-Zellen

Eine grundlegende Voraussetzung für Forscher, die die adaptive Immunität mit In-vivo-Experimentalsystemen untersuchen, ist die Fähigkeit, T-Zellen anhand ihrer T-Zell- ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, seltene, epitopspezifische T-Zellen aus dem endogenen T-Zell-Rezeptorrepertoire von Mäusen zu identifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst gewonnene lymphatische Zellen mit Peptid-MHC-Tetramer-Reagenzien gefärbt werden, die die entsprechenden epitopspezifischen T-Zellen fluoreszenzmarkieren. Diese mit Tetramern markierten Zellen werden anschließend mit magnetischen Mikroperlen beladen, die an Antikörper gekoppelt sind, die spezifisch für das fluoreszente Etikett auf dem Tetramer sind.Anschließend werden die magnetisch markierten Zellen durch eine magnetisierte Säule geleitet, um die Probe an tetramerbindenden, epitopspezifischen T-Zellen anzureichern. Schließlich werden die Zellen mit den gewünschten experimentellen Zellmarkern gefärbt, und eine mehrparametrige Durchflusszytometrie wird durchgeführt, um die seltenen, tetramerangereicherten, epitopspezifischen T-Zellpopulationen nachzuweisen und zu quantifizieren. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu anderen etablierten Methoden wie dem adoptiven Transfer von T-Zellen aus TCR-transgenen Tieren besteht darin, dass die Untersuchungen an echten, polyklonalen Populationen epitopspezifischer T-Zellen durchgeführt werden, die natürlich innerhalb des Immunsystems entstehen.Außerdem ermöglicht die hohe Nachweisempfindlichkeit dieser Technik Untersuchungen dieser Populationen, wenn sie in äußerst geringen Frequenzen vorhanden sind. Diese Methode kann helfen, viele zentrale Fragen im Bereich der Immunologie zu beantworten, beispielsweise wie viele naive T-Zellen ein bestimmtes Antigen eines pathogenen Mikroben erkennen können und wie sich die klonale Zusammensetzung einer epitopspezifischen T-Zellpopulation im Verlauf einer Immunantwort verändert. Bevor Sie mit der Dissektion beginnen, geben Sie ein Milliliter vollständiges EHAA-Medium in eine 60 Millimeter große Kulturschale, die ein kleines Quadrat aus 100 Mikrometer Nylonnetz enthält, und stellen Sie die Schale auf Eis.Entfernen Sie dann die Milz von einem euthanasierten Maus und so viele leicht zugängliche Lymphknoten wie möglich. Legen Sie das Gewebe auf den Nylonfilter in der Kulturschale. Benutzen Sie die flache Oberseite eines verschlossenen 1,5-Millimeter-Mikrozentrifugenröhrchens, um das lymphoide Gewebe vorsichtig auf dem Nylonfilter zu zermahlen.Um die Lymphozyten freizusetzen, geben Sie ein weiteres Milliliter Medium in die Petrischale und pipettieren Sie die Lösung mehrmals auf und ab, um die Zellen in Suspension zu bringen. Platzieren Sie nun ein neues Nylon-Netz auf einem frischen 15-Milliliter-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen und überführen Sie die Zellen durch das neue Netz. Spülen Sie die Schale und das Netz mit einem weiteren Milliliter kaltem Medium nach und ziehen Sie die Flüssigkeitsmengen durch das neue Netzstück in das 15-Milliliter-Röhrchen. Wiederholen Sie die Spülung noch einmal. Nachdem kalter Sortierpuffer auf ein Endvolumen von 15 Milliliter zugegeben wurde, zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten bei 300 ×g und vier Grad Celsius. Anschließend pipettieren Sie vorsichtig den Überstand auf.Suspendieren Sie das Zellpellet in FC-Block, sodass ein Endvolumen resultiert, das ungefähr dem Doppelten des Pelletvolumens entspricht. Falls eine starke Zellagglomeration aufgetreten ist, entfernen Sie den Zellklumpen vorsichtig mit einer Pipettenspitze, um Antigen-spezifische T-Zellen zu färben.Fügen Sie das fluoreszenzmarkierte Peptid-MHC-Tetramer in der optimierten Konzentration zum resuspendierten Zellpellet hinzu. Anschließend mischen Sie die Zellsuspension und inkubieren sie unter optimierten Bedingungen bezüglich Zeit und Temperatur, um die Tetramerbindung zu ermöglichen. Danach geben Sie kalten Sortierpuffer hinzu, um das Volumen auf 15 Milliliter aufzufüllen, und zentrifugieren, wobei die Zellen bei vier Grad Celsius gehalten werden.Ab sofort den Überstand vorsichtig abpipettieren. Dann das Zellpellet in Sortierpuffer bis zu einem Endvolumen von 200 Mikrolitern resuspendieren. Nun 50 Mikroliter Miltenyi-Antikörper-gekoppelter Mikroperlen hinzufügen, die spezifisch an das fluoreszierende Markierung des Tetramer-Gemischs binden, und anschließend die tetramerbindenden Zellen und Perlen bei vier Grad Celsius inkubieren.Nach 20 Minuten waschen Sie die Zellen im Sortierpuffer, während sich die Zellen in der Zentrifuge befinden. Setzen Sie eine Milani-LS-Magnetkolumne auf ein Quadro-Max-Magneten und positionieren Sie ein neues 15-Milliliter-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen direkt unterhalb der Kolumne. Geben Sie drei Milliliter Sortierpuffer auf die Oberseite der Kolumne, sodass dieser in das 15-Milliliter-Röhrchen abfließen kann.Danach eine quadratische Nylonmasche mit 100 Mikrometer auf die Säule legen. Sobald die Zellen fertig zentrifugiert sind, vorsichtig den Überstand abpipettieren und das Zellpellet in drei Milliliter Sortierpuffer resuspendieren; die Zellsuspension durch die Nylonmasche auf die Säule überführen. Wenn die Zellsuspension vollständig in die Säule abgelaufen ist, den ursprünglichen Probengefäß mit weiteren drei Milliliter Sortierpuffer ausspülen und ebenfalls durch die Masche auf die Säule übertragen.Das Waschvolumen im Sammelröhrchen sammeln und das Nylon-Netz verwerfen. Wenn das Puffer vollständig in das Röhrchen abgelaufen ist, die Säule zwei weitere Male mit jeweils drei Milliliter Sortierpuffer waschen. Anschließend die Säule vom Magneten nehmen und über ein neues 15-Milliliter-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen stellen.Geben Sie nun weitere fünf Milliliter Sortierpuffer auf die Säule. Setzen Sie sofort den Kolben in das obere Ende der Säule ein und drücken Sie in einer kontinuierlichen Bewegung den Kolben vollständig nach unten, wodurch der Puffer aus der Säule in das Röhrchen gedrückt wird. Nachdem sowohl das Röhrchen mit der eluierten gebundenen Fraktion als auch das Röhrchen mit der Durchlauf-Fraktion (ungebundene Fraktion) zentrifugiert wurden, pipettieren Sie vorsichtig das Überstand von der gebundenen Fraktion ab und resuspendieren Sie das Zellpellet in Sortierpuffer auf ein Endvolumen von genau 95 Mikrolitern. Resuspendieren Sie die ungebundene Fraktion ebenfalls durch Absaugen und erneutes Aufnehmen in Puffer auf ein Endvolumen von zwei Millilitern. Bevor die Zellfraktionen weiter gefärbt werden, geben Sie 200 Mikroliter Zählperlen in ein fünf Milliliter fassendes FACS-Röhrchen und übertragen fünf Mikroliter Zellen in dieses Röhrchen.Stellen Sie diese Röhrchen zur Analyse bei vier Grad Celsius beiseite. Bereiten Sie anschließend eine Master-Mischung aus Antikörpern zu, um Oberflächenmarker der Zellen gemäß der Tabelle zu färben. Für die gebundene Fraktion geben Sie eine Dosis Antikörpercocktail direkt zu den Zellen, für die ungebundene Fraktion hingegen separat hinzu.Übertragen Sie 90 Mikroliter der Zellen in ein fünf Milliliter fassendes FACS-Röhrchen und geben Sie für jeden zu verwendenden Fluorochrom eine Dosis Antikörper-Cocktail zur übertragenen Probe hinzu. Mischen Sie 50 Mikroliter der übrig gebliebenen, nicht gebundenen Zellfraktion in einem fünf Milliliter fassenden FACS-Röhrchen mit einem Mikroliter Anti-CD4-Antikörper, der mit dem geeigneten Fluorochrom konjugiert ist. Stellen Sie zusätzlich eine unbehandelte Kontrolle beiseite, vortexen Sie anschließend und inkubieren Sie alle Proben 30 Minuten bei vier Grad Celsius.Danach jede Probe in fünf Milliliter Sortierpuffer waschen, vorsichtig den Überstand von den gebundenen Fraktionsproben abpipettieren und die Zellen in 200 Mikroliter Sortierpuffer resuspendieren. Die Zellen in 1,2-Milliliter-Fax-Mikroröhrchen überführen und anschließend die vorherigen Röhrchen mit weiteren 200 Mikroliter Sortierpuffer spülen, wobei die Spüllösungen in den entsprechenden Mikroröhrchen gesammelt werden. Falls Klumpen sichtbar sind, die Zellen für die ungebundene Fraktion und die Kompensationskontrollen durch einen 50-Mikron-Filter geben, den Überstand dekantieren und die Pellets in einem Milliliter Sortierpuffer resuspendieren.Analysieren Sie die gefärbten Proben mithilfe einer Abfolge sukzessiver Inklusionstore zur Identifizierung von CD4-positiven oder CD8-positiven T-Zellen, wie hier für die gebundenen Fraktionsproben veranschaulicht. Sammeln Sie so viele Zellen wie möglich, maximal jedoch 2 Millionen Gesamtereignisse für die ungebundenen Fraktionsproben. Sammeln Sie 1 Million Gesamtereignisse.Schließlich sammeln Sie mit denselben Geräteeinstellungen 10.000 Ereignisse aus den Zählperlenproben. Diese erste Abbildung zeigt repräsentative Durchflusszytometrie-Diagramme von Peptid-MHC-Typ-2-Tetramer-angereicherten Milz- und Lymphknotenproben aus naiven Mäusen für gebundene und ungebundene Zellfraktionen. Eine Abfolge von Toren wurde festgelegt, um lymphoide Zellen mit positiver Streuung und niedriger Seitenstreuung auszuwählen, die negativ für das „Dump“-Marker und positiv für CD3 waren; von diesen wurden die CD4-positiven oder CD8-positiven Ereignisse weitergegated, um epitopspezifische T-Zellen oder Hintergrundfärbungen zu analysieren.Aliquote von unmarkierten Zellen aus den gebundenen und ungebundenen Fraktionen wurden mit fluoreszierenden Zählperlen gemischt und separat analysiert. Diese Dichtediagramme zeigen repräsentative Daten für Mäuse, die zuvor mit dem entsprechenden Peptid zusammen mit komplettem Adjuvans immunisiert worden waren. Derselbe serielle Gating-Ansatz wie im vorherigen Experiment wurde verwendet, um jegliche Autofluoreszenz und andere unerwünschte Ereignisse auszuschließen.Aus der Analyse der CD4-positiven T-Zellpopulationen erwies sich die CD8-positive T-Zellpopulation als nützliche interne negative Kontrolle für die Peptid-MHC-Klasse-II-Tetramer-Färbung von CD4-positiven T-Zellen. Die absoluten Zahlen epitopspezifischer T-Zellen in einer Probe werden berechnet, indem die Gesamtzahl aller Zellen im gebundenen Anteil der angereicherten Probe – ermittelt aus der Analyse der Bead-Zählung – mit dem Anteil dieser Zellen, die tetramerpositiv sind – ermittelt aus der Zellfärbungsanalyse – multipliziert wird. Für die repräsentativen Daten der naiven Maus, dargestellt in der ersten Serie der Dichtediagramme, betrug die Gesamtzellzahl 4.411 und die Bead-Zahl 5.589. Die Stammlösungskonzentration der Beads betrug 2 × 10⁵ pro Milliliter.Das Kugelvolumen betrug 0,2 Milliliter und das Zellvolumen 0,005 Milliliter. Daher wurden diese Daten verwendet, um die Zellkonzentration von 6,31 mal 10 hoch sechs pro Milliliter zu berechnen. Die Zellkonzentration wurde anschließend mit dem gesamten Probenvolumen multipliziert, um die Gesamtzahl der Zellen zu ermitteln.Diese Daten wurden anschließend mit dem Prozentsatz der Tetramer-positiven Ereignisse aus der Zellanalyse multipliziert, um festzustellen, dass die Anzahl der epitopspezifischen CD4-positiven T-Zellen aus dieser naiven Maus 98 betrug. Bei den repräsentativen Daten der immunisierten Maus in der zweiten Serie von Dichtediagrammen lag die Gesamtanzahl der epitopspezifischen CD4-positiven T-Zellen bei 1,53 × 10⁴. Die Effizienz der Anreicherung nimmt ab, wenn die Anzahl der epitopspezifischen T-Zellen steigt.Daher können tetramerpositive Zellen in der ungebundenen Fraktion von Proben mit sehr hohen Frequenzen epitopspezifischer T-Zellen auftreten. In solchen Fällen kann die Anzahl der epitopspezifischen T-Zellen in der ungebundenen Fraktion separat berechnet und zu der in der gebundenen Fraktion gefundenen Anzahl addiert werden. Beispielsweise betrug die Gesamtanzahl epitopspezifischer, CD4-positiver T-Zellen in der ungebundenen Zellfraktion einer repräsentativen immunisierten Maus 8,97 × 10³.Daher ergaben die Summierung der Zahlen in den gebundenen und ungebundenen Fraktionen insgesamt 2,43 mal 10 hoch vier epitopspezifische CD4-positive T-Zellen in der gesamten Probe des immunisierten Mäuschen. Tatsächlich kann der Anreicherungsschritt übersprungen werden, wenn die Expansion epitopspezifischer Zellen ausreichend stark ist. Nach dem Anreicherungsverfahren können Schritte zur Eigenfixierung und Permeabilisierung durchgeführt werden, um die Färbung intrazellulärer Proteine wie Zytokine und Transkriptionsfaktoren zu ermöglichen.Obwohl diese Methode ursprünglich für Untersuchungen von T-Zellen aus Milz und Lymphknoten entwickelt wurde, kann sie auch auf andere Gewebe wie Thymus und Darm angewendet werden. Die Technik kann zudem zur Untersuchung epitopspezifischer T-Zellen in menschlichen Blut- und Gewebeproben verwendet werden.

peptidemhc-tetramer-based-enrichment-of-epitope-specific-t-cells

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Verfahren zeigt die Reinigung und in vitro Expansion von Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen aus ganzen peripheren Blut und deren Visualisierung mit Hilfe der MHC-Klasse II Tetramere. Tetramere erlauben die direkte Visualisierung von T-Zellen mit einem einzigen Antigen-Spezifität und definierte MHC-Klasse II Einschränkung.

Visualizing Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen mit MHC Klasse II Tetramere

Dieses Video beschreibt ein Protokoll zur Isolierung von seltenen Antigen-spezifischen CD8+ T-Zellen unter Verwendung von magnetischen Nanopartikel-basierten künstlichen antigenpräsentierenden Zellen (aAPCs), die mit antigenen, peptidbeladenen MHC-Igs und Anti-CD28-Antikörpern funktionalisiert sind. Die Interaktion der aAPCs mit CD8+ T-Zellen, die spezifisch die antigenen Peptid-Targeting T-Zell-Rezeptoren exprimieren, gefolgt von deren Expansion in vitro, führt zur Anreicherung und Expansion...

Nanopartikelbasierte Anreicherung und Expansion von antigenspezifischen CD8+ T-Zellen

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Charakterisierung von CD8+-Gedächtnis-T-Zellen, die spezifisch für das Affenimmundefizienzvirus (SIV) sind, unter Verwendung von Peptid-Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse I (pMHC-I) Tetrameren. Ein pMHC-I-Tetramer ist ein Komplex aus vier MHC-I-Molekülen, die an SIV-spezifische Peptide gebunden und an ein Fluorophor konjugiert sind. Diese Tetramere binden selektiv an T-Zell-Rezeptoren (TCRs) auf SIV-spezifischen CD8+ T-Zellen, was die...

Eine Peptid-MHC-I-Tetramer-Färbetechnik zur Analyse von SIV-spezifischen CD8+-Gedächtnis-T-Zellen

Biochemischen Assays mit rekombinanten menschlichen MHC-II-Moleküle können schnelle, quantitative Einsichten in immunogenes Epitop Identifizierung, Deletion oder Design zu schaffen. Hier wird ein Peptid-MHC-II-Bindungsassay auf 384-Well-Platten skaliert wird beschrieben. Diese kostengünstige Format ist auf den Gebieten der Protein-und Impfstoff Deimmunisierung Design und Entwicklung beweisen.

Ein hoher Durchsatz MHC II-Bindungsassay für die quantitative Analyse von Peptid-Epitope

Dieses Manuskript beschreibt, wie (Einzelmoleküle) Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-basierte Assays durchgeführt werden, um die Bindungsdynamik zwischen T-Zell-Antigenrezeptoren (TCR) und antigenen, peptidbeladenen MHC-Molekülen zu messen, wie sie in der immunologischen Synapse einer T-Zelle in Kontakt mit einer funktionalisierten planar gestützten Lipiddoppelschicht auftreten.

Mess TCR-pMHC Binding<em&gt; In-situ-</em&gt; Mit einem FRET-Mikroskopie Assay

Hier präsentieren wir ein optimiertes Protokoll für das Aufzählen und Rhesusaffe CD8 + T - Zellen gegen das AIDS - Virus zu charakterisieren. Dieser Artikel ist nützlich , nicht nur auf dem Gebiet der HIV Immunologie, sondern auch auf anderen Bereichen der biomedizinischen Forschung , wo CD8 + T - Zell - Reaktionen bekannt sind , Krankheitsverlauf zu beeinflussen.

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Hier beschreiben wir eine Methode, die kombiniert in Situ MHC-Tetramer Färbung mit Immunohistochemistry, Lokalisierung, Phänotyp und Menge an Antigen-spezifische T-Zellen im Gewebe zu bestimmen. Dieses Protokoll wird verwendet, um die räumliche und phänotypischen Merkmale der Antigen-spezifische CD8 T-Zellen im Vergleich zu anderen Zelltyp und Strukturen im Gewebe zu bestimmen.

In Situ MHC-Tetramer Färbung und Quantitative Analyse zur Bestimmung der Lage, Fülle und Phänotyp der Antigen-spezifische CD8-T-Zellen in den Geweben

Antigen-spezifische T-Zellen sind schwer zu charakterisieren oder Therapien aufgrund ihrer extrem niedrigen Frequenzen zu nutzen. Hier bieten wir ein Protokoll, um eine magnetische Partikel zu entwickeln, die zur antigenspezifischen T-Zellen binden können, um diese Zellen zu bereichern und dann erweitern sie mehrere hundertfachen zur Charakterisierung und Therapie.

Bereichern Sie und erweitern Sie seltene antigenspezifischen T-Zellen mit magnetischen Nanopartikeln

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Ex Vivo qualitativen Nachweis von Antigen-spezifischen CD8+ T Zellen. Analyse ist möglich mit einzelnen Zellsuspensionen von Organen oder geringe Mengen von Blut. Ein breites Spektrum an Studiengängen erfordert die Analyse der zytotoxischen T-Zell-Antworten (Impfung und Krebs-Immuntherapie-Studien).

Gleichzeitige Quantifizierung von Anti-Vektor- und Anti-Transgen-spezifische CD8+ T Zellen über MHC Tetramer Färbung nach der Impfung mit viralen Vektoren

Hier stellen wir ein Protokoll zur Aufreinigung von MHC-Klasse-I- und Klasse-II-Peptidkomplexen aus Maus- und humanen Zelllinien vor, das qualitativ hochwertige Immunopeptidomik-Daten liefert. Das Protokoll konzentriert sich auf die Probenvorbereitung unter Verwendung kommerziell erhältlicher Antikörper.

Immunpeptidomik: Isolierung von Maus- und humanen MHC-Klasse-I- und II-assoziierten Peptiden für die Massenspektrometrie-Analyse

Wir bieten ein detailliertes Protokoll für die Isolierung und Identifizierung seltener antigenspezifischer T-Zellpopulationen in der Lunge von Mäusen durch magnetische T-Zell-Anreicherung und Peptid:Major Histocompatibility Complex (MHC)-Tetramere.

Identifizierung seltener antigenspezifischer T-Zellen aus der Lunge von Mäusen mit Peptid:Major-Histokompatibilitätskomplex-Tetrameren

Lernen Sie die Isolierung seltener epitop-spezifischer T-Zellen aus Mäusen mittels Peptid:MHC-Tetramern und magnetischen Mikroperlen. Diese Methode ermöglicht die Analyse natürlicher polyklonaler T-Zellpopulationen durch Flusszytometrie.

Peptid: MHC-Tetramer-basierte Anreicherung von Epitop-spezifischer T-Zellen

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