Name: Ex vivo dimagerie en temps réel de simples divisions cellulaires dans neuroépithélium de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Découvrez l'imagerie en temps réel ex vivo pour observer les divisions cellulaires simples dans le neuroépithélium de souris E8.5. Cette méthode combine la microscopie confocale et les marqueurs fluorescents pour étudier le développement neuroépithélial.

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Ce projet de recherche a été soutenue par un supplément ARRA, 5 R01 NS056380. Un soutien supplémentaire a été fourni par le vecteur viral de base et le noyau de microscopie de l&#39;Emory Neuroscience NINDS les principales installations de subvention, P30NS055077. Nous remercions la souris transgénique Emory et Gene Targeting base pour dériver la lignée de souris à partir de GENSAT; Greg Pazour pour la lignée cellulaire SSTR3-GFP IMCD3 stable et Bradley Yoder pour le SSTR3-GFP lentiviral construisons. Les anticorps monoclonaux ont été obtenus à partir des études du développement Hybridoma Bank, élaboré sous les auspices du NICHD, et entretenus par l&#39;Université de l&#39;Iowa, Département des sciences biologiques, Iowa City, IA 52242. Toutes les procédures d&#39;animaux ont été approuvés par le IACUC et le Comité de biosécurité de l&#39;Université Emory.

souris adultes sont euthanasiés par dislocation cervicale mécanique. Toutes les procédures d&#39;animaux ont été approuvés par le IACUC et le Comité de biosécurité de l&#39;Université Emory. 1. Embryon Generation <ol><li> Cross tamoxifène Cre inductible ligne, CAGGCreER, et la ligne de journaliste dsRedCre (Tg (CAG-Bgeo,-DsRed * MST) 1Nagy) (Figure 1) 5,6. Pour suivre la chronologie relative de la réponse Shh dans les cellules filles, croix CAGGCreER et DsRed ligne avec le Olig2-eGFP BAC souris transgéniques (Tg (Olig2-EGFP) EK23Gsat) (Figure 1) 7,8. </li><li> Dissoudre le tamoxifène dans l&#39;éthanol à 100%, et d&#39;effectuer une injection intrapéritonéale de 2,5 mg de tamoxifène par 40 g de poids corporel des femelles gravides à 6,5 embryonnaire (E6.5) pour induire l&#39;expression Cre et l&#39;étiquetage DsRed dans un petit sous-ensemble de cellules. </li><li> 48 heures plus tard disséquer embryons, d&#39;identifier les embryons positifs DsRed utilisant le microscope à fluorescence, les transférer à la boîte de culture et observateurse divisions cellulaires simples lors de l&#39;imagerie ex vivo (voir ci-dessous). </li></ol> 2. Whole embryon de souris Culture <ol><li> Disséquer E8.5 embryons en milieu de lavage préchauffé contenant DMEM/F12 (1:1) complété avec 10% de sérum de veau nouveau-né et 1% de pénicilline / streptomycine (P / S) 9. </li><li> Directement après dissection, place embryons sur ° étage de chauffage 37 ° C sous le microscope fluorescent et d&#39;identifier que la GFP et / ou DsRed positive (voir ci-dessous). </li><li> Transfert jusqu&#39;à 2 embryons dans une goutte 500 ul de milieux de culture pré-équilibrée contenant 50% sérum de rat d&#39;un mâle Sprague-Dawley et 50% DMEM/F12 (1:1) sans rouge de phénol additionné de L-glutamine et 1% des 1 M HEPES dans NaCl 0,85% et P / S 9. </li><li> Appliquer une couche mince (0,1 cm) d&#39;huile minérale légère équilibrée sur le moyen pour éviter l&#39;évaporation et le transfert de la boîte de culture contenant les embryons à la 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur. </li></ol> 3.Infection virale <ol><li> Afin de cils de l&#39;étiquette dans le neuroépithélium, ajouter 5-10 pi de SSTR3-GFP lentivirus, environ 2 millions de virions, à une baisse de 500 ul équilibrée de milieu de culture contenant un embryon E8.5. </li><li> Après 18 heures de culture, de transférer l&#39;embryon infecté dans quelques gouttes de milieu de lavage pour laver le virus et préparer tranche du tube neural. </li></ol> 4. Neural Tube Slice Préparation pour l&#39;imagerie en direct <ol><li> Disséquer tube neural de l&#39;embryon E8.5 en milieu de lavage préchauffé en utilisant une taille de micro-couteau 0.025 mm, sur un 1% d&#39;agar plat enduit. </li><li> Placez le neural face ventrale du tube isolé dans une goutte 150 ul de milieu de culture équilibrée sans rouge de phénol sur le mm enduit plat à fond de verre poly-L-lysine 35. </li><li> Mettez de petites quantités d&#39;un mélange 1:1 en 100% pur de la vaseline et la cire de bougie fondue (bougie d&#39;IKEA) autour du tube neural monté, et appuyez doucement par une étroite bande de lamelle de verre afin d&#39;immobiliser l&#39;échantillon. </li><li> Couvrir le plat avec une couche mince (~ 0,1 cm) d&#39;huile minérale légère équilibrée (Figure 2). </li></ol> 5. Vivre Imaging and Time-lapse microscopie confocale <ol><li> Placez le plat sous le Nikon A1R Laser Microscope inversé confocal équipé d&#39;une chambre environnementale qui régule la température, réglé à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Utilisez 60x objectif à immersion d&#39;huile d&#39;enregistrer GFP cils étiquetés et cellules positives DsRed, tandis que l&#39;utilisation de l&#39;objectif à immersion d&#39;huile 40x pour surveiller Olig2-GFP et des cellules positives DsRed. </li><li> Ouvrez le logiciel NIS Elements pour mettre en place les conditions d&#39;imagerie time lapse. Chaque 10 min acquérir z piles allant jusqu&#39;à 25 um avec un espacement de 1,5 um (40x) et jusqu&#39;à 8 pm avec un espacement de 0,4 um (60x objectif). Utilisez 488 et 561 nm les longueurs d&#39;onde d&#39;excitation et le canal transmis si nécessaire. Acquérir des images à 512 x 512 taille. Mettre en place plusieurs régions définies par l&#39;utilisateur de intEREST pour effectuer un enregistrement en même temps. Exposition optimale à la puissance du laser et de la luminosité de l&#39;image a été ajusté par l&#39;utilisation intensité du laser bas (jusqu&#39;à 11% pour mCherry 561; jusqu&#39;à 4,5% EGFP 405/488), vitesse de balayage 1, ligne moyenne 2 et la taille du trou d&#39;épingle (61 um pour dsRED; 28,1 um pour Olig2; 72 um pour SSTR3GFP; 61,3 um pour dsRED et SSTR3GFP; 58 um pour dsRED et Olig2). L&#39;utilisation de reporters fluorescentes codées génétiquement nous a permis de détecter la luminosité avec une puissance laser de faible. </li><li> Analyser les données enregistrées en utilisant un logiciel 3D Imaris de reconstruction. </li></ol> 6. Immunofluorescence <ol><li> Fixer des embryons ou des tubes neuraux isolés dans du paraformaldéhyde 4% / 0,1 M de tampon phosphate sur la glace (4 ° C) pendant 1 heure dans un plat en verre. </li><li> Lavez échantillons 2 h dans du PBS sur la glace (4 ° C) (variation PBS quelques fois) et de mettre en saccharose à 30% / 0,1 M de tampon phosphate au cours de la nuit ou jusqu&#39;à ce que les embryons évier. </li><li> Intégrer dans l&#39;OCT, gel sur la glace sèche et le ranger dans -80 ° C. Perform sectionner le cryostat (10 mm). </li><li> Laver les lames pendant 10 min dans une solution de lavage contenant 1% de sérum de mouton inactivés par la chaleur et de 0,1% de Triton X-100 dans du PBS. </li><li> Diluer anticorps primaires dans la solution de lavage à la suite de concentrations: Rat monoclonal anti-DP (5F8), 1:200; lapin anti-Arl13b 1:1500 sérum et anticorps monoclonal de souris anti-Arl13b 01h05 (295B/54); lapin anti-Olig2 1:300; anticorps monoclonaux de souris Pax6, chut et Nkx2.2-all 01h10 et de lapin polyclonaux Ki67 1:500. Ajouter environ 150 pi par diapo dans chambre humidifiée plat, couvrir avec du parafilm pour éviter le dessèchement et laisser sur la nuit à 4 ° C. </li><li> Laver les lames dans une solution de lavage à trois reprises, à 20 min à chaque fois à la température ambiante. </li><li> Diluer anticorps secondaire Alexa Fluor 488, 568, 350 dans les solutions de lavage à 1:200 concentration. Utilisez Hoechst 1:3,000 ou TO-PRO-3 1:500 pour colorer les noyaux. Ajouter 150 ul par diapositive, laisser 1 heure à température ambiante en chambre humide abri de la lumière. </li><li> Laver les lames dans la solution de lavage two fois, 30 min à chaque fois à la température ambiante. </li><li> Mont glisse dans 80% ProLong réactif et vue anti-fade or dans les 24 heures. </li></ol>

<ol><li>Yamada, T., Pfaff, S. L., Edlund, T., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+pattern+in+the+neural+tube%3A+motor+neuron+induction+by+diffusible+factors+from+notochord+and+floor+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of cell pattern in the neural tube: motor neuron induction by diffusible factors from notochord and floor plate.</a> Cell. 73, 673-686 (1993).</li>
<li>Ericson, J., Muhr, J., Placzek, M., Lints, T., Jessell, T. M., Edlund, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+induces+the+differentiation+of+ventral+forebrain+neurons%3A+A+common+signal+for+ventral+patterning+within+the+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog induces the differentiation of ventral forebrain neurons: A common signal for ventral patterning within the neural tube.</a> Cell. 81, 747-756 (1995).</li>
<li>Briscoe, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeodomain+Protein+Code+Specifies+Progenitor+Cell+Identity+and+Neuronal+Fate+in+the+Ventral+Neural+Tube%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Homeodomain Protein Code Specifies Progenitor Cell Identity and Neuronal Fate in the Ventral Neural Tube.</a> Cell. 101, 435-445 (2000).</li>
<li>Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+ciliary+localization+sequences+within+the+third+intracellular+loop+of+G+protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors.</a> Mol. Biol. Cell. 19 (4), 1540-1547 (2008).</li>
<li>Vintersten, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+red%3A+red+fluorescent+protein+expression+in+mouse+ES+cells%2C+embryos%2C+and+adult+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Mouse in red: red fluorescent protein expression in mouse ES cells, embryos, and adult animals.</a> Genesis. 40 (4), 241-246 (2004).</li>
<li>Hayashi, S., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+recombination+in+diverse+tissue+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre%3A+a+tool+for+temporally+regulated+gene+activation%2Finactivation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient recombination in diverse tissue by a tamoxifen-inducible form of Cre: a tool for temporally regulated gene activation/inactivation in the mouse.</a> Dev. Biol. 244 (2), 305-318 (2002).</li>
<li>Gong, S., Zheng, C., Doughty, M. L., Losos, K., Didkovsky, N., Schambra, U. B., Nowak, N. J., Joyner, A., Leblanc, G., Hatten, M. E., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).</li>
<li>Mukouyama, Y. S., Deneen, B., Lukaszewicz, A., Novitch, B. G., Wichterle, H., Jessell, T. M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olig2%2B+neuroepithelial+motoneuron+progenitors+are+not+multipotent+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Olig2+ neuroepithelial motoneuron progenitors are not multipotent stem cells in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1551-1556 (2006).</li>
<li>Jones, E. A. V., Crotty, D., Kulesa, P. M., Waters, C. W., Baron, M. H., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+in+vivo+imaging+of+postimplantation+mammalian+embryos+using+whole+embryo+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Dynamic in vivo imaging of postimplantation mammalian embryos using whole embryo culture.</a> Genesis. 34, 228-235 (2002).</li>
<li>Piotrowska-Nitsche, K., Caspary, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+individual+cell+divisions+in+mouse+neuroepithelium+shows+asymmetry+in+cilium+formation+and+Sonic+hedgehog+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">Live imaging of individual cell divisions in mouse neuroepithelium shows asymmetry in cilium formation and Sonic hedgehog response.</a> Cilia. 1 (6), In Press (2012).</li>
<li>Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mouse+development+with+confocal+time-lapse+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods in Enzymology. 476, 351-377 (2010).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Notre système ex vivo nous permet d&#39;observer directement divisions cellulaires uniques dans le neuroépithélium développement en temps réel. À titre d&#39;exemple, nous avons examiné les divisions cellulaires dans le tube neural embryonnaire de la souris et surveillés soit la formation cil ou réponse Shh. Nous avons confirmé nos résultats d&#39;imagerie (n = 24) ont été cohérents avec les résultats des sections fixes (n = 178) indiquant notre technique fournit des données physiologiquement ...

<table><tbody><tr><td>Ligne Z/RED (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J</td><td>Jackson Laboratory</td><td>005438</td><td></td></tr><tr><td>Ligne Olig2-eGFP (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd</td><td>MMRRC,</td><td>010555-UCD</td><td></td></tr><tr><td>CAGGCreER</td><td>Jackson Laboratory</td><td>003724</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxifène</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1)</td><td>GIBCO</td><td>21041-025</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau nouveau-né</td><td>Lonza</td><td>14-416F</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de rat SD mâle</td><td>Harlan Bioproducts</td><td>4520</td><td></td></tr><tr><td>Hepes 1 M</td><td>BioWhittaker</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>GIBCO</td><td>21041-025</td><td></td></tr><tr><td>Huile minérale légère</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>Lentivirus Sstr3-GFP</td><td>Emory Viral Core</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-lame, taille 0,025 mm</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62091</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de 35 mm à fond en verre revêtu de poly-L-lysine</td><td>MatTek</td><td>P35GC-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Confiture de pétrole à 100 %</td><td>Kroger</td><td>FL9958c</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal inversé à balayage laser A1R</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel NIS Elements</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel 3D Imaris</td><td>Bitplane AG</td><td>Imaris 7.2.3</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM1850</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de mouton inactivé par la chaleur</td><td>Invitrogen</td><td>16210-072</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Buffer phosphate</td><td>Fabriqué en laboratoire</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-RFP monoclonal de rat (5F8)</td><td>Chromotek</td><td>110411</td><td></td></tr><tr><td>Sérum anti-Arl13b de lapin</td><td>NeuroMab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Arl13b monoclonal de souris 1:5</td><td>NeuroMab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Olig2 de lapin</td><td>Chemicon</td><td>AB9610</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonaux de souris Pax6</td><td>Developmental Hybridoma Bank</td><td>Pax6</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonaux de souris Shh</td><td>Developmental Hybridoma Bank</td><td>5E1</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonaux de souris Nkx2.2</td><td>Developmental Hybridoma Bank</td><td>74.5A5</td><td></td></tr><tr><td>Ki67 polyclonal de lapin</td><td>Abcam</td><td>AB15580</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568</td><td>Molecular Probes</td><td>A11031</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 350</td><td>Molecular Probes</td><td>A11046</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst</td><td>Fisher</td><td>AC22989</td><td></td></tr><tr><td>TO-PRO-3</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>Réactif anti-fade ProLong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo d&#39;imagerie en temps réel de simples divisions cellulaires dans neuroépithélium de souris

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Nous avons développé un système qui intègre l&#39;imagerie en direct de marqueurs fluorescents et des tranches de culture du neuro-épithélium embryonnaire de la souris. Nous avons profité de lignées de souris existants pour la cellule génétique lignée de traçage: une ligne Cre inductible par le tamoxifène et une ligne de journaliste exprimant Cre DsRed lors de la recombinaison Cre-médiation. En utilisant un niveau relativement bas du tamoxifène, nous étions capables d&#39;induire la recombinaison dans un petit nombre de cellules, ce qui permet de suivre les divisions cellulaires individuels. En outre, nous avons observé la réponse transcriptionnelle à Sonic Hedgehog (Shh) de signalisation utilisant un Olig2-eGFP transgénique ligne 1-3 et nous avons suivi la formation des cils en infectant la tranche cultivé avec le virus exprimant le marqueur de cils, SSTR3-GFP 4. Afin d&#39;image à l&#39;neuroépithélium, nous avons récolté embryons à E8.5, isolé du tube neural, fixé la tranche de neurones dans des conditions de culture appropriées dans la chambre de formation d&#39;image et réalisée en accéléré imagerie confocale. Notre exvivo méthode imagerie en temps réel permet de tracer des divisions cellulaires simples pour évaluer la chronologie relative de la formation des cils primaires et la réponse Shh d&#39;une manière physiologiquement pertinents. Cette méthode peut être facilement adapté en utilisant des marqueurs fluorescents distinctes et fournit le terrain, les outils permettant de surveiller le comportement des cellules in situ et en temps réel.

Ici, nous avons effectué ex vivo l&#39;imagerie en direct de divisions cellulaires simples dans le neuroépithélium souris E8.5. Pour marquer les cellules individuelles, nous avons provoqué la recombinase Cre dans un sous-ensemble de cellules contenant une ligne de journaliste Cre celle exprimée DsRed lors de la recombinaison 5,6 (figure 3A). Ainsi, 48 heures plus tard, nous avons pu observer des divisions cellulaires simples pendant ex imagerie in vivo (figu...

Ici, nous développons les outils nécessaires pour<em&gt; Ex vivo</em&gt; Imagerie en temps réel à tracer des divisions cellulaires simples dans la souris E8.5 neuroépithélium

Ex vivo d&#39;imagerie en temps réel de simples divisions cellulaires dans neuroépithélium de souris

Nous avons développé un système intégrant l'imagerie en direct de marqueurs fluorescents et la mise en culture de coupes de neuroépithélium embryonnaire de souris. Nous avons tiré profit de...

L'objectif général de cette procédure est d'intégrer l'imagerie en direct de marqueurs fluorescents à des cultures de tranches d'épithélium neuro-embryonnaire de souris. Cela est réalisé en croisant d'abord la lignée de souris Cree inductible avec la lignée rapporteur Cree afin d'étiqueter génétiquement les cellules en division visible. Ensuite, les embryons entiers de souris sont disséqués et cultivés in vitro en présence de lentivirus.Ensuite, l'embryon est sectionné et une coupe du tube neural est préparée pour l'imagerie vitale. Enfin, la coupe du tube neural est observée par microscopie confocale en prise de vue séquentielle. En définitive, des résultats peuvent être obtenus, montrant l'observation directe de divisions cellulaires individuelles au sein de l'épithélium neurogène en développement, en temps réel, grâce à l'imagerie vitale ex vivo.Ainsi, la force de ce protocole réside dans la possibilité de surveiller individuellement les cellules in vivo, ce qui nous permet de poser des questions sur les événements de signalisation de chaque cellule ainsi que sur le comportement de chaque cellule. Pour commencer, croisez la lignée de souris exprimant la recombinase Cre induite p

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