Name: Ex vivo Live-Imaging von Single Cell Divisionen in Maus Neuroepithel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Lernen Sie ex vivo Live-Imaging einzelner Zellteilungen im Maus-Neuroepithel mit Zeitraffer-Konfokalmikroskopie. Diese Methode ermöglicht Echtzeitbeobachtung dynamischer Entwicklungsprozesse.

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Dieses Forschungsprojekt wurde von einem ARRA Supplement, 5 R01 NS056380 unterstützt. Zusätzliche Unterstützung wurde durch den viralen Vektor-Core und der Mikroskopie Kern der Emory Neuroscience NINDS Core Facilities Grant, P30NS055077 vorgesehen. Wir danken der Emory Transgene Maus und Gene Targeting-Core für die Ableitung der Maus Linie von GENSAT; Greg Pazour für die stabile SSTR3-GFP IMCD3 Zelllinie; und Bradley Yoder für den SSTR3-GFP lentiviralen Konstrukt. Monoklonale Antikörper wurden aus dem Developmental Studies Hybridoma Bank unter der Schirmherrschaft des NICHD entwickelt, erhalten und gepflegt von der University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242. Alle tierischen Verfahren wurden vom IACUC und der Kommission für Biosicherheit an der Emory University genehmigt.

Erwachsene Mäuse werden durch mechanische Genickbruch getötet. Alle tierischen Verfahren wurden vom IACUC und der Kommission für Biosicherheit an der Emory University genehmigt. 1. Embryo-Generation <ol><li> Kreuz Tamoxifen-induzierbare Cre Linie, CAGGCreER und dsRedCre Reporter Linie (Tg (CAG-Bgeo,-DsRed * MST) 1Nagy) (Abbildung 1) 5,6. Um die relative Timing der Shh Reaktion in den Tochterzellen, kreuz und CAGGCreER dsRed Einklang mit dem Olig2-eGFP BAC transgenen Mäusen (Tg (Olig2-EGFP) EK23Gsat) (Abbildung 1) 7,8 überwachen. </li><li> Auflösen Tamoxifen in 100% Ethanol, und führen intraperitoneale Injektion von 2,5 mg Tamoxifen pro 40 g Körpergewicht in schwangeren Frauen an embryonalen 6.5 (E6.5) bis Cre Expression und dsRed Kennzeichnung in einer kleinen Untergruppe von Zellen zu induzieren. </li><li> 48 Stunden später sezieren Embryonen zu identifizieren dsRed positive Embryonen mit Hilfe der Fluoreszenz-Mikroskop, übertragen Sie sie auf der Kulturschale und Beobachtere einzelne Zellteilungen in ex-vivo-Bildgebung (siehe unten). </li></ol> 2. Whole Embryo Culture Maus <ol><li> Präparieren E8.5 Embryonen in vorgewärmten Waschmedium mit DMEM/F12 (1:1) mit 10% Neugeborenen-Kälberserum und 1% Penicillin / Streptomycin (P / S) 9 ergänzt. </li><li> Direkt nach der Präparation erfolgt Embryonen auf 37 ° C Heizstufe unter dem Fluoreszenzmikroskop und zu identifizieren, wie GFP und / oder dsRed positive (siehe unten). </li><li> Übertragen Sie bis zu 2 Embryonen in einem 500 ul Tropfen voräquilibriert Nährböden mit 50% Serum Ratte aus einer Sprague-Dawley männlichen und 50% DMEM/F12 (1:1) ohne Phenolrot mit L-Glutamin ergänzt und 1% 1 M HEPES in 0,85% NaCl und P / S 9. </li><li> Tragen Sie eine dünne Schicht (0,1 cm) von äquilibriert leichtes Mineralöl mittelfristig um Verdunstung zu verhindern und übertragen die Kulturschale mit den Embryonen in die 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator. </li></ol> 3.Viral Infection <ol><li> Um Etikett Flimmerhärchen in den Neuroepithel, fügen 5-10 ul SSTR3-GFP lentivirus, rund 2 Millionen Virionen zu einer 500 ul äquilibriert Tropfen Kulturmedium, das eine E8.5 Embryo. </li><li> Nach 18 h der Kultur, übertragen infizierten Embryos in mehrere Tropfen waschen Medium zum Auswaschen des Virus und bereiten Neuralrohrdefekten Scheibe. </li></ol> 4. Neuralrohr Scheibe Vorbereitung für Live-Imaging <ol><li> Präparieren Neuralrohr des E8.5 Embryo in vorgewärmten Waschmedium mit einem Mikro-Messergröße 0,025 mm, auf einem 1% Agar beschichtete Schale. </li><li> Legen Sie die Neuralrohrdefekte isolierten ventralen Seite nach unten in einer 150 ul Tropfen äquilibriert Kulturmedium ohne Phenolrot auf die 35 mm Poly-L-Lysin beschichteten Glasboden Gericht. </li><li> Setzen geringe Mengen eines 1:1-Gemisches aus 100% reiner Vaseline und geschmolzen Kerzenwachs (Kerze aus IKEA) um den montierten Neuralrohr und vorsichtig auf ein schmales Stück Deckglas hergestellt, umImmobilisierung der Probe. </li><li> Decken Sie die Schüssel mit einer dünnen Schicht (~ 0,1 cm) von äquilibriert leichtem Mineralöl (Abbildung 2). </li></ol> 5. Live-Imaging und Zeitraffer-konfokale Mikroskopie <ol><li> Platz Gericht unter dem Nikon A1R Lasermikroskop Inverses Mikroskop mit einer Klimakammer, die Temperatur reguliert ausgestattet, auf 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Verwenden 60x Ölimmersionsobjektiv zu GFP-markierten Zilien und dsRed positiven Zellen aufzeichnen, während die 40x Ölimmersionsobjektiv Verwendung Olig2-GFP und dsRed positiven Zellen zu überwachen. </li><li> Öffnen Sie die NIS Elements Software zum Einrichten Zeitreihenaufnahmen Bedingungen. Alle 10 min erwerben z-Stapel von bis zu 25 um mit einem Abstand von 1,5 um (40x) und bis zu 8 um mit einem Abstand von 0,4 um (60x Objektiv). Mit 488 und 561 nm die Anregungswellenlängen und übermittelt Kanal, wenn nötig. Erwerben Sie Bilder mit 512 x 512 Größe. Richten Sie mehrere benutzerdefinierte Regionen intERest zu erfüllen gleichzeitig die Aufnahme. , Scan-Geschwindigkeit 1, Zeile 2 und durchschnittliche Größe der Lochblende (61; optimale Belichtung zu Laserleistung und Helligkeit des Bildes wurde durch Verwendung niedriger Laserintensität (bis zu 4,5% EGFP 405/488 bis zu 11% für mCherry 561) eingestellt um für dsRED; 28,1 um für Olig2; 72 um für SSTR3GFP; 61,3 um für dsRED und SSTR3GFP; 58 um für dsRED und Olig2). Die Verwendung von genetisch kodierten fluoreszierenden Reporter ermöglichte es uns, die Helligkeit mit geringen Laserleistung zu erkennen. </li><li> Analysieren aufgezeichneten Daten mit 3D-Rekonstruktion Imaris Software. </li></ol> 6. Immunfluoreszenz <ol><li> Fix Embryonen oder isolierten neuronalen Rohre in 4% Paraformaldehyd / 0,1 M Phosphat-Puffer auf Eis (4 ° C) für 1 Stunde in einer Glasschale. </li><li> Waschen Proben 2 h in PBS auf Eis (4 ° C) (Änderung PBS ein paar Mal) und in 30% Saccharose / 0,1 M Phosphat-Puffer über Nacht oder bis Embryonen Waschbecken. </li><li> Einbetten in OCT, Einfrieren auf Trockeneis und Speicher in -80 ° C. Perform Schneiden auf Kryostaten (10 mm). </li><li> Den Objektträger für 10 min in Waschlösung, enthaltend 1% Hitze-inaktiviertes Schafserum und 0,1% Triton X-100 in PBS. </li><li> Verdünnen Primärantikörper in Waschlösung bei folgenden Konzentrationen: Ratte monoklonalen anti-RFP (5F8,) 1:200; Rabbit anti-Arl13b Serum 1:1500 und monoklonalen Maus-anti-Arl13b 1:5 (295B/54); Rabbit anti-Olig2 1:300; Maus monoklonalen Pax6, Shh und Nkx2.2-all 1,10; und Kaninchen polyklonalen Ki67 1:500. In rund 150 ul pro Folie in flachen befeuchteten Kammer, mit Parafilm abdecken Austrocknen zu vermeiden und lassen Sie über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Waschen Sie gleitet in Waschlösung dreimal jeweils 20 min bei Raumtemperatur. </li><li> Verdünnen Sekundärantikörper Alexa Fluor 488, 568, 350 in Waschlösungen bei 1:200 Konzentration. Verwenden Hoechst 1:3.000 oder TO-PRO-3 1:500 bis Kerne färben. In 150 ul pro Folie, lassen Sie 1 Stunde bei Raumtemperatur in feuchten Kammer vor Licht geschützt. </li><li> Waschen Sie gleitet in Waschlösung two mal jeweils 30 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Berg rutscht in 80% ProLong Gold-anti-fade Reagenz und Ansicht innerhalb von 24 Stunden. </li></ol>

<ol><li>Yamada, T., Pfaff, S. L., Edlund, T., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+pattern+in+the+neural+tube%3A+motor+neuron+induction+by+diffusible+factors+from+notochord+and+floor+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of cell pattern in the neural tube: motor neuron induction by diffusible factors from notochord and floor plate.</a> Cell. 73, 673-686 (1993).</li>
<li>Ericson, J., Muhr, J., Placzek, M., Lints, T., Jessell, T. M., Edlund, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+induces+the+differentiation+of+ventral+forebrain+neurons%3A+A+common+signal+for+ventral+patterning+within+the+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog induces the differentiation of ventral forebrain neurons: A common signal for ventral patterning within the neural tube.</a> Cell. 81, 747-756 (1995).</li>
<li>Briscoe, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeodomain+Protein+Code+Specifies+Progenitor+Cell+Identity+and+Neuronal+Fate+in+the+Ventral+Neural+Tube%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Homeodomain Protein Code Specifies Progenitor Cell Identity and Neuronal Fate in the Ventral Neural Tube.</a> Cell. 101, 435-445 (2000).</li>
<li>Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+ciliary+localization+sequences+within+the+third+intracellular+loop+of+G+protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors.</a> Mol. Biol. Cell. 19 (4), 1540-1547 (2008).</li>
<li>Vintersten, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+red%3A+red+fluorescent+protein+expression+in+mouse+ES+cells%2C+embryos%2C+and+adult+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Mouse in red: red fluorescent protein expression in mouse ES cells, embryos, and adult animals.</a> Genesis. 40 (4), 241-246 (2004).</li>
<li>Hayashi, S., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+recombination+in+diverse+tissue+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre%3A+a+tool+for+temporally+regulated+gene+activation%2Finactivation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient recombination in diverse tissue by a tamoxifen-inducible form of Cre: a tool for temporally regulated gene activation/inactivation in the mouse.</a> Dev. Biol. 244 (2), 305-318 (2002).</li>
<li>Gong, S., Zheng, C., Doughty, M. L., Losos, K., Didkovsky, N., Schambra, U. B., Nowak, N. J., Joyner, A., Leblanc, G., Hatten, M. E., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).</li>
<li>Mukouyama, Y. S., Deneen, B., Lukaszewicz, A., Novitch, B. G., Wichterle, H., Jessell, T. M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olig2%2B+neuroepithelial+motoneuron+progenitors+are+not+multipotent+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Olig2+ neuroepithelial motoneuron progenitors are not multipotent stem cells in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1551-1556 (2006).</li>
<li>Jones, E. A. V., Crotty, D., Kulesa, P. M., Waters, C. W., Baron, M. H., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+in+vivo+imaging+of+postimplantation+mammalian+embryos+using+whole+embryo+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Dynamic in vivo imaging of postimplantation mammalian embryos using whole embryo culture.</a> Genesis. 34, 228-235 (2002).</li>
<li>Piotrowska-Nitsche, K., Caspary, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+individual+cell+divisions+in+mouse+neuroepithelium+shows+asymmetry+in+cilium+formation+and+Sonic+hedgehog+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">Live imaging of individual cell divisions in mouse neuroepithelium shows asymmetry in cilium formation and Sonic hedgehog response.</a> Cilia. 1 (6), In Press (2012).</li>
<li>Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mouse+development+with+confocal+time-lapse+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods in Enzymology. 476, 351-377 (2010).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Unsere Ex-vivo-System ermöglicht es uns, direkt beobachten einzelne Zelle Spaltungen innerhalb der Entwicklung Neuroepithel in Echtzeit. Als Beispiel haben wir untersucht Zellteilungen im embryonalen Neuralrohrdefekten und überwacht entweder Cilium Bildung oder Shh Antwort. Wir bestätigten unsere Imaging-Ergebnisse (n = 24) waren konsistent mit den Ergebnissen aus festen Abschnitten (n = 178), die unsere Technik bietet physiologisch relevanten Daten. Unsere Technik...

<table><tbody><tr><td>Z/RED-Linie (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J</td><td>Jackson Laboratory</td><td>005438</td><td></td></tr><tr><td>Olig2-eGFP-Linie (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd</td><td>MMRRC,</td><td>010555-UCD</td><td></td></tr><tr><td>CAGGCreER</td><td>Jackson Laboratory</td><td>003724</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxifen</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1)</td><td>GIBCO</td><td>21041-025</td><td></td></tr><tr><td>Neugeborenes Kälberserum</td><td>Lonza</td><td>14-416F</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Ratten-Serum SD männlich</td><td>Harlan Bioproducts</td><td>4520</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>BioWhittaker</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>GIBCO</td><td>21041-025</td><td></td></tr><tr><td>Leichtes Mineralöl</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>Sstr3-GFP-Lentivirus</td><td>Emory Viral Core</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikromesser, Größe 0,025 mm</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62091</td><td></td></tr><tr><td>35-mm-Poly-L-Lysin-beschichtete Glasbodenschale</td><td>MatTek</td><td>P35GC-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>100 % Vaseline</td><td>Kroger</td><td>FL9958c</td><td></td></tr><tr><td>Invertiertes konfokales Laser-Scanning-Mikroskop A1R</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements-Software</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris 3D-Software</td><td>Bitplane AG</td><td>Imaris 7.2.3</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Kryostat</td><td>Leica</td><td>CM1850</td><td></td></tr><tr><td>Hitzedinaktiviertes Schafsersum</td><td>Invitrogen</td><td>16210-072</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>Parafolmaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatpuffer</td><td>Im Labor hergestellt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ratten-monoklonaler Anti-RFP (5F8)</td><td>Chromotek</td><td>110411</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen-Anti-Arl13b-Serum</td><td>NeuroMab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maus-monoklonaler Anti-Arl13b 1:5</td><td>NeuroMab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen-Anti-Olig2</td><td>Chemicon</td><td>AB9610</td><td></td></tr><tr><td>Maus-monoklonale Pax6</td><td>Developmental Hybridoma Bank</td><td>Pax6</td><td></td></tr><tr><td>Maus-monoklonale Shh</td><td>Developmental Hybridoma Bank</td><td>5E1</td><td></td></tr><tr><td>Maus-monoklonale Nkx2.2</td><td>Developmental Hybridoma Bank</td><td>74.5A5</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen-polyklonaler Ki67</td><td>Abcam</td><td>AB15580</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568</td><td>Molecular Probes</td><td>A11031</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 350</td><td>Molecular Probes</td><td>A11046</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst</td><td>Fisher</td><td>AC22989</td><td></td></tr><tr><td>TO-PRO-3</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Anti-Fade-Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo live-imaging von single cell divisionen in maus neuroepithel

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Wir entwickelten ein System, das Echtzeit-Bildgebung von fluoreszierenden Markern und Kultivierung von embryonalen Maus Scheiben Neuroepithel integriert. Wir nutzten vorhandene Mauslinien für genetische Zelllinie Tracing: eine Tamoxifen-induzierbare Cre Linie und einer Linie, die Cre-Reporter auf Cre-vermittelte Rekombination dsRed. Durch die Verwendung einer relativ niedrigen Tamoxifen, waren wir in der Lage, um eine Rekombination in einer kleinen Anzahl von Zellen zu induzieren, was uns erlaubt, einzelne Zellteilungen folgen. Darüber hinaus beobachtet man die transkriptionelle Reaktion auf Sonic Hedgehog (Shh) Signal mit einer Olig2-eGFP transgenen Linie 1-3 und man überwacht Bildung von Zilien mittels Infektion des kultivierten Scheibe mit Virus, das die Wimpern Marker SSTR3 4-GFP. Um das Bild Neuroepithel wir geerntet Embryonen bei E8.5, isoliert das Neuralrohr, montiert die neurale Scheibe in der richtigen Kulturbedingungen in die Kammer und Bildgebung durchgeführt Zeitraffer-konfokale Bildgebung. Unsere exLive vivo-Bildgebungsverfahren ermöglicht es uns, einzelne Zellteilungen zu verfolgen, um die relative Timing Hauptwimpern Bildung und Shh Antwort in einem physiologisch relevanten Weise zu beurteilen. Dieses Verfahren kann leicht angepasst werden, mit unterschiedlichen fluoreszierenden Markern und bietet das Feld die Werkzeuge, mit denen das Verhalten der Zelle in situ und in Echtzeit zu überwachen.

Hier führten wir ex vivo Echtzeit-Bildgebung von einzelnen Zellteilungen im E8.5 Maus Neuroepithel. Um einzelne Zellen markieren, induziert wir Cre-Rekombinase in einer Untergruppe von Zellen, die ein Cre-Reporter Linie, die bei der Rekombination 5,6 (3A) dsRed ausgedrückt. So, 48 Stunden später waren wir in der Lage, einzelne Zellteilungen während ex-vivo-Bildgebung (4A-D) zu beobachten. Begleitend überwacht wir, wenn die markierten Zellen wurde Shh-respons...

Hier entwickeln wir die notwendigen Werkzeuge für<em&gt; Ex vivo</em&gt; Live-Aufnahmen zu verfolgen einzelne Zellteilungen in der Maus E8.5 Neuroepithel

Ex vivo Live-Imaging von Single Cell Divisionen in Maus Neuroepithel

Wir haben ein System entwickelt, das die Live-Imaging-Analyse fluoreszierender Marker mit der Kultivierung von Schnitten des embryonalen Neuroepithels von Mäusen integriert. Wir nutzten ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Live-Bildgebung fluoreszierender Marker mit Schnittkulturen aus dem neuroektodermalen Gewebe von Maus-Embryonen zu kombinieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die induzierbare Cre-maus-Linie mit der Cre-Berichterlinie gekreuzt wird, um genetisch sichtbar teilende Zellen zu markieren. Anschließend werden die gesamten Mausembryonen präpariert und in vitro in Gegenwart von Lentivirus kultiviert.Anschließend wird das Embryo geschnitten und der Neuralrohrenabschnitt für die Live-Bildgebung vorbereitet. Schließlich wird der Neuralrohrenschnitt mittels zeitraffender konfokaler Mikroskopie abgebildet. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die direkte Beobachtung einzelner Zellteilungen im sich entwickelnden Neuroepithel in Echtzeit durch ex vivo Live-Bildgebung zeigen.Die Stärke dieses Protokolls liegt also darin, dass wir einzelne Zellen in vivo verfolgen können, was es uns ermöglicht, Fragen zu den Signalereignissen und zum Verhalten jeder einzelnen Zelle zu stellen. Zunächst kreuzen Sie die Tamoxifen-induzierbare Cre-maus-Linie CAGG CRE ER mit der DS-Red-Cre-Berichterlinie. Um die relative zeitliche Abfolge der

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Imaging embryonalem Gewebe in Echtzeit wird über längere Zeit eine Herausforderung. Hier präsentieren wir Ihnen einen Test zur Überwachung der zellulären und subzellulären Veränderungen im Rückenmark Küken für längere Zeit mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung. Diese Technik kann für andere Regionen des Nervensystems und sich entwickelnden Embryo angepasst werden.

Hochauflösende Live-Bildgebung von Zell-Verhalten in der Entwicklung von Neuroepithel

Quelle: Daynac, M., et. al. Zellsortierung von neuralen Stamm- und Vorläuferzellen aus der subventrikulären Zone adulter Mäuse und Live-Bildgebung ihrer Zellzyklusdynamik. J. Vis. Exp. (2015)Dieses Video zeigt die Zeitraffer-Bildgebung von neuralen Stammzellen (NSCs) aus einem transgenen Mausgehirn unter Verwendung eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops. NSCs fluoreszieren während der G1-Phase rot und sind in anderen Zellzyklusphasen nicht fluoreszierend. Eine adhärente NSC-Kultur wird in...

Zeitraffer-Bildgebung der neuralen Stammzellteilung von Mäusen mittels konfokaler Mikroskopie

Quelle: Ing-Esteves, S. &amp; Lefebvre, J. L. Zeitraffer-Bildgebung der neuronalen Arborisierung unter Verwendung der spärlichen Adeno-assoziierten Virusmarkierung von genetisch ausgerichteten retinalen Zellpopulationen. J. Vis. Exp. (2021)Dieses Video demonstriert den Einsatz der konfokalen Mikroskopie zur Visualisierung der dendritischen Dynamik in lebenden Netzhautexplantaten von Mäusen. Es beschreibt die Schritte zur Stabilisierung der Netzhaut unter einem konfokalen Mikroskop, zur...

Konfokale Zeitraffer-Bildgebung der neuronalen dendritischen Dynamik in retinalen Explantaten der Maus

Neuroblast Migration ist ein grundlegendes Ereignis in der postnatalen Neurogenese. Wir beschreiben ein Protokoll für die effiziente Markierung von Neuroblasten durch in vivo Elektroporation postnatalen und anschließende Visualisierung der Migration mit Zeitraffer-Bildgebung der akuten Hirnschnitten. Wir sind eine Beschreibung für die quantitative Analyse von Neuroblast Dynamik von Video-Tracking.

In-vivo-Elektroporation und Postnatale Zeitraffer-Imaging Neuroblast von Migration in Maus Akute Hirnschnitten

Dieses Protokoll beschreibt, wie Bild teilenden Zellen innerhalb eines Gewebes in Caenorhabditis elegans Embryonen. Während mehrere Protokolle beschreiben, wie Bild der Zellteilung im frühen Embryo, beschreibt dieses Protokoll, wie man Bild der Zellteilung in einem Entwicklungs Gewebe während der Embryogenese Mitte spät.

Visualisierung Neuroblast Cytokinesis Während<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryogenese

Neurale Vorläufer Mitose ist ein kritischer Parameter der Neurogenese. Viel von unserem Verständnis der neuralen Vorläufer Mitose basiert auf der Analyse von festen Gewebe basiert. Live-Bildgebung in der embryonalen Hirnschnitten ist eine vielseitige Technik zur Mitose mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung in einer kontrollierten Umgebung zu beurteilen.

Live-Imaging der Mitose in der Entwicklung von embryonalen Maus-Cortex

Dieses Protokoll Details eine optimierte Methode verwendet, um Live-Cell-Imaging im Rahmen eines intakten Larven Gehirn durchzuführen. Live-Cell-Imaging Ansätze sind von unschätzbarem Wert für die Erforschung der neuronalen Stamm asymmetrische Zellteilungen sowie andere neurogene und Entwicklungsprozesse konsequent aufzudecken Mechanismen, die bisher übersehen wurden.

Live-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven Neuroblasten

Hier bieten wir eine kostengünstige und zuverlässige Methode um elektroporiert Gehirn organotypischen Slice Kulturen von mäuseembryonen geeignet für konfokale Mikroskopie und Leben-bildgebende Verfahren zu generieren.

Ex Utero Elektroporation und organotypischen Slice Kulturen der embryonalen Mäusegehirnen für Live-Aufnahmen von Migration Gabaergen Interneuronen

Ein ex vivo Slice-Assay ermöglicht es, das okulomotorische Nervenwachstum in Echtzeit abzubilden. Die Scheiben werden durch Einbetten von E10.5 Isl MN:GFP-Embryonen in Agarose erzeugt, auf einem Vibram geschnitten und in einem Bühnen-Top-Inkubator wachsen. Die Rolle der Axon-Beratungswege wird durch Dieminadien zu den Kulturmedien bewertet.

Ex Vivo Okulomotor Slice Culture von embryonalen GFP-ausdrückenden Mäusen für Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

Die Ex-vivo-Live-Bildgebung ist eine leistungsfähige Technik zur Untersuchung der dynamischen Prozesse zellulärer Bewegungen und Interaktionen in lebendem Gewebe. Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Zwei-Photonen-Mikroskopie implementiert, um dentale Epithelzellen in kultivierten ganzen erwachsenen Mausschneidezähnen live zu verfolgen.

Verwendung von Ex-vivo-Live-Bildgebung zur Untersuchung von Zellteilungen und -bewegungen während der Zahnerneuerung von Mäusen

Während der Entwicklung der Großhirnrinde stammen Neuronen und Gliazellen aus der ventrikulären Zone, die den Ventrikel auskleidet, und wandern zur Gehirnoberfläche. Viele Gene sind an diesem Prozess beteiligt. Dieses Protokoll stellt die Technik für die Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen und glialen Vorläuferzellen vor.

Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen und glialen Vorläuferzellen in embryonalen Hirnschnitten von Mäusen

Lernen Sie ex vivo Live-Imaging einzelner Zellteilungen im Maus-Neuroepithel mit Zeitraffer-Konfokalmikroskopie. Diese Methode ermöglicht Echtzeitbeobachtung dynamischer Entwicklungsprozesse.

Ex vivo Live-Imaging von Single Cell Divisionen in Maus Neuroepithel

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