Name: Ex vivo Imaging in diretta di divisioni cellulari singoli in mouse neuroepitelio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Impara l'imaging ex vivo in tempo reale di divisioni cellulari singole nel neuroepitelio embrionale di topo. Questo metodo combina marcatori fluorescenti con microscopia confocale time-lapse per studiare la neurobiologia dello sviluppo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Questo progetto di ricerca è stata sostenuta da un supplemento ARRA, 5 R01 NS056380. Ulteriore supporto è stato fornito tramite il vettore virale Core e Core Microscopia della Emory Neuroscienze NINDS Nucleo Facilities Grant, P30NS055077. Ringraziamo il mouse Emory transgenico e Gene Targeting Nucleo per derivare la linea di mouse da GENSAT; Greg Pazour per il SSTR3-GFP linea cellulare IMCD3 stabile e Bradley Yoder per il SSTR3-GFP lentivirali costruiamo. Gli anticorpi monoclonali sono stati ottenuti da studi di sviluppo Hybridoma Banca, sviluppato sotto l&#39;egida del NICHD, e mantenuto dalla University of Iowa, Dipartimento di Scienze Biologiche, Iowa City, IA 52242. Tutte le procedure di animali sono stati approvati dal IACUC e del Comitato Biosicurezza alla Emory University.

Topi adulti sono sacrificati per dislocazione cervicale meccanico. Tutte le procedure di animali sono stati approvati dal IACUC e del Comitato Biosicurezza alla Emory University. 1. Generazione Embryo <ol><li> Croce tamoxifene-inducibile Cre linea, CAGGCreER, e la linea giornalista dsRedCre (Tg (CAG-Bgeo,-DsRed * MST) 1Nagy) (Figura 1) 5,6. Per monitorare la relativa tempistica di risposta Shh nelle cellule figlie, croce CAGGCreER e DsRed linea con il Olig2-eGFP BAC topi transgenici (Tg (Olig2-EGFP) EK23Gsat) (Figura 1) 7,8. </li><li> Sciogliere tamoxifene in 100% di etanolo, ed eseguire l&#39;iniezione intraperitoneale di 2,5 mg di tamoxifene per 40 g di peso corporeo nelle femmine gravide a 6,5 ​​embrionale (E6.5) per indurre l&#39;espressione Cre ed etichettatura DsRed in un piccolo sottogruppo di cellule. </li><li> 48 ore più tardi sezionare embrioni, identificare gli embrioni positivi DsRed utilizzando il microscopio a fluorescenza, trasferirli al piatto cultura e osservatoriposta divisioni cellulari singoli durante ex vivo imaging (vedi sotto). </li></ol> 2. Tutta mouse Embrione Cultura <ol><li> Sezionare embrioni E8.5 nel medio lavaggio preriscaldata contenente DMEM/F12 (1:1) supplementato con 10% di siero di vitello neonato e 1% di penicillina / streptomicina (P / S) 9. </li><li> Direttamente dopo la dissezione, posto embrioni sulla ° C fase di riscaldamento 37 al microscopio a fluorescenza e di identificare come GFP e / o DsRed positivo (vedi sotto). </li><li> Trasferire fino a 2 embrioni in 500 microlitri goccia di terreni di coltura pre-equilibrata contenente 50% siero di ratto da un maschio Sprague-Dawley e il 50% DMEM/F12 (1:1) senza rosso fenolo integrato con L-glutammina e 1% di 1 M HEPES in NaCl 0,85% e P / S 9. </li><li> Applicare uno strato sottile (0.1 cm) di olio minerale leggero equilibrata nel medio per evitare l&#39;evaporazione e trasferire il piatto di coltura contenente gli embrioni ai 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. </li></ol> 3.Infezione virale <ol><li> Al fine di etichetta cilia nel neuroepitelio, aggiungere 5-10 ml di SSTR3-GFP lentivirus, circa 2 milioni di virioni, ad un 500 microlitri goccia equilibrata di terreno di coltura contenente un embrione E8.5. </li><li> Dopo 18 ore di coltura, il trasferimento di embrioni infetti in diverse gocce di mezzo di lavaggio per lavare il virus e preparare fetta del tubo neurale. </li></ol> 4. Del tubo neurale Slice Preparazione per Live Imaging <ol><li> Sezionare tubo neurale del E8.5 embrione in media lavaggio pre-riscaldato utilizzando un formato micro-coltello 0,025 millimetri, su un piatto rivestito di agar 1%. </li><li> Posizionare il tubo laterale isolato neurale ventrale giù in una goccia 150 ml di terreno di coltura equilibrato senza rosso fenolo sulla mm rivestito di vetro piatto fondo di poli-L-lisina 35. </li><li> Mettere una piccola quantità di una miscela 1:1 realizzato da gelatina pura al 100% di petrolio e cera fusa (candela da IKEA) attorno al tubo neurale montato, e premere delicatamente da una stretta lingua di coprioggetto di vetro, al fine diimmobilizzare il campione. </li><li> Coprire il piatto con un sottile strato (~ 0,1 centimetri) di olio minerale leggero equilibrata (Figura 2). </li></ol> 5. Vivere Imaging e Time-lapse Microscopia confocale <ol><li> Luogo piatto sotto la Nikon A1R confocale microscopio invertito dotato di una camera climatica che regola la temperatura, impostata a 37 ° C, e il 5% di CO 2. </li><li> Utilizzare 60x obiettivo ad immersione in olio a registrare GFP ciglia etichettati e cellule positive DsRed, mentre l&#39;uso obiettivo ad immersione in olio 40x per monitorare Olig2-GFP e cellule positive DsRed. </li><li> Aprire il software NIS Elements per creare le condizioni di imaging lasso di tempo. Ogni 10 min acquisire z-stack fino a 25 micron con una spaziatura di 1,5 micron (obiettivo 40x) e fino a 8 micron con una spaziatura di 0,4 micron (60x obiettivo). Usare 488 e 561 nm, la lunghezza d&#39;onda di eccitazione e di canali trasmessi, se necessario. Acquisire immagini in formato 512 x 512. Impostare più regioni definite dall&#39;utente di interest per eseguire la registrazione simultanea. Ottima esposizione al potere del laser e la luminosità dell&#39;immagine è stata regolata mediante l&#39;uso del laser a bassa intensità (fino al 11% per mCherry 561 e fino al 4,5% EGFP 405/488), velocità di scansione 1, media linea 2 e la dimensione del foro del perno (61 micron per DsRed; 28,1 micron per Olig2; 72 micron per SSTR3GFP; 61,3 micron per DsRed e SSTR3GFP; 58 micron per DsRed e Olig2). L&#39;uso di giornalisti fluorescenti geneticamente codificati ci ha permesso di rilevare la luminosità con basso potere del laser. </li><li> Analizzare i dati registrati utilizzando Imaris software di ricostruzione 3D. </li></ol> 6. Immunofluorescenza <ol><li> Fissare gli embrioni o tubi neurali isolate in paraformaldeide al 4% / 0,1 M tampone fosfato sul ghiaccio (4 ° C) per 1 ora in un piatto di vetro. </li><li> Lavare i campioni 2 ore in PBS su ghiaccio (4 ° C) (cambiamento PBS un paio di volte) e mettere nel 30% di saccarosio / 0,1 M tampone fosfato durante la notte o fino a quando gli embrioni lavandino. </li><li> Incorpora in ottobre, congelare in ghiaccio secco e conservare in -80 ° C. Peffettuare la giusta sezionamento sul criostato (10 mm). </li><li> Lavare i vetrini per 10 min in soluzione di lavaggio contenente siero ovino inattivato al calore 1% e 0,1% Triton X-100 in PBS. </li><li> Diluire gli anticorpi primari in soluzione di lavaggio a seguito di concentrazioni: Rat monoclonale anti-RFP (5F8,) 1:200; coniglio anti-ARL13B siero 1:1500 e topo monoclonale anti-ARL13B 01:05 (295B/54); coniglio anti-Olig2 1:300; monoclonali mouse Pax6, Shh e Nkx2.2-all 1:10; ed policlonale di coniglio Ki67 1:500. Aggiungere circa 150 ml per diapositiva nel piatto camera umidificata, coprire con parafilm per evitare la disidratazione e lasciare tutta la notte a 4 ° C. </li><li> Lavare i vetrini nella soluzione di lavaggio per tre volte, ogni volta 20 min a temperatura ambiente. </li><li> Diluire gli anticorpi secondari Alexa Fluor 488, 568, 350 nelle soluzioni di lavaggio a 1:200 concentrazione. Utilizzare Hoechst 1:3000 o TO-PRO-3 1:500 a macchia nuclei. Aggiungere 150 microlitri per vetrino, lasciare 1 ora a temperatura ambiente in camera umidificata al riparo dalla luce. </li><li> Lavare i vetrini nella soluzione di lavaggio two volte, ogni volta 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Monte scivola nel 80% Prolungare Oro reagente anti-sbiadimento e la vista entro 24 ore. </li></ol>

<ol><li>Yamada, T., Pfaff, S. L., Edlund, T., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+pattern+in+the+neural+tube%3A+motor+neuron+induction+by+diffusible+factors+from+notochord+and+floor+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of cell pattern in the neural tube: motor neuron induction by diffusible factors from notochord and floor plate.</a> Cell. 73, 673-686 (1993).</li>
<li>Ericson, J., Muhr, J., Placzek, M., Lints, T., Jessell, T. M., Edlund, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+induces+the+differentiation+of+ventral+forebrain+neurons%3A+A+common+signal+for+ventral+patterning+within+the+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog induces the differentiation of ventral forebrain neurons: A common signal for ventral patterning within the neural tube.</a> Cell. 81, 747-756 (1995).</li>
<li>Briscoe, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeodomain+Protein+Code+Specifies+Progenitor+Cell+Identity+and+Neuronal+Fate+in+the+Ventral+Neural+Tube%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Homeodomain Protein Code Specifies Progenitor Cell Identity and Neuronal Fate in the Ventral Neural Tube.</a> Cell. 101, 435-445 (2000).</li>
<li>Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+ciliary+localization+sequences+within+the+third+intracellular+loop+of+G+protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors.</a> Mol. Biol. Cell. 19 (4), 1540-1547 (2008).</li>
<li>Vintersten, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+red%3A+red+fluorescent+protein+expression+in+mouse+ES+cells%2C+embryos%2C+and+adult+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Mouse in red: red fluorescent protein expression in mouse ES cells, embryos, and adult animals.</a> Genesis. 40 (4), 241-246 (2004).</li>
<li>Hayashi, S., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+recombination+in+diverse+tissue+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre%3A+a+tool+for+temporally+regulated+gene+activation%2Finactivation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient recombination in diverse tissue by a tamoxifen-inducible form of Cre: a tool for temporally regulated gene activation/inactivation in the mouse.</a> Dev. Biol. 244 (2), 305-318 (2002).</li>
<li>Gong, S., Zheng, C., Doughty, M. L., Losos, K., Didkovsky, N., Schambra, U. B., Nowak, N. J., Joyner, A., Leblanc, G., Hatten, M. E., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).</li>
<li>Mukouyama, Y. S., Deneen, B., Lukaszewicz, A., Novitch, B. G., Wichterle, H., Jessell, T. M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olig2%2B+neuroepithelial+motoneuron+progenitors+are+not+multipotent+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Olig2+ neuroepithelial motoneuron progenitors are not multipotent stem cells in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1551-1556 (2006).</li>
<li>Jones, E. A. V., Crotty, D., Kulesa, P. M., Waters, C. W., Baron, M. H., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+in+vivo+imaging+of+postimplantation+mammalian+embryos+using+whole+embryo+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Dynamic in vivo imaging of postimplantation mammalian embryos using whole embryo culture.</a> Genesis. 34, 228-235 (2002).</li>
<li>Piotrowska-Nitsche, K., Caspary, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+individual+cell+divisions+in+mouse+neuroepithelium+shows+asymmetry+in+cilium+formation+and+Sonic+hedgehog+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">Live imaging of individual cell divisions in mouse neuroepithelium shows asymmetry in cilium formation and Sonic hedgehog response.</a> Cilia. 1 (6), In Press (2012).</li>
<li>Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mouse+development+with+confocal+time-lapse+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods in Enzymology. 476, 351-377 (2010).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il nostro sistema ex vivo permette di osservare direttamente divisioni cellulari singoli all&#39;interno del neuroepitelio in tempo reale via di sviluppo. Come esempio abbiamo esaminato divisioni cellulari entro il mouse embrionale tubo neurale e vigilato o formazione ciglio o risposta Shh. Abbiamo confermato i nostri risultati di imaging (n = 24) erano coerenti con i risultati di sezioni fisse (n = 178) che indicano la nostra tecnica fornisce dati fisiologicamente rilevanti. <p class="jov...

<table><tbody><tr><td>Linea Z/RED (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J</td><td>Jackson Laboratory</td><td>005438</td><td></td></tr><tr><td>Linea Olig2-eGFP (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd</td><td>MMRRC,</td><td>010555-UCD</td><td></td></tr><tr><td>CAGGCreER</td><td>Jackson Laboratory</td><td>003724</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxifene</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1)</td><td>GIBCO</td><td>21041-025</td><td></td></tr><tr><td>Siero di vitello neonato</td><td>Lonza</td><td>14-416F</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Siero di ratto SD maschio</td><td>Harlan Bioproducts</td><td>4520</td><td></td></tr><tr><td>Hepes 1 M</td><td>BioWhittaker</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>GIBCO</td><td>21041-025</td><td></td></tr><tr><td>Olio minerale leggero</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>Lentivirus Sstr3-GFP</td><td>Emory Viral Core</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-lama, dimensione 0,025 mm</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62091</td><td></td></tr><tr><td>Piatto in vetro con fondo rivestito in poli-L-lisina da 35 mm</td><td>MatTek</td><td>P35GC-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>100% Vaselina</td><td>Kroger</td><td>FL9958c</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale invertito a scansione laser A1R</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software NIS Elements</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software 3D Imaris</td><td>Bitplane AG</td><td>Imaris 7.2.3</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Criostato</td><td>Leica</td><td>CM1850</td><td></td></tr><tr><td>Siero di pecora inattivato per riscaldamento</td><td>Invitrogen</td><td>16210-072</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Tampone fosfato</td><td>Prodotto in laboratorio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale di ratto anti-RFP (5F8)</td><td>Chromotek</td><td>110411</td><td></td></tr><tr><td>Siero anti-Arl13b da coniglio</td><td>NeuroMab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anticorpo monoclonale di topo anti-Arl13b 1:5</td><td>NeuroMab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Olig2 da coniglio</td><td>Chemicon</td><td>AB9610</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpi monoclonali di topo Pax6</td><td>Developmental Hybridoma Bank</td><td>Pax6</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpi monoclonali di topo Shh</td><td>Developmental Hybridoma Bank</td><td>5E1</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpi monoclonali di topo Nkx2.2</td><td>Developmental Hybridoma Bank</td><td>74.5A5</td><td></td></tr><tr><td>Ki67 policlonale da coniglio</td><td>Abcam</td><td>AB15580</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568</td><td>Molecular Probes</td><td>A11031</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 350</td><td>Molecular Probes</td><td>A11046</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst</td><td>Fisher</td><td>AC22989</td><td></td></tr><tr><td>TO-PRO-3</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>Reagente anti-sbiadimento ProLong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo imaging in diretta di divisioni cellulari singoli in mouse neuroepitelio

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Abbiamo sviluppato un sistema che integra l&#39;imaging dal vivo di marcatori fluorescenti e fette di coltura embrionale neuroepithelium mouse. Abbiamo approfittato di linee del mouse esistenti per la cellula genetica lineage tracing: una linea di Cre tamoxifene-inducibile e una linea giornalista Cre esprimendo DsRed su ricombinazione Cre-mediata. Utilizzando un livello relativamente basso di tamoxifene, siamo stati in grado di indurre ricombinazione in un piccolo numero di cellule, permettendo di seguire divisioni cellulari individuali. Inoltre, abbiamo osservato la risposta trascrizionale di Sonic hedgehog (Shh) di segnalazione utilizzando un Olig2-eGFP transgenico linea 1-3 e abbiamo monitorato formazione di ciglia infettando la fetta colta con virus che esprime il marcatore di ciglia, SSTR3-GFP 4. Per l&#39;immagine del neuroepitelio, abbiamo raccolto gli embrioni a E8.5, isolato il tubo neurale, montata la fetta neurale in appropriate condizioni di coltura nella camera di imaging e di eseguita time-lapse imaging confocale. Il nostro exmetodo di imaging in vivo in diretta consente di tracciare divisioni cellulari singoli di valutare la relativa tempistica di formazione ciglia primarie e risposta Shh in modo fisiologicamente rilevanti. Questo metodo può essere facilmente adattato utilizzando marcatori fluorescenti distinti e fornisce il campo gli strumenti con cui monitorare il comportamento delle cellule in situ ed in tempo reale.

Qui abbiamo effettuato ex vivo imaging dal vivo di divisioni cellulari singoli all&#39;interno del E8.5 del mouse neuroepitelio. Per etichettare singole celle, abbiamo indotto ricombinasi Cre in un sottogruppo di cellule contenenti una linea giornalista Cre che esprimevano DsRed upon ricombinazione 5,6 (Figura 3A). Così, 48 ore dopo siamo stati in grado di osservare le divisioni cellulari singoli durante ex vivo imaging (Figure 4A-D). Allo stesso tempo, abbi...

Qui sviluppiamo gli strumenti necessari per<em&gt; Ex vivo</em&gt; L&#39;imaging dal vivo di tracciare divisioni cellulari singoli nel topo E8.5 neuroepitelio

Ex vivo Imaging in diretta di divisioni cellulari singoli in mouse neuroepitelio

Abbiamo sviluppato un sistema che integra l'imaging in vivo di marker fluorescenti e la coltura di sezioni di neuroepitelio embrionale di topo. Abbiamo sfruttato...

L'obiettivo generale di questa procedura è integrare l'immagineggiamento in tempo reale di marcatori fluorescenti con colture di fette di epitelio neuro embrionale di topo. Questo risultato si ottiene innanzitutto incrociando la linea di topo induttibile Cree con la linea reporter Cree, al fine di etichettare geneticamente le cellule in divisione visibilmente. Successivamente, gli embrioni interi di topo vengono dissecati e coltivati in vitro in presenza di lentivirus.Successivamente, l'embrione viene sezionato e la sezione del tubo neurale viene preparata per l'analisi in tempo reale. Infine, la sezione del tubo neurale viene analizzata mediante microscopia confocale a intervalli di tempo. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano l'osservazione diretta delle divisioni cellulari singole all'interno dell'epitelio neurogenico in via di sviluppo, in tempo reale, attraverso l'analisi vitale ex vivo.Pertanto, il punto di forza di questo protocollo è che possiamo monitorare singole cellule in vivo, il che ci permette di indagare gli eventi di segnalazione di ciascuna cellula, così come il comportamento di ogni singola cellula. Per iniziare, incrociare la linea di topi t

ex-vivo-live-imaging-of-single-cell-divisions-in-mouse-neuroepithelium

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Imaging del tessuto embrionale in real-time è una sfida per lunghi periodi di tempo. Qui vi presentiamo un test per monitorare i cambiamenti cellulari e sub-cellulare del midollo spinale pulcino per lunghi periodi con elevata risoluzione spaziale e temporale. Questa tecnica può essere adattato ad altre regioni del sistema nervoso e sviluppo embrionale.

Imaging ad alta risoluzione dal vivo del comportamento delle cellule in via di sviluppo neuroepitelio

Fonte: Daynac, M., et. al. Smistamento cellulare di cellule staminali neurali e progenitrici dalla zona subventricolare del topo adulto e imaging dal vivo delle loro dinamiche del ciclo cellulare. J. Vis. Exp. (2015)Questo video dimostra l'imaging time-lapse di cellule staminali neurali (NSC) da un cervello di topo transgenico utilizzando un microscopio a scansione laser confocale. Le NSC emettono fluorescenza rossa durante la fase G1 e non sono fluorescenti in altre fasi del ciclo cellulare.

Imaging time-lapse della divisione delle cellule staminali neurali di topo mediante microscopia confocale

Fonte: Ing-Esteves, S. &amp; Lefebvre, J. L. Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Powder Cell Populations. J. Vis. Exp. (2021)Questo video dimostra l'uso della microscopia confocale per visualizzare le dinamiche dendritiche negli espianti retinici di topi vivi. Delinea i passaggi per stabilizzare la retina sotto un microscopio confocale, eseguire l'imaging in epifluorescenza per visualizzare gli interneuroni amacrini...

Imaging confocale time-lapse della dinamica dendritica neuronale negli espianti di retina di topo

Migrazione neuroblasti è un evento fondamentale nella neurogenesi postnatale. Descriviamo un protocollo per l'etichettatura efficiente dei neuroblasti di elettroporazione in vivo postnatale e la successiva visualizzazione della loro migrazione utilizzando time-lapse imaging di fette di cervello acuto. Includiamo una descrizione per l'analisi quantitativa delle dinamiche neuroblasti di monitoraggio video.

In vivo postnatale elettroporazione e Time-lapse imaging di migrazione neuroblasti in mouse acuta Fette cervello

Questo protocollo descrive come immagine divisione delle cellule all'interno di un tessuto in Caenorhabditis elegans embrioni. Mentre diversi protocolli descrivono come la divisione cellulare l'immagine in embrione precoce, questo protocollo viene descritto come immagine divisione cellulare all'interno di un tessuto in via di sviluppo durante la metà tarda embriogenesi.

Visualizzazione neuroblasti Citocinesi Durante<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriogenesi

Progenitrici neurali mitosi è un parametro critico della neurogenesi. Gran parte della nostra comprensione delle progenitrici neurali mitosi si basa sull'analisi del tessuto fisso. Vivo imaging in fettine cerebrali embrionali è una tecnica versatile per valutare mitosi con alta risoluzione temporale e spaziale in un ambiente controllato.

Immagini dal vivo della mitosi in via di sviluppo embrionali di topo Cortex

Dettagli Questo protocollo un metodo semplificato utilizzato per condurre cellule vive nel contesto di un cervello larvale intatto. Approcci di imaging cellulare dal vivo hanno un valore inestimabile per lo studio delle divisioni asimmetriche di cellule staminali neurali così come altri processi neurogena e di sviluppo, in coerenza scoprendo i meccanismi che sono stati precedentemente trascurato.

Immagini dal vivo di<em&gt; Drosophila</em&gt; larvali neuroblasti

Qui, forniamo un metodo affidabile e a basso costo per generare colture individulamente cervello organotipiche fetta da embrioni del mouse adatti per la microscopia confocale e tecniche di imaging live.

Ex Utero Elettroporazione e colture Organotypic fetta di cervelli embrionali del Mouse per vivere-Imaging di migrazione interneuroni GABAergici

Un test etta ex vivo permette di immaginare l'escrescenza del nervo oculomotore in tempo reale. Le fette vengono generate incorporando embrioni E10.5 IslMN:GFP in agarose, tagliando su un vibratoma e crescendo in un incubatore stage-top. Il ruolo dei percorsi di orientamento degli assoni viene valutato aggiungendo inibitori ai mezzi di coltura.

Ex Vivo Oculomotor Slice Coltura da embrionico GFP-Expressing Mice per Time-Lapse Imaging di Oculomotor Nerve Outgrowth

L'imaging dal vivo ex vivo è una potente tecnica per studiare i processi dinamici dei movimenti e delle interazioni cellulari nei tessuti viventi. Qui, presentiamo un protocollo che implementa la microscopia a due fotoni per tracciare in tempo reale le cellule epiteliali dentali in incisivi di topo adulti interi in coltura.

Utilizzo dell'imaging dal vivo ex vivo per studiare le divisioni e i movimenti cellulari durante il rinnovamento dentale del topo

Durante lo sviluppo della corteccia cerebrale, i neuroni e le cellule gliali hanno origine nella zona ventricolare che riveste il ventricolo e migrano verso la superficie del cervello. Molti geni sono coinvolti in questo processo. Questo protocollo introduce la tecnica per l'imaging time-lapse di neuroni in migrazione e progenitori gliali.

Imaging time-lapse di neuroni in migrazione e progenitori gliali in fette di cervello embrionale di topo

Impara l'imaging ex vivo in tempo reale di divisioni cellulari singole nel neuroepitelio embrionale di topo. Questo metodo combina marcatori fluorescenti con microscopia confocale time-lapse per studiare la neurobiologia dello sviluppo.

Ex vivo Imaging in diretta di divisioni cellulari singoli in mouse neuroepitelio

Esplora altri video