Name: Ex vivo de imágenes en vivo de las divisiones sola celda en ratón neuroepitelio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Aprende a realizar imágenes en vivo ex vivo para rastrear divisiones de células individuales en el neuroepitelio de ratón E8.5. Este método combina microscopía confocal de tiempo real con cultivos de cortes embrionarios para observar procesos celulares dinámicos.

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Este proyecto de investigación fue apoyada por un suplemento de ARRA, 5 R01 NS056380. Se prestó apoyo adicional a través de la Core Vector viral y el Core Microscopía de la Emory Neurociencia NINDS Core Instalaciones subvención, P30NS055077. Damos las gracias al ratón transgénico Emory y Gene Targeting Core para derivar la línea de ratones de GENSAT; Greg Pazour para la línea celular SSTR3-GFP IMCD3 estable, y Bradley Yoder para la SSTR3-GFP lentiviral construir. Los anticuerpos monoclonales se obtuvieron de los Estudios del Desarrollo del Banco hibridoma, desarrollado bajo los auspicios de la NICHD y mantenido por la Universidad de Iowa, Departamento de Ciencias Biológicas, Iowa City, IA 52242. Todos los animales procedimientos fueron aprobados por el IACUC y el Comité de Seguridad de la Biotecnología en la Universidad de Emory.

Los ratones adultos son sacrificados por dislocación cervical mecánico. Todos los animales procedimientos fueron aprobados por el IACUC y el Comité de Seguridad de la Biotecnología en la Universidad de Emory. 1. Generación de Embriones <ol><li> Cruz Cre line tamoxifeno inducible, CAGGCreER y reportero línea dsRedCre (Tg (CAG-Bgeo,-DsRed * MST) 1Nagy) (Figura 1) 5,6. Para controlar el tiempo relativo de respuesta Shh a las células hijas, y la línea transversal CAGGCreER dsRed con el Olig2-eGFP BAC ratones transgénicos (Tg (Olig2-EGFP) EK23Gsat) (Figura 1) 7,8. </li><li> Disolver el tamoxifeno en etanol 100%, y realizar la inyección intraperitoneal de 2,5 mg de tamoxifeno por 40 g de peso corporal en las hembras embarazadas en el día embrionario 6.5 (E6.5) para inducir la expresión de Cre y etiquetado dsRed en un pequeño subconjunto de células. </li><li> 48 horas más tarde diseccionar embriones, identificar embriones positivos DsRed utilizando el microscopio de fluorescencia, la transferencia a la placa de cultivo y observadorese individuales durante las divisiones celulares ex vivo de imágenes (ver abajo). </li></ol> 2. Todo el embrión de ratón Cultura <ol><li> Diseccionar embriones E8.5 en medio de lavado precalentado que contiene DMEM/F12 (1:1) suplementado con 10% de suero de ternero recién nacido y 1% de penicilina / estreptomicina (P / S) 9. </li><li> Directamente después de la disección, el lugar embriones en la etapa de calentamiento ° C 37 bajo el microscopio de fluorescencia e identificar como GFP y / o dsRed positivo (ver más abajo). </li><li> Transferencia de hasta 2 embriones en una caída de 500 l de medio de cultivo pre-equilibradas que contienen 50% de suero de rata a partir de un macho Sprague-Dawley y 50% DMEM/F12 (1:1) sin rojo fenol suplementado con L-glutamina y 1% de HEPES 1 M en NaCl al 0,85% y P / S 9. </li><li> Aplique una capa fina (0,1 cm) de aceite mineral ligero equilibrada a medio y evitar la evaporación y la transferencia de la placa de cultivo que contiene los embriones a los 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora. </li></ol> 3.Infección viral <ol><li> Con el fin de cilios etiqueta en el neuroepitelio, añadir 5-10 l de SSTR3-GFP lentivirus, aproximadamente 2 millones de viriones, a una caída de l equilibró 500 de medio de cultivo que contiene un embrión E8.5. </li><li> Después de 18 h de la cultura, la transferencia de embriones infectados en varias gotas de medio de lavado para lavar el virus y preparar rebanada del tubo neural. </li></ol> 4. Neural Tube preparación rebanada de imágenes en vivo <ol><li> Disección del tubo neural del embrión E8.5 en el medio de lavado precalentado utilizando un tamaño de micro-cuchillo de 0.025 mm, en un plato de agar recubierto 1%. </li><li> Coloque el lado ventral del tubo neural aislado en una caída de 150 l de medio de cultivo completo equilibrado sin rojo de fenol en el plato mm recubierto con fondo de vidrio 35 con poli-L-lisina. </li><li> Ponga una pequeña cantidad de una mezcla 1:1 de 100% pura vaselina y cera de vela derretida (velas de IKEA) alrededor del tubo neural montada, y presione suavemente por una estrecha franja de cubreobjetos de vidrio con el fin deinmovilizar la muestra. </li><li> Cubra el plato con una capa delgada (~ 0,1 cm) de aceite mineral ligero equilibrada (Figura 2). </li></ol> 5. Imágenes y Time-lapse microscopía confocal en vivo <ol><li> Lugar plato bajo la Nikon A1R escaneo láser confocal microscopio invertido equipado con una cámara ambiental que regula la temperatura, ajuste a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Usa 60x objetivo de inmersión en aceite para grabar GFP cilios etiquetados y células positivas DsRed, mientras que el uso objetivo de inmersión en aceite 40x para supervisar células positivas DsRed Olig2-GFP y. </li><li> Abra el software de elementos NIS para crear condiciones de la imagen lapso de tiempo. Cada 10 min adquirir z-pilas de hasta 25 m con una separación de 1,5 m (objetivo 40x) y hasta 8 m con una separación de 0,4 m (60x objetivo). Use 488 y 561 nm de excitación y las longitudes de onda de los canales de transmisión si es necesario. Adquirir imágenes en tamaño 512 x 512. Configurar varias regiones definidas por el usuario de interest para realizar simultáneamente la grabación. La exposición óptima a la potencia del láser y el brillo de la imagen se ajusta mediante el uso de láser de baja intensidad (hasta el 11% para mCherry 561, hasta el 4,5% EGFP 405/488), velocidad de exploración 1, línea media de 2 y el tamaño del orificio del pasador (61 m para dsRed; 28,1 micras para Olig2; 72 micras para SSTR3GFP; 61,3 m para dsRed y SSTR3GFP, 58 m para dsRed y Olig2). El uso de los reporteros fluorescentes codificadas genéticamente nos ha permitido detectar el brillo con láser de baja potencia. </li><li> Analizar los datos registrados utilizando software de reconstrucción Imaris 3D. </li></ol> 6. Inmunofluorescencia <ol><li> Fijar embriones o tubos neurales aisladas en paraformaldehído al 4% / tampón de fosfato 0,1 M en hielo (4 ° C) durante 1 hora en un plato de cristal. </li><li> Lavar las muestras en PBS 2 horas en hielo (4 ° C) (PBS cambio unas cuantas veces) y poner en sacarosa al 30% / tampón de fosfato 0,1 M a lo largo de la noche o hasta que embriones fregadero. </li><li> Insertar en octubre, la congelación en hielo seco y guárdelo en -80 ° C. Perform seccionar en criostato (10 mm). </li><li> Lavar los portaobjetos durante 10 minutos en solución de lavado que contiene 1% inactivado por calor suero de oveja y 0,1% de Triton X-100 en PBS. </li><li> Diluir anticuerpos primarios en la solución de lavado a raíz de las concentraciones: rata monoclonal anti-RFP (5F8), 1:200; Rabbit anti-Arl13b suero 1:1500 y el ratón monoclonal anti-Arl13b 01:05 (295B/54); Rabbit anti-Olig2 1:300; monoclonales de ratón Pax6, Shh y NKX2.2-all 01:10 y conejo policlonal Ki67 1:500. Añadir alrededor de 150 l por deslizamiento en cámara húmeda plana, cubierta con parafilm para evitar que se sequen y dejar durante la noche a 4 ° C. </li><li> Lavar los portaobjetos en la solución de lavado tres veces, 20 minutos cada vez a temperatura ambiente. </li><li> Diluir anticuerpos secundario Alexa Fluor 488, 568, 350 en las soluciones de lavado a 1:200 concentración. Utilice Hoechst 1:3.000 o TO-PRO-3 1:500 para teñir los núcleos. Añadir 150 l por diapositiva, deja 1 hora a temperatura ambiente en cámara húmeda protegida de la luz. </li><li> Lavar los portaobjetos en solución de lavado two veces, 30 min cada vez a temperatura ambiente. </li><li> Mount desliza en el 80% ProLong Oro reactivo anti-fade y vistas dentro de las 24 horas. </li></ol>

<ol><li>Yamada, T., Pfaff, S. L., Edlund, T., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+pattern+in+the+neural+tube%3A+motor+neuron+induction+by+diffusible+factors+from+notochord+and+floor+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of cell pattern in the neural tube: motor neuron induction by diffusible factors from notochord and floor plate.</a> Cell. 73, 673-686 (1993).</li>
<li>Ericson, J., Muhr, J., Placzek, M., Lints, T., Jessell, T. M., Edlund, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+induces+the+differentiation+of+ventral+forebrain+neurons%3A+A+common+signal+for+ventral+patterning+within+the+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog induces the differentiation of ventral forebrain neurons: A common signal for ventral patterning within the neural tube.</a> Cell. 81, 747-756 (1995).</li>
<li>Briscoe, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeodomain+Protein+Code+Specifies+Progenitor+Cell+Identity+and+Neuronal+Fate+in+the+Ventral+Neural+Tube%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Homeodomain Protein Code Specifies Progenitor Cell Identity and Neuronal Fate in the Ventral Neural Tube.</a> Cell. 101, 435-445 (2000).</li>
<li>Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+ciliary+localization+sequences+within+the+third+intracellular+loop+of+G+protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors.</a> Mol. Biol. Cell. 19 (4), 1540-1547 (2008).</li>
<li>Vintersten, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+red%3A+red+fluorescent+protein+expression+in+mouse+ES+cells%2C+embryos%2C+and+adult+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Mouse in red: red fluorescent protein expression in mouse ES cells, embryos, and adult animals.</a> Genesis. 40 (4), 241-246 (2004).</li>
<li>Hayashi, S., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+recombination+in+diverse+tissue+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre%3A+a+tool+for+temporally+regulated+gene+activation%2Finactivation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient recombination in diverse tissue by a tamoxifen-inducible form of Cre: a tool for temporally regulated gene activation/inactivation in the mouse.</a> Dev. Biol. 244 (2), 305-318 (2002).</li>
<li>Gong, S., Zheng, C., Doughty, M. L., Losos, K., Didkovsky, N., Schambra, U. B., Nowak, N. J., Joyner, A., Leblanc, G., Hatten, M. E., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).</li>
<li>Mukouyama, Y. S., Deneen, B., Lukaszewicz, A., Novitch, B. G., Wichterle, H., Jessell, T. M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olig2%2B+neuroepithelial+motoneuron+progenitors+are+not+multipotent+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Olig2+ neuroepithelial motoneuron progenitors are not multipotent stem cells in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1551-1556 (2006).</li>
<li>Jones, E. A. V., Crotty, D., Kulesa, P. M., Waters, C. W., Baron, M. H., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+in+vivo+imaging+of+postimplantation+mammalian+embryos+using+whole+embryo+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Dynamic in vivo imaging of postimplantation mammalian embryos using whole embryo culture.</a> Genesis. 34, 228-235 (2002).</li>
<li>Piotrowska-Nitsche, K., Caspary, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+individual+cell+divisions+in+mouse+neuroepithelium+shows+asymmetry+in+cilium+formation+and+Sonic+hedgehog+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">Live imaging of individual cell divisions in mouse neuroepithelium shows asymmetry in cilium formation and Sonic hedgehog response.</a> Cilia. 1 (6), In Press (2012).</li>
<li>Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mouse+development+with+confocal+time-lapse+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods in Enzymology. 476, 351-377 (2010).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Nuestro sistema ex vivo nos permite observar directamente las divisiones de células individuales dentro del neuroepitelio en desarrollo en tiempo real. A modo de ejemplo se analizaron las divisiones celulares en el tubo neural embrionario del ratón y monitoreamos ni formación cilio o respuesta Shh. Confirmamos nuestras imágenes de los resultados (n = 24) fueron consistentes con los resultados de las secciones fijas (n = 178) que indican nuestra técnica proporciona datos fisiológicamente releva...

<table><tbody><tr><td>Línea Z/RED (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J</td><td>Jackson Laboratory</td><td>005438</td><td></td></tr><tr><td>Línea Olig2-eGFP (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd</td><td>MMRRC,</td><td>010555-UCD</td><td></td></tr><tr><td>CAGGCreER</td><td>Jackson Laboratory</td><td>003724</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxifeno</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1)</td><td>GIBCO</td><td>21041-025</td><td></td></tr><tr><td>Suero de ternero recién nacido</td><td>Lonza</td><td>14-416F</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Suero de rata SD macho</td><td>Harlan Bioproducts</td><td>4520</td><td></td></tr><tr><td>Hepes 1 M</td><td>BioWhittaker</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>GIBCO</td><td>21041-025</td><td></td></tr><tr><td>Aceite mineral ligero</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>Lentivirus Sstr3-GFP</td><td>Emory Viral Core</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcuchillo, tamaño 0,025 mm</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62091</td><td></td></tr><tr><td>Placa de fondo de vidrio recubierta con poli-L-lisina de 35 mm</td><td>MatTek</td><td>P35GC-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Vaselina al 100 %</td><td>Kroger</td><td>FL9958c</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal invertido con escaneo láser A1R</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software NIS Elements</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software Imaris 3D</td><td>Bitplane AG</td><td>Imaris 7.2.3</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Criostato</td><td>Leica</td><td>CM1850</td><td></td></tr><tr><td>Suero de oveja inactivado por calor</td><td>Invitrogen</td><td>16210-072</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Tampón fosfato</td><td>Elaborado en laboratorio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal de rata anti-RFP (5F8)</td><td>Chromotek</td><td>110411</td><td></td></tr><tr><td>Suero de conejo anti-Arl13b</td><td>NeuroMab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal de ratón anti-Arl13b 1:5</td><td>NeuroMab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo de conejo anti-Olig2</td><td>Chemicon</td><td>AB9610</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpos monoclonales de ratón Pax6</td><td>Developmental Hybridoma Bank</td><td>Pax6</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpos monoclonales de ratón Shh</td><td>Developmental Hybridoma Bank</td><td>5E1</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpos monoclonales de ratón Nkx2.2</td><td>Developmental Hybridoma Bank</td><td>74.5A5</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo policlonal de conejo Ki67</td><td>Abcam</td><td>AB15580</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568</td><td>Molecular Probes</td><td>A11031</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 350</td><td>Molecular Probes</td><td>A11046</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst</td><td>Fisher</td><td>AC22989</td><td></td></tr><tr><td>TO-PRO-3</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo antifade ProLong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo de imágenes en vivo de las divisiones sola celda en ratón neuroepitelio

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Hemos desarrollado un sistema que integra imágenes en vivo de los marcadores fluorescentes y las rebanadas de cultivo embrionario neuroepitelio del ratón. Nos aprovechamos de las actuales líneas de ratones de células linaje genético rastreo: una línea Cre tamoxifeno-inducible y una línea reportero Cre expresan dsRed por recombinación Cre-mediada. Mediante el uso de un nivel relativamente bajo de tamoxifeno, hemos sido capaces de inducir la recombinación en un pequeño número de células, lo que permite que sigamos divisiones celulares individuales. Además, se observó la respuesta transcripcional de la proteína Sonic Hedgehog (Shh) de señalización utilizando un Olig2-EGFP transgénicos línea 1-3 y que supervisó la formación de los cilios mediante la infección de la porción cultivada con virus que expresa el marcador de los cilios, SSTR3-GFP 4. Con el fin de imagen del neuroepitelio, que cosecharon embriones a E8.5, aislado del tubo neural, montado la rebanada neuronal en condiciones de cultivo adecuadas en la cámara de formación de imágenes y realiza de lapso de tiempo de imagen confocal. Nuestro exvivo método de imagen en directo nos permite trazar divisiones celulares individuales para evaluar el tiempo relativo de formación de los cilios primarios y la respuesta de Shh en forma fisiológicamente relevante. Este método se puede adaptar fácilmente el uso de marcadores fluorescentes distintos y proporciona el campo de las herramientas con las que monitorean el comportamiento de células in situ y en tiempo real.

Aquí hemos realizado ex vivo de imágenes en directo de las divisiones de células individuales dentro de la E8.5 neuroepitelio ratón. Para marcar las células individuales, se indujo la recombinasa Cre en un subconjunto de células que contienen una línea reportero Cre que expresaban DsRED tras la recombinación 5,6 (Figura 3A). Por lo tanto, 48 horas más tarde pudimos observar divisiones celulares individuales en ex vivo de imágenes (figuras 4A-D). Al mismo tie...

Aquí desarrollamos las herramientas necesarias para<em&gt; Ex vivo</em&gt; Imágenes en vivo de rastrear las divisiones de células individuales en el ratón E8.5 neuroepitelio

Ex vivo de imágenes en vivo de las divisiones sola celda en ratón neuroepitelio

Desarrollamos un sistema que integra la obtención de imágenes en vivo de marcadores fluorescentes y el cultivo de cortes de neuroepitelio embrionario de ratón. Aprovechamos...

El objetivo general de este procedimiento es integrar el estudio mediante imágenes en vivo de marcadores fluorescentes con cultivos de rodajas de epitelio neuroembrionario de ratón. Esto se logra primero cruzando la línea de ratón Cree inducible con la línea reportera Cree para etiquetar genéticamente las células visiblemente en división. A continuación, se diseccionan los embriones completos de ratón y se cultivan in vitro en presencia de lentivirus.Luego, el embrión se secciona y se prepara una porción del tubo neural para imágenes en vivo. Finalmente, se realiza la imagen del corte del tubo neural mediante microscopía confocal de lapso de tiempo. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la observación directa de divisiones celulares individuales dentro del neuroepitelio en desarrollo, en tiempo real, mediante imágenes en vivo ex vivo.Por lo tanto, la ventaja de este protocolo es que podemos monitorear células individuales in vivo, lo que nos permite formular preguntas acerca de los eventos de señalización de cada célula, así como del comportamiento de cada una. Para comenzar, cruce la línea de ratón Cree inducible por Tamoxifeno, CAGG CRE ER, con la línea r

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Imágenes de alta resolución en vivo del comportamiento de las células en el desarrollo de neuroepitelio

Fuente: Daynac, M., et. al. Clasificación celular de células madre neurales y progenitoras de la zona subventricular de ratón adulto e imágenes en vivo de su dinámica del ciclo celular. J. Vis. Exp. (2015)Este video muestra imágenes de lapso de tiempo de células madre neurales (NSC) de un cerebro de ratón transgénico utilizando un microscopio de escaneo láser confocal. Las NSC emiten fluorescencia roja durante la fase G1 y no son fluorescentes en otras fases del ciclo celular. Se coloca un...

Imágenes de lapso de tiempo de la división de células madre neurales de ratón mediante microscopía confocal

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Imágenes confocales de lapso de tiempo de la dinámica dendrítica neuronal en explantes de retina de ratón

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In vivo Postnatal electroporación y time-lapse de Neuroblast Migración en rodajas de cerebro de ratón aguda

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Visualizar Neuroblast Citocinesis Durante<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriogénesis

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