基质辅助激光解吸/电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱法分析完整蛋白质（分子量大于100 kDa）

本实验的总体目标是通过基质辅助激光解吸电离质谱法（MALDI质谱）对大于100千道尔顿的完整蛋白质进行高灵敏度分析。该目标的实现首先需要配制基质溶液，第二步是将薄层溶液点样至靶板上。

接下来，将样品与基质混合液点样至靶板上。最后一步是在显微镜下观察样品点。最终，使用质谱仪分析完整蛋白质并记录质谱图。

与电喷雾电离等其他分析方法相比，MALDI质谱的主要优势在于其对盐类、污染物和去污剂的耐受性更高。MALDI的另一个优势是其产生的离子所带电荷较少，相较于电喷雾电离。因此，MALDI数据的获取与解读相当直接简便。

开始重结晶时，将10毫升40%乙醇倒入Pyrex烧杯中。然后在水浴和电阻加热器上加入600毫克基质。加热基质溶液并搅拌，直至基质完全溶解。

重复上述步骤，直至溶液达到饱和。将溶液在室温下缓慢冷却数小时，然后在4°C下过夜保存。若未形成晶体，可用玻璃棒轻轻刮擦烧杯内壁液面以下区域，以诱导结晶。

最后，通过过滤收集基质晶体。用少量冰冻溶剂冲洗烧瓶中残留的晶体，并进行过滤。过滤完成后，让晶体干燥，以清洁MALDI靶板。

用甲醇冲洗，并用无尘纸轻轻擦拭。然后用水冲洗，并用无尘纸擦拭。将MALDI靶板插入600毫升烧杯中，并用50%乙醇覆盖。

接着，将靶材置于乙醇溶液中，在超声波清洗机中处理10分钟。如果板上仍有残留物，则重复前述步骤。用甲醇或所使用的溶剂冲洗靶材，溶剂的选择决定了样品的扩散程度。

然后倾斜靶板，使所有液体被吸水纸（Kim wipe）吸收。使用氮气气流干燥靶板。下一步，将α-CHCA溶解于丙酮中。

为了制备饱和溶液，将10微升移液枪吸头浸入α-CHCA饱和溶液中，使少量溶液流入吸头内。用移液枪吸头迅速接触MALDI靶板，使用1.5毫升塑料管将α-CHCA溶液点样至MALDI靶板上。通过将α-CHCA溶解于体积比为7:3的乙腈与5%甲酸溶液中，配制成20毫克/毫升的α-CHCA溶液，并将该溶液标记为α-CHCA溶液。

随后，通过将DHB溶于乙腈与0.1%三氟乙酸按7:3体积比配制的溶液中，制备20毫克每毫升的DHB溶液，并将该溶液标记为DHB溶液。将α-CHCA溶液与DHB溶液按1:1体积比混合，得到CHCA-DHB混合溶液。在开始本实验步骤前，可选步骤是参考所列文献中的缓冲液置换法对蛋白质样品进行纯化。

否则，将未纯化的蛋白质样品点在MALDI靶板上。接着，取0.5 µL蛋白质样品点在已制备好的α-CHCA薄层上。随后立即加入0.5 µL的C-H-C-A-D-H-B溶液。

在MALDI靶板上点样0.5微升的Cain标准品，然后加入0.5微升基质溶液。待样品和Cain干燥后，可在显微镜下观察结晶斑点，将靶板插入仪器中，并选择合适的仪器设置。随后选择合适的质荷比范围。

获取钙的光谱，并使用适当的激光强度校准仪器。采集蛋白质样品的光谱。此处展示了完整染色体区域的MALDI飞行时间分析，以维持一种蛋白质。

C-H-C-A-D-H-B 混合物在信噪比和灵敏度方面产生了更高质量的质谱图。特别是，当在 MALDI 靶板上点样 0.5 皮摩尔的蛋白质时，使用 C-H-C-A-D-H-B 混合物可实现检测，而使用 SINO NIC 酸时，相同量的蛋白质几乎无法检测。此外，利用 C-H-C-A-D-H-B 混合物，观察到了蛋白质的多重电荷离子，从而实现了更高精度的质量测定，因为在轴向多反射飞行时间仪器中，峰分辨率与质荷比成反比。此外，使用 C-H-C-A-D-H-B 混合物时，我们选择的基质沉积方法为薄层法。

采用干燥液滴法时，质量高于100千道尔顿的蛋白质未被检测到。单体β-半乳糖苷酶蛋白也通过多级飞行时间质谱进行了分析。在灵敏度和分辨率方面，C-H-C-A-D-H-B谱图优于芥子酸谱图。

此外，多电荷离子的存在使得能够以更高的准确性确认蛋白质的分子量。本文展示了采用 MALDI 分析完整免疫球蛋白的结果。使用 C-H-C-A-D-H-B 混合物获得的质谱信号强度明显高于 SA 和 α-CHCA 的质谱。

更具体而言，在 C-H-C-A-D-H-B 谱图中，蛋白质信号更强且分辨率更佳。使用 C-H-C-A-D-H-B 混合物及薄层沉积方法，在完整大分子蛋白质的质量上表现出显著提升。质谱数据通过 MALDI 仪器获取。

本方案介绍了如何使用多种仪器获取高质量的高分子量蛋白质质谱图。在进行此类分析时，有三点至关重要。首先，需使用 freshly prepared metrics solution。

其次，正确地将样品沉积在Mali靶上。第三，使用适当的仪器设置，例如激光强度。