Name: Boyutu ince ayar ve Solid-state nanopores Gürültü en aza indirmek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-31T20:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Öğrenin katı hal nanopore boyutunu ince ayar yapma ve elektriksel gürültüyü azaltma yöntemini. Bu teknik, biyomoleküler algılama deneylerinde hassas ölçüm ve güvenilir sonuçlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Doğa Bilimleri ve Kanada, Kanada Yenilik Vakfı, ve Ontario Araştırma Fonu Mühendislik Araştırma Konseyi tarafından destek için minnettarım. Biz Nanopore yazılım ve enstrümantasyon tasarımı ile yardım için değerli tartışmalar ve teknik destek için Nanopore imalat ve karakterizasyonu, L. ANDRZEJEWSKI yılında yardım için Y. Liu teşekkür, ve A. marziali.

1.. Nanopore Fabrikasyon ve Temizlik Not: Bir küçük gözenek yalıtıcı bir zar bulunmaktadır kez aşama 2&#39;de tarif edildiği gibi, doğrudan, ya da daha fazla işlem temizleme olmadan sıvı hücre içinde monte edilebilir. Veya oksijen plazmaya 2 maruz: Bu deneyler arasında kirleticilerin izlerini kaldırmak için gerekli olan, ancak, nanopore cips piranha çözüm 3,15,16 (H 2 O 2 03:01 H 2 SO 4) kullanılarak temizlenebilir. Bu nedenle, pirana çözeltisine maruz bırakılarak ön yıkama gerekli değilse, aşağıdaki protokolde 1,2-1,9 isteğe bağlı adım. <ol><li> Gazını 40 ° C&#39;de 30 dakika boyunca bir sonikatöre vakum altına yerleştirilerek deiyonize (Dİ) su, süzüldü </li><li> Dikkatli bir şekilde 3 ml 1 mi, ardından hidrojen peroksit sülfürik asit eklenerek bir 10 ml beher içine pirana çözelti hazırlayın. Pipet içinde geri akışlayarak iyice karıştırın. DİKKAT: Piranha çözümü son derece tehlikelidir. Lütfen ta<html> tüm tedbirleri ke. </li><li> Aside dayanıklı cımbız kullanarak, dikkatle tamamen çip daldırın ve yüzeyinde yüzen bunu önlemek için piranha çözüm içine kenar ilk nanopore içeren zar çipi takın. </li><li> Filtrelenmiş su ile iyice durulayın cımbız. </li><li> 90 ° C&#39;ye kadar bir sıcak plaka üzerinde önceden behere koyun ve en az 30 dakika boyunca temizlenir izin verir. </li><li> Dikkatlice temiz bir cam pipet kullanarak kaptan piranha çözüm kaldırmak ve bol miktarda su içinde atın. </li><li> Temiz bir cam pipet kullanarak durulama için beher içine adım 1.1 gazı giderilmiş iyonu giderilmiş suyun 5 ml ekleyin. Su çıkarmak ve en az 5x tekrarlayın. </li><li> Dikkatle temiz, keskin uçlu cımbız kullanarak beherlerinden nanopore çipi çıkartın. Nanopore membran çok kırılgan olduğu gibi aşırı dikkatli olun. </li><li> Hafifçe bir aspiratör kullanarak kenarına emme uygulanarak çipi kurutun. Kullanıma hazır olana kadar temiz Petri kabındaki çipi saklayın. </li></ol>ve_title &quot;&gt; 2. nanopore Montaj <ol><li> % 20 nitrik asit çözeltisi içinde yerleştirilmesi ve 10 dakika için kaynatma ile Teflon nanopore hücre (Şekil 1) temizleyin. DİKKAT: Tüm gerekli kişisel koruyucu donanım kullanın ve dikkatle asitleri anlaştım. </li><li> 10 dakika boyunca dikkatli bir şekilde kaynar DI su içinde, nitrik asit ve yerden hücre çıkarın. </li><li> Nitrik asidin tam olarak çıkarılmasının sağlanması için ek bir 10 dakika boyunca DI su içinde hücreyi kaynatın. Sıcak plakadan beher çıkarın ve bu sırada oda sıcaklığına soğumaya bırakın. </li><li> Beher gelen hücre çıkarın ve filtre edilmiş hava ya da kuru bir N2 ile darbe. Temiz Petri kabındaki hücre saklayın. </li><li> Gazını 40 ° C&#39;de 30 dakika boyunca bir sonikatöre vakum altına yerleştirilerek (pH 8 HEPES ile tamponlanmış) KCI çözeltisi süzüldü </li><li> En az 10 dakika boyunca etanol içinde sonike her küçük gözenek çip için temiz, iki silikon elastomer contalar. </li><li> Temiz bir elastomer conta varlık carefu üzerinde nanopore çip yerleştirinconta açıklığı olan membran penceresi hizalamak için l. Yerleştirin ve çip üstüne ikinci bir conta hizalayın. </li><li> Temizlenen nanopore hücrenin bir yarısının rezervuar girişine çipi ve contalar yerleştirin. Yerine diğer yarısı vidalanarak hücre bir araya getirin. Nanopore hücre bileşenlerinin bir dağıtılmış görünüşüdür, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. </li><li> Hücre rezervuar içine pipetle etanol ve birkaç kabarcıkları girişleri çıkmak için görülür kadar bir vakum odası içinde yerleştirerek nanopore çip ıslatın. </li><li> KCl, süzüldü çözeltisi gazı alınmış en az 3 ml rezervuarları yıkama ile etanol çıkarın. Bir aspiratörü kullanarak taşma kaldırmak için özen gösterin. </li></ol> 3. Nanopore Karakterizasyonu <ol><li> Elektriksel ekranlı deney kurulumunda nanopore hücre yerleştirin ve her rezervuar Ag / AgCl elektrotlar yerleştirmek. Bu kurulum olarak, dış güç kaynağı ve akım amplifikatör haricinde, Şekil 2&#39;de gösterilene benzer,düşük gürültü direnç geri besleme amplifikatörü ile değiştirilir. </li><li> Voltaj-kıskaç modunda düşük parazitli bir amplifikatör kullanılarak, +200 mV -200 mV ile süpürme ve IV özelliklerinin kayıt potansiyelleri geçerlidir. </li><li> Çözelti 17, çapı hesaplamak için kullanılabilir küçük gözenek iletkenliği elde etmek için IV eğrisi monte edin. Hesaplanan çap TEM görüntüleme beklenenden çok daha küçük ise, gözenek tam olarak muhtemelen ıslatılmış değildir ve / veya artık veya kontaminasyonu içerir. </li><li> Nanopore genelinde 200 mV potansiyeli uygulayın ve 30 saniye için iyonik akımı kaydedebilirsiniz. </li><li> Iyonik akımın bir güç spektral yoğunluğu (PSD) analizi gerçekleştirmek ve nanopore elektriksel gürültü özelliklerini ölçmek için entegre. Gürültü 5 kHz bant genişliği 15 pA RMS üzerinde ise, o zaman gözenek tam olarak ıslanmamış muhtemeldir ve / veya kirlenme ihtiva eder ve güvenilir bir deneyde kullanılamaz. </li></ol> 4. Yüksek Elektrik Fie kullanma Yastıkları Nanoporeslds Not: IV eğrisi sergilenen asimetri veya daha az beklenenden iletkenlik oluşturulan veya mevcut iz düşük frekanslarda istikrarsızlık ve yüksek gürültü seviyelerini gösterdi, bu gözenek üzerinde herhangi bir kontaminasyonu temizlemek için yüksek elektrik alanları ile Nanopore durum için gerekli yüzey ve / veya gözenek ıslak. Bu yöntem, zar ya da kapasitans ölçümlerinde kullanılan mevcut amplifikatörünün girişine bağlanmış bir parazit kapasitans kaynaklanan yüksek frekanslı gürültü etkilemez birlikte, (aynı zamanda 1 / f gürültü olarak da adlandırılır), düşük frekanslı gürültü 18 büyük ölçüde azaltılabilir. Bu kurutma gerçekleştirmek için kullanılan bir düzeneğin şematik Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir. <ol><li> Patch-kelepçe amplifikatör elektrotları çıkarın. </li><li> Üretme yeteneğine sahip bir bilgisayar kontrollü güç kaynağına elektrotların bir geç&gt; 6 V (&gt; 0.2 V / nm elektrik alanı burada kullanılan 30 nm kalınlığında bir membran için kuvvet) ve e, diğergerçek zamanlı olarak izlenebilir akım amplifikatör xternal. Not: yüksek elektrik alanlarının uygulama çeşitli zar malzemeleri ve kalınlıklarda nanopores durum için kullanılabilir. Aksi belirtilmedikçe, her ikisi de 30 nm ve 10 nm membranlar Burada ele olmakla birlikte, tarif edilen gerilimleri 30 nm kalınlığında bir membran için kullanılan bakın. </li><li> En az 5 saniye boyunca nanopore genelinde 400 mV (ölçüm voltaj) bir potansiyel farkı uygulanması. </li><li> Nanopore iletkenliği belirlemek için veri son 1 sn den ortalama akım değerini hesaplayın. En olası geometrisine göre yazılım ve seçim nanopore iletkenlik modeli kullanılarak otomatik olarak yapılmalıdır bu iletkenlik göre nano-gözeneklere, çapını hesaplamak. Bu IV eğrisinden ölçülen çapma uygun olmalıdır. </li><li> Bir ölçüm süresi 5 saniye, ardından 0.2 V / nm arasında bir elektrik alanı oluşturmak için nano-gözeneklere boyunca 6 V bir 200 msn darbesi (ıslatma voltaj) uygulayın400 mV&#39;de. Yine, verilerin son 1 saniye ile nano-gözenekler bir çapı hesaplamak ve nanopore tamamen ıslak olduğundan emin olmak için TEM ölçümlerinden tahmin değeri ile karşılaştırılması. Gerekirse birkaç kez tekrarlayın. </li><li> Gerektiğinde, ölçüm süresi boyunca akım sinyali kadar artan gerilim ile yüksek elektrik alan palslarının uygulanmasını tekrar istikrarlı ve beklenen iletkenlik gösteren. Bu önemli ölçüde büyütmek ya da hızla Nanopore zarar verebilir gibi, 10 V (yani&gt; 0.3 V / nm) aşmayacak şekilde tavsiye edilmez. </li></ol> 5. Yüksek Elektrik Alanları Kullanarak nanopores büyütme Not: nano-gözeneklere çapı özel bir uygulama için, biyomoleküler algılama işlevselliği belirlenmesinde önemlidir. Bu amaçla, çok küçük gözenek çapı, uygun temiz ve ıslatmak için kullanılan aynı ayarı ile elde edilene kadar bir TEM yüksek elektrik alanları uygulanarak istenen bir boyuta büyütülebilir kullanılarak oluşturulannanopore (Şekil 2). <ol><li> Bölüm 4 ile aynı elektronik konfigürasyonu kullanılarak, bir çap ölçümünü elde etmek için gözenek boyunca 200-500 mV önyargı geçerlidir. Bir IV eğri uydurma daha az hassas olsa da, tek bir nokta ölçümü yaklaşık hızla nanopore büyüklüğünü tahmin etmek için de kullanılabilir. </li><li> 400 mV en az 5 saniyelik bir ölçüm süresi ardından nano-gözeneklere çapında 8 V bir 2 saniye darbe uygulanır. Yeni çapının hesaplanması genellikle Nanopore boyutu çok küçük bir artış (&lt;0.1 nm) gösterecektir. </li><li> Situ ve nanopore çapı artan gerçek zamanlı ölçümler elde etmek için büyütme ve ölçüm gerilimleri arasında değişen, periyodik bu işlemi tekrarlayın. </li><li> Daha hızlı bir büyüme oranı arzu edilir ise, gözenek 0.03 nS / s ile ec &amp; # arasındaki iletkenlik artış oranı ile genişledikçe tipik olarak hızlanır 10 V. Büyüme kadar aşamalı olarak uygulanan voltajın büyüklüğünü artırmak160, 10 nS / saniye, elektrik alanının küçük gözenek, kuvvet ve elektrolit solüsyonu özellikleri boyutuna bağlı olarak değişebilir. </li><li> İstenen çap ulaşıldığında, yüksek elektrik alanları uygulanmasını durdurur. Bu bilgisayar programı kullanılarak otomatik olarak yapılabilir. </li><li> Elektrotlara patch-clamp amplifikatör takın. </li><li> Yukarıda 3.5 - nanopore çapı onaylamak ve adımları 3.2 gibi düşük gürültü akım sinyallerini doğrulamak için 200 mV yeni IV ve mevcut izleme verilerini edinin. Gerekirse, klima ve büyütme protokolü (4,1-5,5 adımları) tekrarlayın. </li></ol> 6. DNA Translokasyon <ol><li> Önce bir Biyomoleküler örnek ekleyerek, rezervuar hiçbir kirlenme olduğunu sağlamak için bir kontrol deneyini gerçekleştirmek. Geçerli bir blokajlar 2 dakika sonra tespit doğrulamak için bir örnek yokluğunda 150-300 mV uygulanan potansiyelin altında bir akım izleme elde edin. </li><li> Için λ DNA (48.5 KBP çift sarmallı) Ekle &lt;em&gt; 0.5-2 ng / ul son konsantrasyon için cis rezervuar. Rezervuar boyunca numunenin homojen dağılımını sağlamak için en az 10 saniye boyunca pipet ile hafifçe geri akışa. </li><li> , 30 nm kalınlığında bir nano-gözenekler için, trans hazneye 150-300 mV potansiyel bir önyargı uygulamak ve nano-gözeneklere geçen iyonik akım ölçer. Çok kısa bir translokasyon olaylar için, nispeten yüksek bir alçak geçirgen filtre frekans (100 kHz) ile yüksek frekansta (250 kHz veya daha fazla) da örnek için tercih edilir. </li><li> Moleküller Nanopore aracılığıyla transloke olarak geçici akım barikatları algılamak için yazılım kullanarak iyonik akımını izlemek. Moleküler translokasyon iyonik mevcut izleri tıkanıklık derinliği, süresi ve ilgi numunesi hakkında bilgi anlaması sıklığını belirlemek için analiz edilebilir. Translocating moleküller hakkında bilgiler bilinmektedir Tersine, eğer, bu veriler nanopore kendisi özelliklerini incelemek için kullanılabilir. </li></ol>

<ol><li>Venkatesan, B. M., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopore+sensors+for+nucleic+acid+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Nanopore sensors for nucleic acid analysis.</a> Nat. Nanotechnol. 6 (10), 615-624 (2011).</li>
<li>Smeets, R. M. M., Keyser, U. F., Dekker, N. H., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+in+Solid-State+Nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Noise in Solid-State Nanopores.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (2), 417-421 (2008).</li>
<li>Tabard-Cossa, V., Trivedi, D., Wiggin, M., Jetha, N. N., Marziali, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+analysis+and+reduction+in+solid-state+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Noise analysis and reduction in solid-state nanopores.</a> Nanotechnology. 18, 4484-4418 (2007).</li>
<li>Wu, M. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Shape+and+Material+Composition+of+Solid-State+Nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Control of Shape and Material Composition of Solid-State Nanopores.</a> Nano Lett. 9 (1), 479-484 (2009).</li>
<li>Prabhu, A. S., Freedman, K. J., Robertson, J. W. F., Nikolov, Z., Kasianowicz, J. J., Kim, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SEM-induced+shrinking+of+solid-state+nanopores+for+single+molecule+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">SEM-induced shrinking of solid-state nanopores for single molecule detection.</a> Nanotechnology. 22, 425302(2011).</li>
<li>Li, J., Stein, D., McMullan, C., Branton, D., Aziz, M. J., Golovchenko, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion-beam+sculpting+at+nanometre+length+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ion-beam sculpting at nanometre length scales.</a> Nature. 412 (6843), 166-169 (2001).</li>
<li>Rosenstein, J. K., Wanunu, M., Merchant, C. A., Drndic, M., Shepard, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+nanopore+sensing+platform+with+sub-microsecond+temporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Integrated nanopore sensing platform with sub-microsecond temporal resolution.</a> Nat. Methods. 9 (5), 487-492 (2012).</li>
<li>Vanden Hout, M., Hall, A. R., Wu, M. Y., Zandbergen, H. W., Dekker, C., Dekker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+nanopore+size%2C+shape+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Controlling nanopore size, shape and stability.</a> Nanotechnology. 21, 115304(2010).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+evolution+and+surface+characterization+of+solid-state+nanopores+in+different+aqueous+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Size evolution and surface characterization of solid-state nanopores in different aqueous solutions.</a> Nanoscale. 4 (5), 1572-1576 (2012).</li>
<li>Smeets, R., Dekker, N., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-frequency+noise+in+solid-state+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Low-frequency noise in solid-state nanopores.</a> Nanotechnology. 20, 095501(2009).</li>
<li>Beamish, E., Kwok, H., Tabard-Cossa, V., Godin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+control+of+the+size+and+noise+of+solid-state+nanopores+using+high+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Precise control of the size and noise of solid-state nanopores using high electric fields.</a> Nanotechnology. 23 (40), 405301(2012).</li>
<li>Smeets, R. M. M., Keyser, U. F., Wu, M. Y., Dekker, N. H., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobubbles+in+Solid-State+Nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Nanobubbles in Solid-State Nanopores.</a> Phys. Rev. Lett. 97 (8), 088101(2006).</li>
<li>Niedzwiecki, D. J., Grazul, J., Movileanu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Observation+of+Protein+Adsorption+onto+an+Inorganic+Surface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Observation of Protein Adsorption onto an Inorganic Surface.</a> J. Am. Chem. Soc. 132 (31), 10816-10822 (2010).</li>
<li>Niedzwiecki, D. J., Movileanu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+Protein+Adsorption+with+Solid-state+Nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores.</a> J. Vis. Exp. (58), e3560(2011).</li>
<li>Wanunu, M., Meller, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWanunu%2C+M+%22Single-molecule+analysis+of+nucleic+acids+and+DNA-protein+interactions.+Single-molecule+techniques%3A+a+laboratory+manual%22">Single-molecule analysis of nucleic acids and DNA-protein interactions. Single-molecule techniques: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 395-420 (2008).</li>
<li>Tabard-Cossa, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instrumentation+for+Low-Noise+High-Bandwidth+Nanopore+Recording%5BTitle%5D)+AND+%22Engineered+Nanopores+for+Bioanalytical+Applications%22%5BJournal%5D)">Instrumentation for Low-Noise High-Bandwidth Nanopore Recording.</a> Engineered Nanopores for Bioanalytical Applications. , 59-93 (2013).</li>
<li>Kowalczyk, S. W., Grosberg, A. Y., Rabin, Y., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+conductance+and+DNA+blockade+of+solid-state+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Modeling the conductance and DNA blockade of solid-state nanopores.</a> Nanotechnology. 22 (31), 315101(2011).</li>
<li>Siwy, Z., Fuliński, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+1%2Ff%CE%B1+Noise+in+Membrane+Channel+Currents%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Origin of 1/fα Noise in Membrane Channel Currents.</a> Phys. Rev. Lett. 89 (15), 158101(2002).</li>
<li>Liebes, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstructing+solid+state+nanopore+shape+from+electrical+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Reconstructing solid state nanopore shape from electrical measurements.</a> Appl. Phys. Lett. 97 (22), 223105(2010).</li>
<li>Kim, M. J., Wanunu, M., Bell, D. C., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Fabrication+of+Uniformly+Sized+Nanopores+and+Nanopore+Arrays+for+Parallel+DNA+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Rapid Fabrication of Uniformly Sized Nanopores and Nanopore Arrays for Parallel DNA Analysis.</a> Adv. Mater. 18 (23), 3149-3153 (2006).</li>
<li>Smeets, R. M. M., Keyser, U. F., Krapf, D., Wu, M. -Y., Dekker, N. H., Salt Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+of+Ion+Transport+and+DNA+Translocation+through+Solid-State+Nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Dependence of Ion Transport and DNA Translocation through Solid-State Nanopores.</a> Nano Lett. 6 (1), 89-95 (2006).</li>
<li>Wanunu, M., Dadosh, T., Ray, V., Jin, J., McReynolds, L., Drndić, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+electronic+detection+of+probe-specific+microRNAs+using+thin+nanopore+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Rapid electronic detection of probe-specific microRNAs using thin nanopore sensors.</a> Nat. Nanotechnol. 5 (11), 807-814 (2010).</li>
<li>Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-state+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Solid-state nanopores.</a> Nat. Nanotechnol. 2 (4), 209-215 (2007).</li>
<li>Powell, M. R., Cleary, L., Davenport, M., Shea, K. J., Siwy, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric-field-induced+wetting+and+dewetting+in+single+hydrophobic+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Electric-field-induced wetting and dewetting in single hydrophobic nanopores.</a> Nat. Nanotechnol. 6 (12), 798-802 (2011).</li>
<li>Egerton, R. F., Li, P., Malac, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+damage+in+the+TEM+and+SEM%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Radiation damage in the TEM and SEM.</a> Micron. 35 (6), 399-409 (2004).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Nanopore boyut kontrolü biyomoleküler algılama uygulamalarında temel bir öneme sahiptir. Nano-gözeneklere çapları problanmış olan moleküllerin büyüklüğü sırasına olmalıdır, bunlar örnek karşılamak için yeterince büyük, ancak en uygun bir sinyal-gürültü elde etmek için yeterince küçük olmalıdır. Boyutunun kontrol yüksek elektrik alanı uygulanması sunulan yöntemi kullanırken bu küçük gözenek çapları, yalnızca tek yönlü işlem boyunca artar, 3-100 nm arasında çaplara sahip nanopores subnanometer hassasiyetle moda olabilir. 3-4 nm gözenekleri hemen bir TEM 23 kullanılarak imal edilebilir, bu hacimli ligand-protein komplekslerinin etkileşimine ssDNA yapı tarama gelen geniş bir uygulama yelpazesi için katı-hal nanopores güvenilir bir imalat sağlar. 100 nm üzerinde küçük gözenek büyüme çok hızlı ve daha az hassas olabilir, daha ılımlı koşullar büyütme işlemi üzerinde daha iyi kontrol sağlamak için kullanılabilecektir. S olarakuch, etkili boyutu kontrolü sağlamak için en önemli adım büyütme verimliliği ve istenilen gözenek çapı ulaşmada gerekli hassasiyet seviyesini dengelemek için darbe gücü ve süresi seçimdir. Bu daha fazla genişleme düşük bir önyargı ancak karşılaştırılabilir elektrik alan kuvveti görülmektedir tiner nanopores (10-nm kalınlık), genişleme ile vurgulanır. Son boyutuna bağlı olarak, bir kaç dakika içinde alt-100-nm çaplarına Nanopore büyütmek için genel olarak mümkündür. Bu arka plan gürültü translokasyon sinyallerini ayırt etmek neredeyse imkansız olduğu gibi benzer şekilde, büyük düşük frekans akım dalgalanmaları tek-molekül çalışmalarını engellemektedir. Eksik 24 ıslatma, ilk üretim 25 ve nanopore duvara 13 enkaz emilmesinden sonra kalan karbonlu kalıntıların varlığı genellikle i olan sert kimyasal tedaviler ile ek temizlik gerektiren, sinyal kalitesini düşürebilirnefficacious. Solid-state nanopore protokoller ıslanmasına yardımcı veya delme, görüntüleme ve işleme süreçlerinden arta kalan herhangi bir kontaminasyonu temizlemek için montaj önce piranha çözüm veya oksijen plazma ile Nanopore temizlik önemini vurgulamak için İlginçtir, bu yaygındır. Hatta bu tedavi ile, ancak, nanopores sık sık ıslak değil yapmak ya da yüksek gürültü sergilemeye devam ve başarısız girişimleri için önerilen çözüm son derece zaman alıcı olabilir 14 ek temizlik yapmaktır. Yüksek elektrik alanların uygulama ile, bu uzun protokoller, uygulamaya bağlı olarak gerekli olmayabilir. Bu aygıtların çoğu zaman sonuç olarak hazırlanması ve sert kimyasallar ile başa çıkmak için gereksinimini azaltır, burada tarif edilen yöntem kullanılarak in situ yenilenmiş edilebilir olduğu bulunmuştur. Elektriksel gürültü azaltıcı en önemli adımlar tamamen gözenek ıslak ve gevşek bağlı enkaz kaldırmak için voltaj ve / veya darbe süresi basit bir artış var.Bu şekilde muamele edilmiş Nanopores güvenilir bir DNA ve proteinlerin geçişi olarak biyomolekül translokasyon deneylerde de kullanılabilir. Bu moleküller bir tıkanmış ve gürültülü elektrik sinyaline yol açan gözenek duvarına yapışır ise, yüksek elektrik alan bakliyat engeli çıkarın ve akışkan hücreden nanopore çip ayrılması olmadan, daha sonraki denemeler için düşük gürültü özelliklerini kazanmak için yeniden uygulanabilir. Açıklanan kurulumu kullanarak yüksek elektrik alanların uygulama için yüksek bant genişliği (&gt; 1 kHz) de hassasiyeti ve düşük gürültü özelliklerini eksikliği 10 V ve akım amplifikatörü, kadar uygulayabileceğiniz bir harici güç kaynağı ihtiyacı ile sınırlıdır tek molekül algılama. Tipik Biyomoleküler deneyler ± 1 V ile sınırlıdır düşük gürültü akım amplifikatörü güveniyor iken, bir Adju yüksek elektrik alan klima ve hassas akım ölçümü hem de başarabileceği tek bir sistem tasarımı basittiristikrarlı kazanç. Bu sınırlamaya rağmen, diğer bir kurulumdan geçiş hızlı ve basittir. Örneğin SEM 5, termal oksidasyon ve 8, şekillendirme zarın kullanımı gibi küçük gözenek boyutunu kontrol etmek için var olan teknikler ile karşılaştırıldığında, yüksek bir elektrik alanı standart ekipmanlar kullanılarak laboratuar tezgah üzerinde yapılır ve temin edilebilir, daha hızlı, daha hassas ve daha ucuz bir yöntem tavsiye Nanopore boyutları daha geniş bir dizi. Hızlı ve tekrarlanabilir düşük frekanslı gürültüyü azaltmak için yeteneği de ilk üretim daha güvenilir hale getirir ve daha önce kullanılan gözenekler daha fazla deneyler için gençleşmek gibi, katı-hal nanopores ömrünü uzatır. Toplamda, yüksek elektrik alanları ile klimalı değişen kalınlıklarda nanopores% 95 üzerinde biomolekül algılama için uygun hale getirilerek, çok az düşük frekanslı gürültü karakteristiği sergiledi. Fabrikasyon solid-state nanopore deneyleri daha accessi yapma, böylece daha kolay ve daha güvenilirAraştırmacılara ble ve potansiyel olarak daha güçlü fabrikasyon süreçleri aracılığıyla Nanopore teknolojilerin ticarileştirilmesi yönünde bir yol için izin.

Biyolojik ve katı-hal nanopores tek molekül düzeyinde 1 biyomoleküler analitlerinin algılama için bir araç sağlar. Bağımsız nanopores genellikle iki sıvı rezervuar arasında geçmesine iyonik akımı için tek boru sağlayan, ince yalıtım membran gömülür. Daha büyük ölçekli bir Coulter sayacı prensiplerini kullanarak, çok küçük gözenek deneyler bu elektroforetik olarak bir dış elektrik alanı varlığında, bir nano-gözenekler ile tahrik edildiği gibidir yüklü biyomoleküllerin uzunluğu, boyut, yük ve yapısını belirlemek için iyonik akımında bir değişiklik ile ilgilidir. Böyle α-hemolisin gibi biyolojik nanopores genellikle daha büyük bir duyarlılık ve düşük gürültü özelliklerini 3 sunarken, destekleyen çift katlı lipid uygulanabilirliğini sınırlayan, kırılgan ve sabit bir boyutu. Solid-state nanopores, diğer taraftan, ince (10-50 nm) silisyum nitrür ya da silisyum oksit zarlarında imal edilir ve farklı sIz yapılabilires, kolayca gofret ölçekli teknolojileri 6,7 ile entegre ve daha sağlam, deneysel koşullarda daha geniş bir aralığı için izin olabilir. Bu avantajlara rağmen, solid-state nanopore teknolojileri biyomoleküler çalışmaları için kullanışlılığını sınırlayan birkaç pratik sakıncaları muzdarip. Küçük gözenek boyutunun kontrolü mümkün olsa da, bu özel bir donanım ve kalifiye personel gerektiren, elde etmek için genellikle, pahalı ve zahmetli bir iştir. Örneğin, odaklanmış iyon demeti tarafından açılan nanopores yakın bir tarama elektron mikroskobu (SEM) 5&#39;te belirli deney koşulları altında küçültmek için gösterilmiştir. Diğer yaklaşımlarda, transmisyon elektron mikroskobu (TEM) tarafından açılan nanopores ışın koşulları ve sulu çözücülerin 8 sonraki maruz bağlı olarak genişletmek veya küçültmek olabilir. Nanopore büyüklüğü kimyasal muamele ya da aşağıdaki değişiklik gibi, bu durumda da, çok küçük gözenek boyutları elde aralığı sınırlı kontrolü zor ve hatta güvenilmezBelirli bir sıvı ortamda 9 içine daldırıldığında. Solid-state nanopores aracılığıyla iyonik akım da yüksek gürültü muzdarip olabilir, kaynaklarıdır nanopore literatürde 2,3,10,11 bir yoğun araştırıldı konudur. Çeşitli yöntemler, elektriksel gürültüyü azaltmak için önerilmiş olsa da, güvenilir ve kararlı düşük gürültü nanopores verimi tipik olarak düşüktür. Sondaj ve görüntüleme sırasında karbonlu artıkların birikmesi sıklıkla tam ıslatma bir meydan okuma yapma ve 12 kaldırmak için zor olabilir nanobubbles oluşumuna neden, elektrik sinyali kalitesi üzerinde zararlı etkileri olabilir. Ayrıca, analit molekülleri tarafından Nanopore tıkanma sinyal kalitesi render başka deneyde 13,14 için kullanılamaz hale gözenekleri düşürür. Toplamda, bu etkileri büyük ölçüde işlevsel Nanopore cihazların verimini azaltır ve katı-hal Nanopore araştırma ile ilişkili maliyetini artırabilir. Uygulamalar0,15-0,3 V / nm aralığında yüksek elektrik alanları üretmek için Ag / AgCl elektrotlu bir voltaj tion, bu sorunlar için şaşırtıcı derecede basit bir çözüm sunar. Kısa voltaj darbeleri, tek-molekül çalışmalar için temiz, düşük gürültü Nanopore yüzey ideal döngüsel uygulama sayesinde üretilir. Yüksek elektrik alanlarına uzun süre maruz kalmak küçük gözenek çapında bir artışa neden gözenek duvarı oluşturan zar malzemesi, kaldırılmasını başlatır. Bu büyüme, tam olarak darbe gücü ve süresi ayarlanması sureti ile kontrol edilebilir. Moleküller nanopore yüzeye adsorbe olarak mevcut izleri nedeniyle Nanopore tıkanma bir deney boyunca aşağılamak gibi, bu süreç aksi takdirde iptal olurdu tıkalı cihazları kurtarmak için tekrar edilebilir. Bu nedenle, fonksiyonel nanopores verimi daha da birden çok kez, aynı cihazı kullanma yeteneği artar. Bu hızlı bir şekilde deneysel altında sıvı içinde gerçekleştirilir ki bu yöntem çeşitli avantajlar sağlarkoşullar, ancak standart laboratuar ekipmanı gerektirir yazılımı ile otomatik olabilir ve% 95 üzerinde bir verimle fonksiyonel, yüksek kaliteli nanopores üretir.

<table><tbody><tr><td>JEM-2100F TEM</td><td>JEOL</td><td></td><td>Sondajı 200 kV hızlanma gerilimi gerektirir</td></tr><tr><td>Axon Axopatch 200B yama kelepçesi amplifikatörü</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td></td><td>Düşük gürültülü voltaj ve akım amplifikatörü</td></tr><tr><td>X-Serisi veri toplama kartı</td><td>National Instruments</td><td>PCI-6351</td><td>Kurulum ile arayüzleme, yüksek elektrik alanlarının uygulanması</td></tr><tr><td>LabVIEW 2012 yazılımı National</td><td>Instruments</td><td></td><td>Voltajları uygulayın, akımı kaydedin, veri analizi</td></tr><tr><td>Akım amplifikatörü</td><td>Keithley</td><td></td><td>Yüksek elektrik alan darbeleri sırasında akım amplifikasyonu</td></tr><tr><td>30 nm kalınlığında silisyum nitrür TEM membran pencereler</td><td>Norcada Inc.</td><td>NT005X</td><td>Nanogözeneklerin oluşturulduğu alt tabaka,</td></tr><tr><td>10 nm kalınlığında silisyum nitrür TEM membran pencereleri</td><td>, Norcada, Inc.</td><td>NT005Z</td><td>Nanogözeneklerin oluşturulduğu substrat</td></tr><tr><td>Silikon elastomer O-ringler</td><td>Marian Chicago</td><td>HT6135</td><td>Nanopor çipi Ag / AgCl elektrotlarını sızdırmaz hale getirmek için delinmiş</td></tr><tr><td></td><td>In Vivo Metrik</td><td>E255</td><td></td></tr><tr><td>Nitrik asit</td><td>Fisher Scientific</td><td>52004P</td><td>Hücreleri temizlemek için kullanılır - dikkatli tutun</td></tr><tr><td>Hidrojen peroksit</td><td>Fisher Scientific</td><td>H323</td><td>Piranha çözeltisi için kullanılır - dikkatli kullanın</td></tr><tr><td>Sülfürik asit</td><td>Fisher Scientific</td><td>A300</td><td>Piranha çözeltisi için kullanılır - dikkatli kullanın</td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>P335</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td>Tamponlama KCl çözeltisi</td></tr><tr><td>Birincil Faraday kafesi</td><td></td><td></td><td>Koruyucu nanopor hücresi, elektrotlar</td></tr><tr><td>İkincil Faraday kafesi</td><td></td><td></td><td>Koruyucu headstage, elektrot telleri</td></tr><tr><td>Teflon hücre</td><td></td><td></td><td>Nanopore çip ve rezervuarları tutmak için Sıcak</td></tr><tr><td>plaka</td><td>VWR</td><td></td><td>Isıtma piranha çözeltisi</td></tr></tbody></table>

boyutu ince ayar ve solid-state nanopores gürültü en aza indirmek

Fine-tuning the Size and Minimizing the Noise of Solid-state Nanopores

Solid-state nanopores gibi nükleik asitlerin ve proteinlerin 1 gibi tek biyomoleküllerin karakterizasyonu için çok yönlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, ince bir yalıtım zar içinde bir nano-gözeneklere yaratılması zor olmaya devam etmektedir. Özel odaklanmış elektron ışını sistemlerini içeren fabrikasyon yöntemleri iyi tanımlanmış nanopores üretebilir, ancak piyasada mevcut zarlarında, güvenilir ve düşük gürültü nanopores verimi 2,3 düşük kalır ve boyut kontrol 4,5 saçma değildir. Burada, ince ayar yüksek elektrik alanların uygulama optimal düşük gürültü performansı sağlarken Nanopore boyutu gösterilmiştir. Yüksek elektrik alanının, kısa darbeler bozulmamış bir elektrik sinyali üreten ve uzun süreli maruz kalma üzerine subnanometer hassasiyetle nanopores büyütülmesi için izin vermek için kullanılır. Bu yöntem, s veriminin ve yeniden üretilebilirliğinin geliştirilmesi, standart laboratuar ekipmanı kullanarak sulu bir ortam içinde yerinde gerçekleştirilirolid-state nanopore fabrikasyon.

Bu çalışmada kullanılan nanopores 30 nm veya 10 nm kalınlığında bir silikon nitrit zar pencereler açılmıştır. Açıklanan protokol çeşitli malzeme katı-hal nanopores herhangi bir yöntemi kullanılarak imal uygulanabilir olsa da, genellikle daha önce kurulmuş protokolleri 11,14 kullanarak TEM ile delinir. TEM tarafından delinmiş Nanopores çapı 4-8 nm (Şekil 2) arasında genellikle bulunmaktadır. Her ikisi de 30-nm ve 10 nm kalınlığında membranlar monte ve yukarıdaki protokolünü kullanarak klimalı edilebilir olsa da, açıklanan gerilim önyargıları aksi belirtilmedikçe 30-nm kalınlığında zarları için gerekli olan bakın. Farklı boyutta membran için, uygulanan voltaj nano-gözenekler içinde 0,15-0,3 V / nm aralığında bir elektrik alanı oluşturmak için ayarlanmalıdır. Şekil 3a, 30 nm kalınlığında bir zar içinde bir 10 nm nano-gözeneklere iki tipik iletkenlik izleri önce ve yüksek elektrik alanları ile muamele edildikten sonra gösterilmektedir. Yeni d üzerine monteNanopore rilled, dengesiz ve gürültülü iyonik akım sinyalini elde düşük frekanslı dalgalanma yüksek derecede sergileme olasılığı genellikle yüksektir. Şekil 3a&#39;da gösterilen bu küçük gözenek davranışı vurgulamaktadır. Bu iletkenlik nedeniyle eksik ıslatma için en olası büyüklüğü, bir nano-gözeneklere için beklenenden önemli ölçüde daha azdır. 8 V bakliyat (2 sn süresi 90 bakliyat) tarafından üretilen büyüklüğü 0.27 V / nm yüksek elektrik alanların başvuru üzerine, nanopore tamamen ıslak olur ve daha sonra çapı 21 nm büyütülür. Bu noktada, gözenek düşük gürültü özellikleri ile kararlı bir iletkenlik sergiler. Benzer olan nano-gözeneklerde gürültü nicel analizi, Şekil 3b&#39;de güç spektral yoğunluğu araziler olarak gösterilir. Unwet ve / veya tıkanmış gözeneklerin düşük frekanslı gürültü genlik deneyde kullanılamaz onları render (&gt; 20 pA RMS) çok yüksektir. Yüksek elektrik alanları, düşük frekanslarda gürültü gücü (&lt;10 kHz) ile klima diminis olduğunu Upon3&#39;e kadar büyüklükte emir ve düşük gürültü deneyler için hazır tarafından hed. Uygulanan potansiyel büyütme ve düşük elektrik alan ölçüm dönemleri için yüksek elektrik alanlar arasında darbeli olarak Şekil 4a tipik bir akım ölçümü gösterir. Ardışık her bir palsta sonra, (örneğin, küçük gözenek iletkenliği) ölçüm voltajı da nano-gözeneklere yoluyla elde edilen iyonik geçerli sınırlı bir miktarda arttırır. Bu çap d ​​etkili uzunluğu l eff silindirik bir geometriye sahip olarak Nanopore yakın, iletkenlik σ eden bir çözelti içerisinde kendi iletkenliği G anlaşılacağı gibi nanopore, boyut olarak artmış olduğunu göstermektedir. Diğer çeşitli modeller geometrisi 17,19-21 ile nanopore iletkenlik ilişkin için mevcut olmakla birlikte, bir geometrik terim ve bir erişim direnç terim içeriyor aşağıdaki ilişki, yüksek tuz TEM-delinmiş nanopores için geçerli kanıtlanmıştırdsDNA translokasyon 17,22 için ilgi çekici geniş bir çap aralığında konsantrasyonları. <img alt="" src="/files/ftp_upload/51081/51081eqn.jpg" width="150px" /> İstenen çap ulaşıldığında, bu işlem otomatik olarak yazılım tarafından durdurulur. Şekil 4b&#39;de gösterildiği gibi, elde edilen küçük gözenek çapı, daha sonra kesin IV ölçümleri kullanılarak teyit edilebilir. Yüksek elektrik alanlarını kullanarak tedavi nanopores tamamen fonksiyonel olduğunu not etmek önemlidir. Şekil 5a&#39;da gösterilen iletim izleri de gösterildiği gibi, λ DNA translokasyon tespiti ile doğrulanır. Bu şekilde, dsDNA tarif edilen yöntem kullanılarak 11 nm ve 32 nm genişletilmiştir iki nanopores ile tahrik edilir. Her durumda, temel iletkenlik son derece kararlı ve dsDNA molekülleri nanopore aracılığıyla transloke gibi net barikatlar yüksek sinyal görüntüleniyor gözlenmektedir-Gürültü tek-molekül translokasyon yüksek gürültü sergilemek işlenmemiş gözenekleri göre olaylar. Şekil 5a ilavelerde gösterildiği gibi, bu boyuttaki nanopores için beklendiği gibi ayrı ayrı katlanmış molekülleri, yerini değiştirmek gibi, bir çok ayrı blokaj seviyeleri gözlenir. Her bir gözenekten translokasyon olaylar sırasında nanopore iletkenlik histogramları Şekil 5b&#39;de gösterilmiştir. Ve çift tıkanma durumları (iki DNA ipliklerini kapandı -) - nanopores düşük gürültü özellikleri başlangıca tekabül ayrı, kolayca çözülebilir zirveleri (hayır DNA), tek (katlanmamış bir DNA iplikçik) ortaya koymaktadır. Dikkat çekici gözenek işgal eden tek bir dsDNA moleküle karşılık iletkenlikteki değişiklik büyük ve küçük nano-gözeneklerde için farklı olduğu bir gerçektir. Bu, diğer gözenekler veya çatlak t oluşturulmaktadır olsaydı, yüksek elektrik alanların uygulama aynı blokaj genlik gözlemlenebilir gibi, mevcut nanopores büyütme aslında bu dolaylı kanıt sağlaro işlemi sırasında 17 zar. Benzer şekilde, Şekil 6, farklı bir kalınlıkta membran imal nanopores büyütmek için yüksek elektrik alanlarının etkinliğini göstermektedir. İşte, bir 10-nm SiNx zarında oluşturulan bir nanopore dengesiz ve nispeten küçük iletkenlik görüntüleme, başlangıçta kısmen unwet olduğunu. ± 3 V alternatif başvurusu üzerine, 4 saniye süresince (30 toplam) bakliyat (0,3 V / nm ±), nanopore ıslak olur ve 3 nm gözenek için idealdir IV özellikleri sergiler. Metodoloji sonra 400 sonraki darbeler için tekrarlandı ve nanopore 8 nm genişletildi. Bu büyütme, benzer elektrik alanlarına gerçekleştirilebilir, ancak 30 nm zarlarında imal edilmiş olan nano-gözeneklerde için daha düşük tatbik edilen voltaj önyargı, işlem esas olarak tahrik edilen elektrik alanı olduğunu göstermektedir. Daha ince bir zar içinden translokasyonu ile üretilen akım blokajı ince zarlarında kalın gözenekler, nano-gözeneklerde üretilen daha büyük olduğuBu şekilde muamele edilmiş bu tür artan duyarlılığı ile proteinler gibi daha kısa moleküller incelemek için kullanılabilir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51081/51081fig1.jpg" width="600px" /> Şekil 1. Nanopore hücre montaj. Nanopore içeren bir silisyum nitrür membran elektrolit rezervuarları içeren iki Teflon yarı-hücreleri tarafından sıkıştırılmış sırayla olan silikon elastomer contaların arasına yerleştirilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51081/51081fig1highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 2," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51081/51081fig2.jpg" width="600px" /> Şekil 2. Nanopore klima ve kurulum büyütme. 30 nm kalınlığında silisyum nitrür membran (solda) açılan bir nanopore iki elektrolit rezervuarları bağlar. ABilgisayar bir yama kelepçe amplifikatör veya elektrolit rezervuarlarda dalmış Ag / AgCl elektrotlar aracılığıyla nanopore genelinde potansiyel bir önyargı geçerlidir harici güç kaynağı (DAQ kartı) ya da kontrol etmek için kullanılır. Geçerli amplifikatör bilgisayar yazılımı kullanarak gerçek zamanlı olarak izlenebilir ölçülen iyonik akım röleleri. Bu rakam [11] modifiye edilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51081/51081fig2highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 3," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51081/51081fig3.jpg" width="600px" /> Şekil 3,. Yüksek elektrik alanların Mevcut izleri öncesi ve sonrası uygulama. (A) montaj ve hatta pirana çözeltisi ile temizlerken, aşağıdaki üzerine, nanopore iletkenlik kararsız ve silindirik bir 10 nm gözenekli (mavi) için beklenenden daha azdır. 8 V 2 sn bakliyat, uygulandıktan sonraNanopore tamamen ıslanması ve genişlemiş, istikrarlı iletimi sergileyen ve biyomoleküler algılama deneyler (yeşil) için kullanılabilir edilir. (B) güç spektral bir eksik ıslatılmış ve tıkanmış Nanopore (sırasıyla mavi ve turuncu,) araziler. 8 V 200 msn bakliyat uygulanması üzerine, nanopores ıslatılmış ve moloz (yeşil ve kırmızı, sırasıyla) uzaklaştırılmıştır. Bu rakam [11] modifiye edilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51081/51081fig3highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 4," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51081/51081fig4.jpg" width="600px" /> Şekil 4. Yüksek elektrik alanları kullanarak büyütme nanopore. (A) genişleme ve ölçüm potansiyel önyargıları (kırmızı) arasında Alternatif nanopore (mavi) ile iyonik akım sonlu adımda artırdığını ortaya koymaktadır. Çıkan davranışance ölçüm nanopore çapı anlaması için kullanılabilir. İstenen çap elde edildikten sonra, işlem durdurulur. (B) iletkenlik hassas IV ölçümleri Nanopore boyutları artmıştır onaylayın. Bunlar uygun olabilir ve simetrik ve omik davranış teyit edilebilir araziler gibi tek nokta akım değerleri daha gözenek boyutundan daha iyi bir tahmin sağlar. Bu rakam [11] modifiye edilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51081/51081fig4highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 5," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51081/51081fig5.jpg" width="600px" /> Şekil 5,. Klimalı nanopores aracılığıyla gerçekleştirilen DNA translokasyon. 150 mV bir önyargı de nano-gözeneklere bir tarafına dsDNA (a) bir ek (48.5 kbp) geçici 11 nm (mavi) ve iletkenlik izleri blokajlar ve 32 nm por üretires (kırmızı). (B) nano-gözeneklerde her iletkenlik histogramları bir taban çizgisine karşı gelen ayrı tepe ve çift translokasyon etkinlik göstermektedir. Bu rakam [11] modifiye edilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51081/51081fig5highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 6," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51081/51081fig6.jpg" width="600px" /> Şekil 6,. 10 nm membranların nanopores Genişleme. 10 nm zarı, ilk sergiler çok az iletkenlik ve asimetrik IV karakteristikleri (turuncu) bir Nanopore. 30 ± 3 V (4 sn süre) arasında değişen bakliyat, nanopore ıslatır ve uygulama üzerine 3 nm gözenek (mavi) için beklenen tutarlı bir iletkenliğindeki ile ideal bir IV özellikleri sergiler. ± 3 V bir başka 400 darbeleri 8 nm çapa Nanopore büyütür(Yeşil). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51081/51081fig6highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a> .

Biyomoleküler translokasyon deneyler için çözelti içinde katı-hal nanopores hazırlanması için bir yöntem sunulmuştur. Yüksek elektrik alanların kısa darbeleri uygulayarak, nanopore çapı kontrollü subnanometer hassasiyetle genişlemiş olabilir ve elektriksel gürültü karakteristikleri önemli ölçüde geliştirilmiş. Bu prosedür, deney koşulları altında, standart laboratuar ekipmanı kullanılarak yerinde gerçekleştirilir.

Boyutu ince ayar ve Solid-state nanopores Gürültü en aza indirmek

Solid-state nanopores have emerged as a versatile tool for the characterization of single biomolecules such as nucleic acids and proteins1. However, the ...

Bu metodolojinin genel amacı, boyutunu hassas bir şekilde kontrol ederek ve iyonik akım gürültü özelliklerini azaltarak, biyomoleküler algılama deneyleri için katı hal bir nanopor hazırlamaktır. Bu işlem, öncelikle iki elektrolit rezervuarı arasında nanometre boyutunda bir kanal oluşturmak amacıyla katı hal nanopor çipinin bir sıvı hücreye yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım olarak, nanoporun başlangıç boyutunu ve elektriksel gürültü özelliklerini karakterize etmek için nanopor boyunca nanometre başına yaklaşık 0,01 voltluk orta düzeyde bir elektrik alanı uygulanır. Ardından, membran boyunca kısa darbeler halinde nanometre başına yaklaşık 0,3 voltluk yüksek elektrik alanları uygulanır.Nanoporu tamamen ıslatmak, elektriksel gürültüyü azaltmak, onu istenen boyuta getirmek ve ayrık alt nanometre adımlar oluşturmak amacıyla işlemler uygulanır. İyonik akım sinyalinin analizi ve biyomoleküllerin başarılı translokasyonu temel alınarak, tamamen ıslatılmış, fonksiyonel ve düşük gürültülü bir nanopor üretildiği sonuçları elde edilmiştir. Bu tekniğin, iletim veya taramalı elektron mikroskobu kullanımı gibi nanopor boyutunu kontrol etmeye yönelik mevcut yöntemlere karşı temel avantajı, işlemin biyomoleküler tespit için kullanılan aynı düzenekle, standart laboratuvar ekipmanları kullanılarak bir tuz çözeltisi içinde gerçekleştirilmesidir.Bu, biyomoleküler algılama deneyleri sırasında gerçek nanopor boyutunun hassas bir şekilde kontrol edilmesini sağlar. Prosedür ayrıca düşük frekanslı elektriksel gürültüyü azaltır ve tıkanmış nanoporların sonraki deneyler için yeniden canlandırılmasına olanak tanır. Bu video, bir nanopor çipinin halihazırda bir nanopor hücresine monte edildiğini varsaymaktadır.Bir sonraki adım, hücreyi deney için hazırlamaktır. Bunun için her bir rezervuara gümüş, gümüş klorür elektrotlar yerleştirin. Ardından, hücrenin rezervuarları arasına düşük gürültülü bir akım amplifikatörü bağlayın.Nanogözenek hücre düzeneğinin tamamını elektriksel olarak ekranlanmış bir muhafazaya yerleştirin. Düşük gürültülü akım amplifikatörünü harici komut moduna getirin. Otomatik bilgisayar kontrolüne olanak sağlamak için, bilgisayar uygulanan potansiyeli -200 millivolt ile 200 millivolt arasında taramalı ve IV karakteristiklerini kaydetmelidir. Nanogözenek iletkenliğini ve çapını elde etmek için IV eğrisi uydurulur; bu örnekte görülen beklenenden düşük iletkenliğin veya burada gösterilen IV eğrisindeki asimetrinin tutarlılığını kontrol etmek için kullanılır.Koşullandırma gerektiren, tam olarak ıslanmamış veya tıkanmış bir nanoporu belirtin. Karakterizasyona devam etmek için nanopore 200 millivolt potansiyel uygulayın ve iyonik akımı 30 saniye boyunca kaydedin. Koşullandırılmamış bir Nanopordan alınan bir izleğin bu bölümü, iyonik akımın tüm ölçümleri için örneği biyomoleküler algılama deneyleri için uygunsuz hale getiren yüksek derecede elektriksel gürültü sergilemektedir.Güç spektral yoğunluk analizi ile düşük frekans gürültü özelliklerini nicelleştirin. Burada görülen düşük frekanstaki yüksek gürültü, tam olarak ıslanmamış veya tıkanmış nanoporların karakteristik özelliğidir. Karakterizasyondan elde edilen veriler, bir nanoporun kondisyonlama gerektirdiğini gösterebilir.Bunu yapmak için elektrotları düşük gürültülü akım amplifikatöründen ayırın. Kablolardan birini, altı volttan daha yüksek bir çıkış voltajı sağlayabilen bilgisayar kontrollü bir güç kaynağına bağlayın. Kurulumu test etmek için toprak elektrodunu harici bir akım amplifikatörüne bağlayın.Nanogözenek boyunca en az beş saniye boyunca 400 millivolt'luk bir potansiyel farkı uygulayın ve akımı ölçün; IV eğrisi ölçümleriyle tutarlılığı kontrol etmek için verilerin son bir saniyesini kullanın. Ardından, nanogözenek boyunca altı voltluk 200 milisaniyelik bir darbe uygulayın. Bunu, 400 millivolt'ta beş saniyelik bir ölçüm süresiyle takip edin ve çapı belirlemek için verilerin son saniyesini kullanın.Nanogözenek çapı elde edilen TEM görüntüleri ile uyumlu hale gelene kadar bu diziyi gerektiği kadar tekrarlayın. Nanogözenek montajından veya iletkenlik ölçümlerinden önce, nanogözeneklerin tıkanması öncesinde, 30 nanometre kalınlığındaki bir membran için kondisyonlama düzeneğinde daha uzun süreli darbeler ve/veya daha yüksek potansiyeller uygulanarak nanogözenekler istenen boyuta genişletilebilir. Nanogözenek boyunca en az beş saniye boyunca 400 milivoltluk bir kutuplaşma voltajı uygulayarak başlayın.Nanogözenek boyutunu tahmin etmek için veri sağlamak amacıyla, üzerinden sekiz voltluk iki saniyelik bir darbe uygulayın. Bunu, 400 milivolt değerinde en az beş saniyelik bir ölçüm süresiyle takip edin.Artan çapı döngüsel olarak belirlemek için, istenen gözenek boyutuna ulaşılana kadar iki saniyelik sekiz voltluk genişletme darbesi ve beş saniyelik 400 milivoltluk ölçüm adımlarını tekrarlayın. Hedef çapa ulaşıldığında, güç kaynağının ve akım amplifikatörünün bağlantısını kesin. Düşük gürültülü akım amplifikatörünü elektrotlara yeniden bağlayın.Nanogözenek çapını doğrulamak ve burada karşılaştırıldığı üzere, karşılanmamış ve asimetrik nanogözeneklere kıyasla düşük gürültülü iyonik akım özelliklerini doğrulamak için yeni IV ve akım izi verileri elde edin. Genişletilmiş nanogözeneğin IV özellikleri, iletkenlikte önemli bir artış ve ideal omik davranış sergiler. Burada, 10 nanometre çapındaki bir nanogözeneğin ve 30 nanometre kalınlığındaki bir membranın yüksek elektrik alanlarıyla işlem görmeden önceki ve sonraki tipik iletkenlik izleri yer almaktadır.İletkenlik ölçeğindeki kırılmaya dikkat edin. Mavi ile gösterilen PO iletkenliği, 10 nanometrelik bir gözenek için beklenenden oldukça düşüktür; bu durum büyük olasılıkla eksik ıslanmadan kaynaklanmaktadır. Sekiz voltluk 92 saniyelik darbelerden sonra, nanogözenek tamamen ıslanmış ve çapı 21 nanometreye genişletilmiştir.Ayrıca, iletkenlik düşük frekans gürültüsü az olacak şekilde stabildir. Bir güç spektral yoğunluğu grafiği, mavi renkli kondisyon uygulanmamış gözeneklerin düşük frekans gürültüsü genliğinin çok yüksek olduğunu ve bunun onları tek molekül deneyleri için kullanılamaz hale getirdiğini göstermektedir. Yüksek elektrik alanları ile kondisyonlama yapıldığında.10⁴ Hz altındaki frekanslarda gürültü gücü üç büyüklük derecesine kadar azaltılarak, DNA translokasyon çalışmalarına yönelik hassas biyomoleküler algılama deneyleri için uygun hale getirilir. Düşük gürültülü akım amplifikatörünün elektrotlara bağlı olduğundan emin olun.Biyomoleküler örneği rezervuara eklemeden önce, en az iki dakika boyunca +150 ile +300 milivolt arasında bir potansiyel uygulayın. Kontaminasyonun kanıtı olan iyonik akım blokajlarını kontrol etmek için akım izini inceleyin.Bu izde olduğu gibi herhangi bir blokaj bulunmamalıdır. Çipe erişin ve nanoporun bir tarafına, son konsantrasyonu 0.5 ile iki nanogram per microliter olacak şekilde 48.5 KILOBASE eşleşmiş çift sarmal lambda DNA ekleyin; numunenin rezervuar boyunca homojen dağılımını sağlamak için pipetleme yoluyla en az 10 saniye boyunca nazikçe karıştırın. DNA eklendikten sonra çipi korumalı bölmeye geri yerleştirin.30 nanometre kalınlığındaki bir nanopor için, negatif yüklü DNA'yı elektroforetik olarak nanopordan geçirmek amacıyla 150 ila 300 milivoltluk bir potansiyel fark uygulayın. Nanopordaki iyonik akımı izlemek ve geçici akım blokajlarını tespit etmek için yazılım kullanın. DNA translokasyonu sayesinde, iyonik akım izleri DNA örneği hakkında daha fazla bilgi edinmek amacıyla analiz edilebilir.Yüksek elektrik alanlarıyla işlem görmüş nanoporların tam olarak işlevsel olduğu, üstteki izde tekil lambda DNA moleküllerinin tespitini gösteren bu iletkenlik izlerinden anlaşılmaktadır. Çift sarmallı DNA, 32 nanometreye genişletilmiş bir nanopor üzerinden sürülmektedir. Alttaki iz ise 11 nanometreye genişletilmiş bir nanopor üzerinden sürülmüş DNA'ya aittir.İletkenlik ölçeğindeki kesintiye dikkat edin. Her durumda, temel iletkenlik son derece kararlı ve temizdir. İletkenlik blokajları, tek moleküller Nanopore üzerinden geçerken gözlemlenir.Böcekler, tekil katlanmış moleküller olarak birden fazla ayrı blokaj seviyesi göstermektedir. Nanogözeneklerin düşük frekanslı gürültü özellikleri, hem yukarıdaki 32 nanometrelik gözenek hem de aşağıdaki 11 nanometrelik gözenek için nanogözenek iletkenliğinin bu histogramlarında kolayca çözümlenebilen pikler sağlar; üç pik çözümlenmiştir. Birincisi DNA içermeyen baz hattına, ikincisi tek bir doğrusal zincire ve üçüncüsü katlanmış DNA'ya karşılık gelmektedir.Bu videoyu izledikten sonra, tek molekül algılama deneyleri için katı hal nanoporların nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu teknik, deneysel verimleri önemli ölçüde artırarak, katı hal nanopor araştırmalarını geniş bir yelpazedeki tek molekül çalışmaları için nihayetinde daha erişilebilir ve güvenilir hale getirebilir.

fine-tuning-the-size-and-minimizing-the-noise-of-solid-state-nanopores

Research

JoVE Journal

Engineering

Mühendislik

Inorganik bir yüzeye proteinlerin non-spesifik adsorpsiyon izlemek için solid-state nanopores kullanarak bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, gerçek zamanlı olarak ve tek-molekül düzeyinde probed olması adsorpsiyon için izin, rezistif-pulse prensibi kullanmaktadır. Tek bir protein adsorpsiyon süreci denge noktasından uzak olduğu için, kantitatif protein adsorpsiyonu sabit görünen birinci dereceden reaksiyon hızı belirlenmesi yanı sıra ve Langmuir adsorpsiyon sabit sağlayan sentetik nanopores...

Solid-state Nanopores ile izlenmesi Protein Adsorpsiyon

Dielektrik düşük güç optik hapsi aşağıdaki kurulum yaklaşımı ayrıntıları metal film bir çift nanohole kullanarak nanopartiküller.

Nanopartiküllerin Optik Yakalama

Polidimetilsiloksan (PDMS) içinde iki mikrokanal arasında nanoakışkan bir bağlantı oluşturmak için silika kolloidal nanopartiküllerin basit bir kendi kendine montaj tekniği öneriyoruz. Bu teknik kullanılarak, bir mikrokanalın içine ~ 45 nm'ye kadar gözenek boyutuna sahip nano gözenekli bir boncuk zarı inşa edildi ve DNA örneklerinin elektrokinetik ön konsantrasyonuna uygulandı.

Kolloidal Parçacıkların Öz-Montaj Süreci yoluyla PDMS mikroakışkan Chip Sub-50 Nm Nanofluidic Junctions oluşturma

Düzgün boyutlu nanopartiküller elektron demeti (E-ışını) litografi poli (metil metakrilat) desenli temas delik boyutları (PMMA) fotorezist filmlerde dalgalanmaları kaldırabilirsiniz. süreç fotorezist yeniden akıtma ve Plazma ve ıslak aşındırma adımları takip temas delik merkezi ve mevduat nanopartiküller, elektrostatik hunileflme- içerir.

Kurban Nanopartiküller Kullanım E-ışın Litografi tarafından Fabrikasyon İletişim Holes Shot gürültü Etkilerinin çıkarmak

Biz sıvı genlik modülasyonu (dokunarak modu) atomik kuvvet mikroskobu ile alt nanometre çözünürlüklü görüntüler elde etmek için bir yöntem mevcut. yöntem ticari atomik kuvvet mikroskobu üzerinde gösterilmiştir. Biz parametrelerin seçimlerimizde arkasındaki mantığı açıklamak ve çözünürlük optimizasyonu için stratejiler önermek.

Sıvı olarak Genlik modülasyonu Atomik Kuvvet Mikroskobu ile alt nanometre Çözünürlüklü Görüntüleme

Bu protokol, nano ölçekli dinamik süreçleri gözlem için kullanıldığı şekilde, su içinde AuNPs transmisyon elektron mikroskobu için bir sıvı akımı numune tutucu çalışmasını açıklar.

Tarama Transmisyon Elektron Mikroskobu kullanılarak Sıvı Nano-ölçekli Nesnelerin dinamik Süreçlerinin İncelenmesi

plasmonik cımbız katılan bir mikroçip üretim süreci burada sunulmuştur. Mikroçip maksimum sıkıştırma kuvvetinin ölçülmesi için bir tuzak parçacığın görüntülenmesine olanak sağlar.

Bir İzleme Ortamında plasmonik Yakalama ve Nanopartiküller Yayın

Kovalent çapraz nano tanecikleri doğrusal polyester kolye işlevleri içeren üzerinden boyutu ve crosslinking yoğunluğunu ayarlama için bir süreç bu makalede. Sentez parametreleri (polimer molekül ağırlığı, kolye işlevselliği birleşme ve crosslinker eşdeğerleri) uyarlayarak, istenen nanopartikül boyutu ve crosslinking yoğunluğu ilaç teslim uygulamalar için elde edilebilir.

Nanosponge ayar boyutu ve Crosslinking yoğunluğu

Burada, ayrı metal oksijen kümeleri, polyoxometalates (POMs), biyolojik nanopore tabanlı elektronik platform kullanarak tek molekül limitinde tespit etmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, bu moleküllerin çalışmada kullanılan geleneksel analitik kimya araçlarına tamamlayıcı bir yaklaşım sağlar.

Tek metalik nanopartiküller yüksek çözünürlüklü fiziksel karakterizasyonu

Burada, bir protokol kapalı tip kablosuz nanopore elektrot imalatı ve tek nanopartikül çarpışmalar sonraki elektrokimyasal ölçümü için mevcut.

Tek nano tanecikleri analiz etmek için kapalı tip kablosuz Nanopore elektrot

Biz kalkış fotolitografi, nano-derin reaktif iyon gravür ve oda sıcaklığında plazma ile akustik nanoakışkanlar için lityum niyobat üzerine yüzey akustik dalga aktüasyon cihazlarıentegrasyonu ile nanoheight kanalların imalatı göstermek tek kristal lityum niyobat yüzey aktif çok katmanlı yapıştırma, oksitler lityum niyobat yapıştırma için benzer bir süreç.

Akustik Nanofluidics için Lityum Niyobat ile Yüzey Akustik Dalga Aktüasyon Birleştiren Nanoheight Kanallarıimalatı

Öğrenin katı hal nanopore boyutunu ince ayar yapma ve elektriksel gürültüyü azaltma yöntemini. Bu teknik, biyomoleküler algılama deneylerinde hassas ölçüm ve güvenilir sonuçlar sağlar.

Boyutu ince ayar ve Solid-state nanopores Gürültü en aza indirmek

Daha fazla video keşfet